TW201906858A - 拮抗腫瘤細胞中wnt訊息傳導之多肽 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關新穎LRP5結合性多肽、且更特定而言可抑制Wnt訊息傳導路徑之新穎LRP5結合性免疫球蛋白單一可變結構域構築體。本發明亦係關於此等多肽之特定序列、其產生方法及其使用方法，包括治療諸如癌症等疾病之方法。

Description

拮抗腫瘤細胞中WNT訊息傳導之多肽
本發明係關於新穎低密度脂蛋白受體樣蛋白5 (LRP5)結合多肽。本發明亦係關於編碼此等多肽之核酸；製備此等多肽之方法；表現或能夠表現此等多肽之宿主細胞；包含此等多肽之組合物；及此等多肽或此等組合物之用途，其尤其用於癌症疾病領域中之治療性目的。
Wnt訊息傳導路徑之活化需要細胞外Wnt配體與捲曲受體(Frizzled receptor)及與輔受體LRP5 (登錄號：UniProtKB - O75197 / LRP5_HUMAN)之結合。哺乳動物細胞中存在19種Wnt蛋白及10種捲曲受體。在Wnt配體不存在下，細胞質β-連環蛋白係經由支架蛋白Axin及APC以及激酶GSK3β及CK1a組成之蛋白質複合物磷酸化。隨後由泛素連接酶β-TrcP識別，導致泛素介導之β-連環蛋白降解。在Wnt配體存在下，Wnt與捲曲受體(Frizzled)及LRP5之結合導致細胞質效應蛋白Dvl之募集及LRP5胞質尾區之磷酸化，此為Axin提供停泊位點。LRP5螯合Axin導致Axin-APC-GSK3β複合物之鈍化，且因此導致細胞內β-連環蛋白穩定化及累積。因此，β-連環蛋白之細胞質含量上升，且β-連環蛋白遷移至細胞核並與轉錄因子之T細胞因子(TCF)/淋巴增強子結合因子(LEF)家族之成員複合。然後募集基礎轉錄機(basal transcription machinery)及轉錄輔活化因子(co-activator)，包括cAMP反應元件結合蛋白(CREB)結合蛋白(CBP)或其同系物p300，從而導致各種靶基因(包括Axin2、cyclin D1及c-Myc)之表現。
額外程度之配體依賴性Wnt路徑調控由E3連接酶RNF43及其密切相關之同系物ZNRF3及由分泌之R-Spondin蛋白介導(de Lau等人，「The R-spondin/Lgr5/Rnf43 module: regulator of Wnt signal strength」.Genes Dev . 2014;28(4):305-16)。RNF43介導細胞表面處捲曲受體/LRP5受體複合物之泛素化，從而導致其降解且藉此抑制配體依賴性Wnt路徑活性。RNF43之活性由R spondin家族成員(R-spondin 1至4配體)抵消。當R-Spondin配體存在時，其自細胞表面去除RNF43，從而容許在Wnt配體存在之情形下捲曲受體/LRP5複合物累積且Wnt訊息傳導增強。
LRP5作為配體依賴性Wnt訊息傳導活化之看門者起作用，且因此可視為為達成由所有19種Wnt配體及10種捲曲受體介導且由R-spondin配體增強之路徑之完全阻斷的靶標。具體而言，Wnt配體可分成Wnt1類及Wnt3a類，其各自結合至LRP5之不同表位/區用於訊息傳導。LRP5之胞外結構域包含連結至EGF樣結構域之β-螺旋槳之四個重複單元，之後為三個LDLR A型重複序列(repeat)。對LRP5之組合結構及功能分析顯示，Wnt1 (Wnt1類配體)結合至含有β-螺旋槳1及2之片段且Wnt3a結合至含有β-螺旋槳3及4之片段。
LRP5及干擾LRP5活性之試劑已在各種適應症之背景下闡述，該等適應症包括骨病症、脂質調節病症、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、類風濕性關節炎及胰島素依賴性糖尿病(例如，參見WO2002/092015、WO2006/102070、WO2009/155055及WO1998/046743)。
Wnt訊息傳導之超活化進一步涉及各種類型癌症之發病機制。在一些癌症類型中，下游訊息傳導分子中之頻繁突變促成組成型活化之Wnt路徑(例如結腸直腸癌中之APC突變；肝細胞癌中之β-連環蛋白活化突變)。相比之下，在三陰性乳癌(TNBC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、胰臟腺癌中及在結腸直腸癌(CRC)及子宮內膜癌之子組中，Wnt訊息傳導活化係由配體依賴性機制(即藉由自分泌/旁分泌Wnt活化)驅動，如藉由β-連環蛋白細胞內累積所檢測。在NSCLC、TNBC及胰臟腺癌中，配體依賴性Wnt活化係由多種機制介導，包括Wnt配體及/或LRP5受體之表現增加或LRP5負調節劑DKK1之沉默(TNBC：Khramtsov等人，「Wnt/beta-catenin pathway activation is enriched in basal-like breast cancers and predicts poor outcome」.Am J Pathol . 2010; 176(6): 2911-20；NSCLC：Nakashima等人，「Wnt1 overexpression associated with tumor proliferation and a poor prognosis in non-small cell lung cancer patients」.Oncol Rep. 2008; 19(1):203-9；胰臟癌：Zhang等人，「Canonical wnt signaling is required for pancreatic carcinogenesis」.Cancer Res . 2013; 73(15):4909-22)。腫瘤中之配體依賴性Wnt活化顯示驅動腫瘤生長及對化學療法或免疫療法之抗性，且與臨床前模型中之復發相關。
能夠調節Wnt訊息傳導路徑之一些LRP5結合性分子為業內所已知：
Dickkopf-1 (DKK1)係LRP5抑制劑。DKK1與LRP5締合且跨膜蛋白Kremen抑制Wnt訊息傳導且導致快速LRP5內化。顯示DKK1抑制Wnt1及Wnt3a介導之訊息傳導二者。
進一步顯示，活體內DKK1處理在胃腸道中引起嚴重毒性。具體而言，顯示腺病毒介導之DKK1在成年小鼠中之表現顯著抑制在小腸及結腸中之增殖，伴隨進行性架構變性、嚴重體重減輕及因結腸炎及全身性感染之死亡。具體而言，LRP5在腸中在增殖性上皮細胞中表現且為腸上皮之增殖所必需，此表明LRP5抑制可對此及其他正常組織有毒(Zhong等人，「Lrp5及Lrp6 play compensatory roles in mouse intestinal development」.J Cell Biochem . 2012; 113(1):31-8)。此使得對抑制LRP5或通常抑制Wnt (Wnt1及Wnt3a)訊息傳導路徑之試劑是否可用於治療性目的(例如可開發為抗癌藥物)產生懷疑。
WO 1998/046743 A1揭示對LRP5具特異性之抗體且提出若干種用於產生此一抗體之LRP5肽。然而，未闡述關於產生此一抗體之實驗結果，亦未具體揭示此一抗體。
US9175090揭示抑制具有Apc表現缺陷之癌細胞中Wnt訊息傳導之方法，其係藉由投與單株抗體，特定而言結合LRP5之IgM抗體來實施。
WO2013/109819揭示抗LRP5抗體，尤其增強Norrin活性及/或Norrin/Fzd4訊息傳導之抗體，及其在治療與血管生成相關之病狀中之用途。
然而，迄今為止，業內所闡述之LRP5結合性分子均未經衛生當局授權用作治療任何疾病之藥劑。特定而言，此用途需要極特異之結合性質、正確之特異性，使得此等分子結合或不結合、活化或抑制其他靶標(例如導致其他訊息傳導路徑之不期望活化或抑制，或對靶標同種型缺乏活化或抑制)，在雙特異性或多特異性試劑之情形下，兩種或更多種結合特異性之間的正確平衡、適宜藥物動力學及藥效學性質、可接受之毒物學特徵及當然活體內效能。
鑒於以上，業內需要容許對若干類型之癌症疾病及腫瘤有效治療之新穎治療劑。因此，本發明之目標係提供此等藥理學活性劑，其可用於治療若干種癌症疾病，包括NSCLC及TNBC。
具體而言，本發明之目標係提供此等藥理學活性劑、組合物及/或治療方法，其與目前所使用及/或業內已知之試劑、組合物及/或方法相比提供某些優點。該等優點包括活體內效能、改良之治療及藥理學性質、較少之副作用及其他有利性質，例如改良之易製備性或降低之商品成本，尤其與業內已知之候選藥物相比。
根據本發明之第一態樣，本發明提供結合至低密度脂蛋白受體樣蛋白5 (LRP5)之多肽，該多肽包含選自由以下LRP5結合性免疫球蛋白單一可變結構域(ISVD) (i)至(iv)組成之群之ISVD：(i) 具有以下互補性決定區(CDR)序列之ISVD： CDR1：TYVMG (SEQ ID NO:1) CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:2) CDR3：SRGTSTPSRASGVSRYDY (SEQ ID NO:3)， (ii) 具有以下CDR序列之ISVD： CDR1：RYAVA (SEQ ID NO:4) CDR2：AITWSSGRIDYADSVKG (SEQ ID NO:5) CDR3：DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY (SEQ ID NO:6)， (iii) 具有以下CDR序列之ISVD： CDR1：IGAMG (SEQ ID NO:7) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)，及 (iv) 具有以下CDR序列之ISVD： CDR1：INAMG (SEQ ID NO:10) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)。
在此態樣中，本發明之多肽較佳包含第一ISVD (a)，其選自如上文所定義之ISVD (i)及(ii)，及第二ISVD (b)，其選自如上文所定義之ISVD (iii)及(iv)。甚至更佳地，ISVD (i)-(iv)中之一或多者分別藉由包含以下序列來定義：(i) AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSTYVMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAASRGTSTPSRASGVSRYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:11)，或 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGRTFSTYVMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAASRGTSTPSRASGVSRYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:23)、 (ii) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSRYAVAWFRQAPGKEREFVAAITWSSGRIDYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADRRPRSTGRSGTGSPSTYDYWGQGTLVTVSSA (SEQ ID NO:12)、 (iii) AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFRIGAMGWYRQAPGKQRELVAAVSSGGSTYYVDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNRETGPYGPPKRDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:13)，或 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFRIGAMGWYRQAPGKQRELVAAVSSGGSTYYVDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNRETGPYGPPKRDYWGQGTLVTVSSA (SEQ ID NO:22)，及 (iv) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFRINAMGWYRQAPGKQRELVAAVSSGGSTYYVDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNRETGPYGPPKRDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:14)。
如本文所使用，關於此等ISVD或結構域之術語「第一」及「第二」通常僅意欲指示該等結構域係兩個不同的結構域(此乃因其將至少包括不同之CDR序列)。因此，該等術語不應理解為係指此多肽鏈內之結構域之確切次序或順序。換言之，以上ISVD (a)及(b)可在本文所闡述之多肽內以次序(a)-(b)或以次序(b)-(a)排列。
在一些實施例中，本文所闡述之多肽包含-第一ISVD (a)，其包含以下CDR序列： CDR1：TYVMG (SEQ ID NO:1) CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:2) CDR3：SRGTSTPSRASGVSRYDY (SEQ ID NO:3)，及 -第二ISVD (b)，其包含以下CDR序列： CDR1：IGAMG (SEQ ID NO:7) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)。
在一些實施例中，本文所闡述之多肽包含-第一ISVD (a)，其包含以下CDR序列： CDR1：TYVMG (SEQ ID NO:1) CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:2) CDR3：SRGTSTPSRASGVSRYDY (SEQ ID NO:3)，及 -第二ISVD (b)，其包含以下CDR序列： CDR1：INAMG (SEQ ID NO:10) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)。
在一些實施例中，本文所闡述之多肽包含-第一ISVD (a)，其包含以下CDR序列： CDR1：RYAVA (SEQ ID NO:4) CDR2：AITWSSGRIDYADSVKG (SEQ ID NO:5) CDR3：DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY (SEQ ID NO:6)，及 -第二ISVD (b)，其包含以下CDR序列： CDR1：IGAMG (SEQ ID NO:7) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)。
在一些實施例中，本文所闡述之多肽包含-第一ISVD (a)，其包含以下CDR序列： CDR1：RYAVA (SEQ ID NO:4) CDR2：AITWSSGRIDYADSVKG (SEQ ID NO:5) CDR3：DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY (SEQ ID NO:6)，及 -第二ISVD (b)，其包含以下CDR序列： CDR1：INAMG (SEQ ID NO:10) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)。
特定而言，本文所闡述多肽之ISVD (例如包含如上文所定義之CDR序列之ISVD)係VHH結構域，較佳人類化VHH結構域。
在一些實施例中，本文所闡述多肽之ISVD (i)包含SEQ ID NO:11之序列或SEQ ID NO:23之序列。在一些實施例中，ISVD (ii)包含SEQ ID NO:12之序列。在一些實施例中，ISVD (iii)包含SEQ ID NO:13之序列或SEQ ID NO:22之序列。在一些實施例中，ISVD (iv)包含SEQ ID NO:14之序列。
特定而言，本文所闡述之多肽包含第一ISVD (a)及第二ISVD (b)，該第一ISVD包含選自由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:23組成之群之序列，且該第二ISVD包含選自由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:22組成之群之序列。在一些實施例中，該第一ISVD包含SEQ ID NO:11之序列且該第二ISVD包含SEQ ID NO:22之序列。在一些實施例中，該第一ISVG包含SEQ ID NO:12之序列且該第二ISVD包含SEQ ID NO:13之序列。在一些實施例中，該第一ISVD包含SEQ ID NO:23之序列，且該第二ISVD包含SEQ ID NO:14之序列。在一些實施例中，該第一ISVD包含SEQ ID NO:11之序列且該第二ISVD包含SEQ ID NO:14之序列。在一些實施例中，該第一ISVD包含SEQ ID NO:11之序列且該第二ISVD包含SEQ ID NO:13之序列。在一些實施例中，該第一ISVD包含SEQ ID NO:12之序列且該第二ISVD包含SEQ ID NO:14之序列。在一些實施例中，該第一ISVD包含SEQ ID NO:12之序列且該第二ISVD包含SEQ ID NO:22之序列。在一些實施例中，該第一ISVD包含SEQ ID NO:23之序列且該第二ISVD包含SEQ ID NO:22之序列。在一些實施例中，該第一ISVD包含SEQ ID NO:23之序列且該第二ISVD包含SEQ ID NO:13之序列。
根據一個態樣，本文所闡述多肽之第一ISVD及第二ISVD由連接體肽共價連接，其中該連接體肽視情況包含第三ISVD (例如白蛋白結合性ISVD)或由其組成。
根據另一態樣，本文所闡述之多肽進一步包含半衰期延長部分體，其共價連接至該多肽且視情況選自由以下組成之群：白蛋白結合性部分體(例如白蛋白結合性肽或白蛋白結合性免疫球蛋白結構域)、運鐵蛋白結合性部分體(例如抗運鐵蛋白免疫球蛋白結構域)、聚乙二醇分子、人類血清白蛋白及人類血清白蛋白之片段。特定而言，半衰期延長部分體係包含以下序列之白蛋白結合性部分體，較佳白蛋白結合性ISVD，甚至更佳Alb11結構域：EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS (SEQ ID NO:21) 根據較佳態樣，本文所闡述之多肽包含第一(a)及第二(b) LRP5結合性ISVD及第三ISVD (c) (例如，白蛋白結合性ISVD (c))； -該第一LRP5結合性ISVD (a)係選自由ISVD (i)及(ii)組成之群： (i) 包含以下CDR序列之ISVD： CDR1：TYVMG (SEQ ID NO:1) CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:2) CDR3：SRGTSTPSRASGVSRYDY (SEQ ID NO:3)，及 (ii) 包含以下CDR序列之ISVD： CDR1：RYAVA (SEQ ID NO:4) CDR2：AITWSSGRIDYADSVKG (SEQ ID NO:5) CDR3：DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY (SEQ ID NO:6)， -該第二ISVD (b)係選自由ISVD (iii)及(iv)組成之群： (iii) 包含以下CDR序列之ISVD： CDR1：IGAMG (SEQ ID NO:7) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)，及 (iv) 包含以下CDR序列之ISVD： CDR1：INAMG (SEQ ID NO:10) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)，及 -該白蛋白結合性ISVD (c)藉由包含以下CDR序列來定義： CDR1：SFGMS (SEQ ID NO:15) CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:16) CDR3：GGSLSR (SEQ ID NO:17)。
舉例而言，多肽包含如由以上CDR序列所定義之第一及第二ISVD以及第三ISVD，該第三ISVD係如由以上CDR序列所定義之白蛋白結合性ISVD且其直接或間接地連接該第一及該第二ISVD。在一些實施例中，該第一ISVD經由肽連接體共價連接至該第三ISVD，該第三ISVD經由肽連接體共價連接至該第二ISVD。如上所述之術語「第一」及「第二」並不指示其在多肽內之位置，因此自N至C末端，多肽內之ISVD序列可以以下次序排列：ISVD (a)-(c)-(b)、(a)-[連接體]-(c)-[連接體]-(b)、(b)-(c)-(a)、(b)-[連接體]-(c)-[連接體]-(a)。
在一些實施例中，多肽包含 -第一ISVD，其包含以下CDR序列： CDR1：TYVMG (SEQ ID NO:1) CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:2) CDR3：SRGTSTPSRASGVSRYDY (SEQ ID NO:3)， -第二ISVD，其包含以下CDR序列： CDR1：IGAMG (SEQ ID NO:7) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)，及 -白蛋白結合性ISVD (第三ISVD)，其藉由包含以下CDR序列來定義： CDR1：SFGMS (SEQ ID NO:15) CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:16) CDR3：GGSLSR (SEQ ID NO:17)。
