TW201731868A

TW201731868A - 在腫瘤細胞中拮抗ｗｎｔ信號傳遞之雙抗體結合部位（ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）多肽

Info

Publication number: TW201731868A
Application number: TW105139826A
Authority: TW
Inventors: 維托利亞辛薩拉; 克勞斯－彼得坤克勒; 馬利－安卓拜司; 凱倫克蘿蜜; 史戴芬妮史戴倫斯; 畢翠斯史特勞勃
Original assignee: 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司
Priority date: 2015-12-04
Filing date: 2016-12-02
Publication date: 2017-09-16
Also published as: UA122079C2; AR106949A1; US10597449B2; KR20180081825A; EP3383425B1; SI3383425T1; LT3383425T; CN108289943B; RS60823B1; PH12018501155A1; TWI734719B; CN108289943A; CA3006235A1; EA201891331A1; PL3383425T3; PT3383425T; EP3383425A1; CL2018001384A1; JP2019506841A; EP3797790A1

Abstract

本發明提供新穎雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性結合多肽，且更特別是新穎雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性免疫球蛋白單一可變域構築體，其可抑制Wnt信號傳遞路徑。本發明亦關於此多肽之特異性序列，其製造方法及其使用方法，包括治療疾病(諸如癌症)之方法。

Description

在腫瘤細胞中拮抗WNT信號傳遞之雙抗體結合部位(BIPARATOPIC)多肽

本發明係關於新穎低密度脂蛋白受體樣蛋白5(LRP5)結合多肽及低密度脂蛋白受體樣蛋白6(LRP6)結合多肽。本發明亦係關於編碼此類多肽之核酸；製備此類多肽之方法；表現或能夠表現此類多肽之宿主細胞；包含此類多肽之組合物；及此類多肽或此類組合物尤其針對癌症疾病之領域中的治療性目的之用途。

Wnt信號傳遞路徑之活化需要胞外Wnt配位體結合至Frizzled受體且結合至共受體LRP5(寄存編號：UniProtKB-O75197/LRP5_HUMAN)或其緊密相關之同系物LRP6(寄存編號：UniProtKB-O75581/LRP6_HUMAN)。哺乳動物細胞中存在19種Wnt蛋白及10種Frizzled受體。在不存在Wnt配位體之情況下，細胞質β-索烴素係藉由由骨架蛋白質軸蛋白與APC及激酶GSK3β與CK1a組成之蛋白複合物磷酸化。藉由泛素接合酶β-TrcP之後續識別會引起β-索烴素之經泛素介導之降解。在存在Wnt配位體之情況下，Wnt結合至Frizzled及LRP5或LRP6會引起細胞質效應子蛋白Dvl之募集及LRP5或LRP6細胞質尾區之磷酸化，其為軸蛋白提供對接位點。藉由LRP5或LRP6之軸蛋白螯合作用會引起軸蛋白-APC-GSK3β複合物之不活化，且因此引起胞內β-索烴素穩定化及積聚。因此，β-索烴素之細胞質水準上升，且β-索烴素遷移至具有轉錄因子之T細胞因子(TCF)/淋巴強化子-結合因子(LEF)家族之成員的細胞核及複合物。隨後募集基礎轉錄機制及轉錄共活化劑，包括cAMP應答元件結合蛋白(CREB)-cAMP結合蛋白(CBP)或其同系物p300，引起各種靶基因之表現，包括軸蛋白2、細胞週期素D1及c-Myc。

另外水準之配位體依賴性Wnt路徑調節係藉由E3接合酶RNF43及其緊密相關同系物ZNRF3且藉由分泌性R-反應素蛋白質介導(de Lau等人「The R-spondin/Lgr5/Rnf43 module：regulator of Wnt signal strength」.Genes Dev.2014；28(4)：305-16)。RNF43介導細胞表面處的Frizzled/LRP5或LRP6受體複合物之泛素化，引起其降解，且由此抑制配位體依賴性Wnt路徑活性。RNF43之活性係藉由R反應素家族成員(R-反應素1至4配位體)削弱。當存在R-反應素配位體時，其自細胞表面移除RNF43，使得在Wnt配位體存在下，Frizzled/LRP5或LRP6複合物積聚且Wnt信號傳遞增強。

LRP5及LRP6充當配位體依賴性Wnt信號傳遞活化之守門，且因此，可視為達成經全部19種Wnt配位體及10種Frizzled受體介導且經R-反應素配位體強化的路徑之完全阻斷的靶向物。詳言之，Wnt配位體可劃分成Wnt1類及Wnt3a類，其各自與LRP5及LRP6之不同抗原決定基/區域結合以供信號傳遞。LRP5及LRP6之胞外域包含連接至EGF樣域的β-螺旋槳之四個重複單元，之後為三個LDLR型A重複序列。LRP5及LRP6之組合結構性及功能性分析表明，Wnt1(Wnt1類配位體)與LRP6之含有β-螺旋槳1及β-螺旋槳2之片段結合，且Wnt3a與含有β-螺旋槳3及β-螺旋槳4之片段結合。到目前為止，僅報導含有來自1至4區之β-螺旋槳的LRP6胞外域之低解析度圖片(Ahn等人「Structural basis of Wnt signaling inhibition by Dickkopf binding to LRP5/6」.Dev Cell.2011；21(5)：862-73)。然而，此等低解析度重建構(40A°)之不確定性及缺乏具有Wnt配位體之複合物中的LRP6胞外域之結構性資料使得無法界定出Wnt1或Wnt3a配位體結合中所涉及之精確抗原決定基。

各種類型之癌症的發病機制中均涉及Wnt信號傳遞之過度活化。在一些癌症類型中，下游信號傳遞分子中之常見突變會促成組成性活化之Wnt路徑(例如結腸直腸癌中之APC突變；肝細胞癌中之β-索烴素活化突變)。對比而言，在三陰性乳癌(TNBC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌中且在一小類結腸直腸癌(CRC)及子宮內膜癌中，如藉由β-索烴素胞內積聚所偵測，Wnt信號傳遞活化係藉由配位體依賴性機制(亦即藉由自分泌/旁分泌Wnt活化)來驅動。在NSCLC、TNBC及胰腺癌中，配位體依賴性Wnt活化係藉由多種機制來介導，其包括Wnt配位體及/或LRP5與LRP6受體之增加之表現，或LRP5及LRP6負調節因子DKK1沉默(TNBC：Liu等人「LRP6過度表現界定出一類乳癌次型且為療法之靶向物」.Proc Natl Acad Sci U S A 2010；107(11)：5136-41；Khramtsov等人「Wnt/β-索烴素路徑活化富集於基底樣乳癌中且預測不良後果」.Am J Pathol.2010；176(6)：2911-20；NSCLC：Nakashima等人「Wnt1 overexpression associated with tumor proliferation and a poor prognosis in non-small cell lung cancer patients」.Oncol Rep.2008；19(1)：203-9；胰臟癌：Zhang等人「典型wnt信號傳遞為胰腺癌癌發生所必需的」.Cancer Res.2013；73(15)：4909-22)。詳言之，所公開之資料已顯示，在健康組織(例如乳腺及肺上皮)中，β-索烴素僅定位於質膜處。對比而言，歸因於異常Wnt信號傳遞，大多數TNBC、NSCLC及胰腺癌初級臨床樣本顯示出β-索烴素胞內積聚(亦即在細胞質/細胞核；Wnt信號傳遞活化之生物標記物中)。近期公開案已顯示，在一小類CRC及子宮內膜癌中，配位體依賴性Wnt信號傳遞活化係藉由突變/不活化RNF43(Giannakis等人「RNF43常常在結腸直腸癌及子宮內膜癌中突變」.Nat Genet.2014；46(12)：1264-6)或藉由活化R-反應素融合轉錄物(編碼藉由組成性活性強啟動子驅動之R-反應素2或R-反應素3蛋白質；Seshagiri等人“Recurrent R-spondin fusions in colon cancer”.Nature 2012；488(7413)：660-4)介導。不活化RNF43突變及R-反應素融合轉錄物均已顯示藉由增加細胞表面上的Frizzled之豐度而強化活體外配位體依賴性Wnt信號傳遞。已顯示腫瘤中之配位體依賴性Wnt活化會驅動腫瘤生長及對化學療法或免疫療法之抗性，且與臨床前模型中之復發有關。

一些LRP5或LRP6結合分子能夠調變Wnt信號傳遞路徑在此項技術中為已知的：Dickkopf-1(DKK1)為LRP5及LRP6抑制因子。DKK1與Wnt共受體，LRP5及LRP6兩者相關聯，且跨膜蛋白Kremen抑制Wnt信號傳遞且引起LRP5與LRP6快速內化。顯示DKK1會抑制經Wnt1及Wnt3a介導之信號傳遞。結構性模型化研究顯示，單一DKK1分子會與LRP6胞外域之延伸區域(來自β-螺旋槳1至β-螺旋槳3)合作性地結合。結構性分析表明DKK1與LRP6之合作性結合相互作用，其中DKK1與β-螺旋槳3區初始結合，便於經由LRP6胞外域之構形變化與β-螺旋槳1區及β-螺旋槳2區相互作用/結合。然而，如所提及，歸因於與DKK1結合的全部LRP6胞外域之結構性重建構的解析度較低，因此缺乏對DKK1與LRP6結合中所涉及的β-螺旋槳1 區、β-螺旋槳2區及β-螺旋槳3區中的確定的抗原決定基的闡明。

DKK1活體內治療顯示會在胃腸道中產生嚴重毒性。詳言之，DKK1在成年小鼠中的經腺病毒介導之表現顯示顯著抑制小腸及結腸中之增殖，其伴有由結腸炎及全身性感染導致之進行性架構退化、體重急劇下降及死亡。詳言之，LRP5及LRP6表現於腸道中之增殖上皮細胞中且為腸道上皮之增殖所必需的，表明LRP5及LRP6抑制對於此正常組織及其他正常組織可能具有毒性(Zhong等人「Lrp5及Lrp6在小鼠腸道進展中起補償性作用」.J Cell Biochem.2012；113(1)：31-8)。此使得抑制LRP5及LRP6或一般而言，抑制Wnt(Wnt1及Wnt3a)信號傳遞路徑之藥劑是否可用於治療性目的，例如，可研發作為抗癌藥物為令人懷疑的。

WO2009/056634提及可與Wnt1信號傳遞路徑或與Wnt3/Wnt3a信號傳遞路徑相互作用之LRP6結合分子，其可為拮抗性或促效性的，且可用於診斷性目的或用於治療「Wnt信號傳遞相關病症」，諸如骨關節炎、多囊性腎病或癌症。由其胺基酸序列界定之此類結合分子之特定實例並未提供於此文獻中。

WO2011/138391及WO2011/138392揭示多價LRP6結合抗體。WO2011/138391主張阻斷一個Wnt信號傳遞路徑(Wnt1或Wnt3)而不強化另一路徑(Wnt3或Wnt1，分別)的抗體。以上WO2011/138392提供藉由LRP6受體簇集強化Wnt信號傳遞之抗體或抗體片段。

WO2011/138391解釋LRP6結合分子需要格式化至全長IgG抗體中以達成所需效應。提供了LRP6雙抗體結合部位分子之實例，其包括IgG分子，具有第一結合特異性，偶合至單鏈Fv部分，具有第二結合特異性。一些格式描述為具有顯著降低之熱穩定性(Tm為50℃至52℃)。Fc部分可賦予IgG 分子效應功能，諸如補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。

WO2013/067355揭示半衰期延長之雙抗體結合部位LRP6結合scFv免疫球蛋白構築體，其衍生自WO2011/138391中所揭示之IgG分子。

WO2011/119661揭示結合至LRP6且抑制由第一Wnt同功異型物，尤其Wnt3或Wnt3a誘導之信號傳遞，但強化由第二Wnt同功異型物誘導之信號傳遞的抗體，該第二Wnt同功異型物可為Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt4、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a或Wnt10b同功異型物。揭示了結合至LRP6之E1至E2區且結合至LRP6之E3至E4區之雙特異性分子。杵臼結構(knob-in-hole)技術用於產生雙特異性抗體。

LRP6抗體之結合中所涉及的結合抗原決定基(LRP6胞外域/β-螺旋槳區中的確定之胺基酸殘基)之鑑別並未提供於WO2009/056634及WO2011/138391或WO2013/067355中，且僅部分提供於WO2011/119661中。詳言之，LRP6結合抗體可經由根據與不同LRP6之區域結合的替代性機制抑制Wnt信號傳遞，包括直接與Wnt競爭或抑制三元受體複合物(Wnt-LRP6-Frizzled)之形成，然而其餘可能藉由受體簇集強化信號傳遞(Ahn等人「Structural basis of Wnt signaling inhibition by Dickkopf binding to LRP5/6」.Dev Cell.2011；21(5)：862-73)。

然而，到目前為止，此項技術中描述之結合分子中無一者經衛生管理機構授權而供用作治療任何疾病之藥劑。具體而言，此類用途需要極具特異性之結合特性，適當的特異性，以使得此類分子結合或不結合、活化或抑制其他靶向物(例如，引起不合需要之活化或其他信號傳遞路徑之抑制，或缺乏活化或對靶向同功異型物之抑制)，在雙特異性或多特異性藥劑之情況下，該等特性為：兩個或大於兩個結合特異性之間的適當平衡、適合之藥物動力學及動力學特性、可接受之毒理學型態及理所當然之活體內功效。

鑒於上文，需要允許對若干類型之癌症疾病及腫瘤進行高效治療之新穎治療劑。因此，本發明之目標在於提供可用於若干癌症疾病，包括NSCLC及TNBC之治療中的此類藥理學活性劑。

詳言之，本發明之目標在於提供此類藥理學活性劑、組合物及/或治療方法，其提供相較於當前所用及/或此項技術中已知的藥劑、組合物及/或方法之特定優點。此等優點包括尤其相較於此項技術中已經已知的候選藥物的活體內功效、改良之治療特性及藥理學特性、較少副作用及其他有利特性，諸如改良之易於製備性或降低的製品成本。

根據本發明之第一態樣，本發明提供特異性結合至LRP5或LRP6之多肽，其中本發明之此類多肽包含第一免疫球蛋白單一可變域(a)，其選自藉由具有以下CDR序列而界定之免疫球蛋白單一可變域(i)至(iii)之群：

(i)：

CDR1：TYTVG(=SEQ ID NO：1)

CDR2：AIRRRGSSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：2)

CDR3：DTRTVALLQYRYDY(=SEQ ID NO：3)

(ii)：

CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：4)

CDR2：AIRRSGRRTYYADSVKG(=SEQ ID NO：5)

CDR3：ARRVRSSTRYNTGTWWWEY(=SEQ ID NO：6)

(iii)：

CDR1：RYTMG(=SEQ ID NO：7)

CDR2：AIVRSGGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：8)

CDR3：DRRGRGENYILLYSSGRYEY(=SEQ ID NO：9)，及第二免疫球蛋白單一可變域(b)，其選自藉由具有以下CDR序列而界定之免疫球蛋白單一可變域(iv)及(v)之群：

(iv)：

CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：10)

CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：11)

CDR3：SPIPYGSLLRRRNNYDY(=SEQ ID NO：12)

(v)：

CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：13)

CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：14)

CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(=SEQ ID NO：15)。

關於該等免疫球蛋白單一可變域之術語「第一」及「第二」僅意欲指示此等域為兩種不同域(因為其將至少包括不同CDR序列)。因此，此等術語不應理解為指代該多肽鏈中的域之精確次序或序列。

本發明之多肽視情況包含第三免疫球蛋白單一可變域，諸如尤其白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域，諸如Alb11域，其包含以下CDR：

CDR1(Alb11)：SFGMS(=SEQ ID NO：16)

CDR2(Alb11)：SISGSGSDTLYADSVKG(=SEQ ID NO：17)

CDR3(Alb11)：GGSLSR(=SEQ ID NO：18)。

根據一更具體實施例，本發明之多肽包括為VHH域且較佳人類化VHH域的免疫球蛋白單一可變域。

根據一甚至更具體實施例，本發明之多肽包括第一免疫球蛋白單一可變域(a)，其選自具有以下序列之免疫球蛋白單一可變域(i)至(iii)之群：

(i)： (=SEQ ID NO：19)

(ii)： (=SEQ ID NO：20)

(iii)： (=SEQ ID NO：21)，及第二免疫球蛋白單一可變域(b)，其選自由具有以下序列之免疫球蛋白單一可變域(iv)及(v)組成之群：

(iv)： (=SEQ ID NO：22)，及

(v)： (=SEQ ID NO：23)。

根據一具體較佳實施例，本發明之多肽另外包括半衰期延長部分，其中該半衰期延長部分共價連接至該多肽且視情況選自由以下組成之群：白蛋白結合部分，諸如白蛋白結合肽或白蛋白結合免疫球蛋白域、較佳白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域、更佳Alb11域；運鐵蛋白結合部分，諸如抗運鐵蛋白免疫球蛋白域、聚乙二醇分子、人類血清白蛋白及人類血清白蛋白之片段。

具體較佳地，除了如上文所概述之兩個免疫球蛋白單一可變域(a)及 (b)以外，多肽亦包括具有以下序列之Alb11域：

(=SEQ ID NO：24)

根據一另一實施例，具體而言，本發明包括包含或由以下三種多肽鏈中之任一者組成之多肽：F13500575，其具有序列SEQ ID NO：25，F13500571，其具有序列SEQ ID NO：26，及F13500720，其具有序列SEQ ID NO：27。

根據其他態樣，本發明係關於核酸分子、表現載體、宿主細胞及製造本發明之多肽中所用的製造方法。呈分離形式的編碼本發明之多肽的核酸分子可用於建構相應表現載體，隨後可轉染至用於本發明之多肽的生物醫藥製造的宿主細胞中。該製造方法通常包含以下步驟：在允許表現多肽之條件下培養宿主細胞，根據此項技術中已知之方法回收多肽且對其進行純化。

涉及本發明之多肽的其他態樣、實施例、用途及方法將由以下本發明之[實施方式]及隨附申請專利範圍而變得清楚。

本發明提供允許對若干癌症類型，諸如TNBC、CRC及NSCLC進行較高效治療而具有較少副作用之新穎分子。本發明之多肽在癌症患者之治療中提供出人意料之治療效應(亦即功效)，其可誘導引起病理性完全反應(pCR)之腫瘤消退。反過來，預期此尤其在高度未滿足的醫學需要適應症中，諸如在乳癌中引起無進展存活期及總存活期之顯著改良。因此，本發明之多肽在若干癌症類型，尤其顯示失調Wnt信號傳遞路徑及β-索烴素積聚的癌症類型之治療中提供新穎治療性選擇。

此外，本發明之多肽易於製造，具有高穩定性及低抗原性，且提供除了注射及輸注以外的關於投藥途徑之各種選擇。

圖1展示拮抗Wnt1及Wnt3a信號傳遞之雙抗體結合部位多肽之示意圖。其由三個域組成，其中兩個域結合至LRP5及LRP6之相異抗原決定基(Wnt1及Wnt3a阻斷子)且一個域用於半衰期延長(人類血清白蛋白結合子)。

圖2展示針對衍生自駱馬免疫接種的LRP6結合VHH之代表性數目的結合FACS及ELISA分析之間相關性之缺乏。如藉由FACS結合分析所偵測，VHH之編號「1」側圖係藉由對在質膜上表現LRP6的細胞之高親和力來表徵(在y軸上報導MCF值)。如藉由ELISA結合分析所偵測，VHH之編號「2」側圖係藉由對重組人類LRP6胞外域(rhLRP6-Fc)之高親和力來表徵(在x軸上報導OD405值)。

圖3展示當與由非靶向結合子組成之陰性對照(結合至未表現於HEK293細胞中之細菌性蛋白的VHH構築體)比較時，三個半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體與人類LRP5(圖3A)及人類LRP6(圖3B)過度表現HEK293細胞株之結合。

圖4展示如藉由基於FACS之DKK1競爭分析所偵測，結合至人類LRP5(圖4A)及人類LRP6(圖4B)過度表現HEK293細胞株的三個半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體之完整DKK1競爭。

圖5展示在組合Wnt1及Wnt3a報導分析中，三個半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體的Wnt1及Wnt3a路徑之完全抑制(圖5A)及與其他LRP6結合分子之對比(圖5B：Knob HC YW210.09及MOR08168IgG1LALA 6475 scfv；圖5C：802T)。

圖6展示如藉由相對軸蛋白2 mRNA表現之抑制所偵測，Wnt信號傳遞在癌細胞中之抑制(圖6A)，及相較於F013500571及未經處理(對照)之細胞(圖6B之左側圖/右側圖)，用三個半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體(最終濃度為1mM)處理且藉由用802T處理之後，如藉由下降之活細胞百分比(%)所偵測之細胞增殖(圖6B)；針對用一個半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6構築體(圖6C)及802T(圖6D)之處理顯示劑量反應曲線。

圖7展示在經Wnt驅動之腫瘤模型(MMTV-Wnt1異種移植模型)中，半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體(圖7A中為F013500571且圖7B中為F013500720)之活體內功效及Knob HC YW210.09(圖7C)之活體內功效。

圖8展示如藉由軸蛋白2 mRNA表現相對於對照組減少所偵測，用半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體F013500571(圖8A)及F013500720(圖8B)治療的腫瘤中的Wnt路徑抑制。

圖9展示如藉由用半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體處理後的干擾素-γ釋放(圖9B)所測定，經Wnt3a驅動之信號傳遞抑制對藉由樹突狀細胞釋放之促炎性細胞激素TNFα(圖9A)的作用及對T細胞活化之作用。各符號表示單一樹突狀細胞(DC)供體。所展示之資料標準化為未經處理之對照的TNFα水準(圖9A)，且各符號表示針對DC及T細胞之單一供體對(圖9B)。