在一些實施例中，多肽包含 -第一ISVD，其包含以下CDR序列： CDR1：TYVMG (SEQ ID NO:1) CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:2) CDR3：SRGTSTPSRASGVSRYDY (SEQ ID NO:3)， -第二ISVD，其包含以下CDR序列： CDR1：INAMG (SEQ ID NO:10) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)，及 -白蛋白結合性ISVD，其藉由包含以下CDR序列來定義： CDR1：SFGMS (SEQ ID NO:15) CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:16) CDR3：GGSLSR (SEQ ID NO:17)。
在一些實施例中，多肽包含 -第一ISVD，其包含以下CDR序列： CDR1：RYAVA (SEQ ID NO:4) CDR2：AITWSSGRIDYADSVKG (SEQ ID NO:5) CDR3：DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY (SEQ ID NO:6)， -第二ISVD，其具有以下CDR序列： CDR1：IGAMG (SEQ ID NO:7) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)，及 -白蛋白結合性ISVD，其藉由包含以下CDR序列來定義： CDR1：SFGMS (SEQ ID NO:15) CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:16) CDR3：GGSLSR (SEQ ID NO:17)。
在一些實施例中，多肽包含 -第一ISVD，其包含以下CDR序列： CDR1：RYAVA (SEQ ID NO:4) CDR2：AITWSSGRIDYADSVKG (SEQ ID NO:5) CDR3：DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY (SEQ ID NO:6)， -第二ISVD，其包含以下CDR序列： CDR1：INAMG (SEQ ID NO:10) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)，及 -白蛋白結合性ISVD，其藉由包含以下CDR序列來定義： CDR1：SFGMS (SEQ ID NO:15) CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:16) CDR3：GGSLSR (SEQ ID NO:17)。
在一些實施例中，如由以上多肽中之其CDR序列所定義之ISVD經排列使得白蛋白結合性ISVD直接地或間接地(例如經由連接體肽)連接該第一及該第二ISVD。
在一些實施例中，本文所闡述之多肽包含選自SEQ ID NO: 18、19及20之序列或由其組成。
在另一態樣中，本發明係關於結合至LRP5之多肽，其包含與參考ISVD競爭結合至LRP5之ISVD，其中該參考ISVD具有由SEQ ID NO: 11、12、13、14、22或23所鑑別之序列。
在另一態樣中，本發明係關於結合至LRP5之多肽，其包含與第一參考ISVD競爭結合至LRP5之第一ISVD (a)，其中該第一參考ISVD具有由SEQ ID NO: 11、23或12所鑑別之序列，及與第二參考ISVD競爭結合至LRP5之第二ISVD (b)，其中該第二參考ISVD具有由SEQ ID NO: 13、22或14所鑑別之序列。
在另一態樣中，本發明係關於結合至LRP5之多肽，其包含第一LRP5結合性結構域，較佳ISVD，及第二LRP5結合性結構域，較佳ISVD，其中該第一結構域所結合之LRP5之區不同於該第二結構域所結合之LRP5區。根據較佳實施例，該第一LRP5結合性結構域阻斷LRP5之Wnt3a結合位點，且較佳抑制Wnt3a驅動之靶基因轉錄，及/或其中該第二LRP5結合性結構域阻斷LRP5之Wnt1結合位點，且較佳抑制Wnt1驅動之靶基因轉錄。
根據其他態樣，本發明係關於用於本發明之多肽產生中之核酸分子、表現載體、宿主細胞及製造方法。編碼本發明多肽之核酸分子可以分離形式用於構築各別表現載體，然後將其轉染至用於本發明多肽之生物醫藥生產之宿主細胞中。此製造方法通常包含以下步驟：在容許多肽表現之條件下培養宿主細胞，回收該多肽且根據業內已知之方法將其純化。
涉及本發明之多肽之其他態樣、實施例、用途及方法將自本發明之以下詳細說明及隨附申請專利範圍變得顯而易見。
本發明提供新穎分子，其容許以較少副作用更有效地治療若干種癌症類型，例如TNBC、CRC及NSCLC。本發明之多肽在癌症患者之治療中提供令人驚訝之治療效應(即效能)，此乃因其可誘導腫瘤消退，從而導致病理完全反應(pCR)。進而預期此使得無進展存活及總體存活顯著改良，尤其在高未滿足醫學需求適應症(例如乳癌)中。因此，本發明之多肽在若干種癌症類型，尤其顯示失調Wnt訊息傳導路徑及β-連環蛋白累積之彼等之治療中提供新穎治療選項。
此外，本發明之多肽易於製造，具有高穩定性及低抗原性，且除注射及輸注以外提供關於投與途徑之多種選項。
定義 本發明之以上及其他態樣及實施例將自本文之進一步說明變得顯而易見，其中： a) 除非另有指示或定義，否則所使用之所有術語具有其在此項技術中之通常含義，該等含義為熟習此項技術者所明瞭。舉例而言，參考標準手冊，例如Sambrook等人，「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」 (第2版), 第 1-3卷, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)；Lewin，「Genes IV」, Oxford University Press, New York, (1990)及Roitt等人，「Immunology」 (第2版), Gower Medical Publishing, London, New York (1989)以及本文中所引用之一般背景技術。此外，除非另有指示，否則未明確詳細闡述之所有方法、步驟、技術及操縱均可實施且已以本身已知之方式實施，如熟習此項技術者所明瞭。再次參考例如標準手冊、上文所提及之一般背景技術及其中所引用之其他參考文獻。 b) 除非另有指示，否則術語「免疫球蛋白 」及「免疫球蛋白序列 」 (不論在本文中用於指重鏈抗體 抑或習用 4 鏈抗體 )係用作通用術語以包括全長抗體、其個別鏈二者以及其所有部分、結構域或片段(包括(但不限於)抗原結合結構域或片段，分別例如VHH結構域或VH/VL結構域)。另外，除非上下文需要更有限之解釋，否則如本文所使用之術語「序列」(例如在諸如「免疫球蛋白序列」、「抗體序列」、「(單一)可變結構域序列」、「VHH序列」或「蛋白質序列」等術語中)通常應理解為包括相關胺基酸序列以及編碼該胺基酸序列之核酸序列或核苷酸序列二者； c) 如本文所使用之術語(多肽或蛋白質之)「結構域 」係指摺疊蛋白質結構，其具有獨立於蛋白質之其餘部分保留其三級結構之能力。通常，結構域負責蛋白質之離散功能性質，且在許多情形下可添加、移除或轉移至其他蛋白質而不損失蛋白質之剩餘部分及/或結構域之功能。 d) 如本文所使用之術語「免疫球蛋白結構域 」係指抗體鏈(例如習用4鏈抗體或重鏈抗體之鏈)之球形區，或係指基本上由此一球形區組成之多肽。免疫球蛋白結構域之特徵在於其保留抗體分子之免疫球蛋白摺疊特性，其由以2個β片排列且視情況由保守二硫鍵穩定之約7條反平行β鏈之2層夾層組成。 e) 如本文所使用之術語「免疫球蛋白可變結構域 」意指基本上由4個「框架區」組成之免疫球蛋白結構域，該等框架區在業內及下文中分別稱為「框架區1」或「FR1」；「框架區2」或「FR2」；「框架區3」或「FR3」；及「框架區4」或「FR4」；該等框架區雜有3個「互補性決定區」或「CDR」，其在業內及下文中分別稱為「互補性決定區1」或「CDR1」；「互補性決定區2」或「CDR2」；及「互補性決定區3」或「CDR3」。因此，免疫球蛋白可變結構域之通用結構或序列可如下指示：FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4。免疫球蛋白可變結構域藉由攜帶抗原結合位點賦予抗體對抗原之特異性。 f) 如本文所使用之術語「免疫球蛋白單一可變結構域 」(或ISVD)意指能夠特異性結合至抗原之表位而不與額外可變免疫球蛋白結構域配對之免疫球蛋白可變結構域。本發明含義中之ISVD之一個實例係「結構域抗體 」，例如ISVD VH及VL (VH結構域及VL結構域)。ISVD之另一重要實例係來自駱駝科動物之「VHH 結構域 」(或簡稱為「VHH」)，如下文所定義。
鑒於以上定義，習用4鏈抗體(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；為業內所已知)或源自此習用4鏈抗體之Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段(例如二硫化物連接之Fv或scFv片段)或雙價抗體(所有均為業內所已知)之抗原結合結構域通常將不被視為ISVD，此乃因在該等情形下通常將不由一個(單一)免疫球蛋白結構域而是由一對(締合)免疫球蛋白結構域(例如輕鏈及重鏈可變結構域)，即由共同結合至各別抗原之表位的免疫球蛋白結構域之VH-VL對結合至抗原之各別表位。
f1) 「VHH 結構域 」亦稱為VHH、VH H結構域、VHH抗體片段及VHH抗體，其最初闡述為「重鏈抗體」(即「無輕鏈之抗體」；Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.：「Naturally occurring antibodies devoid of light chains」; Nature 363, 446-448 (1993))之抗原結合免疫球蛋白(可變)結構域。選擇術語「VHH結構域」以區分該等可變結構域與習用4鏈抗體中存在之重鏈可變結構域(其在本文中稱為「VH 結構域」或「VH結構域」)及習用4鏈抗體中存在之輕鏈可變結構域(其在本文中稱為「VL 結構域」或「VL結構域」)。VHH結構域可在無額外抗原結合結構域之情形下特異性結合至表位(與習用4鏈抗體中之VH或VL結構域相反，在該情形下由VL結構域與VH結構域一起識別表位)。VHH結構域係由單一免疫球蛋白結構域形成之小的、穩健且有效之抗原識別單元。
在本發明之上下文中，術語VHH結構域、VHH、VH H結構域、VHH抗體片段、VHH抗體以及「Nanobody® 」及「Nanobody® 結構域」(「Nanobody」為公司Ablynx N.V.; Ghent; Belgium之商標)可互換使用且係ISVD (具有結構FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4且特異性結合至表位而無需第二免疫球蛋白可變結構域之存在)之代表，且其亦可藉由如(例如) WO2009/109635之圖1中所定義之所謂的「標誌殘基」與VH結構域區分。
VHH結構域之胺基酸殘基係根據由Kabat等人(「Sequence of proteins of immunological interest」, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, 公開案第91號)所給出之針對VH 結構域之通用編號進行編號，如適於來自駱駝科動物之VHH結構域，如(例如) Riechmann及Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999)之圖2中所示。根據此編號方式，- FR1包含在位置1-30處之胺基酸殘基， - CDR1包含在位置31-35處之胺基酸殘基， - FR2包含在位置36-49處之胺基酸， - CDR2包含在位置50-65處之胺基酸殘基， - FR3包含在位置66-94處之胺基酸殘基， - CDR3包含在位置95-102處之胺基酸殘基，且 - FR4包含在位置103-113處之胺基酸殘基。
然而，應注意，如業內對於VH 結構域及VHH結構域所熟知，每一CDR中之胺基酸殘基的總數量可有所變化且可不對應於由Kabat編號指示之胺基酸殘基的總數量(亦即，根據Kabat編號之一或多個位置在實際序列中可未被佔據，或實際序列可含有多於Kabat編號所容許數量之胺基酸殘基)。此意味著，一般而言，根據Kabat之編號可對應於或可不對應於實際序列中之胺基酸殘基之實際編號。
業內已知對VH 結構域之胺基酸殘基進行編號之替代方法，該等方法亦可以類似方式應用於VHH結構域。然而，除非另有指示，否則在本發明說明、申請專利範圍及圖中，將遵循如上文所闡述根據Kabat且應用於VHH結構域之編號。
VHH結構域中之胺基酸殘基之總數量通常將在110至120範圍內，經常介於112與115之間。然而，應注意，較小且較長序列亦可適於本文所闡述之目的。
VHH結構域及含有其之多肽之其他結構特性及功能性質可匯總如下：VHH結構域(其本質上經「設計」以在輕鏈可變結構域不存在且不與輕鏈可變結構域具有任何相互作用之情形下功能性結合至抗原)可作為相對較小之單一功能性抗原結合結構單元、結構域或多肽起作用。此將VHH結構域與習用4鏈抗體之VH及VL結構域區分開，該等習用4鏈抗體之VH及VL結構域本身通常並不適於作為單一抗原結合蛋白或ISVD用於實際應用，而是需要以某種形式組合以提供功能性抗原結合單元(如在(例如)習用抗體片段(例如Fab片段)中；在scFv中，其由共價連接至VL結構域之VH結構域組成)。
由於該等獨特性質，使用VHH結構域(單獨或作為較大多肽之一部分)提供多種優於使用習用VH及VL結構域、scFv或習用抗體片段(例如Fab-或F(ab')2-片段)之顯著優點：-僅需要單一結構域以高親和力(affinity)及高選擇性結合抗原，從而使得既不需要存在兩個單獨結構域，亦不需要確保該兩個結構域以正確空間構象及構形存在(即與scFv一般，藉助使用經特別設計之連接體)； - VHH結構域可自單一基因表現且不需要轉譯後摺疊或修飾； - VHH結構域可容易地改造成多價及多特異性形式(如本文所進一步論述)； - VHH結構域高度可溶且不具有聚集之趨勢(正如Ward等人，Nature 341: 544-546 (1989)所闡述之小鼠源抗原結合結構域)； - VHH結構域對熱、pH、蛋白酶及其他變性劑或條件高度穩定，且因此可在不使用冷凍設備之情形下製備、儲存或運輸，從而節省成本、時間及環境； -即使在生產所需規模上，VHH結構域亦易於製備且花費相對較少。舉例而言，正如例如習用抗體片段，VHH結構域及含有其之多肽可使用微生物發酵(例如如下文所進一步闡述)來產生且不需要使用哺乳動物表現系統； -與習用4鏈抗體及其抗原結合片段相比，VHH結構域相對較小(大約15 kDa，或較習用IgG小10倍)，且因此 --顯示進入組織中之(較)高滲透性且 --可以高於此等習用4鏈抗體及其抗原結合片段之劑量投與； - VHH結構域可顯示所謂的空腔結合性質(尤其由於與習用VH結構域相比其延長之CDR3環)，且因此亦可及習用4鏈抗體及其抗原結合片段不可及之靶標及表位。
先前已闡述獲得結合至特定抗原或表位之VHH結構域之方法，例如於WO2006/040153及WO2006/122786中。亦如其中所詳細闡述，源自駱駝科動物之VHH結構域可藉由用來自人類習用4鏈抗體之VH結構域中之相應位置處出現之一或多個胺基酸殘基替代初始VHH序列之胺基酸序列中之一或多個胺基酸殘基來「人類化」。人類化VHH結構域可含有一或多個全人類框架區序列，且在甚至更特定之實施例中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51或其部分之人類框架區序列，其視情況與JH序列(例如JH5)組合。
f2) 「結構域抗體 」亦稱為「Dab」、「結構域抗體」及「dAb」(術語「結構域抗體」及「dAb」由GlaxoSmithKline公司集團用作商標)，其已闡述於(例如) Ward, E.S.等人：「Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli」; Nature 341: 544-546 (1989)；Holt, L.J.等人：「Domain antibodies: proteins for therapy」；TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003)；及WO2003/002609中。
結構域抗體基本上對應於非駱駝科哺乳動物之VH或VL結構域，尤其人類4鏈抗體。為結合作為單一抗原結合結構域之表位(即不與VL或VH結構域分別配對)，需要對此等抗原結合性質進行特異性選擇，例如藉由使用人類單一VH或VL結構域序列之庫來實施。
如同VHH，結構域抗體具有大約13 kDa至大約16 kDa之分子量，且若源自全人類序列，則不需要針對(例如)人類中之治療用途進行人類化。如在VHH結構域之情形下，其亦在原核表現系統中充分表現，從而顯著降低整體製造費用。
可藉由在一或多個CDR之胺基酸序列中引入一或多個改變使結構域抗體以及VHH結構域經受親和力成熟，與各別母體分子相比，該等改變導致所得ISVD對其各別抗原之親和力改良。本發明之親和力成熟ISVD分子可藉由業內已知之方法來製備，例如如由Marks等人，1992, Biotechnology 10:779-783或Barbas等人，1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813.；Shier等人，1995, Gene 169:147-155；Yelton等人，1995, Immunol. 155: 1994-2004；Jackson等人，1995, J. Immunol. 154 (7):3310-9；及Hawkins等人，1992, J. MoI. Biol. 226(3): 889 896；KS Johnson及RE Hawkins，「Affinity maturation of antibodies using phage display」, Oxford University Press 1996所闡述。
f3) 此外，熟習此項技術者亦應明瞭，可將上文所提及CDR中之一或多者「移植」至其他「支架」(包括(但不限於)人類支架或非免疫球蛋白支架)上。用於此CDR移植之適宜支架及技術為業內所已知。
g) 術語「表位 」及「抗原決定子 」可互換使用，其係指由抗原結合分子(例如習用抗體或本發明之多肽)且更具體而言由該等分子之抗原結合位點識別之巨分子(例如多肽)之部分。表位界定免疫球蛋白之最小結合位點，且因此代表免疫球蛋白之特異性之靶標。
抗原結合分子(例如習用抗體或本發明之多肽)中識別表位之部分稱為互補位 。
h) 如本文所使用之術語「雙互補位 」(抗原-)結合分子或「雙互補位」多肽應意指包含如本文所定義之第一ISVD及第二ISVD之多肽，其中該兩個可變結構域能夠結合至一種抗原之兩個不同表位，該等表位通常不由一種單特異性免疫球蛋白(例如習用抗體或一種ISVD)同時結合。根據本發明之雙互補位多肽係由具有不同表位特異性之可變結構域構成，且不含結合至相同表位之互補可變結構域對。因此，其不會相互競爭與LRP5之結合。
i) 可「結合 」、「結合至 」、「特異性結合 」或「特異性結合 至 」某一表位、抗原或蛋白質(或其至少一部分、片段或表位)且對其「具有親和力 」及/或「具有特異性 」之多肽(例如本發明之免疫球蛋白、抗體、ISVD、多肽或通常抗原結合分子或其片段)據稱「針對 (against 或directed against )」該表位、抗原或蛋白質或係關於此表位、抗原或蛋白質之「結合 」分子。
k) 通常，術語「特異性 」特定抗原結合分子或抗原結合蛋白(例如本發明之免疫球蛋白、抗體、ISVD或多肽)可結合之不同類型抗原或表位之數量。抗原結合蛋白之特異性可基於其親和力及/或結合力(avidity)來測定。親和力由抗原與抗原結合蛋白之解離平衡常數(KD )表示，其係抗原結合蛋白上之表位與抗原結合位點之間的結合強度之量度：KD 值愈小，則表位與抗原結合分子之間的結合強度愈強(或者，親和力亦可表示為親和力常數(KA )，其係1/KD )。如熟習此項技術者所明瞭(例如，基於本文之其他揭示內容)，親和力可以本身已知之方式測定，此取決於所關注之特定抗原。結合力係抗原結合分子(例如本發明之免疫球蛋白、抗體、ISVD或多肽)與有關抗原之間的結合強度之量度。結合力與抗原結合分子上之表位與其抗原結合位點之間的親和力及抗原結合分子上存在之有關結合位點的數量二者有關。
通常，抗原結合蛋白(例如本發明之多肽)將以10E-5至10E-14莫耳/公升(M)或更小、且較佳10E-7至10E-14莫耳/公升(M)或更小，更佳10E-8至10E-14莫耳/公升且甚至更佳10E-11至10E-13之解離常數(KD ) (如Kinexa分析中所量測；為業內所已知)及/或至少10E7 ME-1，較佳至少10E8 ME-1，更佳至少10E9 ME-1 (例如至少10E11 ME-1)之締合常數(KA )結合。通常將大於10E-4 M之任一KD 值視為指示非特異性結合。較佳地，本發明之多肽將以小於500 nM，較佳小於200 nM，更佳小於10 nM (例如小於500 pM)之KD 結合至期望抗原。抗原結合蛋白與抗原或表位之特異性結合可以本身已知之任一適宜方式來測定，包括(例如)本文所闡述之分析、Scatchard分析及/或競爭性結合分析，例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夾心競爭分析及業內本身已知之其不同變化形式。