定義

本發明之以上及其他態樣及實施例將由本文中之進一步描述而變得清楚，其中：

a)除非另外指明或定義，否則所用全部術語均具有其在此項技術中之常用含義，其對熟習此項技術者將為清楚的。例如參照標準手冊，諸如Sambrook等人，「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」(第2版)，第1至3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Lewin,「Genes IV」,Oxford University Press,New York,(1990)及Roitt等人，「Immunology」(第2版)，Gower Medical Publishing,London,New York(1989)，以及本文中所列舉之一般先前技術。此外，如熟習此項技術者將清楚，除非另外指明，否則所有未特定詳細描述之方法、步驟、技術及操作可以本身已知之方式進行且已以本身已知之方式進行。此外，針對實例參照標準手冊、上文所提及之一般先前技術及其中所引用之其他參考文獻。

b)除非另外指明，否則術語「免疫球蛋白」及「免疫球蛋白序列」(無論在本文中是否用於指代重鏈抗體或習知4-鏈抗體)用作一般術語以包括全尺寸抗體、其個別鏈以及其所有部分、域或片段(包括但不限於抗原結合域或片段，諸如相應VHH域或VH/VL域)。此外，除非情形需要較具侷限性之解釋，否則如本文所用(例如在類似「免疫球蛋白序列」、「抗體序列」、「(單一)可變域序列」、「VHH序列」或「蛋白質序列」之術語中)，術語「序列」應通常理解為包括相關胺基酸序列以及編碼其之核酸序列或核苷酸序列；

c)如本文所用，術語(多肽或蛋白質之)「域」係指具有獨立於蛋白質之其餘部分保留其三級結構之能力的摺疊蛋白質結構。一般而言，域負責蛋白質之離散功能特性，且在許多情況下，在蛋白質及/或域之剩餘部分無功能缺失之情況下，可將域添加、移除或轉移至其他蛋白質。

d)如本文所用，術語「免疫球蛋白域」係指抗體鏈(諸如習知4-鏈抗體之鏈或重鏈抗體之鏈)之球狀區域或係指基本上由此類球狀區域組成之多肽。免疫球蛋白域之特徵在於其保留抗體分子之免疫球蛋白摺疊特徵，該特徵由配置於兩個β片層中的約7個反向平行之β股鏈的2層夾層組成，視情況藉由保守的二硫鍵穩定化。

e）如本文所用，術語「免疫球蛋白可變域」意謂基本上由四個「構架區」組成之免疫球蛋白域，該等「構架區」在此項技術中且在下文中分別稱為「構架區1」或「FR1」；「構架區2」或「FR2」；「構架區3」或「FR3」；及「構架區4」或「FR4」；其構架區間雜有三個「互補決定區」或「CDR」，該等「互補決定區」在此項技術中且在下文中分別稱為「互補決定區1」或「CDR1」；「互補決定區2」或「CDR2」；及「互補決定區3」或「CDR3」。因此，免疫球蛋白可變域之一般結構或序列可指示如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可變域藉由攜帶抗原結合位點而賦予抗原之抗體特異性。

f)如本文所用，術語「免疫球蛋白單一可變域」意謂能夠特異性結合至抗原之抗原決定基而不與另外可變免疫球蛋白域配對的免疫球蛋白可變域。在本發明之含義中，免疫球蛋白單一可變域之一個實例為「域抗體」，諸如免疫球蛋白單一可變域VH及VL(VH域及VL域)。免疫球蛋白單一可變域之另一重要實例為如下文所定義的來自駱駝之「VHH域」(或簡言之「VHH」)。

鑒於以上定義，習知4-鏈抗體(諸如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；此項技術中已知)之抗原結合域或Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段(諸如二硫鍵連接Fv)或scFv片段之抗原結合域或衍生自該等習知4-鏈抗體之雙功能抗體(均為此項技術中已知)將通常不視為免疫球蛋白單一可變域，此係因為，在此等情況下，結合至抗原之相應抗原決定基將通常不會藉由一個(單一)免疫球蛋白域，而是藉由一對(締合)免疫球蛋白域，諸如輕鏈可變域及重鏈可變域，亦即藉由免疫球蛋白域之VH-VL對進行，該等免疫球蛋白域之VH-VL對共同地結合至相應抗原之抗原決定基。

f1)亦稱為VHH、V_HH域、VHH抗體片段及VHH抗體之「VHH域」最初描述為「重鏈抗體」之抗原結合免疫球蛋白(可變)域(亦即「不含輕鏈之抗體」之抗原結合免疫球蛋白(可變)域；Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R.：「Naturally occurring antibodies devoid of light chains」；Nature 363,446-448(1993))。已選定術語「VHH域」，以將此等可變域與習知4-鏈抗體中所存在的重鏈可變域(在本文中稱為「V_H域」或「VH域」)及習知4-鏈抗體中所存在的輕鏈可變域(在本文中稱為「V_L域」或「VL域」)區分開。VHH域可特異性結合至抗原決定基而不經另外抗原結合域(與習知4-鏈抗體中之VH或VL域相對，在此情況下抗原決定基藉由VL域與VH域共同識別)。VHH域為由單一免疫球蛋白域形成的小型、穩健及高效抗原識別單元。

在本發明之上下文中，術語VHH域、VHH、V_HH域、VHH抗體片段、VHH抗體以及「Nanobody^®」及「Nanobody^®域」(「Nanobody」為公司Ablynx N.V.；Ghent；Belgium之商標)可互換使用且為免疫球蛋白單一可變域之代表(具有以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4且特異性結合至抗原決定基，而無需存在第二免疫球蛋白可變域)，且亦可如例如WO2009/109635，圖1中所定義，藉由所謂「標誌殘基」區別於VH域。

當應用於來自駱駝之VHH域時，如例如Riechmann及Muyldermans,J.Immunol.Methods 231,25-38(1999)之圖2中所示，根據由Kabat等人(「Sequence of proteins of immunological interest」,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD，第91版)所給定的針對V_H域之一般編號來對VHH域之胺基酸殘基進行編號。根據此編號，-FR1包含位1至30處之胺基酸殘基，-CDR1包含位31至35處之胺基酸殘基，-FR2包含位36至49處之胺基酸，-CDR2包含位50至65處之胺基酸殘基，-FR3包含位66至94處之胺基酸殘基，-CDR3包含位95至102處之胺基酸殘基，且-FR4包含位103至113處之胺基酸殘基。

然而，應注意如此項技術中對於V_H域及VHH域所熟知，CDR中之每一者中之胺基酸殘基之總數可變化且可不對應於由Kabat編號指示之胺基酸殘基之總數(亦即，在實際序列中可不佔據一或多個根據Kabat編號之位置，或實際序列可含有比Kabat編號所允許之數目多的胺基酸殘基)。此意謂一般而言，根據Kabat之編號可或可不對應於實際序列中之胺基酸殘基之實際編號。

V_H域之胺基酸殘基的替代性編號方法為此項技術中已知，該等方法亦可以類似方式應用於VHH域。然而，在本說明書、申請專利範圍及圖式中，除非另外指出，否則將遵循根據Kabat且應用於如上所述之VHH域的編號。

VHH域中的胺基酸殘基之總數將通常在110至120範圍內，通常在112與115之間。然而應注意，較小及較長序列亦可適合於本文所述之目的。

VHH域之其他結構性特徵及功能性特性及含有其之多肽可概述如下：VHH域(已藉由性質「設計」為功能性地結合至抗原，而不存在且無與輕鏈可變域之相互作用)可充當單一、相對較小、功能性抗原結合結構單元、域或多肽。此將VHH域與習知4-鏈抗體之VH及VL域區分開，對於實際應用而言，該等VH及VL域本身通常不適合於作為單一抗原結合蛋白或免疫球蛋白單一可變域，但需要以某種形式或另一種形式組合以提供功能性抗原結合單元(如例如習知抗體片段，諸如Fab片段中；scFv中，其由共價連接至VL域之VH域組成)。

由於此等單一特性，VHH域之使用(單獨或作為大型多肽之部分)提供多種優於習知VH及VL域、scFv或習知抗體片段(諸如Fab片段或F(ab')2片段)之使用的明顯優點：-僅單一域需要以高親和力及高度選擇性結合抗原，以使得無需存在兩個分開的域，亦無需確保此等兩種域以合宜的空間構形及組態存在(亦即經由使用特別設計之連接子，如同scFv)；-VHH域可自單一基因表現且不需要轉譯後摺疊或修飾；-VHH域可易於工程改造為多價及多特異性格式(如本文所進一步論述)；-VHH域為高度可溶的且不具有聚集傾向(如同Ward等人，Nature 341：544-546(1989)所述之小鼠衍生抗原結合域)；-VHH域對於加熱、pH、蛋白酶及其他變性劑或條件為高度穩定的，且因此，可在不使用冷藏設備之情況下進行製備、儲存或輸送，實現成本、時間及環境節約；-VHH域易於製備且相對便宜，即使以製造所需之量級。舉例而言，VHH域及含有其之多肽可使用微生物醱酵(例如如下文進一步描述)製造且不需要使用哺乳動物表現系統，如同例如習知抗體片段；-相較於習知4-鏈抗體及其抗原結合片段，VHH域相對較小(大約15kDa，或比習知IgG小10倍)，且因此，與該等習知4-鏈抗體及其抗原結合片段相比--顯示(較)高組織滲透率，且--可以較高劑量投與；- VHH域可顯示所謂的凹穴結合特性(尤其歸因於其延長之CDR3環，相較於習知VH域)且可因此亦接近習知4-鏈抗體及其抗原結合片段不可接近之靶向物及抗原決定基。

早期，例如，在WO2006/040153及WO2006/122786中，已描述獲得結合至特異性抗原或抗原決定基之VHH域的方法。亦如其中詳細所述，可藉由由來自人類之習知4-鏈抗體的VH域中之對應位置處所出現的胺基酸殘基中之一或多者取代初始VHH序列之胺基酸序列中的一或多個胺基酸殘基使衍生自駱駝之VHH域「人類化」。人類化VHH域可含有一或多個完全人類構架區序列，且在一甚至更特定的實施例中，可含有衍生自DP-29、DP-47、DP-51或其部分之人類構架區序列，其視情況與JH序列，諸如JH5組合。

f2)「域抗體(Domain antibodies)」，亦稱為「Dab」、「Domain Antibodies」及「dAb」(術語「Domain Antibodies」及「dAb」由GlaxoSmithKline集團公司用作商標)，描述於例如Ward,E.S.等人：「Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli」；Nature 341：544-546(1989)；Holt,L.J.等人：「Domain antibodies：proteins for therapy」；TRENDS於Biotechnology 21(11)中：484-490(2003)；及WO2003/002609中。

域抗體基本上與非駱駝哺乳動物之VH或VL域，尤其人類4-鏈抗體相對應。為了以單一抗原結合域形式結合抗原決定基，亦即不與VL或VH域分別配對，需要例如藉由使用人類單一VH或VL域序列庫對此類抗原結合特性進行特定選擇。類似VHH，域抗體之分子量為大約13kDa至大約16kDa，且若衍生自完全人類序列，則針對例如人類中之治療用途不需要人類化。如在VHH域之情況下，其亦很好地表現於原核表現系統中，提供總製造成本之明顯降低。

可藉由在一或多個CDR之胺基酸序列中引入一或多個變化對域抗體以及VHH域進行親和力成熟，該等變化引起所得免疫球蛋白單一可變域對其相應抗原之親和力相比於相應母分子得到改良。經親和力成熟的本發明之免疫球蛋白單一可變域分子可藉由此項技術中已知之方法，例如如Marks等人，1992,Biotechnology 10：779-783或Barbas等人，1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813.；Shier等人，1995,Gene 169：147-155；Yelton等人，1995,Immunol.155：1994-2004；Jackson等人，1995,J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992,J.Mol.Biol.226(3)：889 896；KS Johnson及RE Hawkins,「Affinity maturation of antibodies using phage display」,Oxford University Press 1996所述製備。

f3)此外，熟習此項技術者亦將清楚，可將上述CDR中之一或多者「移植」於其他「骨架」上，其包括(但不限於)人類骨架或非免疫球蛋白骨架。針對該等CDR移植的適合之骨架及技術為此項技術中已知的。

g)可互換使用之術語「抗原決定基」及「抗原決定子」係指藉由抗原結合分子，諸如習知抗體或本發明之多肽，且更特定言之，藉由該等分子之抗原結合位點識別的大分子，諸如多肽之一部分。抗原決定基界定免疫球蛋白之最小結合位點，且因此表示免疫球蛋白之特異性之靶向物。

識別抗原決定基的抗原結合分子(諸如習知抗體或本發明之多肽)之一部分稱為互補位。

h)如本文所用，術語「雙抗體結合部位」(抗原)結合分子或「雙抗體結合部位」多肽應意謂包含如本文所定義之第一免疫球蛋白單一可變域及第二免疫球蛋白單一可變域的多肽，其中此等兩個可變域能夠結合至一種抗原之兩種不同抗原決定基，該等抗原決定基通常不會同時經一種單特異性免疫球蛋白，諸如習知抗體或一種免疫球蛋白單一可變域結合。根據本發明之雙抗體結合部位多肽由具有不同抗原決定基特異性之可變域組成，且不含結合至同一抗原決定基之互補可變域對。因此，其不會彼此競爭結合至LRP5或LRP6。

i)可「結合」特定抗原決定基、抗原或蛋白質(或其至少一個部分、片段或抗原決定基)；「結合至」特定抗原決定基、抗原或蛋白質(或其至少一個部分、片段或抗原決定基)；「特異性結合」特定抗原決定基、抗原或蛋白質(或其至少一個部分、片段或抗原決定基)；或「特異性結合至」特定抗原決定基、抗原或蛋白質(或其至少一個部分、片段或抗原決定基)；對特定抗原決定基、抗原或蛋白質(或其至少一個部分、片段或抗原決定基)「具有親和力」及/或對特定抗原決定基、抗原或蛋白質(或其至少一個部分、片段或抗原決定基)「具有特異性」之多肽(諸如免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單一可變域、本發明之多肽或通常抗原結合分子或其片段)稱為「對抗」或「針對」該抗原決定基、抗原或蛋白質或為關於該抗原決定基、抗原或蛋白質之「結合」分子。

k)一般而言，術語「特異性」係指特定抗原結合分子或抗原結合蛋白(諸如免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單一可變域或本發明之多肽)可結合的不同類型之抗原或抗原決定基的數目。抗原結合蛋白之特異性可基於其親和力及/或親合力進行測定。由抗原與抗原結合蛋白之解離平衡常數(K_D)表示之親和力為抗原決定基與抗原結合蛋白上的抗原結合位點之間的結合強度之量度：K_D值愈小，抗原決定基與抗原結合分子之間的結合強度愈強(或者，親和力亦可表示為親和力常數(K_A)，其為1/K_D)。如熟習此項技術者將清楚(例如基於本文中之其他揭示內容)，親和力可以本身已知的方式進行測定，其視相關特異性抗原而定。親合力為抗原結合分子(諸如免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單一可變域或本發明之多肽)與相關抗原之間的結合強度之量度。親合力與抗原決定基與抗原結合分子上之其抗原結合位點之間的親和力及抗原結合分子上所存在的相關結合位點之數目兩者有關。

通常，抗原結合蛋白(諸如本發明之多肽)將以10E-5至10E-14莫耳/公升(M)或小於10E-14莫耳/公升(M)，且較佳10E-7至10E-14莫耳/公升(M)或小於10E-14莫耳/公升(M)，更佳10E-8至10E-14莫耳/公升，且甚至更佳10E-11至10E-13之解離常數(K_D)(如例如Kinexa分析中所量測；此項技術中已知)，及/或以至少10E7 ME-1、較佳至少10E8 ME-1、更佳至少10E9 ME-1，諸如至少10E11 ME-1之締合常數(K_A)結合。大於10E-4 M之任何K_D值通常視為指示非特異性結合。較佳地，本發明之多肽將以小於500 nM、較佳小於200nM、更佳小於10nM，諸如小於500pM之K_D結合至所需抗原。可以本身已知的任何適合方式，包括(例如)本文所述之分析、史卡查分析(Scatchard analysis)及/或競爭性結合分析，諸如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夾心競爭分析，及此項技術中本身已知的其不同變體來測定抗原結合蛋白與抗原或抗原決定基之特異性結合。

l)與能夠結合至LRP5以及LRP6之結合分子有關的術語「交叉反應性」(「LRP5/LRP6交叉反應性」)意指該等結合分子可特異性結合至LRP5分子中所包含之抗原決定基，且亦可可替代地特異性結合至LRP6分子中所包含之抗原決定基。通常，可在該等結合分子所結合的不同蛋白質之抗原決定基具有相似結構及/或序列，例如表示保守抗原決定基，例如由屬於同一蛋白質家族之蛋白質(例如LRP5及LRP6，其屬於LRP蛋白質家族)共用之情況下產生該等交叉反應性。

m)如此項技術中通常已知且同意，將根據標準三字母或單字母胺基酸編碼指示胺基酸殘基。當比較兩個胺基酸序列時，術語「胺基酸差異」係指相較於第二序列，在參考序列之某一位置處插入、缺失或取代指定數目個胺基酸殘基。在取代之情況下，該(等)取代將較佳為保守性胺基酸取代，其意謂胺基酸殘基經具有相似化學結構之另一胺基酸殘基取代，且其幾乎不會或基本上不會對多肽之功能、活性或其他生物特性造成影響。該等保守性胺基酸取代為此項技術中熟知，例如根據WO 98/49185，其中保守胺基酸取代較佳為其中以下群(i)至群(v)中的一個胺基酸經同一群中的另一胺基酸殘基取代的取代：(i)小型脂族、非極性或輕微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)極性、帶負電殘基及其(不帶電)醯胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)極性、帶正電殘基：His、Arg及Lys；(iv)大型脂族、非極性殘基： Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族殘基：Phe、Tyr及Trp。尤其較佳之保守性胺基酸取代如下：Ala取代為Gly或Ser；Arg取代為Lys；Asn取代為Gln或His；Asp取代為Glu；Cys取代為Ser；Gln取代為Asn；Glu取代為Asp；Gly取代為Ala或Pro；His取代為Asn或Gln；Ile取代為Leu或Val；Leu取代為Ile或Val；Lys取代為Arg、Gln或Glu；Met取代為Leu、Tyr或Ile；Phe取代為Met、Leu或Tyr；Ser取代為Thr；Thr取代為Ser；Trp取代為Tyr；Tyr取代為Trp或Phe；Val取代為Ile或Leu。

n)舉例而言，當相較於自其獲得核酸或多肽分子的該核酸或多肽分子之天然生物源及/或反應介質或培養介質時，當該核酸或多肽分子已與至少一種其他組分，諸如另一核酸、另一蛋白質/多肽、另一生物組分或大分子或至少一種摻雜物、雜質或微量組分分離，其中該核酸或多肽分子通常與該至少一種其他組分締合於該源或介質中時，該核酸或多肽分子視為「(呈)基本上分離(形式)」。詳言之，當以至少2倍，尤其至少10倍、較尤其至少100倍且高達1000倍或大於1000倍純化核酸或多肽分子時，其視為「基本上分離」的。如使用適合技術，諸如適合之層析技術，諸如聚丙烯醯胺-凝膠電泳所測定，「呈基本上分離形式」之核酸或多肽分子較佳為基本上均質的；

o)例如兩個免疫球蛋白單一可變域序列之間的「序列一致性」指示此等兩個序列之間一致的胺基酸百分比。可如WO2008/020079之第49頁及第50頁上的段落f)所述來對其進行計算或測定。「序列相似性」指示一致的或表示保守性胺基酸取代的胺基酸百分比。

靶特異性

本發明之多肽具有對LRP5以及LRP6之特異性，此係因為其包含特異性結合於此等分子(LRP5/LRP6交叉反應性結合分子)中所包括之抗原決定基的免疫球蛋白單一可變域。

本發明之分子應結合至LRP5及LRP6之人類形式，且亦較佳結合至與藥物研發相關之其他物種中的對應物，亦即食蟹獼猴及小鼠LRP5及LRP6。

本發明之多肽

在其最廣泛意義中，本發明提供用於治療癌症疾病之新穎藥理學活性劑。根據本發明之藥劑屬於結合分子之新穎類別，亦即LRP5/LRP6交叉反應性雙抗體結合部位多肽，其包含兩個或大於兩個在不同抗原決定基處結合至LRP5及/或LRP6之免疫球蛋白單一可變域。術語「交叉反應性」及「雙抗體結合部位」如上文所解釋，使得LRP5/LRP6交叉反應性雙抗體結合部位分子可定義為能夠在LRP5蛋白中所包含之兩個不同抗原決定基處結合至LRP5，且亦能夠在LRP6蛋白中所包含之兩個相應抗原決定基處結合至LRP6的分子。

更具體而言，本發明之多肽包括：-第一免疫球蛋白單一可變域，其能夠經由抗原決定基/以引起對Wnt1信號傳遞路徑之抑制的方式特異性結合至LRP5以及LRP6(LRP5/LRP6交叉反應性)，以使得經Wnt1驅動之靶基因轉錄受到抑制，及-第二免疫球蛋白單一可變域，其能夠經由抗原決定基/以引起對Wnt3a信號傳遞路徑之抑制的方式特異性結合至LRP5以及LRP6(LRP5/LRP6交叉反應性)，以使得經Wnt3a驅動之靶基因轉錄受到抑制。

歸因於該多肽中存在兩個免疫球蛋白單一可變域，其中該等兩個域結合至不同抗原決定基(Wnt1/Wnt3a信號傳遞相關性)，因此此等分子為雙抗體結合部位結合分子。此雙抗體結合部位結合模式示意性地展示於圖1中。

在此情形中，應注意，如圖1中所示，假定本發明之多肽可經由一個單一LRP5或LRP6分子之LRP5/LRP6結合域結合至該一個單一LRP5或LRP6分子(分子內結合模式)。然而，亦可出現其他結合模式。

最後，假定本發明之多肽能夠與LRP5及LRP6之天然配位體，且干擾Wnt1及Wnt3a信號傳遞之DKK1競爭結合至LRP5及LRP6，由此抑制Wnt1以及Wnt3a信號傳遞路徑。然而，此理論亦不應理解為限制本發明之範疇。