l) 與能夠結合至LRP5以及LRP6 (「LRP5/LRP6 交叉反應 」)之結合分子相關之術語「交叉反應 」意欲意指此等結合分子可特異性結合至LRP5分子中所包含之表位，且替代地可亦特異性結合至LRP6分子中所包含之表位。
m) 根據標準三字母或單字母胺基酸編碼指示胺基酸殘基，如業內通常所已知並認可。在比較兩種胺基酸序列時，術語「胺基酸差異 」係指與第二序列相比，所指示數量之胺基酸殘基在參考序列位置處之插入、缺失或取代。在一或多個取代之情形下，此(等)取代將較佳為保守胺基酸取代，此意指胺基酸殘基經具有類似化學結構且對多肽之功能、活性或其他生物學性質具有極小或基本上無影響之另一胺基酸殘基替代。此等保守胺基酸取代為業內(例如自WO 98/49185)所熟知，其中保守胺基酸取代較佳係以下群組(i) - (v)內之一個胺基酸由同一群組內之另一胺基酸殘基取代之取代：(i) 小的脂肪族、非極性或輕微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii) 極性、帶負電荷之殘基及其(不帶電荷之)醯胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii) 極性、帶正電荷之殘基：His、Arg及Lys；(iv) 大的脂肪族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v) 芳香族殘基：Phe、Tyr及Trp。尤佳之保守胺基酸取代係如下：Ala取代為Gly或取代為Ser； Arg取代為Lys； Asn取代為Gln或取代為His； Asp取代為Glu； Cys取代為Ser； Gln取代為Asn； Glu取代為Asp； Gly取代為Ala或取代為Pro； His取代為Asn或取代為Gln； Ile取代為Leu或取代為Val； Leu取代為Ile或取代為Val； Lys取代為Arg，取代為Gln或取代為Glu； Met取代為Leu，取代為Tyr或取代為Ile； Phe取代為Met，取代為Leu或取代為Tyr； Ser取代為Thr； Thr取代為Ser； Trp取代為Tyr； Tyr取代為Trp或取代為Phe； VaI取代為Ile或取代為Leu。
n) 舉例而言，當與獲得核酸或多肽分子之天然生物來源及/或反應介質或培養介質相比時，當核酸或多肽分子自通常在該來源或介質中與其締合之至少一種其他組分(例如另一核酸、另一蛋白質/多肽、另一生物組分或巨分子或至少一種污染物、雜質或次要組分)分離時，則將該核酸或多肽分子視為「( 呈) 基本上分離之( 形式) 」。具體而言，若核酸或多肽分子已純化至少2倍，尤其至少10倍、更尤其至少100倍且高達1000倍或更多倍，則將其視為「基本上分離」。「呈基本上分離之形式」之核酸或多肽分子較佳基本上均勻，如使用適宜技術(例如適宜層析技術，例如聚丙烯醯胺凝膠電泳)所測定；
o) 例如兩個ISVD序列之間的「序列一致性 」指示該兩個序列之間相同胺基酸之百分比。其可如WO2008/020079之第49頁及第50頁上之段落f)中所闡述進行計算或測定。「序列相似性 」指示一致之胺基酸百分比或代表保守胺基酸取代之胺基酸百分比。
靶標特異性 本發明之多肽對LRP5具有特異性，此乃因其通常包含特異性結合至LRP5表位之ISVD。在較佳情況下，本發明之多肽對LRP5，尤其人類LRP5之親和力及/或結合力為其對LRP6，尤其人類LRP6 (登錄號：UniProtKB - O75581 / LRP6_HUMAN)之親和力及/或結合力的至少10倍，較佳地至少100倍，更佳地至少1000倍，甚至更佳地至少10000倍，又甚至更佳地至少100000倍或至少1000000倍。最佳地，多肽不與LRP6，尤其人類LRP6交叉反應(參見實例7.1)。
本發明之分子應結合至LRP5之人類形式，且較佳地亦結合至與藥物開發相關之其他物種中之對應體，即食蟹猴及小鼠LRP5。
本發明之多肽 在其最廣義上，本發明提供用於治療癌症疾病之新穎藥理學活性劑。根據本發明之典型製劑屬一類新穎結合分子，即雙互補位多肽，其包含兩個或更多個ISVD，可結合至不同表位之LRP5。術語「雙互補位」在上文中已解釋，因此雙互補位分子之定義為能夠與LRP5蛋白中所包含之兩個不同表位處之LRP5結合之分子。
在一態樣中，本發明之多肽包含第一LRP5結合性結構域及第二LRP5結合性結構域，其中該第一結構域所結合之LRP5之區不同於該第二結構域所結合之LRP5區。此LRP5結合性結構域可係任何免疫球蛋白結構域，例如本文所闡述之任何免疫球蛋白結構域。較佳地，此LRP5結合性結構域係ISVD。
在一實施例中，該第一結構域阻斷LRP5之Wnt3a結合位點，且較佳抑制Wnt3a驅動之靶基因轉錄，及/或其中該第二結構域阻斷LRP5之Wnt1結合位點，且較佳抑制Wnt1驅動之靶基因轉錄。
換言之，本發明之多肽可包括：-第一ISVD，其能夠經由表位/以導致Wnt3a訊息傳導路徑抑制之方式特異性結合至LRP5，從而使得Wnt3a驅動之靶基因轉錄受抑制，及 -第二ISVD，其能夠經由表位/以導致Wnt1訊息傳導路徑抑制之方式特異性結合至LRP5，從而使得Wnt1驅動之靶基因轉錄受抑制。
由於上文所闡述多肽中存在之兩個ISVD，其中該兩個結構域結合至不同表位(Wnt1 / Wnt3a訊息傳導相關)，因此該等分子係雙互補位結合分子。此雙互補位結合模式示意性地示於圖1中。
在此背景下，應注意，假定本發明之多肽可經由其兩個LRP5結合性結構域結合至一個單一LRP5分子，如圖1中所示(分子內結合模式)。然而，亦可出現其他結合模式。
最終，假定本發明之多肽能夠與DKK1 (LRP5之天然配體，且干擾Wnt1及Wnt3a訊息傳導)競爭結合至LRP5，藉此抑制Wnt1以及Wnt3a訊息傳導路徑。然而，此理論亦不應理解為限制本發明之範圍。
特定而言，本發明提供結合至低密度脂蛋白受體樣蛋白5 (LRP5)之多肽，該多肽包含選自以下LRP5結合性ISVD之群之ISVD：(i) 具有以下互補性決定區(CDR)序列之ISVD： CDR1：TYVMG (SEQ ID NO:1) CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:2) CDR3：SRGTSTPSRASGVSRYDY (SEQ ID NO:3)、 (ii) 具有以下CDR序列之ISVD： CDR1：RYAVA (SEQ ID NO:4) CDR2：AITWSSGRIDYADSVKG (SEQ ID NO:5) CDR3：DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY (SEQ ID NO:6)、 (iii) 具有以下CDR序列之ISVD： CDR1：IGAMG (SEQ ID NO:7) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)，及 (iv) 具有以下CDR序列之ISVD： CDR1：INAMG (SEQ ID NO:10) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)。
本發明之多肽較佳包含第一ISVD (a)，其選自如上文所定義之ISVD (i)及(ii)，及第二ISVD (b)，其選自如上文所定義之ISVD (iii)及(iv)。在實施例中，該第一ISVD係ISVD (i)且該第二ISVD係ISVD (iii)。在另一實施例中，該第一ISVD係ISVD (i)且該第二ISVD係ISVD (iv)。在另一實施例中，該第一ISVD係ISVD (ii)且該第二ISVD係ISVD (iii)。在另一實施例中，該第一ISVD係ISVD (ii)且該第二ISVD係ISVD (iv)。較佳地，ISVD (i)藉由具有由SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:23鑑別之序列進一步定義，ISVD (ii)藉由具有由SEQ ID NO:12鑑別之序列進一步定義，ISVD (iii)藉由具有由SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:22鑑別之序列進一步定義，及/或ISVD (iv)藉由具有由SEQ ID NO:14鑑別之序列進一步定義。
關於此等ISVD使用術語「第一」及「第二」僅意欲指示該等結構域係不同結構域，此乃因其將包括不同之CDR序列且將結合至不同表位。然而，該等術語不應理解為係指此多肽鏈內結構域之確切次序或順序。換言之，以上ISVD可在本發明之此多肽內以次序(i)/(ii) - (iii)/(iv)或以次序(iii)/(iv) - (i)(ii)排列。
ISVD通常基本上由四個框架區(分別FR1至FR4)及三個互補性決定區(分別CDR1至CDR3)組成。為位於一個多肽或多肽鏈內，該第一及該第二ISVD需要直接地或藉由連接體肽(例如源自重鏈抗體鉸鏈區之連接體序列、聚-丙胺酸連接體序列、不同長度之Gly/Ser連接體或諸如此類)共價連接。
因此，本發明分子之通用結構亦可如下繪示：FR(a)1 - CDR(a)1 - FR(a)2 - CDR(a)2 - FR(a)3 - CDR(a)3 - FR(a)4 - [連接體肽] - FR(b)1 - CDR(b)1 - FR(b)2 - CDR(b)2 - FR(b)3 - CDR(b)3 - FR(b)4 其中 FR(a)表示第一ISVD之框架區， FR(b)表示第二ISVD之框架區， CDR(a)表示第一ISVD之CDR， CDR(b)表示第二ISVD之CDR， [連接體肽]表示可視情況存在之連接體肽， 較佳地，其中該等CDR具有如上文所陳述之序列(即(a)之CDR可係(i)或(ii)之CDR且(b)之CDR可係(iii)或(iv)之CDR)。
再次，應理解，(a)及(b)可交換，即本發明亦應涵蓋具有以下通用結構之分子FR(b)1 - CDR(b)1 - FR(b)2 - CDR(b)2 - FR(b)3 - CDR(b)3 - FR(b)4 - [連接體肽] - FR(a)1 - CDR(a)1 - FR(a)2 - CDR(a)2 - FR(a)3 - CDR(a)3 - FR(a)4。
連接體肽可包含胺基酸序列，例如具有9個或更多個胺基酸，較佳至少17個胺基酸(例如約20個至40個胺基酸)之長度。連接體序列可係天然序列或非天然序列。例示性連接體序列包括(但不限於)源自重鏈抗體鉸鏈區之連接體序列、聚-丙胺酸連接體序列及不同長度之Gly/Ser連接體(例如(glyx sery )z 連接體，例如(gly4 ser)3 、(gly4 ser)5 、(gly4 ser)7 、(gly3 ser)3 、(gly3 ser)5 、(gly3 ser)7 、(gly3 ser2 )3 、(gly3 ser2 )5 及(gly3 ser2 )7 )。
在較佳情況下，多肽進一步包含白蛋白結合性ISVD (例如作為第三ISVD)，較佳地且其中該白蛋白結合性ISVD將多肽之區段(該區段包含第一ISVD (例如如上文所定義之ISVD (i)或(ii))或由其組成)共價連接至多肽之區段(該區段包含第二ISVD (例如如上文所定義之ISVD (iii)或(iv))或由其組成)。換言之，連接體肽可將該第一ISVD共價連接至該第二ISVD，其中該連接體肽較佳地包含另一ISVD，更佳地白蛋白結合性ISVD，尤其如本文所述之白蛋白結合性ISVD或由其組成。
在一些實施例中，連接體肽包含第三結構域或由其組成，該第三結構域例如白蛋白結合性ISVD，例如Alb11結構域，其包含以下CDR：CDR(Alb11)1：SFGMS (= SEQ ID NO:15) CDR(Alb11)2：SISGSGSDTLYADSVKG (= SEQ ID NO:16) CDR(Alb11)3：GGSLSR (= SEQ ID NO:17) 此產生一組具有以下通用結構之本發明之多肽： FR(a)1 - CDR(a)1 - FR(a)2 - CDR(a)2 - FR(a)3 - CDR(a)3 - FR(a)4 - [連接體肽] - FR(Alb11)1 - CDR(Alb11)1 - FR(Alb11)2 - CDR(Alb11)2 - FR(Alb11)3 - CDR(Alb11)3 - FR(Alb11)4 - [連接體肽] - FR(b)1 - CDR(b)1 - FR(b)2 - CDR(b)2 - FR(b)3 - CDR(b)3 - FR(b)4，較佳地其中該等CDR具有如上文所陳述之序列(即(a)之CDR可係(i)或(ii)之CDR且(b)之CDR可係(iii)或(iv)之CDR)。
再次，該三個ISVD (a)、(b)及Alb11之次序並不固定，但其中以上結構域以以下次序排列之多肽： (b) - Alb11 - (a) 亦應涵蓋在內。
此外，本發明亦應涵蓋在多肽之N-或C-末端具有Alb11結構域之多肽(例如Alb11 - (a) - (b)、Alb11 - (b) - (a)、(a) - (b) - Alb11或(b) - (a) - Alb11)。
在三個較佳實施例中，本發明之多肽包括如以下所定義之ISVD：第一較佳實施例：多肽，其包含具有以下CDR序列之第一ISVD： CDR1：TYVMG (SEQ ID NO:1) CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:2) CDR3：SRGTSTPSRASGVSRYDY (SEQ ID NO:3)， 及具有以下CDR序列之第二ISVD： CDR1：INAMG (SEQ ID NO:10) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)。
第二較佳實施例：多肽，其包含具有以下CDR序列之第一ISVD：CDR1：RYAVA (SEQ ID NO:4) CDR2：AITWSSGRIDYADSVKG (SEQ ID NO:5) CDR3：DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY (SEQ ID NO:6)。 及具有以下CDR序列之第二ISVD： CDR1：IGAMG (SEQ ID NO:7) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9) 第三較佳實施例：多肽，其包含具有以下CDR序列之第一ISVD： CDR1：TYVMG (SEQ ID NO:1) CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:2) CDR3：SRGTSTPSRASGVSRYDY (SEQ ID NO:3) 及具有以下CDR序列之第二ISVD： CDR1：IGAMG (SEQ ID NO:7) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)。
當然，如上文所陳述之變體(即，視情況包括連接體肽(例如源自重鏈抗體鉸鏈區之連接體序列、聚-丙胺酸連接體序列、不同長度之Gly/Ser連接體或諸如此類)及/或其他結構域(尤其包括Alb11結構域，即不同次序之ISVD))亦應適用於該三個較佳實施例。
在尤佳實施例中，白蛋白結合性ISVD (例如Alb11)位於兩個LRP5結合性ISVD (ISVD (a)及(b))之間。因此，此等較佳多肽可具有結構(a) - Alb11 - (b)或(b) - Alb11 - (a)。特定而言，白蛋白結合性ISVD (例如Alb11)可以其N-及C-末端直接地或藉由連接體肽(例如源自重鏈抗體鉸鏈區之連接體序列、聚-丙胺酸連接體序列、不同長度之Gly/Ser連接體或諸如此類)共價結合至LRP5結合性ISVD結構域(a)及(b) (例如白蛋白結合性結構域之N-末端結合至ISVD (a)且白蛋白結合性結構域之C-末端結合至ISVD (b))或反之亦然，較佳地其中該等ISVD包含如上文所陳述之CDR或全長ISVD序列(即(a)之CDR/ISVD序列可係(i)或(ii)之CDR/ISVD序列，且(b)之CDR/ISVD序列可係(iii)或(iv)之CDR/ISVD序列)。
三個尤佳實施例可如下設想：第一尤佳實施例：多肽，其包含具有以下CDR序列之第一(LRP5結合性) ISVD： CDR1：TYVMG (SEQ ID NO:1) CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:2) CDR3：SRGTSTPSRASGVSRYDY (SEQ ID NO:3) 具有以下CDR序列之白蛋白結合性ISVD： CDR1：SFGMS (= SEQ ID NO:15) CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG (= SEQ ID NO:16) CDR3：GGSLSR (= SEQ ID NO:17)； 及具有以下CDR序列之第二(LRP5結合性) ISVD： CDR1：INAMG (SEQ ID NO:10) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)； 其按此次序，或以上結構域之次序經改變。
第二尤佳實施例：多肽，其包含具有以下CDR序列之第一(LRP5結合性) ISVD： CDR1：RYAVA (SEQ ID NO:4) CDR2：AITWSSGRIDYADSVKG (SEQ ID NO:5) CDR3：DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY (SEQ ID NO:6)； 具有以下CDR序列之白蛋白結合性ISVD： CDR1：SFGMS (= SEQ ID NO:15) CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG (= SEQ ID NO:16) CDR3：GGSLSR (= SEQ ID NO:17)； 及具有以下CDR序列之第二(LRP5結合性) ISVD： CDR1：IGAMG (SEQ ID NO:7) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)； 其按此次序，或以上結構域之次序經改變。
第三尤佳實施例：多肽，其包含具有以下CDR序列之第一(LRP5結合性) ISVD： CDR1：TYVMG (SEQ ID NO:1) CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:2) CDR3：SRGTSTPSRASGVSRYDY (SEQ ID NO:3)； 具有以下CDR序列之白蛋白結合性ISVD： CDR1：SFGMS (= SEQ ID NO:15) CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG (= SEQ ID NO:16) CDR3：GGSLSR (= SEQ ID NO:17)； 及具有以下CDR序列之第二(LRP5結合性) ISVD： CDR1：IGAMG (SEQ ID NO:7) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)； 其按此次序，或以上結構域之次序經改變。
上文所提及CDR序列匯總於表IA、IB及IC中：表 IA ：干擾Wnt3a訊息傳導之ISVD之CDR序列： 表 IB ：干擾Wnt1訊息傳導之ISVD之CDR序列： 表 IC ：結合至血清白蛋白之ISVD (Alb11結構域)之CDR序列：
除如上文所陳述之CDR序列以外，本發明之多肽中所包含之ISVD亦包括免疫球蛋白框架區(FR)序列。該等序列較佳在人類中不具有免疫原性，且因此較佳係人類或人類化FR序列。適宜人類或人類化FR序列為業內所已知。尤佳FR序列可取自下文所示之實施例，其揭示完整ISVD且藉此揭示CDR序列以及FR序列。
根據更特定之實施例，本發明之多肽包含為VHH結構域，且較佳人類化VHH結構域之ISVD (例如如由表IA至IC中所列示之CDR序列定義且形成如上文實施例中所陳述之ISVD (a)、(b)或(c)之ISVD)。特定而言，本文所闡述之多肽包含第一ISVD (a)，其包含(i)或(ii)之CDR序列，及第二ISVD (b)，其包含(iii)或(iv)之CDR序列，及第三ISVD，其係白蛋白結合性ISVD (例如Alb11)，該等ISVD係VHH結構域，且較佳人類化VHH結構域。
根據甚至更特定之實施例，本發明之多肽包括第一ISVD (a)，該第一ISVD (a)係選自由具有以下序列之ISVD (i)及(ii)組成之群：(i) AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSTYVMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAASRGTSTPSRASGVSRYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:11)，或 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGRTFSTYVMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAASRGTSTPSRASGVSRYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 23)，及 (ii) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSRYAVAWFRQAPGKEREFVAAITWSSGRIDYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADRRPRSTGRSGTGSPSTYDYWGQGTLVTVSSA (SEQ ID NO: 12)， 及第二ISVD (b)，該第二ISVD (b)係選自由具有以下序列之ISVD (iii)及(iv)組成之群： (iii) AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFRIGAMGWYRQAPGKQRELVAAVSSGGSTYYVDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNRETGPYGPPKRDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:13)，或 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFRIGAMGWYRQAPGKQREVAAVSSGGSTYYVDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYNRETGPYGPPKRDYWGQGTLVTVSSA (SEQ ID NO:22)，及 (iv) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFRINAMGWYRQAPGKQRELVAAVSSGGSTYYVDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNRETGPYGPPKRDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:14)。
較佳實施例係包含以下之多肽：-第一ISVD，該第一ISVD具有如SEQ ID NO:23中所示之胺基酸序列，及第二ISVD，該第二ISVD具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列；或 -第一ISVD，該第一ISVD具有如SEQ ID NO:12中所示之胺基酸序列，及第二ISVD，該第二ISVD具有如SEQ ID NO:13中所示之胺基酸序列；或 -第一ISVD，該第一ISVD具有如SEQ ID NO:11中所示之胺基酸序列，及第二ISVD，該第二ISVD具有如SEQ ID NO:22中所示之胺基酸序列。
因此，以上實施例可示意性地呈現為isvd(a) - [連接體肽] - isvd(b)， 其中「isvd」表示各別ISVD，且其中在其他情況下相同定義及變體應如上文所述適用，尤其關於可選連接體肽及/或其他結構域，尤其Alb11結構域之存在及關於ISVD之不同次序。
特定而言，白蛋白結合性ISVD (例如Alb11)可以其N-及C-末端直接地或藉由連接體肽(例如源自重鏈抗體鉸鏈區之連接體序列、聚-丙胺酸連接體序列、不同長度之Gly/Ser連接體或諸如此類)共價結合至LRP5結合性ISVD結構域(a)及(b)；例如白蛋白結合性結構域之N-末端經由連接體肽連接至ISVD (a)，且白蛋白結合性結構域之C-末端經由連接體肽連接至ISVD (b)，或反之亦然，較佳地其中該等ISVD包含如上文所陳述之全長ISVD序列(即(a)之ISVD序列可係(i)或(ii)之ISVD序列，且(b)之ISVD序列可係(iii)或(iv)之ISVD序列，如上文所定義)。
在一些實施例中，第一ISVD藉由連接體肽連接至白蛋白結合性ISVD，且第二ISVD直接連接至白蛋白結合性ISVD。在一些實施例中，第二ISVD藉由連接體肽連接至白蛋白結合性ISVD，且第一ISVD直接連接至白蛋白結合性ISVD。在一些實施例中，第一及第二ISVD二者均藉由連接體肽分別連接至白蛋白結合性ISVD。
根據本發明之特定實施例，以上多肽可另外包括半衰期延長部分體，其中該半衰期延長部分體共價連接至該多肽且視情況選自由以下組成之群：白蛋白結合性部分體，例如白蛋白結合性肽或白蛋白結合性免疫球蛋白結構域，較佳白蛋白結合性ISVD，更佳Alb11結構域；運鐵蛋白結合性部分體，例如抗運鐵蛋白免疫球蛋白結構域；聚乙二醇分子；血清白蛋白，較佳人類血清白蛋白及(人類)血清白蛋白之片段。
上文所提及之Alb11 ISVD之序列係如下：EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMS WVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKG RFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSR SSQGTLVTVSS (= Alb11結構域；= SEQ ID NO: 21) 結合至人類血清白蛋白之ISVD之其他實例為業內所已知，且進一步詳細闡述於(例如)國際專利公開案WO2006/122787及WO2008/028977中。結合至人類血清白蛋白之其他肽闡述於(例如) WO2008/068280、WO2009/127691及WO2011/095545中。
因此，本發明之三個較佳特定實施例係如下：第一較佳特定實施例：多肽，其包含 -第一(LRP5結合性) ISVD，其具有如SEQ ID NO:23中所示之胺基酸序列； -白蛋白結合性ISVD，其具有如SEQ ID NO:21中所示之胺基酸序列； -第二(LRP5結合性) ISVD，其具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列； 其按此次序，或以上三個結構域之次序經改變。
第二較佳特定實施例：多肽，其包含-第一(LRP5結合性) ISVD，其具有如SEQ ID NO:12中所示之胺基酸序列； -白蛋白結合性ISVD，其具有如SEQ ID NO:21中所示之胺基酸序列； -第二(LRP5結合性) ISVD，其具有如SEQ ID NO:13中所示之胺基酸序列； 其按此次序，或以上三個結構域之次序經改變。
第三較佳特定實施例：多肽，其包含-第一(LRP5結合性) ISVD，其具有如SEQ ID NO:11中所示之胺基酸序列； -白蛋白結合性ISVD，其具有如SEQ ID NO:21中所示之胺基酸序列； -第二(LRP5結合性) ISVD，其具有如SEQ ID NO:22中所示之胺基酸序列； 其按此次序，或以上三個結構域之次序經改變。
在甚至更尤佳之實施例中，白蛋白結合性ISVD位於兩個LRP5結合性ISVD之間。
上文所提及ISVD之序列匯總於表IIA、IIB及IIC中：表 IIA ：干擾Wnt3a訊息傳導之ISVD之序列： 表 IIB ：干擾Wnt1訊息傳導之ISVD之序列： 表 IIC ：結合至血清白蛋白之ISVD (Alb11結構域)之序列：
在一態樣中，本發明係關於結合至LRP5之多肽，其包含與參考ISVD競爭結合至LRP5之ISVD，其中該參考ISVD具有由SEQ ID NO: 11、12、13、14、22或23所鑑別之序列。較佳地，ISVD阻斷LRP之Wnt1或Wnt3a結合位點。具體而言ISVD抑制Wnt1驅動或Wnt3a驅動之靶基因轉錄。
在另一態樣中，本發明係關於結合至LRP5之多肽，其包含第一ISVD，該第一ISVD與第一參考ISVD競爭結合至LRP5，其中該第一參考ISVD具有由SEQ ID NO: 11、23或12所鑑別之序列；及第二ISVD，該第二ISVD與第二參考ISVD競爭結合至LRP5，其中該第二參考ISVD具有由SEQ ID NO: 13、22或14所鑑別之序列。較佳地，該第一ISVD阻斷LRP5之Wnt3a結合位點，具體而言抑制Wnt3a驅動之靶基因轉錄。或者，或除此以外，該第二ISVD可阻斷LRP5之Wnt1結合位點，具體而言抑制Wnt1驅動之靶基因轉錄。
本文中，表述「與參考ISVD競爭結合至抗原之ISVD」 (或類似表述)包含結合至與參考ISVD相同之表位或結合至與參考ISVD之表位重疊之表位且將參考ISVD與抗原(即LRP5)之結合抑制至一定程度之所有ISVD。較佳地，此等ISVD結合至與參考ISVD相同之表位及/或基本上完全抑制參考ISVD (例如上文所提及之參考ISVD)與抗原(即LRP5)之結合。若熟習此項技術者具有參考ISVD及抗原之知識，即使不知曉參考ISVD所結合抗原之表位，其亦可藉由實施業內已知之任何適宜競爭結合分析容易地測試某一ISVD是否係與參考ISVD競爭結合之ISVD。此等競爭結合分析為業內所熟知。舉例而言，熟習此項技術者可將抗原與經標記之參考ISVD一起培育且可將結合抗原之經標記參考ISVD之量與在與欲測試之ISVD一起預培育時結合至抗原之經標記參考ISVD之量進行比較。若後一量降低(即由於預培育容許欲測試之ISVD阻斷其與參考ISVD共享之結合位點)，則可認為欲測試之ISVD與參考ISVD競爭結合至抗原。
如上文所陳述，存在於本發明之多肽中之(至少兩個) ISVD可直接地無需使用連接體或經由連接體彼此連接。連接體較佳係連接體肽，且將根據本發明經選擇以便容許至少兩個不同ISVD與其靶標表位中之每一者結合。
適宜連接體將尤其取決於表位且特定而言ISVD應結合之靶分子上之表位之間的距離。基於本文之揭示內容，視情況在一些有限程度之常規實驗之後，此對熟習此項技術者而言將顯而易見。
因此，適宜連接體可包含胺基酸序列，例如長度為9個或更多個胺基酸，較佳至少17個胺基酸(例如約20至40個胺基酸)。連接體序列可係天然序列或非天然序列。若用於治療性目的，則連接體在本發明之多肽所投與之個體中較佳不具有免疫原性。
一組可用之連接體序列係源自重鏈抗體鉸鏈區之連接體，如WO1996/34103及WO1994/04678中所闡述。其他實例為聚-丙胺酸連接體序列，例如Ala-Ala-Ala。
連接體序列之其他較佳實例係不同長度之Gly/Ser連接體，例如(glyx sery )z 連接體，包括(例如) (gly4 ser)3 、(gly4 ser)5 、(gly4 ser)7 、(gly3 ser)3 、(gly3 ser)5 、(gly3 ser)7 、(gly3 ser2 )3 、(gly3 ser2 )5 及(gly3 ser2 )7 。
或者，或除多肽連接體以外，本發明之多肽中所存在之至少兩個ISVD可經由另一部分彼此連接，該另一部分係例如另一多肽，其在較佳但非限制性實施例中可係如上文已述之另一ISVD。此部分可基本上無活性或可具有生物效應，例如改良多肽之期望性質或可賦予多肽一或多種額外之期望性質。如上文已述，較佳之額外多肽結構域將延長多肽之半衰期，例如(人類)血清白蛋白結合性結構域(例如Alb11結構域)。
因此，根據另一實施例，本發明特定而言包括包含以下序列中之任一者之多肽，其中確切胺基酸序列可取自下表III：F012900082，其具有由SEQ ID NO: 18所鑑別之序列， F012900135，其具有由SEQ ID NO: 19所鑑別之序列，及 F012900141，其具有由SEQ ID NO: 20所鑑別之序列。表 III ：本發明多肽之三個特定實施例之序列
如之前所解釋，除非另有指示，否則本發明之多肽可包括其他部分及/或額外多肽結構域，只要其與LRP5之結合不會由此額外部分或結構域阻止即可。
本發明之多肽可另外含有修飾(例如醣基殘基或經修飾之胺基酸側鏈)，且其可經聚乙二醇化以增加此分子之半衰期及其他性質。可用於使ISVD構築體聚乙二醇化之技術及試劑可取自(例如) WO2011/107507。
本發明之多肽可具有經修飾之N-末端序列，例如N-末端胺基酸中之一或多者之缺失，或(例如)第一N-末端胺基酸之交換(例如麩胺酸鹽至丙胺酸)，以對分子進行最佳化以用於藉由使用某些表現系統(例如特定載體或宿主細胞)表現、或作為包涵體或以可溶形式表現、或分泌至培養基或周質空間中或含於細胞內部、或產生更均質之產物。本發明之多肽可具有經修飾之C-末端序列，例如額外之丙胺酸及/或C-末端部分中或任一框架區內之其他界定位置處之其他胺基酸交換，如(例如) WO2012/175741、WO2011/075861或WO2013/024059中所解釋，以(例如)進一步增強此等多肽之穩定性或降低其免疫原性。
此外，本發明多肽之半衰期可藉由添加白蛋白結構域來增加，即藉由將多肽轉化成白蛋白融合蛋白來實施。可用白蛋白部分之實例及如何將其添加至結合分子提供於(例如) WO2001/079271及WO2003/059934中。
較佳地，本發明之多肽具有在如下文實例7.1中所闡述之FACS結合分析中量測之結合(EC50)值，其範圍為10-6 莫耳/公升或更小，更佳地10-9 莫耳/公升或更小且甚至更佳地在10-10 至10-13 莫耳/公升範圍內，或具有如在下文實例7.3中所陳述之組合Wnt1及Wnt3a報導基因分析中所量測之IC50值，其為10-9 莫耳/公升或以下，且較佳地在5 × 10-10 莫耳/公升至10-12 莫耳/公升範圍內。
本發明之多肽容許更有效地治療若干種癌症類型，例如TNBC、CRC及NSCLC。其具有改良之活體外特性(即較高之Wnt路徑抑制效能)，參見例如下文之實例7及8，及顯著活體內腫瘤生長抑制性質，從而導致與此項技術中所闡述之LRP6結合分子相比更高之活體內效能，如例如下文實例9中所示。另外，本發明之多肽具有遠低於此項技術中所闡述之LRP6結合分子之胃腸毒性，如例如實例9中所示。
具體而言，如在活體內Wnt驅動之腫瘤模型中所示，LRP5半衰期延長之雙互補位人類化VHH構築體可抑制活體內Wnt訊息傳導及腫瘤生長，且甚至提供顯著之腫瘤萎縮(即腫瘤生長抑制高於100%)。腫瘤萎縮(即腫瘤消退)係癌症患者治療之期望治療效應(即效能)。此外，產生病理完全反應(pCR)之腫瘤消退係公認之臨床終點，此指示無進展存活及總體存活之顯著改良。
在相同之活體內實驗中，未觀察到顯著體重變化(＜ 10%)，且來自胃腸組織病理學分析之結果未指示以上本發明多肽之任何毒性效應。此鑒於上文所論述之活體內DKK1表現研究(即導致腸黏膜潰瘍及體重減輕)係特別令人驚訝的。
此外，下文所闡述之實例展現半衰期延長之雙互補位LRP5特異性VHH構築體選擇性地抑制在RNF43 基因中具有突變之癌細胞之細胞增殖的能力，該等突變依賴於活躍Wnt訊息傳導。特定而言，進一步顯示本文所闡述之半衰期延長之雙互補位LRP5特異性VHH構築體選擇性地抑制在RNF43 基因中具有突變之癌細胞之Wnt訊息傳導。
因此，本發明之多肽實際上提供用於治療癌症疾病、且尤其甚至用於高未滿足醫學需求適應症(例如(三陰性)乳癌)中之新穎治療選項。
在下文實例中且藉助其中所包括之比較數據將進一步說明以上有利效應。
此外，本發明之多肽易於製造且更易容，此意味著其與習用抗體相比可以更高濃度儲存及/或投與。其在室溫下穩定且即使在極端pH下亦具有延長之穩定性，使得其可在不使用冷凍設備之情形下製備、儲存及/或運輸，從而節省成本、時間及環境。由於以上原因且由於其低免疫原性，其此外提供關於除注射及輸注以外之投與途徑以及關於投與方案及使用特定裝置之多種選項。
核酸、載體、宿主細胞 根據其他態樣，本發明係關於核酸分子及編碼本發明多肽之表現載體以及表現其之宿主細胞。該等核酸、載體及宿主細胞可用於製造本發明之多肽，且下文將結合本發明多肽之製造方法之概述進一步闡述其其他態樣及實施例。
治療用途 由於其生物學性質，本發明之多肽適於治療特徵在於過度或異常細胞增殖之疾病，例如癌症及特發性肺纖維化(IPF)。
舉例而言，可用根據本發明之多肽治療以下癌症、腫瘤及其他增殖性疾病，但不限於此：頭頸癌；肺癌，例如非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌(SCLC)；縱膈贅瘤，例如神經源性腫瘤及間質瘤；胃腸(GI)道癌症，例如食管、胃(胃癌)、胰臟、肝及膽道系統(包括(例如)肝細胞癌(HCC))及小腸及大腸(包括(例如)結腸直腸癌)之癌症；前列腺癌；睪丸癌；婦科癌症，例如卵巢癌；乳房癌，例如乳癌、激素受體陽性乳癌、Her2陽性乳癌及三陰性乳癌；內分泌系統癌症；軟組織肉瘤，例如纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi´s sarcoma)；骨肉瘤，例如骨髓瘤、骨肉瘤、尤恩氏腫瘤(Ewing´s tumor)、纖維肉瘤、骨軟骨瘤、骨胚細胞瘤及軟骨胚細胞瘤；間皮瘤； 皮膚癌，例如基底細胞癌、鱗狀細胞癌、默克爾氏細胞癌(Merkel´s cell carcinoma)及黑色素瘤；中樞神經系統及腦之贅瘤，例如星細胞瘤、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤、神經胚細胞瘤及視網膜母細胞瘤；淋巴瘤及白血病，例如B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphomas，NHL)、T細胞非霍奇金氏淋巴瘤、慢性B細胞淋巴球性白血病(B-CLL)、慢性T細胞淋巴球性白血病(T-CLL)、霍奇金氏病(HD)、大顆粒性淋巴球白血病(LGL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性/骨髓樣白血病(AML)、急性淋巴/淋巴母細胞性白血病(ALL)、多發性骨髓瘤(MM)、漿細胞瘤及骨髓發育不良症候群(MDS)；及未知原發性位點之癌症。
特徵在於其在體內之特定位置/起源之上文所提及所有癌症、腫瘤、贅瘤等意欲包括原發性腫瘤及源自其之轉移性腫瘤二者。
更特定而言，本發明之多肽可用於治療疾病、且尤其其中異常細胞增殖係由異常(活化) Wnt訊息傳導引起或涉及異常(活化) Wnt訊息傳導之癌症疾病。
因此，本發明之多肽特別可用於治療實體腫瘤，且更特定而言用於治療肺癌、肝癌、結腸癌、腦癌、甲狀腺癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌及前列腺癌，且甚至更特定而言用於治療非小細胞肺癌(NSCLC)、三陰性乳癌(TNBC)及結腸直腸癌(CRC)。具體而言，本發明之多肽可作為單一藥劑或組合用於治療患有局部晚期或轉移性TNBC之患者、患有轉移性NSCLC或局部晚期或轉移性CRC之患者，以延長無進展存活(PFS)及總體存活(OS)。此外，本發明之多肽可用作針對乳癌患者之前導性治療以達成病理完全反應(pCR；定義為在前導性全身療法完成後，藉由對完全切除之乳房樣本及所有取樣之局部淋巴結之組織病理學評估，不存在殘餘侵襲性及原位癌症)。
本發明之多肽可用於一線、二線或任何其他線治療背景下之治療方案中。
本發明之多肽可用於上文所提及疾病之預防、短期或長期治療，視情況亦與放射療法及/或手術組合。
同樣，本發明之多肽特別可用於治療由涉及Wnt訊息傳導路徑之異常細胞增殖所引起之其他疾病，例如特發性肺纖維化(IPF) (Königshoff等人，「Functional Wnt signaling is increased in idiopathic pulmonary fibrosis」.PLoS One 2008;3(5):e2142；Lam等人，「Wnt coreceptor Lrp5 is a driver of idiopathic pulmonary fibrosis」.Am J Respir Crit Care Med . 2014;190(2):185-95)。
此外，本發明之多肽特別可用於治療視網膜病變，且尤其用於治療糖尿病視網膜病變，其係由於內部視網膜細胞中異常之Wnt活化，此引起異常新視網膜血管形成之增加，從而導致糖尿病視網膜病變之發生及進展 (Chen, Y.等人，「Activation of the Wnt pathway plays a pathogenic role in diabetic retinopathy in humans and animal models」The Am J Pathol. 2009; 175(6):2676-85.，Gao等人，「Elevated LRP6 levels correlate with vascular endothelial growth factor in the vitreous of proliferative diabetic retinopathy」Mol Vis . 2015;21:665-72)。
最終，由於可顯示Wnt1/Wnt3a訊息傳導路徑之抑制亦可對樹突細胞(DC)及樹突細胞功能具有效應，因此本發明之多肽亦可用於治療免疫學疾病及傳染病，以及用於影響上文已陳述各種癌症疾病中之腫瘤微環境。腫瘤積極阻抑抗腫瘤免疫性，且DC在癌症免疫逃逸機制中起重要作用。具體而言，研究已顯示，腫瘤微環境中之Wnt配體亦可起始免疫細胞內之旁分泌訊息傳導且調控主體抗腫瘤免疫性(Hong等人，「beta-catenin promotes regulatory T-cell responses in tumors by inducing vitamin A metabolism in dendritic cells」.Cancer Res . 2015;75(4):656-65)。
上文亦包括本發明之多肽在治療上文疾病之各種方法(藉由向有需要之患者投與治療有效劑量來實施)中的用途，以及該等多肽用於製造用於治療此等疾病之藥劑的用途，以及包括本發明之此等多肽之醫藥組合物，以及包括本發明之此等多肽之藥劑及諸如此類的製備及/或製造。
與其他活性物質之組合 本發明之多肽可單獨使用或與其他藥理學活性物質組合使用，例如現有技術或標準照護化合物，例如細胞生長抑制性或細胞毒性物質、細胞增殖抑制劑、抗血管生成物質、類固醇、免疫調節劑/檢查點抑制劑及諸如此類。