更具體而言，根據本發明之多肽特異性結合至LRP5或LRP6，其中該等多肽包含第一免疫球蛋白單一可變域(a)，其選自藉由具有以下CDR序列而界定之免疫球蛋白單一可變域(i)至(iii)之群：

(i)：

CDR1：TYTVG(=SEQ ID NO：1)

CDR2：AIRRRGSSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：2)

CDR3：DTRTVALLQYRYDY(=SEQ ID NO：3)

[=Wnt1-333E06mod域之CDR]

(ii)：

CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：4)

CDR2：AIRRSGRRTYYADSVKG(=SEQ ID NO：5)

CDR3：ARRVRSSTRYNTGTWWWEY(=SEQ ID NO：6)

[=Wnt1-333G06域之CDR]

(iii)：

CDR1：RYTMG(=SEQ ID NO：7)

CDR2：AIVRSGGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：8)

CDR3：DRRGRGENYILLYSSGRYEY(=SEQ ID NO：9)

[=Wnt1-332D03mod域之CDR]，及第二免疫球蛋白單一可變域(b)，其選自藉由具有以下CDR序列而界定之免疫球蛋白單一可變域(iv)及(v)之群：

(iv)：

CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：10)

CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：11)

CDR3：SPIPYGSLLRRRNNYDY(=SEQ ID NO：12)

[=Wnt3a-093A01域之CDR]

(v)：

CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：13)

CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：14)

CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(=SEQ ID NO：15)

[=Wnt3a-367B10域之CDR]。

關於該等免疫球蛋白單一可變域之術語「第一」及「第二」的使用僅意欲指示此等域為不同域，因為其將包括不同CDR序列且將結合至不同抗原決定基。然而，此等術語不應理解為指示該多肽鏈中該等域之精確次序或序列。換言之，以上免疫球蛋白單一可變域(a)及(b)在本發明之該多肽中可按次序(a)-(b)或按次序(b)-(a)排列。

術語「特異性結合至LRP5或LRP6」意指免疫球蛋白單一可變域(a)及(b)與LRP5及LRP6交叉反應。當然，該等分子之結合特性係由其(CDR)序列決定，因此上文及申請專利範圍中所述之特徵「特異性結合至LRP5或LRP6」僅意欲說明本發明之效用，且不限制本發明之範疇。

免疫球蛋白單一可變域通常基本上由四個構架區(分別為FR1至FR4)及三個互補決定區(分別為CDR1至CDR3)組成。該第一免疫球蛋白單一可變域及該第二免疫球蛋白單一可變域需要直接或藉由連接子肽共價連接以位於一種多肽或多肽鏈中。

因此，本發明分子之一般結構亦可描繪如下：FR(a)1-CDR(a)1-FR(a)2-CDR(a)2-FR(a)3-CDR(a)3-FR(a)4-[連接子肽]-FR(b)1-CDR(b)1-FR(b)2-CDR(b)2-FR(b)3-CDR(b)3-FR(b)4

其中FR(a)表示第一免疫球蛋白單一可變域之構架區，FR(b)表示第二免疫球蛋白單一可變域之構架區，CDR(a)表示第一免疫球蛋白單一可變域之CDR，CDR(b)表示第二免疫球蛋白單一可變域之CDR，[連接子肽]表示可視情況存在之連接子肽，其中CDR具有如上文所述之序列。

此外，應理解，(a)及(b)可互換，亦即具有以下一般結構之分子 FR(b)1-CDR(b)1-FR(b)2-CDR(b)2-FR(b)3-CDR(b)3-FR(b)4-[連接子肽]-FR(a)1-CDR(a)1-FR(a)2-CDR(a)2-FR(a)3-CDR(a)3-FR(a)4

亦應由本發明涵蓋在內。

連接子肽視情況包含或由第三域組成，諸如白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域，諸如Alb11域，其包含以下CDR：

CDR(Alb11)1：SFGMS(=SEQ ID NO：16)

CDR(Alb11)2：SISGSGSDTLYADSVKG(=SEQ ID NO：17)

CDR(Alb11)3：GGSLSR(=SEQ ID NO：18)

此產生一組具有以下一般結構的本發明之多肽：FR(a)1-CDR(a)1-FR(a)2-CDR(a)2-FR(a)3-CDR(a)3-FR(a)4-[連接子肽]-FR(Alb11)1-CDR(Alb11)1-FR(Alb11)2-CDR(Alb11)2-FR(Alb11)3-CDR(Alb11)3-FR(Alb11)4-[連接子肽]-FR(b)1-CDR(b)1-FR(b)2-CDR(b)2-FR(b)3-CDR(b)3-FR(b)4。

此外，三個免疫球蛋白單一可變域(a)、(b)及Alb11之次序並非不變，但其中以上域按以下次序排列之多肽：(b)-Alb11-(a)

亦應涵蓋在內。

此外，在多肽之N末端或C末端處具有Alb11域(例如Alb11-(a)-(b)、Alb11-(b)-(a)、(a)-(b)-Alb11或(b)-(a)-Alb11)的多肽亦應由本發明涵蓋在內。

在三個較佳實施例中，本發明之多肽包括如下定義之免疫球蛋白單一可變域：

第一較佳實施例：多肽，其包含具有以下CDR序列之第一免疫球蛋白單一可變域：

CDR1：TYTVC(=SEQ ID NO：1)

CDR2：AIRRRGSSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：2)

CDR3：DTRTVALLQYRYDY(=SEQ ID NO：3)

及具有以下CDR序列之第二免疫球蛋白單一可變域：

CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：10)

CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：11)

CDR3：SPIPYGSLLRRRNNYDY(=SEQ ID NO：12)。

第二較佳實施例：多肽，其包含具有以下CDR序列之第一免疫球蛋白單一可變域：

CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：4)

CDR2：AIRRSGRRTYYADSVKG(=SEQ ID NO：5)

CDR3：ARRVRSSTRYNTGTWWWEY(=SEQ ID NO：6)

及具有以下CDR序列之第二免疫球蛋白單一可變域：

CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：13)

CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：14)

CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(=SEQ ID NO：15)。

第三較佳實施例：多肽，其包含具有以下CDR序列之第一免疫球蛋白單一可變域：

CDR1：RYTMG(=SEQ ID NO：7)

CDR2：AIVRSGGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：8)

CDR3：DRRGRGENYILLYSSGRYEY(=SEQ ID NO：9)

及具有以下CDR序列之第二免疫球蛋白單一可變域：

CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：13)

CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：14)

CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(=SEQ ID NO：15)。

當然，如上文所述的亦即視情況包括連接子肽及/或其他域，尤其包括Alb11域，免疫球蛋白單一可變域之不同次序之變體應亦適用於此等三個較佳實施例。

在一具體較佳實施例中，白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域位於兩個LRP5/LRP6結合免疫球蛋白單一可變域之間。因此，三個具體較佳實施例可設想如下：

第一具體較佳實施例：多肽，其包含具有以下CDR序列之第一(LRP5/LRP6結合)免疫球蛋白單一可變域：

CDR1：TYTVG(=SEQ ID NO：1)

CDR2：AIRRRGSSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：2)

CDR3：DTRTVALLQYRYDY(=SEQ ID NO：3)

具有以下CDR序列之白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域：

CDR1：SFGMS(=SEQ ID NO：16)

CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG(=SEQ ID NO：17)

CDR3：GGSLSR(=SEQ ID NO：18)；及具有以下CDR序列之第二(LRP5/LRP6結合)免疫球蛋白單一可變域：

CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：10)

CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：11)

CDR3：SPIPYGSLLRRRNNYDY(=SEQ ID NO：12)；該等域呈此次序或呈以上域之經改變之次序。

第二具體較佳實施例：多肽，其包含具有以下CDR序列之第一(LRP5/LRP6結合)免疫球蛋白單一可變域：

CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：4)

CDR2：AIRRSGRRTYYADSVKG(=SEQ ID NO：5)

CDR3：ARRVRSSTRYNTGTWWWEY(=SEQ ID NO：6)；具有以下CDR序列之白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域：

CDR1：SFGMS(=SEQ ID NO：16)

CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG(=SEQ ID NO：17)

CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：13)

CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：14)

CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(=SEQ ID NO：15)；該等域呈此次序或呈以上域之經改變之次序。

第三具體較佳實施例：多肽，其包含具有以下CDR序列之第一(LRP5/LRP6結合)免疫球蛋白單一可變域：

CDR1：RYTMG(=SEQ ID NO：7)

CDR2：AIVRSGGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：8)

CDR3：DRRGRGENYILLYSSGRYEY(=SEQ ID NO：9)；具有以下CDR序列之白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域：

CDR1：SFGMS(=SEQ ID NO：16)

CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG(=SEQ ID NO：17)

CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：13)

CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：14)

上述CDR序列概述於表IA、表IB及表IC中：

除了如上文所述之CDR序列以外，本發明之多肽中所包含之免疫球蛋白單一可變域亦包括免疫球蛋白構架區(FR)序列。此等序列較佳在人類中沒有免疫原性，且因此較佳為人類或人類化FR序列。適合之人類或人類化FR序列為此項技術中已知的。具體較佳之FR序列可取自下文所示之實施例，其揭示全部免疫球蛋白單一可變域且由此揭示CDR序列以及FR序列。

根據一甚至更具體實施例，本發明之多肽包括第一免疫球蛋白單一可變域(a)，其選自由具有以下序列之免疫球蛋白單一可變域(i)至(iii)組成之群：

(i) [=Wnt1-333E06mod域；=SEQ ID NO：19]

(ii) [=Wnt1-333G06域；=SEQ ID NO：20]，及

(iii) [=Wnt1-332D03mod域；=SEQ ID NO：21]，及第二免疫球蛋白單一可變域(b)，其選自由具有以下序列之免疫球蛋白單一可變域(iv)及(v)組成之群：

(iv) [=Wnt3a-093A01域；=SEQ ID NO：22]，及

(v) [=Wnt3a-367B10域；=SEQ ID NO：23]。

較佳實施例為：多肽，其包含-具有如SEQ ID NO：19中所示之胺基酸序列的第一免疫球蛋白單一可變域及具有如SEQ ID NO：22中所示之胺基酸序列的第二免疫球蛋白單一可變域；或-具有如SEQ ID NO：20中所示之胺基酸序列的第一免疫球蛋白單一可變域及具有如SEQ ID NO：23中所示之胺基酸序列的第二免疫球蛋白單一可變域；或-具有如SEQ ID NO：21中所示之胺基酸序列的第一免疫球蛋白單一可變域及具有如SEQ ID NO：23中所示之胺基酸序列的第二免疫球蛋白單一可變域。

因此，以上實施例可示意性地展現為isvd(a)-[連接子肽]-isvd(b)，其中「isvd」表示相應免疫球蛋白單一可變域，且其中另外，尤其在存在視情況選用之連接子肽及/或其他域，尤其Alb11域方面，且在免疫球蛋白單一可變域之不同次序方面，相同定義及變體應如上文所述進行應用。

根據本發明之具體實施例，以上多肽可另外包括半衰期延長部分，其中該半衰期延長部分共價連接至該多肽且視情況選自由以下組成之群：白蛋白結合部分，諸如白蛋白結合肽或白蛋白結合免疫球蛋白域、較佳白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域、更佳Alb11域；運鐵蛋白結合部分，諸如抗運鐵蛋白免疫球蛋白域、聚乙二醇分子、血清白蛋白(較佳人類血清白蛋白)及(人類)血清白蛋白之片段。

上述Alb11免疫球蛋白單一可變域之序列如下：

(=Alb11域；=SEQ ID NO：24)

結合至人類血清白蛋白的免疫球蛋白單一可變域之其他實例為此項技術中已知的，且進一步詳細地描述於例如國際專利公開案WO2006/122787及WO2008/028977中。結合至人類血清白蛋白之其他肽描述於例如WO2008/068280、WO2009/127691及WO2011/095545中。

因此，本發明之三個較佳具體實施例如下：

第一較佳具體實施例：多肽，其包含-具有如SEQ ID NO：19中所示之胺基酸序列的第一(LRP5/LRP6結合)免疫球蛋白單一可變域；-具有如SEQ ID NO：24中所示之胺基酸序列的白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域；-具有如SEQ ID NO：22中所示之胺基酸序列的第二(LRP5/LRP6結合)免疫球蛋白單一可變域；該等域呈此次序或呈以上三個域之經改變之次序。

第二較佳具體實施例：多肽，其包含-具有如SEQ ID NO：20中所示之胺基酸序列的第一(LRP5/LRP6結合)免疫球蛋白單一可變域；-具有如SEQ ID NO：24中所示之胺基酸序列的白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域；-具有如SEQ ID NO：23中所示之胺基酸序列的第二(LRP5/LRP6結合) 免疫球蛋白單一可變域；該等域呈此次序或呈以上三個域之經改變之次序。

第三較佳具體實施例：多肽，其包含-具有如SEQ ID NO：21中所示之胺基酸序列的第一(LRP5/LRP6結合)免疫球蛋白單一可變域；-具有如SEQ ID NO：24中所示之胺基酸序列的白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域；-具有如SEQ ID NO：23中所示之胺基酸序列的第二(LRP5/LRP6結合)免疫球蛋白單一可變域；該等域呈此次序或呈以上三個域之經改變之次序。

在一甚至更具體較佳實施例中，白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域位於兩個LRP5/LRP6結合免疫球蛋白單一可變域之間。

上述免疫球蛋白單一可變域之序列概述於表IIA、表IIB及表IIC中：

如上文所述，本發明之多肽中所存在的(至少兩個)免疫球蛋白單一可變域可直接而不使用連接子或經由連接子彼此連接。連接子較佳為連接子肽且根據本發明，將加以選擇以使至少兩個不同免疫球蛋白單一可變域結合至其靶抗原決定基中之每一者。

適合之連接子將尤其視抗原決定基，且具體而言，視免疫球蛋白單一可變域應結合至的靶分子上之抗原決定基之間的距離而定。基於本文中之揭示內容，視情況在一定有限程度之常規實驗之後，此對熟習此項技術者將為清楚的。

因此，適合之連接子可包含例如，具有9個或大於9個胺基酸，較佳為至少17個胺基酸，諸如約20至40個胺基酸之長度的胺基酸序列。連接子序列可為天然存在之序列或非天然存在之序列。若用於治療性目的，連接子較佳在本發明之多肽所投與之個體中為非免疫原性的。

如WO1996/34103及WO1994/04678中所述，連接子序列之一個適用群為衍生自重鏈抗體之鉸鏈區的連接子。其他實例為聚丙胺酸連接子序列，諸如Ala-Ala-Ala。

連接子序列之更佳實例為具有不同長度之Gly/Ser連接子，諸如(gly_xser_y)_z連接子，包括例如，(gly₄ser)₃、(gly₄ser)₅、(gly₄ser)₇、(gly₃ser)₃、(gly₃ser)₅、(gly₃ser)₇、(gly₃ser₂)₃、(gly₃ser₂)₅及(gly₃ser₂)₇。

可替代地，或除了多肽連接子，本發明之多肽中所存在之至少兩個免疫球蛋白單一可變域可經由另一部分，諸如另一多肽彼此連接，在一較佳但非限制性實施例中，該另一部分可為如上已經描述之另一免疫球蛋白單一可變域。該部分可基本上為非活性的或可具有諸如改良多肽之所需特性或可賦予多肽一或多個另外所需特性的生物作用。如上文已經闡述，較佳的另外多肽域將增加多肽，諸如(人類)血清白蛋白結合域，諸如Alb11域之半衰期。

因此，根據另一實施例，本發明具體包括包含以下序列中之任一者的多肽，其中精確胺基酸序列可取自下表III：SEQ ID NO：25(=多肽F013500575之序列)，SEQ ID NO：26(=多肽F013500571之序列)，及SEQ ID NO：27(=多肽F013500720之序列)。

根據一甚至更具體實施例，本發明之多肽係選自以下分子之群：多肽F013500575，其具有序列SEQ ID NO：25，多肽F013500571，其具有序列SEQ ID NO：26，及多肽F013500720，其具有序列SEQ ID NO：27。

如先前所解釋，除非另外指明，否則本發明之多肽可包括其他部分及/或另外多肽域，只要其與LRP5/LRP6之結合將不會受到該另外部分或域阻止即可。

本發明之多肽可另外含有修飾，諸如糖基殘基或經修飾之胺基酸側鏈，且其可經聚乙二醇化以便增加該分子之半衰期及其他特性。適用於聚乙二醇化雙抗體結合部位免疫球蛋白單一可變域構築體之技術及試劑可獲自例如WO2011/107507。

本發明之多肽可具有經修飾之N末端序列，例如，N末端胺基酸中之一或多者缺失或例如第一N末端胺基酸之交換(例如麩胺酸交換為丙胺酸)，以使分子最佳化以藉由使用某些表現系統(諸如特異性載體或宿主細胞)表現、或表現為包涵體或呈可溶形式、或分泌至介質或周質空間中或含於細胞內、或產生較均勻產物。本發明之多肽可具有經修飾之C末端序列，諸如另外丙胺酸(如上表III中所展示之三個實施例所示)及/或C末端部分中或構架區中之任一者中的其他限定位置處之其他胺基酸交換，如例如WO2012/175741、WO2011/075861或WO2013/024059中所解釋，以例如進一步增強該等多肽之穩定性或降低該等多肽之免疫原性。

此外，本發明之多肽的半衰期可藉由添加白蛋白域，亦即藉由將其轉化成白蛋白融合蛋白質來提高。適用白蛋白部分及如何將其添加至結合分子中之實例提供於例如WO2001/079271及WO2003/059934中。

較佳地，本發明之多肽具有在如下文實例7.1中所述的FACS結合分析中所量測之結合(EC₅₀)值，其在10^-6莫耳/公升或小於10^-6莫耳/公升、更佳10^-9莫耳/公升或小於10^-9莫耳/公升範圍內、且甚至更佳在10^-10莫耳/公升至10^-13莫耳/公升範圍內，或具有如在如下文實例7.3中所述的組合Wnt1及Wnt3a報導分析中所量測的IC₅₀值，其為10^-9莫耳/公升或10^-9莫耳/公升，且較佳在5×10^-10莫耳/公升至10^-12莫耳/公升範圍內。

本發明之多肽允許對若干癌症類型，諸如TNBC、CRC及NSCLC進行較高效治療。其具有改良之活體外特徵(亦即Wnt路徑抑制之較高功效)(參見例如下文實例7及實例8)，及顯著活體內腫瘤生長抑制特性，產生比此項技術中所述之其他LRP6結合分子高之活體內功效(如例如下文實例9及實例10中所示)。

詳言之，如經Wnt驅動之腫瘤模型中之活體內所示，LRP5/LRP6交叉反應性半衰期延長之雙抗體結合部位人類化VHH構築體可抑制Wnt信號傳遞及活體內腫瘤生長，且甚至提供實質上腫瘤縮小(亦即腫瘤生長抑制率高於100%)，其在相同實驗環境下，使用此項技術中已知的LRP6結合子可能不會達成。腫瘤縮小(亦即腫瘤消退)理所當然為癌症患者之治療的所需治療性作用(亦即功效)。此外，引起病理性完全反應(pCR)之腫瘤消退為已確認之臨床指標，其指示無進展存活期及總存活期得到顯著改良。

在相同活體內實驗中，未觀測到顯著體重變化(<10%)，且來自胃腸道組織病理學分析之結果並未指示出以上本發明之多肽的任何毒性作用。鑒於上文所論述之活體內DKK1表現研究(亦即引起腸黏膜潰爛及體重降低)，此特別出人意料。

因此，本發明之多肽實際上提供用於治療癌症疾病，且尤其甚至供用於高度未滿足的醫學需要適應症，諸如(三陰性)乳癌中之新穎治療性選擇。

出人意料地，本發明人並未藉由習知途徑，亦即嘗試研發對一種給定靶向物，諸如LRP6(例如在WO2009/056634中，經提及作為治療「經Wnt信號傳遞介導之疾病」之靶向物)具有高度特異性/選擇性之抑制劑或結合分子來達成此解決方案。與此相反，本發明人研發出了同時靶向兩種相關蛋白質(LRP6及LRP5)，且由此達成由先前技術所不可預期的以上顯著改良之活體外及活體內作用的分子。

此優越性之潛在分子機制並不完全清楚，但在不希望受特定理論束縛之情況下，可推測該等交叉反應性分子可具有對Wnt信號傳遞路徑之高度複雜信號級聯之另外且由此較強之作用。

以上有利作用將進一步在下文實例中且藉助於其中所包括之比較資料加以說明。

此外，本發明之多肽易於製造且較具可溶性，其意謂與習知抗體相比，該等多肽可以較高濃度儲存及/或投與。其在室溫下穩定且甚至在pH 之極值下仍具有延長之穩定性，以使得可在不使用冷藏設備之情況下對其進行製備、儲存及/或輸送，實現成本、時間及環境節約。歸因於上文且歸因於其低免疫原性，其進一步提供關於除注射及輸注以外之投藥途徑，以及關於投藥療程及特定裝置之使用的多種選擇。

核酸、載體、宿主細胞

根據其他態樣，本發明係關於編碼本發明之多肽的核酸分子及表現載體，以及表現其之宿主細胞。此等核酸、載體及宿主細胞適用於製造本發明之多肽，且其其他態樣及實施例將結合製造本發明之多肽的方法之概述進一步描述於下文。