可與根據本發明之化合物組合投與之細胞生長抑制性及/或細胞毒性活性物質包括以下(但不限於此)：激素、激素類似物及抗激素、芳香酶抑制劑、LHRH激動劑及拮抗劑、生長因子(諸如血小板源生長因子(PDGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、人類表皮生長因子(HER，例如HER2、HER3、HER4)及肝細胞生長因子(HGF)等生長因子)之抑制劑，抑制劑係(例如)(抗)生長因子抗體、(抗)生長因子受體抗體及酪胺酸激酶抑制劑，例如西妥昔單抗(cetuximab)、吉非替尼(gefitinib)、阿法替尼(afatinib)、尼達尼布(nintedanib)、伊馬替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、伯舒替尼(bosutinib)及曲妥珠單抗(trastuzumab)；抗代謝物(例如抗葉酸劑，例如胺甲喋呤、雷替曲塞(raltitrexed)；嘧啶類似物，例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱(capecitabine)及吉西他濱(gemcitabine)；嘌呤及腺苷類似物，例如巰嘌呤、硫鳥嘌呤、克拉屈濱(cladribine)及噴司他汀(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)(ara C)、氟達拉濱(fludarabine))；抗腫瘤抗生素(例如蒽環抗生素)；鉑衍生物(例如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、卡鉑(carboplatin))；烷基化劑(例如雌氮芥(estramustin)、氮芥、美法侖(melphalan)、氮芥苯丁酸、白消安(busulphan)、達卡巴嗪(dacarbazin)、環磷醯胺、異環磷醯胺、替莫唑胺(temozolomide)、亞硝基脲(例如卡莫司汀(carmustin)及洛莫司汀(lomustin))、噻替派(thiotepa))；抗有絲分裂劑(例如長春花生物鹼(Vinca alkaloid)，例如長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesin)、長春瑞濱(vinorelbin)及長春新鹼(vincristine)；及紫杉烷(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel))；血管生成抑制劑、微管蛋白抑制劑；DNA合成抑制劑、PARP抑制劑、拓樸異構酶抑制劑(例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)，例如依託泊苷(etoposide)及凡畢複(etopophos)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrin)、托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone))、絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑(例如PDK1抑制劑、Raf抑制劑、A-Raf抑制劑、B-Raf抑制劑、C-Raf抑制劑、mTOR抑制劑、mTORC1/2抑制劑、PI3K抑制劑、PI3Kα抑制劑、雙重mTOR/PI3K抑制劑、STK33抑制劑、AKT抑制劑、PLK1抑制劑(例如伏拉塞替(volasertib))、CDK抑制劑、極光激酶抑制劑)、酪胺酸激酶抑制劑(例如PTK2/FAK抑制劑)、蛋白質蛋白質相互作用抑制劑、MEK抑制劑、ERK抑制劑、FLT3抑制劑、BRD4抑制劑、IGF-1R抑制劑、TRAILR2激動劑、Bcl-xL抑制劑、Bcl-2抑制劑、Bcl-2/Bcl-xL抑制劑、ErbB受體抑制劑、BCR-ABL抑制劑、ABL抑制劑、Src抑制劑、雷帕黴素(rapamycin)類似物(例如依維莫司(everolimus)、替西羅莫司(temsirolimus)、瑞達福羅莫司(ridaforolimus)、西羅莫司(sirolimus))、雄激素合成抑制劑、雄激素受體抑制劑、DNMT抑制劑、HDAC抑制劑、ANG1/2抑制劑、CYP17抑制劑、放射性藥物、免疫治療劑，例如免疫檢查點抑制劑(例如CTLA4、PD1、PD-L1、LAG3及TIM3結合分子/免疫球蛋白，例如伊匹單抗(ipilimumab)、尼沃魯單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab))、癌症疫苗，例如傳統腫瘤疫苗(基於細胞之疫苗，例如用於治療前列腺癌之西普魯塞-T (Sipuleucel-T))、個人化新抗原疫苗及溶瘤病毒及各種化學治療劑，例如阿米福汀(amifostin)、阿那格雷(anagrelid)、氯膦酸鹽(clodronat)、非格司亭(filgrastin)、干擾素、干擾素α、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、利妥昔單抗(rituximab)、丙卡巴肼(procarbazine)、左旋咪唑、美司鈉(mesna)、米托坦(mitotane)、帕米膦酸(pamidronate)及卟吩姆(porfimer)。
尤佳者係包括使用本發明之多肽與選自由以下組成之群之藥物組合之治療方法：(i)抗VEGF抗體(貝伐珠單抗(bevacizumab)及其他抗血管生成物質)，其中有或沒有用於乳癌患者之化學療法組合(包括在前導性環境中之多柔比星(doxorubicin)/環磷醯胺組合及/或卡培他濱/多西他賽組合；用於一線及後線治療之紫杉烷/鉑方案)； (ii) 用於EGFR突變NSCLC之EGFR TKI或用於ALK易位NSCLC之克唑替尼(crizotinib)，其中有或沒有用於肺癌患者之化學療法組合(基於鉑之細胞毒性組合療法，包括一線治療中之吉西他濱/順鉑；二線治療中之多西他賽或培美曲塞(pemetrexed))； (iii)抗EGFR抗體(用於KRAS 野生型腫瘤之西妥昔單抗及帕尼單抗(panitumumab))，其中有或沒有(例如)用於治療CRC患者之化學療法組合(包括伊立替康)、抗VEGF抗體組合(貝伐珠單抗及其他抗血管生成物質)或瑞格菲尼(regorafenib)組合。
(iv)免疫治療劑，包括抗PD-1劑(例如派姆單抗及尼沃魯單抗)、抗PD-L1劑、抗CTLA4劑、抗BTLA劑、抗LAG3劑及抗TIM3劑，例如抗PDL1抗體等，例如用於治療乳癌、肺癌及CRC患者。
(v)化學治療劑，例如基於鉑之抗瘤劑，或與FOLFOX化學療法方案(包括醛葉酸、5'-氟尿嘧啶及奧沙利鉑)組合，或與FOLFOXIRI化學療法方案(包括醛葉酸、5'-氟尿嘧啶、奧沙利鉑及伊立替康)組合，例如用於治療乳癌或CRC患者。
當兩種或更多種物質或原理欲用作組合治療方案之一部分時，其可經由相同投與途徑或經由不同投與途徑、基本上在同一時間(即同時、並行)或在不同時間(例如依序、相繼、交替、連續或根據任何其他類型之交替方案)投與。
當該等物質或原理欲經由相同投與途徑同時投與時，其可作為不同醫藥調配物或組合物或作為組合醫藥調配物或組合物之一部分投與。同樣，當兩種或更多種活性物質或原理欲用作組合治療方案之一部分時，該等物質或原理中之每一者可以相同量且根據與化合物或原理單獨使用時相同之方案投與，且此組合使用可或可不導致協同效應。然而，當兩種或更多種活性物質或原理之組合使用導致協同效應時，則亦可在仍達成期望治療作用的同時降低該等物質或原理中之一者、多者或全部之量。此可(例如)在仍獲得期望藥理學或治療效應的同時用於避免、限制或降低與使用該等物質或原理中之一或多者(在其以其通常量使用時)相關的任何不希望之副作用。
上文包括用於與以上組合配對物組合使用之本發明多肽之製劑及其製備方法。亦包括用於與本發明之多肽組合使用之上文所提及組合配對物之製劑及其製備方法。因此，本發明藉此(例如)提供使用或準備使用免疫調節劑/檢查點抑制劑(例如抗PD1抗體，例如派姆單抗或尼沃魯單抗)之方法，其用於與本發明之多肽組合投與、且更特定而言與本發明之多肽以組合療法方案投與。
此外，本發明亦涵蓋套組，其包含至少一種本發明之多肽及一或多種選自由用於治療如上文所述疾病及病症之其他藥物組成之群之其他組分，及如下文所闡述之裝置。
醫藥組合物、投與方法、劑量 熟習此項技術者應明瞭，上文治療疾病之方法包括製備用於治療該疾病之藥劑。因此，本發明進一步係關於用於治療上文所提及疾病之醫藥組合物，其中此等組合物包含至少一種本發明之多肽。
本發明之多肽及/或包含其之組合物可以任何適宜方式向有需要之患者投與，此取決於欲使用之特定醫藥調配物或組合物。因此，本發明之多肽及/或包含其之組合物可(例如)以有效量或劑量以以下方式投與：靜脈內(i.v.)、皮下(s.c.)、肌內(i.m.)、腹膜內(i.p.)、經皮、經口、舌下(例如以舌下錠劑、噴霧劑或滴劑之形式置於舌下並經由黏膜吸附至舌下之毛細管網絡)、經鼻(鼻內)(例如以經鼻噴霧劑及/或氣溶膠之形式)、局部、藉助栓劑、藉由吸入或任何其他適宜方式。
本發明之多肽及/或包含其之組合物係根據適於治療及/或緩和欲治療或緩和之疾病、病症或病狀之治療方案來投與。臨床醫師通常將能夠確定適宜治療方案，此取決於諸如以下等因素：欲治療或緩和之疾病、病症或病狀、疾病之嚴重程度、其症狀之嚴重程度、欲使用之本發明之具體多肽、欲使用之具體投與途徑及醫藥調配物或組合物、患者之年齡、性別、體重、飲食、一般狀況及臨床醫師所熟知之類似因素。通常，治療方案將包含以治療有效量或劑量投與一或多種本發明之多肽或一或多種包含其之組合物。
通常，對於治療及/或緩和本文所提及之疾病、病症及病狀而言且端視於欲治療之具體疾病、病症或病狀、欲使用之本發明特定多肽之功效、所用具體投與途徑及具體醫藥調配物或組合物而定，本發明之多肽通常將以介於0.005 mg/公斤體重/劑與20.0 mg/公斤體重/劑之間，較佳地介於0.05 mg/kg/劑與10.0 mg/kg/劑之間且更佳地介於0.5 mg/kg/劑與10 mg/kg/劑之間的量連續(例如藉由輸注)或更佳地作為單一劑量(例如每週兩次、每週一次或每月一次劑量；參見下文)投與，但可有所變化，此尤其取決於前文所提及之參數。因此，在一些情形下，使用低於上文給出之最低劑量可能已足矣，而在其他情形下可能不得不超出上限。當大量投與時，可適當地將其分成多個較小劑量在一天中之不同時間投與。
端視於本發明之具體多肽及其具體藥物動力學及其他性質而定，其可每天、每兩天、每三天、每四天、每五天或每六天、每週、每月及諸如此類來投與。投與方案可包括長期、每週治療。「長期」意指至少兩週且較佳地數月或數年之持續時間。
本發明之多肽及包含其之組合物之效能可使用本身已知之任何適宜活體外分析、基於細胞之分析、活體內分析及/或動物模型或其任一組合來測試，此取決於所涉及之具體疾病。適宜分析及動物模型對熟習此項技術者而言將顯而易見，且(例如)包括下文實例中所使用之分析及動物模型。
較佳地，本發明之多肽在該等分析或模型中之至少一者中、且較佳地在活體內模型中之一或多者中具有優於業內已知之習用抗體之特性。
調配物 對於醫藥用途而言，可將本發明之多肽調配為醫藥製劑，其包含(i) 至少一種本發明之多肽及(ii) 至少一種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或穩定劑及(iii) 視情況一或多種其他藥理學活性多肽及/或化合物。「醫藥上可接受」意指各別材料在投與個體時不顯示任何生物或其他不期望之效應且不與含有其之醫藥組合物中之任何其他組分(例如醫藥活性成分)以有害方式相互作用。具體實例可參見標準手冊，例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Company, USA (1990)。舉例而言，對於習用抗體及抗體片段以及其他醫藥活性蛋白質而言，可以本身已知之任一方式調配並投與本發明之多肽。因此，根據另一實施例，本發明係關於醫藥組合物或製劑，其含有至少一種本發明之多肽及至少一種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或穩定劑及視情況一或多種藥理學活性物質。
用於非經腸投與(例如靜脈內、肌內、皮下注射或靜脈內輸注)之醫藥製劑可係(例如)包含活性成分且視情況在進一步溶解或稀釋步驟後適於輸注或注射之無菌溶液、懸浮液、分散液、乳液或粉末。用於此等製劑之適宜載劑或稀釋劑(例如)包括(但不限於)無菌水及醫藥上可接受之水性緩衝液及溶液，例如生理磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及漢克氏溶液(Hank's solution)；水油；甘油；乙醇；二醇，例如丙二醇；以及礦物油、動物油及植物油，例如花生油、大豆油以及其適宜混合物。
本發明多肽之溶液亦可含有防腐劑以防止微生物生長，例如抗細菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、對羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞、乙二胺四乙酸(之鹼金屬鹽)及諸如此類。在許多情形中，將較佳包括等滲劑，例如糖、緩衝劑或氯化鈉。視情況，可使用乳化劑及/或分散劑。可(例如)藉由形成脂質體、藉由維持所需粒徑(在分散液之情形中)或藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。亦可添加其他劑延遲吸收之試劑，例如單硬脂酸鋁及明膠。可將溶液填充至注射小瓶、安瓿、輸注瓶及諸如此類中。
在所有情形中，最終劑型必須無菌、可流動且在製造及儲存條件下穩定。無菌可注射溶液係藉由以下方式來製備：將所需量之活性化合物與(視需要)上文所列舉之各種其他成分一起併入適當溶劑中，之後進行過濾滅菌。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情形中，較佳之製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥技術，其產生存在於先前經無菌過濾之溶液中之活性成分加上任何其他期望成分之粉末。
通常，水溶液或懸浮液將係較佳的。通常，治療性蛋白質(例如本發明之多肽)之適宜調配物係經緩衝之蛋白質溶液，例如包括以下之溶液：適宜濃度(例如0.001 mg/ml至400 mg/ml，較佳地0.005 mg/ml至200 mg/ml，更佳地0.01 mg/ml至200 mg/ml，更佳地1.0 mg/ml - 100 mg/ml，例如1.0 mg/ml (i.v.投與)或100 mg/ml (s.c.投與)之蛋白質及諸如以下等水性緩衝液：-磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4， -其他磷酸鹽緩衝液，pH 6.2至8.2， -乙酸鹽緩衝液，pH 3.2至7.5，較佳pH 4.8至5.5 -組胺酸緩衝液，pH 5.5至7.0， -琥珀酸鹽緩衝液，pH 3.2至6.6，及 -檸檬酸鹽緩衝液，pH 2.1至6.2， 及視情況，用於提供溶液等滲性之鹽(例如NaCl)及/或糖(例如蔗糖及海藻糖)及/或其他多元醇(例如甘露醇及甘油)。
較佳經緩衝之蛋白質溶液係包括約0.05 mg/ml本發明之多肽溶解於25 mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.5)中之溶液，其藉由添加220 mM海藻糖調整至等滲性。另外，此等溶液中可包括其他試劑，例如清潔劑(例如0.02 % Tween-20或Tween-80)。用於皮下施加之調配物可包括更高濃度之本發明之多肽(例如高達100 mg/ml或甚至在100 mg/ml以上)。然而，熟習此項技術者將明瞭，如上文所給出之成分及其量僅代表一個較佳選項。熟習此項技術者將立即明瞭其替代方案及變化形式，或可自以上揭示內容容易地構想。
此外，與習用抗體或抗體片段相比，使用本發明之多肽之一個主要優點在於其亦可經由除非經腸投與以外之途徑容易地投與且可針對此投與容易地調配。舉例而言，如國際專利申請案WO2004/041867中所闡述，此等多肽可經調配用於經口、鼻內、肺內及經皮投與。
根據本發明之另一態樣，本發明之多肽可與可用於投與該多肽之裝置組合使用，該裝置例如注射器、注射筆、微型幫浦或其他裝置。
製造及純化方法 本發明進一步提供製造本發明多肽之方法，此等方法通常包含以下步驟： -將包含編碼本發明多肽之核酸(下文：「本發明之核酸」)之宿主細胞在容許本發明多肽之表現的條件下培養；且， -自培養物回收或分離由宿主細胞所表現之多肽；且 -視情況進一步純化及/或修飾及/或調配本發明之多肽。
本發明之核酸可係(例如)包含編碼序列以及調節序列及視情況天然或人工內含子之DNA分子，或可係cDNA分子。其可具有其原始密碼子或可具有已特別適於在預期宿主細胞或宿主生物體中表現之最佳化之密碼子使用。根據本發明之一個實施例，本發明之核酸係呈基本上分離之形式，如上文所定義。
本發明之核酸亦可呈載體(例如質體、黏粒或YAC)之形式、存在於載體中及/或為載體之一部分，該載體亦可呈基本上分離之形式。載體可尤其係表現載體，即可提供多肽在活體外及/或活體內(例如在適宜宿主細胞、宿主生物體及/或表現系統中)表現之載體。此表現載體通常包含至少一種可操作地連接至一或多個適宜調節元件(例如啟動子、增強子、終止子及諸如此類)之本發明之核酸。可用於表現本發明之多肽或為表現本發明之多肽所需之此等調節元件及其他元件(例如整合因子、選拔標記物、訊息或前導序列、報導基因及諸如此類)之特定實例揭示於(例如) WO2006/040153之第131頁至第133頁上。
基於本文給出之關於本發明多肽之胺基酸序列之資訊，本發明之核酸可以本身已知之方式(例如藉由自動化DNA合成及/或重組DNA技術)製備或獲得。
根據另一實施例，本發明係關於宿主或宿主細胞，其表現或能夠表現本發明之多肽；及/或含有編碼本發明多肽之核酸。根據尤佳實施例，該等宿主細胞係細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。
對於工業規模之生產而言，用於(工業)生產ISVD多肽及含有其之蛋白質治療劑之較佳異源宿主包括適於大規模表現、生產及發酵、且尤其適於大規模(生物)醫藥表現、生產及發酵之大腸桿菌(E. coli )、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris )及啤酒酵母(S. cerevisiae )之菌株。
在如上文所陳述之細胞中產生之本發明多肽可在細胞內(例如在胞質液中、在周質中或在包涵體中)產生且可然後自宿主細胞分離並視情況經進一步純化；或其可在細胞外(分泌至其中培養宿主細胞之培養基中)產生且然後自培養基分離並視情況經進一步純化。
用於重組產生多肽之其他方法及試劑(例如，合適之表現載體、轉化或轉染方法、選拔標記物、誘導蛋白質表現之方法、培養條件及諸如此類)為業內所已知。類似地，可用於本發明多肽之製造方法中之蛋白質分離及純化技術為熟習此項技術者所熟知。
與通常需要昂貴之哺乳動物細胞培養設施之習用抗體相比，經由在便捷重組宿主生物體(例如大腸桿菌及酵母)中發酵產生本發明之多肽係成本有效的。此外，可達成之表現量較高且本發明多肽之產率係在1 g/l至10 g/l (大腸桿菌)範圍內且高達10 g/l (酵母)及更多。
實例 實例 1 ：用 LRP5 免疫接種駱馬以誘導體液性免疫反應 需要制定若干種用於免疫接種駱馬之方案，並進行以鑑別LRP5結合性VHH結構域：首先用LRP5蛋白(小鼠)之重組細胞外結構域免疫接種駱馬。然而，以上所提及之LRP5重組蛋白之功能特徵分析顯示重組蛋白未正確摺疊。因此，需要進行進一步工作以開發用於免疫接種之適宜抗原。作為變通方案(work-around)，用經人類LRP5或食蟹猴(cynomolgus或cyno) LRP5穩定轉染之HEK293細胞免疫接種駱馬。然而，同樣，藉由瞬時或穩定轉染，且使用不同細胞系(HEK293及CHO)，僅可達成人類或食蟹猴LRP5之極低表現。因此，需要更進一步的工作以達成LRP5之充足表現。最終且在一些不成功的試驗及錯誤之後，此可藉由開發涉及用MesDC-2 (即一種意欲用於增加外源性LRP5表現之伴護蛋白)穩定共轉染HEK293細胞之方案來達成。即使如此，即在LRP5穩定轉染之細胞系之產生期間共同表現MesDC-2時，亦反覆觀察到蛋白質表現之不穩定性。相比之下，在HEK293細胞中共同表現人類LRP6與MesDC-2時，則達成顯著更高且穩定之表現程度。該等結果與顯示人類LRP5之內在攻毒為表現極低之蛋白質之公開數據一致(Fleury等人，Protein Expr Purif. 2010年3月;70(1):39-47)。此導致LRP5表現會在免疫接種及選拔期間流失的問題。為解決此進一步之問題，儘量限制表現LRP5之細胞之傳代並進行額外細胞分選，以富集表現LRP5之細胞。
另外用在相對側中具有及不具hMesDC-2伴護蛋白之編碼LRP5之DNA免疫駱馬。向若干駱馬遞送額外加強免疫以試圖增強物種交叉反應性免疫反應，目標係增加鑑別與小鼠及食蟹猴LRP5交叉反應之抗人類-LRP5 VHH結構域之機會。
每隔一定時間取免疫血液(PBL)樣品，測定血清反應，並自經分離之PBL製備總RNA。用重組蛋白免疫後對LRP5之血清反應低；相比之下，對於用DNA免疫之駱馬，觀察到中度LRP5免疫反應。對於細胞免疫，觀察到極低之免疫反應。另外，亦探索合成庫。然而，最終，可達成譜系之足夠多樣性以繼續進行後續步驟，如實例2中所概述。
實例 2 ： LRP5 結合性單價 VHH 結構域 (VHH) 之分離 庫構築： 在收集免疫組織後立即提取總RNA，並驗證RNA完整性及濃度。自該等RNA製備物製備cDNA樣品。自該等cDNA樣品以一步RT-PCR反應擴增編碼VHH之核苷酸序列。將自樣品中之IgG2及IgG3 cDNA特異性擴增之700bp擴增子自瓊脂糖凝膠分離且隨後用作巢式PCR反應中之模板。隨後用Sfi I及BstE II消化PCR產物並連接至噬粒載體pAX50之相應限制位點。使連接混合物電穿孔進入大腸桿菌TG-1中。所得轉化體庫構成噬菌體展示庫之遺傳多樣性。
pAX50係源自pUC119之表現載體，其含有胺苄青黴素之抗性基因及lac 啟動子，之後為在下游VHH結構域選殖位點之框架內之pIII蛋白訊息肽的編碼序列。在VHH結構域編碼序列之框架內中，載體編碼C-末端Myc及六組胺酸標籤以及大腸桿菌噬菌體pIII蛋白。在用輔助噬菌體感染大腸桿菌TG-1庫純系之後，pAX50之存在容許自該等純系產生噬菌體顆粒，從而將個別VHH結構域展示為與pIII蛋白之融合蛋白。
選擇： 構築VHH結構域-噬粒庫並用於選擇。鑒於跨物種之極高物種同源性(駱馬與人類LRP5之間)，不確定在駱馬中產生之免疫反應是否會引起VHH結構域之足夠多樣性。因此，在選擇期間同時使用兩個合成庫與免疫庫。
如下在選擇期間使用不同之策略：-物種源之交替(即人類及小鼠LRP5源工具)以增強鑑別人類/小鼠LRP5物種交叉反應性VHH結構域之機會，例如利用穩定表現小鼠LRP5之HEK293對來自經人類LRP5免疫之駱馬之庫進行選擇或在合成庫之選擇期間使用表現小鼠及人類LRP5二者之HEK293細胞系(此LRP5拮抗劑之小鼠交叉反應性容許在相同臨床前模型(即在異種移植物腫瘤-小鼠模型)中評估用於評價治療窗所需之效能(即腫瘤生長抑制)及安全性概況)。 -利用LRP5重組蛋白進行「溶液中」選擇以使表位保持其天然構形：作為另外之障礙，發現若將LRP5重組蛋白直接塗覆於ELISA結合板上，則其失去正確摺疊。因此，使重組蛋白生物素化，且在功能分析中確認正確摺疊之後，用於「溶液中」之選擇。 -使用過表現LRP5之細胞進行選擇，以具有受體之天然構形。令人驚訝地，此被證明係重要策略，尤其為改良結合劑對LRP5之Wnt3a類結合結構域之選擇所需要，此乃因重組蛋白之功能數據顯示Wnt3a結合表位缺乏正確摺疊。 -使用過表現LRP6之細胞進行負向選擇以鑑別LRP5-選擇性結合劑。
實例 3 ：單價 VHH 之篩選 在選擇之後，使純系在96深孔板(1 mL體積)中生長，並藉由添加IPTG來誘導VHH表現。根據標準方法製備單一純系之周質提取物，如例如WO2011/107507中所報導，並針對與人類LRP5之結合進行篩選。最初，使用重組LRP5在結合ELISA分析中篩選周質提取物，當與基於FACS之結合分析相比時，其代表敏感、穩健及高通量之分析。在純化後，使用結合FACS分析來進一步表徵ELISA分析中所鑑別之VHH，以確認經純化之VHH以其天然構形結合至LRP5受體。
通常，預期在ELISA與FACS結合分析之間具有良好相關性。然而，在本發明情形下，ELISA分析中之最佳LRP5結合性VHH (即對重組LRP5胞外結構域具有高親和力)在FACS結合分析中並未顯示與人類LRP5之任何結合或與其之結合極弱。在ELISA設置中使用不同塗覆緩衝液(dPBS對碳酸氫鹽緩衝液)及封阻溶液(Marvel對BSA)並未解決所觀察到之差異。相反地，已發現ELISA中之極弱結合劑在使用表現LRP5之HEK293細胞的結合FACS分析中顯示對LRP5之高親和力。因此，該等其他數據及實驗容許對識別該兩種受體之天然構形之高親和力結合劑進行選擇。另外，藉此獲得該等高親和力結合劑識別構形依賴性表位而非LRP5蛋白中之線性表位之確認。因此，該等進一步非常規數據及實驗容許對治療相關LRP5結合劑進行選擇，該等治療相關LRP5結合劑應對質膜上以其天然構形表現之LRP5具有高親和力。
因此，儘管(i) FACS結合分析通量較低，(ii) 穩健分析設置較不穩健，且(iii) 由於在過表現LRP5之細胞傳代時重組蛋白表現損失而遇到的上文所述困難，但隨後使用該等分析以進一步選擇並表徵高親和力VHH結合劑。簡言之，將細胞與經純化VHH稀釋液(1 μM至1 pM之1:5連續稀釋液，最終濃度)一起在板振盪器上在4℃下培育1.5小時。在用FACS緩衝液(由1×磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) + 10%胎牛血清(FBS) + 0.05%疊氮化鈉組成)將細胞洗滌5次之後，將其與結合至VHH之框架區且因此結合至所測試之所有LRP5結合劑之多株小鼠抗體一起在4℃下培育30分鐘直至1小時。在用FACS緩衝液將細胞洗滌3次之後，將細胞與經標記之二級抗體(抗小鼠PE)一起在4℃下培育30分鐘直至1小時，之後為利用FACS緩衝液之3次洗滌步驟。使用FACS陣列(BD)量測螢光。
基於結合FACS數據及序列分析，自免疫庫及合成起源總共鑑別出大約50個LRP5-選擇性VHH家族/簇。下文進一步示出其代表性實例並由其序列界定。在大腸桿菌中表現VHH並純化。倘若大腸桿菌中之表現證明不足，則使VHH在巴斯德畢赤酵母中產生。下文進一步報告表現並純化VHH之簡要描述。
VHH 在大腸桿菌中之一般表現： 將編碼序列選殖至pAX100表現載體中並在大腸桿菌中表現為c-Myc帶六組胺酸標籤之蛋白質。於搖瓶中使含有所關注VHH構築體之大腸桿菌TG-1細胞於補充有康黴素(kanamycin)之TB培養基中生長(37℃, 250 rpm)並藉由添加1 mM IPTG誘導表現。在使細胞培養物旋轉後，藉由使沈澱冷凍-解凍並重新懸浮於dPBS中來製備周質提取物。
VHH 在巴斯德畢赤酵母中之一般表現： 將編碼序列選殖至pAX159表現載體中並在巴斯德畢赤酵母中表現為c-Myc帶六組胺酸標籤之蛋白質。使含有所關注VHH構築體之巴斯德畢赤酵母X-33細胞於BGCM (經緩衝之甘油-複合培養基；Invitrogen)中生長(30℃, 250 rpm)。在第三天，將培養基換為BMCM (經緩衝之甲醇-複合培養基；Invitrogen)，且使培養物進一步生長並藉由添加0.5 vol%甲醇(100%)定期誘導。在使細胞培養物旋轉後，收集上清液(含有經分泌之VHH)。
VHH 純化： 藉由固定化金屬親和層析(RoboColumns 100 ul Nickel SepharoseTM 6 FF, Atoll)在Tecan EVO150上純化帶六組胺酸標籤之VHH，利用250 mM咪唑自管柱溶析，且隨後對dPBS脫鹽。藉由SDS-PAGE及/或西方墨點(western blot)使用抗Myc及抗VHH檢測驗證VHH之純度及完整性。
實例 4 ：經純化單價 VHH 之活體外表徵 在VHH篩選後，藉由使用如下文所闡述之若干功能及生物物理學分析表徵對表現LRP5之細胞具有高親和力之經純化VHH：
4.1 LRP5 選擇性結合功效及交叉反應性：基於 FACS 之 DKK1 競爭分析 在LRP5選擇性單價VHH之表徵期間，觀察到在結合FACS分析中所獲得之數據並不總是與在Wnt1及Wnt3a報導基因分析中所觀察到之功效相關，此最可能係由於一些VHH之快速解離速率。因此，需要確立此額外分析(即DKK1競爭FACS)，其證明對於選擇性及結合功效測定(包括LRP5結合性及缺乏LRP6結合性)更可靠。目標係選擇功能性VHH，其在高達1 μM之濃度下選擇性結合至LRP5而檢測不到與LRP6之結合。因此，將所鑑別之Wnt1及Wnt3a功能性VHH在如下之DKK-1競爭FACS中進行表徵： 對於基於FACS之DKK1競爭分析，使用穩定過表現人類LRP5或人類LRP6之HEK293細胞。將人類重組DKK1 (rhDKK1 - R&D Systems，目錄號5439-DK/CF)以1 nM之恆定最終濃度添加至細胞。使細胞與rhDKK1及LRP5結合劑稀釋液(經純化VHH之1:5連續稀釋液)一起在板振盪器上在4℃下培育1.5小時。在用FACS緩衝液將細胞洗滌三次之後，使其與經生物素化之山羊抗人類DKK1 (R&D Systems，目錄號BAF1096)一起在板振盪器上在4℃下培育30分鐘。在用FACS緩衝液將細胞洗滌三次之後，使其與鏈黴抗生物素蛋白PE (BD Biosciences，目錄號554061)一起於暗處在板振盪器上在4℃下培育30分鐘至1小時。用FACS緩衝液將細胞洗滌兩次並使用FACS陣列(BD)量測螢光且報告平均通道螢光(MCF)值。
預期LRP5選擇性VHH與人類DKK1競爭結合至過表現人類LRP5之HEK293細胞，但不或以極低功效(＞1 μM)競爭結合至過表現人類LRP6之HEK293細胞(且反之亦然，相同情況將適用於LRP6特異性VHH)。相比之下，LRP5/LRP6交叉反應性VHH將與人類DKK1競爭結合至過表現人類LRP5之HEK293，以及競爭結合至過表現人類LRP6之HEK293。作為此實驗之結果，可顯示本發明之LRP5選擇性VHH與人類DKK1競爭結合至過表現人類LRP5之HEK293細胞(即隨著結合劑之濃度增加，MCF值降低，其中DKK1結合之完全抑制對應於在所測試之最高濃度下≤ 60之MCF值)。
4.2 物種交叉反應性：小鼠及食蟹猴 為確定所選擇之LRP5選擇性VHH組是否能夠結合至小鼠及食蟹猴起源之LRP5，如下實施DKK1競爭FACS： 使VHH之連續稀釋液與穩定表現小鼠LRP5或食蟹猴LRP5之HEK293細胞在1 nM及0.3 nM hDKK1 (濃度分別低於小鼠及食蟹猴之EC50值)存在下一起培育。使用經生物素化之抗DKK1抗體與鏈黴抗生物素蛋白-PE作為二次檢測檢測DKK1與細胞之結合，如上文所闡述。由此，可證實此交叉反應性。
4.3 表位分級 (epitope binning) 針對最強效之Wnt1訊息傳導阻斷LRP5選擇性VHH實施分級實驗，以鑑別不同表位分級箱(epitope bin)。具體而言，使用基於FACS之分析分析個別VHH與其他經生物素化之VHH (稱為參考VHH)競爭LRP5受體結合之能力。使個別VHH之連續稀釋液與200 pM或500 pM經生物素化之參考VHH (濃度低於EC50值)一起在穩定表現人類LRP5之HEK293上培育。使用鏈黴抗生物素蛋白-PE檢測經生物素化之參考VHH與細胞之結合。與參考VHH競爭結合至LRP5之VHH顯示使用FACS陣列量測之螢光降低。
作為該等實驗之結果，Wnt1阻斷劑及Wnt3a阻斷劑可分別分為兩個及六個分級箱。
4.4 Wnt1 及 Wnt3a 報導基因分析 在功能性Wnt1及Wnt3a分析中測試LRP5選擇性VHH抑制Wnt訊息傳導之能力。同樣就此而言，無確立方案可用，但需要嘗試若干嘗試以確立生物化學功能分析，例如Wnt1/Wnt3a - LRP5阻斷分析：除重組LRP5蛋白所遇到之困難(參見實例1)以外，功能性重組Wnt1配體亦不可獲得，更不必說可商業購得。Wnt蛋白含有許多保守半胱胺酸，且由附接至保守絲胺酸之單-不飽和脂肪酸(棕櫚油酸)修飾。該等轉譯後修飾為有效訊息傳導及Wnt分泌所必需。結構分析顯示，含有棕櫚油酸脂質之結構域中之一者為結合至捲曲受體所必需，從而導致容許Wnt配體與細胞表面上LRP5受體之相互作用之構形變化。因此，結果表明此轉譯後修飾係涉及此蛋白質之功能研究所必需的，但同時此等基於脂質之轉譯後修飾使得該等蛋白質極難以表現及純化(低溶解性)。因此，此證明係生物化學分析之主要障礙。
因此，開發出一種基於細胞之功能分析以用於表徵經純化VHH：Wnt β-內醯胺酶報導基因分析。尤其對於Wnt1路徑抑制，用人類Wnt1轉染CellSensor LEF/TCF-bla FreeStyle 293F細胞(Invitrogen，目錄號K1677)，並選擇穩定過表現人類Wnt1之純系。為測試Wnt3a路徑抑制，產生穩定過表現人類Wnt3a之CellSensor LEF/TCF-bla FreeStyle 293F細胞，且在用LRP5選擇性VHH處理前兩天，根據製造商之說明書，經由siRNA (SMARTpool, ON-TARGETplus siRNA, Dharmacon，目錄號L-003845-0010)對人類LRP6實施瞬時敲低。
CellSensor® LEF/TCF - bla FreeStyle™ 293細胞系含有在Wnt誘導型LEF/TCF啟動子控制下之β-內醯胺酶報導基因，其穩定整合至FreeStyle™ 293細胞(Invitrogen)中。因此，Wnt1或Wnt3a在該等細胞中之表現產生組成型表現，且因此產生β-內醯胺酶之酶活性。因此，預期用LRP5選擇性功能性VHH處理導致Wnt1或Wnt3a路徑抑制，從而導致β-內醯胺酶酶活性抑制。
對於分析，將過表現Wnt1或Wnt3a之1E06 / ml細胞接種至384孔組織培養板中並在37℃下培育過夜。第二天，製備各種LRP5選擇性VHH溶液之連續稀釋液並在LiCl存在下以10 nM之最終濃度添加至細胞。將DKK1 (作為陽性對照)以200 nM之最終濃度添加至細胞。DKK1處理導致Wnt1及Wnt3a路徑之完全抑制，且因此導致β-內醯胺酶酶活性之完全抑制。將細胞在37℃下培育過夜。第二天，根據製造商之說明書(Invitrogen，目錄號K1085)量測β-內醯胺酶酶活性。對於螢光發射，使用標準螢光讀板儀及針對所指示處理繪製之460/530 nm發射比獲得460 nm及530 nm處之值。針對陽性對照(DKK1；200 nM最終濃度)計算效能。
鑑別兩種Wnt1阻斷劑。總共八種Wnt3a阻斷劑顯示良好功效(IC50 低於100 nM)及全效能。
4.5 Wnt1 及 Wnt3a 磷酸化分析 隨後在Wnt1及Wnt3a依賴性LRP5磷酸化分析中測試來自Wnt1阻斷劑之每一分級箱的最強且最有效之領先者(lead)及最強且最有效之Wnt3a阻斷劑。在磷酸化分析中使用用編碼Wnt1或Wnt3a之表現載體共轉染之來自Invitrogen之Cellsensor LEF/TCF 293F細胞(目錄號K1677)。由於Wnt-捲曲受體-LRP5複合物形成導致LRP5磷酸化及隨後下游訊息傳導，因此磷酸化之量化可用於量測此訊息傳導。為獲得LRP5特異性讀出，將細胞溶解並用LRP5選擇性抗體實施免疫沈澱(針對受體之細胞內結構域)。在西方墨點中，使用多株抗磷酸化LRP6 (Ser1490)抗體(Cell Signaling Technology)檢測經磷酸化之LRP5，該多株抗磷酸化LRP6 (Ser1490)抗體與LRP5磷酸化蛋白交叉反應。所選含有至少一種來自每一分級箱之代表性VHH之經純化Wnt1及Wnt3a阻斷VHH組係以10 nM至100 nM之最終濃度測試。具體而言，在細胞溶解及LRP5免疫沈澱之前，將細胞在阻斷VHH存在下培育過夜。經由針對陽性對照(DKK1，最終濃度為1 µM)對西方墨點條帶之量化來計算Wnt1或Wnt3a阻斷VHH在阻斷LRP5磷酸化中之效能。
4.6 生物物理學表徵 進一步表徵LRP5選擇性VHH在大腸桿菌及巴斯德畢赤酵母中之表現及純化，如實例3中所報告。具體而言，若單價領先組VHH之表現產率高於0.1 mg/L，則認為其係可接受的。所選之LRP5選擇性VHH在大腸桿菌中顯示介於0.3 mg/L與22.6 mg/L之間範圍內之表現且在巴斯德畢赤酵母中更高(＞ 1mg/L)。藉由SDS-PAGE分析評估表現。
使用Lightcycler (Roche)在基於螢光之熱位移分析(TSA)中測定單價LRP5選擇性VHH之熱穩定性。將VHH在Sypro Orange存在下於不同pH值下培育並施加溫度梯度。在熱誘導之解摺疊時，蛋白質之疏水片暴露，Sypro Orange與其結合，從而導致螢光強度增加(Ex/Em = 465/580 nm)。螢光強度曲線之一階導數之拐點用作熔融溫度(Tm)之量度。對於所有VHH，Tm隨pH增加而增加並在pH 6時趨於平穩，此係VHH所見之典型Tm模式。對於LRP5選擇性Wnt1阻斷劑VHH及Wnt3a阻斷劑VHH，在pH 7下獲得超過68℃之平均值。
藉由分析型粒徑篩析層析(SEC)研究LRP5選擇性VHH之聚集及多聚化的潛在發生。為此，經由Agilent SEC-3管柱上之Dionex Ultimate 3000設備以0.5 mg/mL注射8 ug經純化之VHH樣品。使用L-精胺酸緩衝液(10 mM磷酸鹽，300 mM Arg-HCl，pH 6.0)作為移動相並施加1 mL/min之流速。在SEC分析期間LRP5選擇性VHH均未顯示主要聚集問題：對於大多數樣品，概況指示單體多於95%。
實例 5 ：半衰期延長之雙互補位構築體之產生及表徵 使用LRP5選擇性Wnt1及Wnt3a VHH作為構建單元以產生如圖1中所繪示之雙互補位構築體。使用與血清白蛋白結合性VHH之遺傳融合作為半衰期延長方法。三個構建單元(Wnt1阻斷劑、Wnt3a阻斷劑及白蛋白結合劑)係經由撓性連接體連接。在巴斯德畢赤酵母中產生VHH並如實例3中所闡述進行純化。根據如(例如) WO2012/131078中所報導之標準程序，將所得構築體(即雙互補位半衰期延長之LRP5選擇性VHH構築體)以C-末端cMyc-帶六組胺酸標籤之VHH構築體形式選殖於巴斯德畢赤酵母表現載體pAX159中。探索不同定向之構建單元及不同之連接體，尤其GS-連接體。基於反映LRP5中潛在Wnt1與Wnt3a結合位點之間的擴展表面積之同源性建模數據，選擇相對較長之GS-連接體。藉由將人類血清白蛋白/ HSA結合VHH置於中間，獲得關於組合之Wnt1及Wnt3a報導基因分析中之功效之最佳結果。使用35 GS連接體，且Wnt1及Wnt3a VHH阻斷劑係以較佳次序排列。
為選擇最佳VHH結合劑及結合劑組合，產生庫，其中將人類血清白蛋白(HSA)結合VHH置於LRP5選擇性Wnt1-Wnt3a阻斷劑之間。具體而言，在庫中使用在Wnt1或Wnt3a分析(報導基因及磷酸化分析)中具有高功效及效能之高親和力結合劑組以產生如圖1中所繪示設計之半衰期延長之雙互補位構築體。在巴斯德畢赤酵母中表現(如實例3中所報告)、之後純化後，隨後在Wnt1及Wnt3a報導基因分析(闡述於實例4中)中在30 uM HSA存在下以三種稀釋度(1/100、1/1000、1/7000)篩選半衰期延長之雙互補位構築體，以評價效能及相對功效。一般而言，在Wnt1及Wnt3a報導基因分析中之數據之間觀察到良好之相關性，且量測到多個格式化結合劑之高效能。選擇總共十個半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性構築體以用於進一步表徵，此慮及兩個報導基因分析中之效能及Wnt1及Wnt3a阻斷劑之多樣性。此進一步之表徵分析闡述於下文。
Wnt1 / Wnt3a 報導基因分析： Wnt1及Wnt3a報導基因分析係如實例4.4中所闡述在30 uM HSA最終濃度存在下實施。自2.5 µM開始以12個稀釋度測試經純化之雙互補位LRP5選擇性構築體。
大部分構築體顯示高功效(其中IC50 值分別在Wnt3a報導基因分析中低於1 nM且在Wnt1報導基因分析中低於5.7 nM)，且在LRP5依賴性Wnt訊息傳導之兩個報導基因分析中均具有全效能。
實例 6 ： VHH 及 VHH 構築體之序列最佳化 序列最佳化係使親代序列突變以使其與人類IGHV3-IGHJ種系共有序列更一致之過程。舉例而言，以蛋白質結構、活性及穩定性應得以保持之方式將框架區中之特定胺基酸(所謂的標誌殘基除外)交換為其人類對應體。
該等突變可如下分類：1. 標準：預期該等位置之序列最佳化不會顯著改變VHH之穩定性或活性或親和力，且其因此一次性全部改變，從而產生基礎變體。 2. 獨特：尚不知該等位置之序列最佳化是否影響VHH之穩定性或活性或親和力，且因此在基礎變體之上個別地對其進行研究。
已知標誌殘基對於VHH之穩定性、活性及親和力至關重要且因此不使其突變。
另外，有實驗證據表明其對轉譯後修飾(PTM)敏感之在CDR中存在之胺基酸係以在使蛋白質結構、活性及穩定性應完整保留的同時使PTM位點不活化之此一方式來改變。針對抗體及VHH所闡述之最常見之轉譯後修飾列示於下表IV中。在加速應力研究中分析VHH對轉譯後修飾之敏感性，施加若干標準條件，包括H2 O2 處理以分析甲硫胺酸氧化、高溫、高pH及長期儲存以研究天冬醯胺去醯胺及天冬胺酸鹽異構化。氧化、去醯胺及異構化之百分比係根據標準程序來量測並與參考樣品(儲存在-20℃下之VHH)進行比較。實施反相層析(RPC)中之全蛋白分析及使用質譜(MS)之肽圖譜分析以鑑別潛在敏感殘基。在應力測試後在VHH中觀察到轉譯後修飾之情形下，使相應一或多個胺基酸突變。表 IV ： 潛在轉譯後修飾及可能觸發其之基序
因此，在上文所陳述之構築體中引入若干個突變，從而尤其產生上表III中所示之三個構築體，其經選擇以用於進一步活體外及活體內表徵，如下文實例中所進一步陳述。
實例 7 ：與 LRP6 結合分子相比，三種半衰期延長之雙互補位 LRP5 特異性 VHH 構築體之活體外表徵； 在VHH序列最佳化後，將三種半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體(參見上表III)重組表現並純化，並使用如下文所闡述之若干種功能及生物物理學分析進行表徵。
7.1 FACS 結合分析 藉由FACS分析在細胞上測定與人類LRP5及LRP6之結合，如圖2A及2B中所分別報告。具體而言，與人類LRP5之結合係在穩定過表現人類LRP5之HEK293細胞上測定。對於人類LRP6結合，使用穩定過表現人類LRP6之HEK293細胞。使細胞與LRP5結合劑稀釋液(對應於圖2A及圖2B中所指示最終濃度之結合劑之1:5連續稀釋液)一起在板振盪器上在4℃下培育1.5小時。在用FACS緩衝液(1× PBS (Invitrogen目錄號141190-094) + 10% FBS (Sigma目錄號F7524) + 0.05%疊氮化鈉)將細胞洗滌5次之後，使其與結合至VHH框架區之多株小鼠抗體一起在4℃下培育1小時。在用FACS緩衝液將細胞洗滌3次之後，使細胞與經標記之二級抗體(抗小鼠PE (115-116-071)一起在4℃下培育1小時，之後為利用FACS緩衝液洗滌3次之步驟。使用FACS陣列(BD)量測螢光。與人類LRP5及LRP6之結合對應於在所測試之最高濃度下≥ 3000之MCF值。陰性對照係由非靶向結合劑(結合至不在HEK293細胞中表現之細菌蛋白之VHH構築體)組成。如圖2A中所示，與人類LRP5之結合對應於在三種半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體之最高測試濃度下≥ 3000之MCF值。相比之下，未檢測到與人類LRP6之結合(MCF值≤ 300)，如圖2B中所示。該等數據確認，在細胞分析系統中，格式化、雙互補位且序列最佳化之結合分子以其天然構形選擇性地結合至人類LRP5受體。與hLRP5結合之EC50值報告於下表V中。表 V ：藉由FACS結合分析所測定之與人類LRP5結合之EC50 值
將LRP5選擇性格式化、雙互補位且序列最佳化之結合分子之特異性與WO2011/138391中所報導之先前所揭示之LRP6結合分子進行比較：在WO2011/138391中，揭示結合至LRP6且抑制Wnt1及Wnt 3配體相互作用二者之多價抗體。該等多價LRP6結合抗體係由作為第一受體結合結構域之IgG抗體及作為第二受體結合結構域之scFv片段組成之雙互補位LRP6結合分子，其中該IgG抗體及scFv片段藉由連接體連接在一起。據WO2011/138391中報導，所有LRP6結合分子在Wnt1及Wnt3a報導基因分析中具有大致相同之功效(WO2011/138391之圖18)。因此，可選擇彼等多價LRP6結合分子中之任一者用於比較實驗。因此，決定使用「901」構築體(稱為MOR08168IgG1LALA 6475 scfv；亦示於WO2011/138391之圖27中)作為第一比較化合物。