治療用途

歸因於其生物特性，本發明之多肽適合於治療藉由過量或異常細胞增殖表徵之疾病，諸如癌症及特發性肺纖維化(IPF)。

舉例而言，可用根據本發明之多肽治療以下癌症、腫瘤及其他增生性疾病，但並不限於此：頭頸癌；肺癌，諸如非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌(SCLC)；縱隔贅瘤，諸如神經性腫瘤及間葉細胞腫瘤；胃腸(GI)道癌，諸如食道癌、胃癌(stomach cancer/gastric cancer)、胰腺癌、肝癌及膽道癌(包括例如，肝細胞癌(HCC))及小腸及大腸癌(包括例如，結腸直腸癌)；前列腺癌；睪丸癌、婦科癌症，諸如卵巢癌；乳癌，諸如乳腺癌、激素受體陽性乳癌、Her2陽性乳癌及三陰性乳癌；內分泌系統之癌症；軟組織肉瘤，諸如纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)；骨骼肉瘤，諸如骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏腫瘤(Ewing's tumor)、纖維肉瘤、骨軟骨瘤、骨母細胞瘤及軟骨母細胞瘤；間皮瘤；皮膚癌，諸如基底細胞癌、鱗狀細胞癌、梅克爾細胞癌(Merkel's cell carcinoma)及黑素瘤；中樞神經系統及腦贅瘤，諸如星形細胞瘤、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤及視網膜胚細胞瘤；淋巴瘤及白血病，諸如B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphomas；NHL)、T細胞非霍奇金氏淋巴瘤、慢性B細胞淋巴細胞性白血病(B-CLL)、慢性T細胞淋巴細胞性白血病(T-CLL)、霍奇金氏疾病(HD)、大顆粒淋巴細胞白血病(LGL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性/骨髓白血病(AML)、急性淋巴/淋巴母細胞白血病(ALL)、多發性骨髓瘤(MM)、漿細胞瘤及骨髓發育不良症候群(MDS)；及未知原發部位之癌症。

藉由其在體內的特定位置/源表徵之上述所有癌症、腫瘤、贅瘤等意謂包括原發腫瘤及自其衍生之轉移性腫瘤。

更具體而言，本發明之多肽適用於治療疾病，且尤其癌症疾病，其中異常細胞增殖係由異常(活化)Wnt信號傳遞引起或涉及異常(活化)Wnt信號傳遞。

因此，本發明之多肽特別適用於治療實體腫瘤，且更具體而言，適用於治療肺癌、肝癌、結腸癌、腦癌、甲狀腺癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌及前列腺癌，且甚至更具體而言，適用於治療非小細胞肺癌(NSCLC)、三陰性乳癌(TNBC)及結腸直腸癌(CRC)。詳言之，本發明之多肽可用作單一藥劑或用於組合中，以治療患有局部晚期或轉移性TNBC之患者、患有轉移性NSCLC或局部晚期或轉移性CRC之患者以延長無進展存活期(PFS)及總存活期(OS)。此外，本發明之多肽可用作乳癌患者之新輔助治療以達成病理性完全反應(pCR；藉由完成新輔助全身性療法後的完整的經切除之乳房試樣及全部經取樣之局部淋巴結的組織病理學評估定義為不存在殘餘侵襲性及原位癌症)。

本發明之多肽可用於第一線、第二線或任何其他線治療之情形中的治療療程中。

本發明之多肽可用於預防、短期或長期治療上述疾病，視情況亦與放射線療法及/或手術組合。

同樣，本發明之多肽特別適用於治療由涉及Wnt信號傳遞路徑之異常細胞增殖引起的其他疾病，諸如特發性肺纖維化(IPF)(Königshoff等人「功能性Wnt信號傳遞在特發性肺纖維化中會有所增加」.PLoS One 2008；3(5)：e2142；Lam等人「Wnt共受體Lrp5為特發性肺纖維化之驅動子」.Am J Respir Crit Care Med.2014；190(2)：185-95)。

此外，本發明之多肽特別適用於治療視網膜病變，且尤其治療糖尿病性視網膜病變，歸因於內視網膜細胞中之異常Wnt活化，其使得引起糖尿病性視網膜病變之產生及進展的異常新視網膜血管形成增加(Chen,Y.等人「Wnt路徑之活化在人類及動物模型中的糖尿病性視網膜病變中起致病性作用」The Am J Pathol.2009；175(6)：2676-85.；Gao等人「升高之LRP6水準與增生性糖尿病性視網膜病變之玻璃體中的血管內皮生長因子相關」Mol Vis.2015；21：665-72)。

最後，由於可顯示Wnt1/Wnt3a信號傳遞路徑之抑制亦可對樹突狀細胞(DC)及樹突狀細胞功能產生作用，因此本發明之多肽亦可適用於治療免疫性及感染性疾病，且適用於影響上文已經闡述的各種癌症疾病中之腫瘤微環境。腫瘤主動遏制抗腫瘤免疫性，且DC在癌症免疫逃避機制中起重要作用。詳言之，研究已顯示，腫瘤微環境中之Wnt配位體亦可在免疫細胞內發起旁分泌信號傳遞且調節宿主抗腫瘤免疫(Hong等人「β-索烴素藉由在樹突狀細胞中誘導維生素A代謝來促進腫瘤中之調節性T細胞反應」.Cancer Res.2015；75(4)：656-65)。

當然，上文亦包括本發明之多肽在藉由向有需要之患者投與治療有效劑量治療以上疾病之各種方法中的用途，以及此等多肽用於製造供用於治療該等疾病之藥劑的用途，以及包括本發明之該等多肽的醫藥組合物，以及包括本發明之該等多肽的藥劑的製備及/或製造及類似者。

與其他活性物質之組合

本發明之多肽可獨立或與其他藥理學活性物質組合使用，該等活性物質諸如目前先進技術或標準照護化合物，諸如細胞生長抑制或細胞毒性物質，細胞增殖抑制劑、抗血管生成物質、類固醇、免疫調節劑/檢查點抑制劑及類似者。

可與根據本發明之化合物組合投與的細胞生長抑制及/或細胞毒性活性物質包括(但不限於)激素、激素類似物及抗激素；芳香酶抑制劑；LHRH促效劑及拮抗劑；生長因子(諸如血小板衍生生長因子(PDGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、人類表皮生長因子(HER，例如，HER2、HER3、HER4)及肝細胞生長因子(HGF)之生長因子)之抑制劑，抑制劑為例如(抗)生長因子抗體、(抗)生長因子受體抗體及酪胺酸激酶抑制劑，諸如西妥昔單抗(cetuximab)、吉非替尼(gefitinib)、阿法替尼(afatinib)、尼達尼布(nintedanib)、伊馬替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、伯舒替尼(bosutinib)及曲妥珠單抗(trastuzumab)；抗代謝物(例如抗葉酸劑，諸如甲胺喋呤、雷替曲塞(raltitrexed)、嘧啶類似物(諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱(capecitabine)及吉西他濱(gemcitabine))、嘌呤及腺苷類似物(諸如巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、克拉屈濱(cladribine)及噴司他汀(pentostatin))、阿糖胞苷(ara C)、氟達拉濱(fludarabine))；抗腫瘤抗生素(例如蒽環黴素)；鉑衍生物(例如順鉑、奧沙利鉑、卡鉑)；烷基化劑(例如雌莫司汀(estramustin)、氮芥(meclorethamine)、美法侖(melphalan)、氯芥苯丁酸、白消安、達卡巴嗪(dacarbazin)、環磷醯胺、異環磷醯胺、替莫唑胺、亞硝脲(諸如卡莫司汀(carmustin)及洛莫司汀(lomustin))、噻替派)；抗有絲分裂劑(例如長春花生物鹼，諸如長春鹼、長春地辛(vindesin)、長春瑞濱(vinorelbin)及長春新鹼；及紫杉烷，諸如太平洋紫杉醇、多西他賽(docetaxel))；血管生成抑制劑；微管蛋白抑制劑；DNA合成抑制劑；PARP抑制劑；拓撲異構酶抑制劑(例如表鬼臼毒素，諸如依託泊苷(etoposide)及凡畢複(etopophos)、替尼泊甙(teniposide)、安吖啶(amsacrin)、拓朴替康(topotecan)、伊立替康(伊立替康)、米托蒽醌(mitoxantrone))；絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑(例如PDK1抑制劑、Raf抑制劑、A-Raf抑制劑、B-Raf抑制劑、C-Raf抑制劑、mTOR抑制劑、mTORC1/2抑制劑、PI3K抑制劑、PI3Kα抑制劑、雙重mTOR/PI3K抑制劑、STK33抑制劑、AKT抑制劑、PLK1抑制劑(諸如伏拉塞替(volasertib))、CDK抑制劑、Aurora激酶抑制劑)；酪胺酸激酶抑制劑(例如PTK2/FAK抑制劑)；蛋白質-蛋白質相互作用抑制劑；MEK抑制劑；ERK抑制劑；FLT3抑制劑；BRD4抑制劑；IGF-1R抑制劑；TRAILR2促效劑；Bcl-xL抑制劑；Bcl-2抑制劑；Bcl-2/Bcl-xL抑制劑；ErbB受體抑制劑；BCR-ABL抑制劑；ABL抑制劑；Src抑制劑；雷帕黴素類似物(例如依維莫司(everolimus)、替西羅莫司(temsirolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、西羅莫司(sirolimus))；雄激素合成抑制劑；雄激素受體抑制劑；DNMT抑制劑；HDAC抑制劑；ANG1/2抑制劑；CYP17抑制劑；放射性藥品；免疫治療劑，諸如免疫檢查點抑制劑(例如CTLA4、PD1、PD-L1、LAG3及TIM3結合分子/免疫球蛋白，諸如伊匹單抗(ipilimumab)、納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab))；癌症疫苗，諸如傳統腫瘤疫苗(基於細胞之疫苗，例如用於治療前列腺癌之西普魯塞-T(Sipuleucel-T))、個體化新抗原疫苗及溶瘤病毒；及各種化學治療劑，諸如阿米福汀(amifostin)、阿那格雷(anagrelid)、氯屈膦酸鹽(clodronat)、非格司亭(filgrastin)、干擾素、干擾素α、甲醯四氫葉酸、利妥昔單抗(rituximab)、丙卡巴肼(procarbazine)、左旋咪唑(levamisole)、美司鈉(mesna)、米托坦(mitotane)、帕米膦酸鹽(pamidronate)及卟吩姆(porfimer)。

尤其較佳為包括使用本發明多肽與選自由以下組成之群的藥物組合的治療方法：(i)在乳癌患者中，在存在或不存在化學療法組合(包括新輔助設定中之小紅莓/環磷醯胺組合及/或卡培他濱/多西他賽組合；針對第一線及後線治療之紫杉烷/鉑療程)之情況下，抗VEGF抗體(貝伐單抗(bevacizumab)及其他抗血管生成物質)；(ii)在肺癌患者中，在存在或不存在化學療法組合(基於鉑之細胞毒性組合療法，其包括第一線治療中之吉西他濱/順鉑；第二線治療中之多西他賽或培美曲塞(pemetrexed))之情況下，針對EGFR突變NSCLC之EGFR TKI或針對ALK易位之NSCLC之克唑替尼(crizotinib)；(iii)例如針對CRC患者之治療，在存在或不存在化學療法組合(包括伊立替康)、抗VEGF抗體組合(貝伐單抗及其他抗血管生成物質)或瑞戈非尼(regorafenib)組合之情況下，抗EGFR抗體(KRAS野生型腫瘤中之西妥昔單抗及帕尼單抗(panitumumab))；(iv)例如針對乳癌、肺癌及CRC患者之治療的免疫治療劑，其包括抗PD-1劑(諸如派姆單抗及納武單抗)、抗PD-L1劑、抗CTLA4劑、抗BTLA劑、抗LAG3劑及抗TIM3劑(諸如抗PDL1抗體等)；(v)例如針對乳癌或CRC患者之治療的化學治療劑，諸如基於鉑之抗腫瘤劑，或呈與FOLFOX化學療法療程的組合形式，其包括醛葉酸、5'-氟尿嘧啶及奧沙利鉑；或呈與FOLFOXIRI化學療法療程的組合形式，其包括醛葉酸、5'-氟尿嘧啶、奧沙利鉑及伊立替康。