此「901」構築體之衍生物示於WO2013/067355中。特定而言，揭示命名為801T及802T之化合物(參見該說明書第132頁上之揭示內容)，該兩者均具有兩個LRP6結合scFv結構域加上半衰期延長部分體。由於801T及802T似乎具有相同活體外功效及生物物理學特性，因此以下所闡述之實驗中僅包括其中之一者(即變體802T)。
使用實例3中所闡述之FACS結合分析將半衰期延長之雙互補位LRP5特異性VHH構築體之結合親和力與MOR08168IgG1LALA 6475 scfv雙互補位LRP6結合分子進行比較。如在本發明之過程中所發現及圖2A及圖2B所示，MOR08168IgG1LALA 6475 scfv雙互補位LRP6結合分子結合至人類LRP5及人類LRP6二者，此對應於在所測試之最高濃度下≥ 3000之MCF值；相比之下，本發明之半衰期延長之雙互補位LRP5特異性VHH構築體僅結合至人類LRP5，而在人類LRP6上檢測不到結合(MCF值≤ 300)。該等數據顯示，當與WO2011/138391中所報導之先前所揭示之LRP6結合分子(其在本發明之過程中測試時，證明係LRP5/LRP6交叉反應性結合劑)相比時，半衰期延長之雙互補位LRP5特異性VHH構築體具有不同結合特異性(LRP5選擇性結合劑)。
7.2 FACS - DKK1 競爭分析 使用基於FACS之DKK1競爭分析進一步分析LRP5選擇性VHH構築體之功效及效能，如實例4.1中所闡述。使穩定過表現人類LRP5或小鼠LRP5之HEK293細胞與LRP5選擇性VHH構築體之連續稀釋液(對應於圖3A及圖3B所指示最終濃度之1:5連續稀釋液)一起培育。LRP5選擇性VHH與人類DKK1競爭結合至過表現人類LRP5之HEK293細胞，以及競爭結合至過表現小鼠LRP5之HEK293細胞，如圖3A及3B中分別所示。在最高測試濃度(≥ 1 µM)下達成對DKK1結合之完全抑制且對應於≤ 100之MCF值。作為此實驗之結果，可顯示本發明之LRP5選擇性VHH與人類DKK1競爭結合至過表現人類LRP5之HEK293細胞以及競爭結合至過表現小鼠LRP5之彼等(即隨著結合劑之濃度增加，MCF值降低，其中DKK1結合之完全抑制對應於在所測試之最高濃度下≤ 100之MCF值)。因此，本發明之LRP5選擇性VHH係小鼠交叉反應性的。該數據強化以下概念：格式化、雙互補位且序列最佳化之結合分子以其天然構形結合至人類/小鼠LRP5受體。
7.3 組合之 Wnt1 及 Wnt3a 報導基因分析 使用如實例4.4中所闡述之Wnt1及Wnt3a報導基因分析分析格式化、雙互補位且序列最佳化之LRP5結合性分子之功效及效能。在圖4A中，報告為「Wnt1」之螢光比率值[460/535nm]對應於Wnt1路徑之活化，其係自Wnt1過表現細胞測定；Wnt1路徑之完全抑制對應於≤ 0.8之螢光比率[460/535nm]。在圖4B中，報告為「Wnt3a」之螢光比率值[460/535nm]對應於Wnt3a路徑之活化，其係自Wnt3a過表現細胞測定；圖4B中報告為「基線」之螢光比率值[460/535nm]對應於Wnt3a路徑之完全抑制，其係藉由用陽性對照(DKK1；200 nM最終濃度)處理來測定。如圖4A及4B中所示，Wnt1及Wnt3a路徑二者之完全抑制係藉由利用三種LRP5選擇性、格式化、雙互補位且序列最佳化之結合分子處理來達成。此外，亦報告高功效，如下表VI中由IC50值所示。表 VI ：Wnt1及Wnt3a路徑抑制之IC50 值
實例 8 ：三種半衰期延長之雙互補位 LRP5 選擇性 VHH 構築體對癌細胞系中之 Wnt 訊息傳導及存活率之效應 使用具有活躍Wnt訊息傳導之癌細胞系進一步表徵半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體抑制活躍Wnt訊息傳導之能力，如先前所闡述(Bafico等人，「An autocrine mechanism for constitutive Wnt pathway activation in human cancer cells」.Cancer Cell 2004;6(5):497-506；DeAlmeida等人，「The soluble wnt receptor Frizzled8CRD-hFc inhibits the growth of teratocarcinomas in vivo」.Cancer Res . 2007;67(11):5371-9)；Akiri等人，「Wnt pathway aberrations including autocrine Wnt activation occur at high frequency in human non-small-cell lung carcinoma」.Oncogene . 2009;28(21):2163-72)。簡言之，將具有活躍Wnt訊息傳導之癌細胞系PA-TU-8988S接種於12孔板中，並用LRP5選擇性VHH構築體以1 µM之最終濃度處理過夜。抑制Wnt訊息傳導之能力係藉由內源性Wnt靶基因Axin2之mRNA表現之抑制來檢測。使用標準RNA技術來實施qPCR表現分析：RNA分離係根據QIAGEN提供之方案使用QIAGEN RNeasy Mini套組來實施；cDNA合成使用SuperScript VILO cDNA合成套組(Invitrogen，目錄號11754050)且qPCR使用利用Axin2 TaqMan引子/探針(Hs00610344_m1 AXIN2 FAM, Life Technologies)及真核18s內源性對照VIC-MGB (4319413E-1307061, Applied Biosystems)之TaqMan基因表現分析。
如圖5 (右圖)中所示，當與未經處理之細胞或經非靶向VHH構築體處理之細胞(陰性對照)相比時，經半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體處理之PA-TU8988S癌細胞顯示顯著降低之Axin2相關mRNA含量(即正規化至內源性對照)。該等數據展現半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體在具有活躍Wnt訊息傳導之癌細胞系中抑制Wnt訊息傳導之能力。此外，在PA-TU8988S癌細胞系中研究Wnt訊息傳導阻斷對細胞存活率之效應，先前報導該細胞系之增殖依賴於活躍Wnt訊息傳導(Jiang等人，「Inactivating mutations of RNF43 confer Wnt dependency in pancreatic ductal adenocarcinoma」. Proc Natl Acad Sci U S A . 2013; 110(31):12649-54)。在經半衰期延長之雙互補位LRP5特異性VHH構築體(最終濃度為1 µM)或經非靶向VHH構築體(陰性對照)或經多柔比星(最終濃度為1 µM；陽性對照)處理10天後，藉由實施Alamar Blue分析(Invitrogen，目錄號DAL1100)來量測細胞存活率。如圖5 (左圖)中所示，當與未經處理之細胞或經對細胞存活率無效應之陰性對照處理之細胞相比時，經半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體處理之PA-TU8988S癌細胞顯示顯著降低之活細胞百分比(≥ 75%降低)。細胞存活率之最大降低對應於利用化學治療劑(例如多柔比星)之處理(≥ 80%降低)。該等數據展現半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體抑制依賴於活躍Wnt訊息傳導之癌細胞的細胞增殖之能力。
實例 9 ：活體內效能 在Wnt驅動之腫瘤模型中活體內進一步表徵LRP5選擇性雙互補位半衰期延長之VHH構築體/結合分子。進行實驗以確定該等結合分子是否在活體內抑制腫瘤生長。使用小鼠乳房腫瘤病毒LTR增強子(MMTV啟動子)之Wnt配體之轉基因表現在小鼠中導致廣泛導管增生，之後在6月齡時在轉基因(TG)小鼠中導致乳房腺癌。該等乳房腫瘤受糖皮質激素誘導之Wnt配體過表現驅動且具有與TNBC腫瘤類似之特性，包括上皮及間葉細胞標記物(基底樣表型)之表現及如藉由細胞內β-連環蛋白定位所評價之活躍Wnt訊息傳導。具體而言，源自MMTV-Wnt-1轉基因小鼠之乳房腫瘤係Wnt1依賴的。據報導，使用包含融合至人類Fc結構域之捲曲受體8富含半胱胺酸之結構域(CRD) (F8CRDhFc)之可溶性Wnt受體阻斷Wnt活性(DeAlmeida等人， 「The soluble wnt receptor Frizzled8CRD-hFc inhibits the growth of teratocarcinomas in vivo」.Cancer Res . 2007;67(11):5371-9)抑制活體內腫瘤生長。因此，在起始效能實驗之前，將自MMTV-Wnt1轉基因小鼠分離之腫瘤作為腫瘤塊在裸小鼠中皮下傳代2代至5代。在植入後14天與21天之間，當腫瘤達到大約150 mm3 至300 mm3 之平均體積時，將小鼠隨機分組，每組7隻小鼠並i.v. 投用化合物。將LRP5選擇性雙互補位半衰期延長之VHH構築體每週三次(F012900082)或每週兩次(F012900141)i.v. 投與小鼠，其中圖6A中所示之劑量係針對F012900082且圖6B中所示之劑量係針對F012900141。在效能實驗期間監測腫瘤體積(左圖)及體重(右圖)，且中值腫瘤體積報告於圖6A及6B中。在效能實驗結束時測定腫瘤生長抑制(TGI)。具體而言，與對照組(用組胺酸緩衝液(20 mM組胺酸pH 6.5緩衝液)治療小鼠)相比測定每一治療組之TGI。此外，在效能實驗結束時實施胃腸(GI)組織病理學分析(經由對來自十二指腸至直腸之GI道切片之H&E染色)以評估LRP5拮抗劑之潛在毒性。表VIIA及VIIB中報告每一治療組之腫瘤生長抑制(TGI)、在活體內效能研究結束時GI組織病理學分析之結果、對應於由於體重顯著損失(與效能實驗開始時相比體重損失＞18%)而需要處死之小鼠數量之死亡率及腫瘤消退數量(實驗結束時之腫瘤體積小於治療開始時之腫瘤體積量測)，且與圖6A及6B中亦分別顯示之實驗及數據有關。表 VIIA ：每週i.v. 投與三次之F012900082之活體內效能。此實驗之結果亦示於圖6A中。 表 VIIB ：每週兩次i.v. 投與之F012900141之活體內效能。此實驗之結果亦示於圖6B中。
如圖6A至6B及上表VIIA及VIIB中所示，用LRP5選擇性半衰期延長之雙互補位VHH構築體(F012900082在3次/週時間表中以50 mg/kg且F012900141在2次/週時間表中以15 mg/kg及50 mg/kg)治療使得腫瘤消退(即腫瘤生長抑制(TGI) ＞ 100%，此對應於腫瘤萎縮；與效能實驗開始時之腫瘤體積相比，在該實驗結束時腫瘤體積降低)，無顯著體重變化(＜ 10%)且在GI組織病理學分析後未報告有所發現，此表明係耐受性良好之治療。
對於癌症患者之治療而言，腫瘤萎縮(即腫瘤消退)係期望治療效應(即效能)。在臨床研究中，誘導腫瘤消退從而導致病理完全反應(pCR)之治療積極地產生高度未滿足醫學需求適應症(例如乳癌)中無進展存活及總體存活之顯著改良。此外，在有效劑量量下耐受性良好且無脫腫瘤-在靶(off tumor - on target)不良效應之治療具有臨床相關性。
作為對比，研究MOR08168IgG1LALA 6475 scfv雙互補位LRP6結合分子是否可提供類似有利效應。出於此目的，在小鼠中如下實施活體內耐受性研究：MOR08168IgG1LALA 6475 scfv化合物係以3 mg/kg每週兩次(2qw)i.v. 投與；此係WO2011/138391中之異種移植物腫瘤模型中所檢測到活體內效能之相同劑量/方案，如其中之圖22中所闡述。在第1天實施利用MOR08168IgG1LALA 6475 scfv之第一治療且自第6天開始，在小鼠中檢測到顯著之體重損失。在第10天，一些經MOR08168IgG1LALA 6475 scfv化合物治療之小鼠顯示顯著之體重減輕(＞10%)。在第11天，將小鼠處死，且胃腸(GI)組織病理學分析揭示在小鼠之結腸中及盲腸中具有伴糜爛之發炎。該等數據表明，在有效劑量/方案下MOR08168IgG1LALA 6475 scfv不耐受。因此，就治療窗而言，LRP5選擇性雙互補位半衰期延長之VHH構築體係優異的；即其誘導腫瘤消退而無顯著體重變化(＜ 10%)且在GI組織病理學分析後未報告有所發現。
實例 10 ：活體內 Wnt 路徑抑制 為進一步表徵LRP5選擇性雙互補位半衰期延長之VHH構築體/結合分子對Wnt訊息傳導之效應，在實例9中所闡述之效能實驗結束時將腫瘤分離。具體而言，在用化合物(F012900082 (50 mg/kg)或F012900141 (15 mg/kg))或用對照治療最後一次注射後24小時將腫瘤分離。Wnt訊息傳導抑制係藉由降低Axin2以及其他Wnt靶基因(分別用F012900082及F012900141治療之腫瘤中的RNF43及Notum)之mRNA表現來測定，如實例8中所闡述進行分析。使用TaqMan引子/探針來分析Notum及RNF43 (Mm01253278_m1 Notum FAM及Mm00552558_m1 RNF43 FAM Life Technologies)。Axin2、RNF43或Notum mRNA表現相對於對照組之倍數變化報告於圖7 (左手側，F012900082之活體內效能(參見圖6A))中及圖7 (右手側，F012900141之活體內效能(參見圖6B))中。
如自圖7可見，與對照組相比，在經LRP5選擇性結合分子治療之腫瘤中觀察到Axin2、RNF43及Notum mRNA表現之顯著降低。該等結果表明，LRP5選擇性結合分子能夠藉由阻抑腫瘤細胞中之Wnt訊息傳導來抑制腫瘤生長。
實例 11 ：工業 製造 製程 11.1 發酵 ： 上表III中所陳述多肽中之任一者均可在誘導型啟動子控制下表現於諸如W3110、TG1、BL21、BL21(DE3)、HMS174、HMS174(DE3)、MM294等不同大腸桿菌菌株之細胞質中。此啟動子可選自lacUV5、tac、T7、trp、T5、araB。培養基較佳根據以下完全定義：Wilms等人，2001 (Wilms, B., Hauck, A., Reuss, M., Syldatk, C., Mattes, R., Siemann, M.及Altenbuchner, J.：High-Cell-Density Fermentation for Production of L-N-Carbamoylase Using an Expression System Based on the Escherichia coli rhaBAD Promoter. Biotechnology and Bioengineering, 73: 95-103 (2001))、DeLisa等人，1999 (DeLisa, M. P., Li, J. C., Rao, G., Weigand, W. A.及Bentley, W. E.：Monitoring GFP-operon fusion protein expression during high cell density cultivation of Escherichia coli using an on-line optical sensor. Biotechnology and Bioengineering, 65: 54-64.(1999))或等效內容。然而，用諸如異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸及纈胺酸等胺基酸或諸如大豆蛋白腖或酵母提取物等之複合培養基組分補充培養基可係有益的。發酵製程係以饋料分批模式實施。條件：溫度30℃- 40℃，pH 6 - 7.5，溶解氧保持在20%以上。在將初始C源消耗之後，向培養物進給上文所述之進料培養基(或等效物)。當發酵罐中之細胞乾重達到40 g/L至90 g/L時，利用對應於所用啟動子系統之適當誘導物(例如IPTG、乳糖、阿拉伯糖)誘導培養物。誘導可藉由將各別誘導物經延長時間進給至發酵罐中作為脈衝完全誘導或作為部分誘導來實施。生產期應持續至少4小時。藉由在碗式離心機(bowl centrifuge)、管式碗式離心機(tubular bowl centrifuge)或碟盤式離心機(disc stack centrifuge)中離心回收細胞，棄掉上清液。
11.2 純化 ：將大腸桿菌細胞團塊重新懸浮於6倍至8倍量之溶解緩衝液(磷酸鹽或Tris緩衝液，pH 7-8.5)中。細胞溶解較佳藉由高壓均質化來實施，之後藉由於碗式、管式碗式或碟盤式離心機中離心去除細胞碎片。視情況使用0.22-10 µm過濾器過濾含有靶蛋白之上清液並經由陽離子交換層析(例如Toyopearl MegaCap® II SP-550EC、Toyopearl GigaCap S-650M、SP Sepharose BB、SP Sepharose FF或S HyperCelTM )在pH 7-8.5下進行分離。藉由線性增加NaCl梯度在pH 7-8.5下實施溶析。將含有靶蛋白之流份合併並隨後與5-10 mM DTT一起培育以防止由游離半胱胺酸殘基介導之二聚化或聚集。在進一步添加0.8-1 M硫酸銨或2-3 M NaCl之後，經由親水性相互作用層析(例如Phenyl Sepharose HP、Phenyl Sepharose FF、Butyl Sepharose HP、Butyl Sephrose FF、Butyl Toyopearl 650 (S,M,C)、Phenyl Toyopearl 650 (S,M,C))在pH 7-8.5下將溶液分離。在5 mM DTT存在下，藉由線性降低之硫酸銨或NaCl梯度在pH 7-8.5下實施溶析。將含有純度值最低90%之靶蛋白之流份合併並藉由在5 mM DTT存在下滲濾脫鹽，之後濃縮至大約5 mg/ml。隨後藉由用50 mM Tris、150 mM NaCl、4 mM胱胺、10 mM CHAPS在pH 8.5下將蛋白質溶液1:5-1:20稀釋至最終蛋白質濃度為0.25-1 mg/ml來實施重摺疊。將重摺疊溶液在室溫下在攪拌下培育12-36 h，且然後藉由陽離子交換層析(例如SP Sepharose FF、SP Sepharose HP、Toyopearl SP-650 (S, M, C))在pH 7-8.5下分離。藉由線性增加NaCl梯度在pH 7-8.5下實施溶析。將含有單體靶蛋白之流份合併並經由滲濾調配於25 mM磷酸鈉、220 mM無內毒素之海藻糖(pH 7.5)中。藉由過濾將溶液滅菌並儲存在2℃至8℃下。
實例 12 ：用於 s.c. 投與之醫藥調配物 可選擇本發明之任一以上雙互補位多肽構築體以用於製造具有如下組成之用於皮下施加之醫藥調配物： 原料藥： 100 mg/ml (1 nmol/ml至3 nmol/ml) 乙酸鹽緩衝液： 25 mM 海藻糖： 220 mM Tween-20： 0.02 % 將原料藥調配於具有以上組成之溶液中，滅菌並儲存在2℃至8℃下。
實例 13 ：人類中之醫藥用途 每兩週至四週藉由靜脈內輸注(劑量為100 mg至200 mg)將如上文實例11.2中所製備之溶液施加至有需要之患者，例如患有對Wnt訊息傳導抑制劑敏感之癌症的人類。
實例 14 ：在離體分析中 Wnt3a- 訊息傳導抑制對由樹突細胞釋放之促發炎細胞介素之效應 在獲得知情同意之情形下自健康供體獲得PBMC。如下產生人類單核球源樹突細胞(Mo-DC)：將PBMC於補充有50 ng/mL GM-CSF及50 ng/mL IL-4之X-VIVO培養基中培養。在培養24 h後，將上清液小心地去除並用補充有相同GM-CSF及IL-4之X-VIVO培養基替換。在第四天，移除細胞之等分試樣用於LRP5及LRP6表現之FACS分析，且將剩餘細胞之上清液小心地去除並用X-VIVO培養基在僅LPS存在下或與人類Wnt3a或與人類Wnt3a及LRP5選擇性結合分子組合來替換。次日，收集上清液並根據製造商之說明書經由ELISA使其經受TNF-α之分析。
如實例7.1中所闡述使用以下抗體實施分化樹突細胞(DC)之FACS分析：-LRP5特異性單株抗體：小鼠IgG1抗人類LRP5 -純系1E9 (Sigma編號WH0004041M1)，自1 mg/ml至10 µg/ml之1:100連續稀釋液 - LRP6特定單株抗體：小鼠IgG2a抗人類LRP6 (R&D編號Mab1505)；自500 µg/ml至10 µg/ml之1:50連續稀釋液 -對照：小鼠IgG2a同型對照(Dako編號X0943)；1:10之連續稀釋液 -二級經標記之多株抗體：山羊抗小鼠IgG/Fc - PE (Dianova編號115-115-164)；1:100稀釋液。
如圖8 (左圖)中所報告，當與對照相比時，藉由FACS分析經分化DC檢測到LRP5之高表現(高PE-A值)。亦檢測到LRP6表現，但當與LRP5相比時程度較低(LRP6 PE-A值＜ LRP5 PE-A值)。
如先前所報導(Oderup等人，「Canonical and noncanonical Wnt proteins program dendritic cell responses for tolerance」.J Immunol. 2013;190(12): 6126-34)，且如圖8中所示，Wnt3a直接抑制經分化DC之促發炎細胞介素分泌(即TNF-α釋放)。藉由添加LRP5選擇性結合分子修復Wnt3a驅動之對來自DC之TNF-α釋放之阻抑。
該等數據顯示，格式化、雙互補位且序列最佳化之結合分子能夠修復經Wnt3a處理之樹突細胞之TNFα分泌，藉此阻抑Wnt對樹突細胞之抑制性效應。
重要的是應注意阻斷腫瘤微環境中樹突細胞中之Wnt路徑代表打破腫瘤介導之免疫抑制及增強抗腫瘤免疫性之潛在治療方法。
為研究DC對T細胞(效應T細胞)之效應，使經Wnt3a與或不與LRP5/選擇性結合分子一起預處理之DC與自PBMC分離之T細胞一起共培養，如先前所闡述(Oderup等人，「Canonical and noncanonical Wnt proteins program dendritic cell responses for tolerance」. J Immunol. 2013;190(12): 6126-34)。在DC/T細胞共培養3天之後，收集上清液並根據製造商之說明書經由ELISA使其經受IFNγ之分析。
IFNγ分泌係T細胞活化之標記物。如圖8 (中圖及右圖)中所示，Wnt3a介導之DC抑制導致T細胞之IFNγ分泌降低(T細胞功能抑制)，其藉由用LRP5選擇性結合分子處理而修復。
總之，該等數據顯示LRP5選擇性結合分子阻抑Wnt對樹突細胞之抑制性效應，從而使得T細胞功能修復。
已知T細胞之連續活化/刺激誘導終末分化，從而導致T細胞表型耗竭，即T細胞功能逐漸喪失。因此，設想由DC活化介導之LRP5選擇性結合分子對T細胞之效應可受T細胞耗竭限制。因此，預期組合治療(將LRP5選擇性結合分子之投與與阻斷T細胞耗竭之免疫檢查點抑制劑之投與組合)有助於活化並維持T細胞功能，藉此改變腫瘤微環境並藉此支持本發明之分子之治療效應。
實例 15 ：三種半衰期延長之雙互補位 LRP5 選擇性 VHH 構築體對 RNF43 突變 CRC 類器官中 Wnt 訊息傳導及存活率之效應 使用RNF43 突變結腸直腸癌(CRC)類器官表徵半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體選擇性地抑制增殖(藉由細胞存活率之抑制檢測)及活躍Wnt訊息傳導(藉由Axin2 mRNA含量之降低檢測)之能力。CRC類器官係如先前所闡述(van de Wetering等人，「Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients」.Cell 2015;161(4):933-45)確立。簡言之，為實施細胞存活率分析，使三種CRC患者源類器官(RNF43 mut1、RNF43 mut2及RNF43 WT)中之每一者經由40 μm過濾器過濾並接種於384孔板(塗覆有基底膜基質-BME)中。具體而言，將約500個類器官重新懸浮於每孔40 μl培養基(含有5% BME)之總體積中。培養基不含Wnt配體。使用Tecan D300數位分配器使化合物分佈。使類器官暴露於LRP5選擇性VHH構築體或對照化合物之8點稀釋系列及一種固定濃度之星形孢菌素(staurosporin)(2 μM)。在類器官接種後第0天及第3天添加新鮮化合物。5天後，使用CellTiter-Glo 3D細胞存活率分析(Promega)來測定CRC患者源類器官之細胞存活率。CellTiter-Glo 3D細胞存活率分析係用以基於所存在ATP之定量測定3D細胞培養物中活細胞數量之均相法，該ATP係代謝活性細胞存在之標記物。在每一實驗中，用半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體及對照化合物處理係以每類器官系一式三份運行。作為內部對照，該三種CRC患者源類器官亦經DMSO及星形孢菌素處理，且相應細胞存活率數據係用作參照：DMSO值作為100%存活且星形孢菌素值作為0%存活。將DMSO添加至所有孔以正規化至最高濃度(星形孢菌素中之DMSO為0.1%)。
為使用qRT-PCR分析Axin2 mRNA含量，使三種CRC患者源類器官(RNF43 mut1、RNF43 mut2及RNF43 WT)中之每一者經由40 μm過濾器過濾並接種於384孔板(塗覆有BME)中。具體而言，將約500個類器官重新懸浮於每孔40 μl培養基(含有5% BME)之總體積中。培養基不含Wnt配體。使用Tecan D300數位分配器使化合物分佈。使類器官暴露於62 nM最終濃度之半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體或1 µM對照化合物。在第0天添加化合物且在處理24小時後收穫類器官以實施qRT-PCR分析並測定作為活躍Wnt訊息傳導抑制之生物標記物之Axin2 mRNA含量。
如圖9中所示，當與經對細胞存活率無效應之非靶向VHH構築體(對照)處理之細胞相比時，經半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體處理之RNF43 突變CRC類器官(RNF43 mut1、RNF43 mut2)顯示顯著降低之活細胞百分比(≥ 50%降低)。當與經對照化合物處理之細胞相比時，經半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體處理之RNF43野生型CRC類器官(RNF43 WT)顯示對細胞存活率無效應。該等數據展現半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體選擇性地抑制依賴於活躍Wnt訊息傳導之在RNF43 基因中具有突變之癌細胞的細胞增殖之能力。
如圖10中所示，當與經對照(最終濃度為1 µM)處理之細胞相比時，經半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體(最終濃度為62 nM)處理之RNF43 突變CRC類器官(RNF43 mut1、RNF43 mut2)顯示顯著降低之Axin2相關mRNA含量(即正規化至內源性對照)。當與經對照化合物(最終濃度為1 µM)處理之細胞相比時，經半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體(最終濃度為62 nM)之RNF43野生型CRC類器官(RNF43 WT)顯示對Axin2 mRNA含量無顯著效應。該等數據展現半衰期延長之雙互補位LRP5選擇性VHH構築體選擇性地抑制在RNF43 基因中具有突變之癌細胞的Wnt訊息傳導之能力。
圖 1 顯示拮抗Wnt1及Wnt3a訊息傳導之雙互補位(biparatopic)多肽之示意圖示。其係由三個結構域組成，其中兩個結構域結合至LRP5之不同表位(Wnt1及Wnt3a阻斷劑)且一個結構域用於半衰期延長(人類血清白蛋白結合劑)。圖 2A/2B 顯示當與由非靶向結合劑(結合至不在HEK293細胞中表現之細菌蛋白之VHH構築體)組成之陰性對照相比及與LRP5/6-交叉反應性結合劑MOR08168IgG1LALA 6475 scfv相比時，三種半衰期延長之雙互補位LRP5-選擇性VHH構築體(即本發明之尤佳多肽)與過表現人類LRP5 (圖2A)及人類LRP6 (圖2B)之HEK293細胞系之結合。與LRP5/6-交叉反應性結合劑形成對比，本發明之半衰期延長之雙互補位LRP5特異性VHH構築體僅結合至人類LRP5，而在人類LRP6上檢測不到結合。圖 3A/3B 顯示三種半衰期延長之雙互補位LRP5-選擇性VHH構築體(即本發明之尤佳多肽)對於結合至過表現人類LRP5 (圖3A)及小鼠LRP5 (圖3B)二者之HEK293細胞系之完全DKK1競爭，如藉由基於FACS之DKK1競爭分析所檢測。圖 4A/4B 顯示三種半衰期延長之雙互補位LRP5-選擇性VHH構築體(即本發明之尤佳多肽)對Wnt1 (圖4A)及Wnt3a路徑(圖4B)之完全抑制。圖 5 顯示在經半衰期延長之雙互補位LRP5-選擇性VHH構築體(即本發明之尤佳多肽)(最終濃度為1 µM)處理後，如藉由相關Axin2 mRNA表現之抑制所檢測之癌細胞中Wnt訊息傳導之抑制(右圖)，及如藉由活細胞之百分比(%)降低所檢測之細胞增殖(左圖)。圖 6A/6B 顯示半衰期延長之雙互補位LRP5-選擇性VHH構築體(圖6A中之F012900082及圖6B中之F012900141)(即本發明之尤佳多肽)在Wnt驅動之腫瘤模型(MMTV-Wnt1異種移植物模型)中之活體內效能。圖 7 顯示經半衰期延長之雙互補位LRP5-選擇性VHH構築體(即本發明之尤佳多肽)處理之腫瘤中的Wnt路徑抑制，如藉由相對於對照組，Axin2/RNF43/Notum mRNA表現降低所檢測。圖 8 顯示在人類單核球源樹突細胞中，LRP5表現高於LRP6 (左圖)。此外，如藉由干擾素-γ釋放所測定之Wnt3a對T細胞活化之阻抑效應藉由經半衰期延長之雙互補位LRP5-選擇性VHH構築體(即本發明之較佳肽)處理得以強烈減輕(中圖及右圖)。每一符號表示獨特樹突細胞(DC)供體。將所示數據正規化至未處理對照之TNFα值，且每一符號表示DC及T細胞之獨特供體對。圖 9 顯示在經半衰期延長之雙互補位LRP5-選擇性VHH構築體(即本發明之尤佳多肽)處理後，當與RNF43 野生型CRC類器官增殖(RNF43 WT)上無顯著效應相比時，RNF43 突變CRC類器官增殖(RNF43 mut1及RNF43 mut2)選擇性地抑制，如藉由活細胞之百分比(%)降低所檢測。亦報告RNF43 突變CRC類器官增殖之抑制之IC50 nM值。圖 10 顯示在經半衰期延長之雙互補位LRP5-選擇性VHH構築體(即本發明之尤佳多肽)(最終濃度為62 nM)處理後，當與RNF43 野生型CRC類器官(RNF43 WT)中無顯著效應相比時，RNF43 突變CRC類器官(RNF43 mut1及RNF43 mut2)中之Wnt訊息傳導選擇性地抑制，如藉由相關hAxin2 mRNA表現之抑制所檢測。

Claims (49)

  1. 一種結合至低密度脂蛋白受體樣蛋白5 (LRP5)之多肽，該多肽包含選自由免疫球蛋白單一可變結構域(ISVD) (i)至(iv)組成之群之ISVD： (i) 包含以下互補性決定區(CDR)序列之ISVD： CDR1：TYVMG (SEQ ID NO:1) CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:2) CDR3：SRGTSTPSRASGVSRYDY (SEQ ID NO:3)， (ii) 包含以下CDR序列之ISVD： CDR1：RYAVA (SEQ ID NO:4) CDR2：AITWSSGRIDYADSVKG (SEQ ID NO:5) CDR3：DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY (SEQ ID NO:6)， (iii) 包含以下CDR序列之ISVD： CDR1：IGAMG (SEQ ID NO:7) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)，及 (iv) 包含以下CDR序列之ISVD： CDR1：INAMG (SEQ ID NO:10) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)。
  2. 如請求項1之多肽，其包含選自ISVD (i)及(ii)之第一ISVD以及選自ISVD (iii)及(iv)之第二ISVD。
  3. 如請求項2之多肽，其中該第一ISVD係ISVD (i)且該第二ISVD係ISVD (iii)。
  4. 如請求項2之多肽，其中該第一ISVD係ISVD (i)且該第二ISVD係ISVD (iv)。
  5. 如請求項2之多肽，其中該第一ISVD係ISVD (ii)且該第二ISVD係ISVD (iii)。
  6. 如請求項2之多肽，其中該第一ISVD係ISVD (ii)且該第二ISVD係ISVD (iv)。
  7. 如請求項1之多肽，其中該等ISVD係VHH結構域，較佳係人類化VHH結構域。
  8. 如請求項1之多肽，其中： ISVD (i)包含SEQ ID NO:11之序列或SEQ ID NO:23之序列， ISVD (ii)包含SEQ ID NO:12之序列 ISVD (iii)包含SEQ ID NO:13之序列或SEQ ID NO:22之序列，及/或 ISVD (iv)包含SEQ ID NO:14之序列。
  9. 如請求項8之多肽，其包含第一ISVD及第二ISVD，其中該第一ISVD包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:23之序列，且該第二ISVD包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:22之序列。
  10. 如請求項9之多肽，其中該第一ISVD包含SEQ ID NO: 11之序列且該第二ISVD包含SEQ ID NO:22之序列。
  11. 如請求項9之多肽，其中該第一ISVG包含SEQ ID NO:12之序列且該第二ISVD包含SEQ ID NO:13之序列。
  12. 如請求項9之多肽，其中該第一ISVD包含SEQ ID NO:23之序列，且該第二ISVD包含SEQ ID NO:14之序列。
  13. 如請求項2至12中任一項之多肽，其中該第一ISVD及該第二ISVD由連接體肽共價連接，其中該連接體肽視情況包含第三ISVD或由其組成。
  14. 如請求項2至12中任一項之多肽，其中該多肽進一步包含半衰期延長部分體，其中該半衰期延長部分體共價連接至該多肽且視情況選自由以下組成之群：白蛋白結合性部分體，例如白蛋白結合性肽或白蛋白結合性免疫球蛋白結構域；運鐵蛋白結合性部分體，例如抗運鐵蛋白免疫球蛋白結構域；聚乙二醇分子；人類血清白蛋白；及人類血清白蛋白之片段。
  15. 如請求項14之多肽，其中該半衰期延長部分體係白蛋白結合性部分體，較佳白蛋白結合性ISVD，更佳包含SEQ ID NO:21之序列之Alb11結構域。
  16. 一種多肽，其包含第一及第二LRP5結合性ISVD及一個白蛋白結合性ISVD， 該第一LRP5結合性ISVD選自由ISVD (i)及(ii)組成之群： (i) 包含以下CDR序列之ISVD： CDR1：TYVMG (SEQ ID NO:1) CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO:2) CDR3：SRGTSTPSRASGVSRYDY (SEQ ID NO:3) (ii) 包含以下CDR序列之ISVD： CDR1：RYAVA (SEQ ID NO:4) CDR2：AITWSSGRIDYADSVKG (SEQ ID NO:5) CDR3：DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY (SEQ ID NO:6)， 該第二ISVD選自由ISVD (iii)及(iv)組成之群： (iii) 包含以下CDR序列之ISVD： CDR1：IGAMG (SEQ ID NO:7) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9)，及 (iv) 包含以下CDR序列之ISVD： CDR1：INAMG (SEQ ID NO:10) CDR2：AVSSGGSTYYVDSVKG (SEQ ID NO:8) CDR3：ETGPYGPPKRDY (SEQ ID NO:9), 該白蛋白結合性ISVD藉由包含以下CDR序列來定義： CDR1：SFGMS (SEQ ID NO:15) CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO:16) CDR3：GGSLSR (SEQ ID NO:17)。
  17. 如請求項16之多肽，其中該第一ISVD係ISVD (i)且該第二ISVD係ISVD (iii)。
  18. 如請求項16之多肽，其中該第一ISVD係ISVD (i)且該第二ISVD係ISVD (iv)。
  19. 如請求項16之多肽，其中該第一ISVD係ISVD (ii)且該第二ISVD係ISVD (iii)。
  20. 如請求項16之多肽，其中該第一ISVD係ISVD (ii)且該第二ISVD係ISVD (iv)。
  21. 一種結合至LRP5之多肽，其包含選自SEQ ID NO: 18、19及20之序列或由其組成。
  22. 一種結合至LRP5之多肽，其包含與參考ISVD競爭結合至LRP5之ISVD，其中該參考ISVD具有由SEQ ID NO: 11、12、13、14、22或23所鑑別之序列；較佳地其中該ISVD阻斷LRP5之Wnt1或Wnt3a結合位點，具體而言其中該ISVD抑制Wnt1驅動或Wnt3a驅動之靶基因轉錄。
  23. 如請求項22之多肽，其包含與第一參考ISVD競爭結合至LRP5之第一ISVD，其中該第一參考ISVD具有由SEQ ID NO: 11、23或12所鑑別之序列；及與第二參考ISVD競爭結合至LRP5之第二ISVD，其中該第二參考ISVD具有由SEQ ID NO: 13、22或14所鑑別之序列；較佳地其中該第一ISVD阻斷LRP5之Wnt3a結合位點，具體而言抑制Wnt3a驅動之靶基因轉錄，及/或較佳地其中該第二ISVD阻斷LRP5之Wnt1結合位點，具體而言抑制Wnt1驅動之靶基因轉錄。
  24. 如請求項23之多肽，其中連接體肽將該第一ISVD共價連接至該第二ISVD，其中該連接體肽視情況包含另一ISVD，較佳白蛋白結合性ISVD，尤其如請求項16中所述之白蛋白結合性ISVD，或由其組成。
  25. 如請求項23之多肽，其中該第一及/或該第二ISVD係VHH結構域，較佳人類化VHH結構域。
  26. 一種結合至LRP5之多肽，其包含第一LRP5結合性結構域，較佳ISVD，及第二LRP5結合性結構域，較佳ISVD，其中該第一LRP5結合性結構域所結合之LRP5之區不同於該第二LRP5結合性結構域所結合之LRP5區。
  27. 如請求項26之多肽，其中該第一結構域阻斷LRP5之Wnt3a結合位點，且較佳抑制Wnt3a驅動之靶基因轉錄，及/或其中該第二結構域阻斷LRP5之Wnt1結合位點，且較佳抑制Wnt1驅動之靶基因轉錄。
  28. 如請求項22至27中任一項之多肽，其中該多肽進一步包含半衰期延長部分體，其中該半衰期延長部分體共價連接至該多肽且較佳選自由以下組成之群：白蛋白結合性部分體，例如白蛋白結合性肽或白蛋白結合性免疫球蛋白結構域(例如白蛋白結合性ISVD)；運鐵蛋白結合性部分體，例如抗運鐵蛋白免疫球蛋白結構域；聚乙二醇分子；人類血清白蛋白；及人類血清白蛋白之片段。
  29. 如請求項1至12及16至27中任一項之多肽，其中該多肽對LRP5，尤其人類LRP5之親和力及/或結合力為其對LRP6，尤其人類LRP6之親和力及/或結合力的至少10倍，較佳至少100倍，更佳至少1000倍，甚至更佳至少10000倍，甚至更佳至少100000倍。
  30. 如請求項1至12及16至27中任一項之多肽，其中該多肽不與LRP6，尤其人類LRP6交叉反應。
  31. 一種較佳呈分離形式之核酸分子，其編碼如請求項1至30中任一項之多肽。
  32. 一種表現載體，其包含如請求項31之核酸。
  33. 一種宿主細胞，其攜帶如請求項32之表現載體。
  34. 一種製造如請求項1至30中任一項之多肽之方法，其包含以下步驟： 在容許表現如請求項1至30中任一項之多肽之條件下培養如請求項33之宿主細胞；及 回收該多肽。
  35. 如請求項34之方法，其另外包含以下步驟： 純化該多肽。
  36. 一種醫藥組合物，其包含(i)如請求項1至30中任一項之多肽作為活性成分，及(ii) 醫藥上可接受之載劑，及視情況選用(iii) 稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或穩定劑。
  37. 如請求項1至12及16至27中任一項之多肽，其作為藥劑，用於治療、預防或緩和人類或動物之疾病、病症或病狀之方法中。
  38. 如請求項1至12及16至27中任一項之多肽，其用於治療癌症，較佳乳癌、肺癌，特定而言非小細胞肺癌(NSCLC)、胰臟癌、結腸直腸癌、肉瘤、卵巢癌或肝細胞癌，或用於治療特發性肺病，或用於治療由異常Wnt訊息傳導所引起之視網膜病變。
  39. 如請求項1至12及16至27中任一項之多肽，其用於治療三陰性乳癌(TNBC)。
  40. 如請求項1至12及16至27中任一項之多肽，其用於與化學治療劑、抑制血管生成之治療活性化合物、訊息轉導路徑抑制劑、EGFR抑制劑、免疫調節劑、免疫檢查點抑制劑或激素治療劑組合使用。
  41. 一種治療劑，其選自由化學治療劑、抑制血管生成之治療活性化合物、訊息轉導路徑抑制劑、EGFR抑制劑、免疫調節劑、免疫檢查點抑制劑及激素治療劑組成之群，其用於與如請求項1至30中任一項之多肽組合使用。
  42. 一種如請求項1至30中任一項之多肽或如請求項36之醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療有需要之患者的癌症或特發性肺病或視網膜病變之藥劑。
  43. 一種如請求項1至30中任一項之多肽之用途，其用於製造藉由抑制樹突細胞中Wnt1及Wnt3a驅動之靶基因轉錄改造腫瘤微環境之藥劑。
  44. 一種如請求項1至30中任一項之多肽之用途，其用於藉由活體外抑制樹突細胞中Wnt1及Wnt3a驅動之靶基因轉錄來改造腫瘤微環境。
  45. 如請求項1至12及16至27中任一項之多肽，其用於與選自由抗PD1抗體、抗PDL1抗體、抗CTLA4抗體、抗BTLA抗體、抗LAG3抗體及抗TIM3抗體組成之群之免疫檢查點抑制劑組合或與癌症疫苗組合治療癌症。
  46. 一種如請求項1至30中任一項之多肽之用途，其用於製造治療癌症，較佳乳癌、肺癌，特定而言非小細胞肺癌(NSCLC)、胰臟癌、結腸直腸癌、肉瘤、卵巢癌或肝細胞癌、或用於治療特發性肺病、或治療由異常Wnt訊息傳導所引起之視網膜病變之藥劑。
  47. 一種如請求項1至30中任一項之多肽之用途，其用於製造治療三陰性乳癌(TNBC)之藥劑。
  48. 一種如請求項1至30中任一項之多肽之用途，其用於製造用於與化學治療劑、抑制血管生成之治療活性化合物、訊息轉導路徑抑制劑、EGFR抑制劑、免疫調節劑、免疫檢查點抑制劑或激素治療劑組合使用之藥劑。
  49. 一種如請求項1至30中任一項之多肽之用途，其用於製造與選自由抗PD1抗體、抗PDL1抗體、抗CTLA4抗體、抗BTLA抗體、抗LAG3抗體及抗TIM3抗體組成之群之免疫檢查點抑制劑組合或與癌症疫苗組合治療癌症之藥劑。
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