當使用兩種或大於兩種物質或成分作為組合治療療程之一部分時，其可基本上在同一時間(亦即同時，並行)或在不同時間(例如依序、依次、交替、連續或根據任何其他類別之交替方案)經由同一投藥途徑或經由不同投藥途徑進行投與。

當經由同一投藥途徑同時投與該等物質或成分時，其可以不同醫藥調配物或組合物形式或作為組合醫藥調配物或組合物之一部分進行投與。此外，當使用兩種或大於兩種活性物質或成分作為組合治療療程之一部分時，可以相同量且根據與單獨使用該化合物或成分時所用之療程相同的療程投與該等物質或成分中之每一者，且該組合使用可或可不引起協同效應。然而，當兩種或大於兩種活性物質或成分之組合使用引起協同效應時，亦可降低待投與之該等物質或成分中之一者、多者或全部的量，同時仍達成所需治療性作用。此可例如適用於避免、限制或降低當以其常用量使用其時，任何與該等物質或成分中之一或多者的使用相關聯之不合需要之副作用，同時仍獲得所需藥理學或治療性作用。

當然，上文包括製備本發明之多肽以用於與以上組合搭配物進行組合使用的製劑及方法。製備上述組合搭配物以用於與本發明之多肽進行組合使用的製劑及方法亦包括在內。因此，本發明特此例如提供使用或製備免疫調節劑/檢查點抑制劑，諸如抗PD1抗體(諸如派姆單抗或納武單抗)以供用於與本發明之多肽組合投藥，且更具體而言，用於與本發明之多肽的組合療法療程中的投藥的方法。

此外，本發明亦涵蓋包含至少一種本發明之多肽及一或多種其他組分及如下文所述之裝置的套組，該等其他組分選自由用於治療如上所述之疾病及病症的其他藥物組成之群。

醫藥組合物、投藥方法、劑量

熟習此項技術者將清楚，以上疾病治療方法包括供用於治療該疾病之藥劑的製備。因此，本發明進一步關於用於治療上文所提及之疾病的醫藥組合物，其中該等組合物包含至少一種本發明之多肽。

可以任何適合之方式向有需要之患者投與本發明之多肽及/或包含其之組合物，其視待使用之特定醫藥調配物或組合物而定。因此，本發明之多肽及/或包含其之組合物可例如以以下方式以有效量或劑量投與：靜脈內(i.v.)、皮下(s.c.)、肌肉內(i.m.)、腹膜內(i.p.)、經皮、經口、舌下(例如呈置放於舌頭下且經由黏膜吸收至舌頭下的毛細血管網中的舌下錠劑、噴霧劑或滴劑形式)、經鼻(內)(例如呈鼻用噴霧劑形式及/或以氣溶膠形式)、局部、借助於栓劑、藉由吸入或任何其他適合方式。

根據適合於治療及/或緩解待治療或緩解之疾病、病症或病狀的治療療程來投與本發明之多肽及/或包含其之組合物。臨床醫師將通常能夠確定適合之治療療程，其視諸如以下因素而定：待治療或緩解之疾病、病症或病狀、疾病之嚴重程度、其症狀之嚴重程度、待使用的本發明之特定多肽、待使用的特定投藥途徑及醫藥調配物或組合物、患者年齡、性別、體重、飲食、一般情況及臨床醫師所熟知的類似因素。一般而言，治療療程將包含一或多種本發明之多肽或一或多種包含其之組合物以治療有效量或劑量之投藥。

一般而言，對於本文中所提及的且視待治療之特定疾病、病症或病狀、待使用的本發明之特定多肽的效能、所用特定投藥途徑及特定醫藥調配物或組合物而定的疾病、病症及病狀之治療及/或緩解而言，本發明之多肽將通常以每公斤體重及每劑量0.005毫克與每公斤體重20.0毫克之間、較佳0.05毫克/公斤/劑量與10.0毫克/公斤/劑量之間、且更佳0.5毫克/公斤/劑量與10毫克/公斤/劑量之間的量以連續方式(例如藉由輸注)或更佳以單次劑量(諸如一週兩次、每週一次或每月一次之劑量；參見下文)形式投與，但可顯著變化，尤其視先前提及之參數而定。因此，在一些情況下，使用小於上文給出之最小劑量可為足夠的，而在其他情況下可能必須超過上限。當投與較大量時，在一天內將其分成多個較小劑量可為可取的。

視本發明之特定多肽及其特定藥物動力學特性及其他特性而定，可每天一次、每兩天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次或每六天一次、每週一次、每月一次及其類似方式投與該多肽。投藥療程可包括每週一次的長期治療。「長期」意謂持續時間為至少兩週且較佳數月或數年。

可使用任何適合之活體外分析、基於細胞之分析、活體內分析及/或本身已知的動物模型或其任何組合測試本發明之多肽及包含其之組合物的功效，其視所涉及之特定疾病而定。適合之分析及動物模型對熟習此項技術者將為清楚的，且例如包括以下實例中所用之分析及動物模型。

較佳地，在此等分析或模型中之至少一者中，且較佳在活體內模型中之一或多者中，本發明之多肽具有比此項技術中已知的習知抗體(諸如以上「先前技術」部分中所述之LRP6結合子)更佳之特徵。

調配物

出於醫藥用途，本發明之多肽可調配為包含以下之醫藥製劑：(i)至少一種本發明之多肽及(ii)至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或穩定劑，及(iii)視情況選用之一或多種其他藥理學活性多肽及/或化合物。「醫藥學上可接受」意謂當向個體投與時，相應物質不會顯示任何生物或者不合需要之作用且不會以有害方式與醫藥組合物中所含有之其他組分(諸如醫藥學上活性成分)中之任一者相互作用。特定實例可見於標準手冊，諸如雷明頓氏醫藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第18版，Mack Publishing Company,USA(1990)。舉例而言，可以習知抗體及抗體片段及其他醫藥學上活性蛋白質本身已知的任何方式調配且投與本發明之多肽。因此，根據另一實施例，本發明係關於一種醫藥組合物或製劑，其含有至少一種本發明之多肽及至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或穩定劑，及視情況選用之一或多種其他藥理學活性物質。

用於非經腸投藥，諸如靜脈內、肌肉內、皮下注射或靜脈內輸注之藥物製劑可為例如無菌溶液、懸浮液、分散液、乳液或粉末，其包含活性成分且其視情況在另一溶解或稀釋步驟之後適用於輸注或注射。該等製劑的適合載劑或稀釋劑例如包括(但不限於)無菌水及醫藥學上可接受之緩衝劑水溶液及溶液，諸如磷酸鹽緩衝生理鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及漢克氏溶液(Hank's solution)；水油(water oils)；甘油；乙醇；二醇，諸如丙二醇，以及礦物油、動物油及植物油，例如花生油、大豆油，以及其適合之混合物。

本發明多肽之溶液亦可含有防腐劑以防止微生物生長，諸如抗細菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯(p-hydroxybenzoates/parabens)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thiomersal)、乙二胺四乙酸(之鹼金屬鹽)及其類似物。在許多情況下，將較佳包括等張劑，例如糖、緩衝劑或氯化鈉。視情況可使用乳化劑及/或分散劑。適當流動性可例如藉由形成脂質體、在分散液情況下藉由維持所需粒度或藉由使用界面活性劑來維持。亦可添加延遲吸收之其他劑，例如單硬脂酸鋁及明膠。可將溶液填充至注射小瓶、安瓿、輸注瓶及其類似瓶中。

在所有情況下，最終劑型在製造及儲存條件下均必須為無菌、流體且穩定。無菌可注射溶液係如下製備：將所需量之活性化合物視需要與上文列舉之各種其他成分一起併入適當溶劑中，隨後過濾滅菌。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其產生存在於預先無菌過濾溶液中之活性成分加任何另外所需成分之粉末。

通常，水溶液或懸浮液將為較佳的。一般而言，適合之治療蛋白，諸如本發明多肽的調配物為緩衝蛋白質溶液，諸如包括以下之溶液：呈適合濃度(諸如0.001mg/ml至400mg/ml、較佳0.005mg/ml至200mg/ml、更佳0.01mg/ml至200mg/ml、更佳1.0mg/ml至100mg/ml，諸如1.0mg/ml(i.v.投與)或100mg/ml(s.c.投與))之蛋白質及諸如以下之緩衝劑水溶液：-磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.4，-其他磷酸鹽緩衝液，pH 6.2至pH 8.2，-乙酸鹽緩衝液，pH 3.2至pH 7.5，較佳pH 4.8至pH 5.5， -組胺酸緩衝液，pH 5.5至pH 7.0，-丁二酸鹽緩衝液，pH 3.2至pH 6.6，及-檸檬酸鹽緩衝液，pH 2.1至pH 6.2，及視情況選用的提供溶液之等張性的鹽(例如NaCl)及/或糖(諸如蔗糖及海藻糖)及/或其他多元醇(諸如甘露醇及甘油)。

較佳緩衝蛋白質溶液為包括溶解於25mM磷酸鹽緩衝液，pH 6.5中的約0.05mg/ml本發明之多肽的溶液，其藉由添加220mM海藻糖調整等張性。此外，其他試劑，諸如清潔劑，例如0.02% Tween-20或Tween-80可包括於該等溶液中。皮下施用之調配物可包括顯著較高濃度，諸如高達100mg/ml或甚至大於100mg/ml的本發明之多肽。然而，熟習此項技術者將清楚，如上所給出的成分及其量僅表示一種較佳選擇。其替代方案及變體對熟習此項技術者將直接顯而易知，或可易於自以上揭示內容開始進行構想。

此外，相較於習知抗體或抗體片段，使用本發明之多肽的一個主要優點在於其亦可易於經由除非經腸投藥以外之途徑投與且可容易針對該投與進行調配。舉例而言，如國際專利申請案WO2004/041867中所述，該等多肽可經調配以用於經口、鼻內、肺內及經皮投藥。

根據本發明之另一態樣，本發明之多肽可用於與適用於投與該多肽之裝置，諸如注射器、注射筆、微型泵或其他裝置進行組合。

製造及純化方法

本發明進一步提供製造本發明之多肽的方法，該等方法通常包含以下步驟：-在允許表現本發明之多肽的條件下培養包含編碼本發明之多肽的核酸(以下稱作：「本發明之核酸」)之宿主細胞；且 -自培養物回收或分離由宿主細胞表現之多肽；且-視情況進一步純化及/或修飾及/或調配本發明之多肽。

本發明之核酸可例如為包含編碼序列以及調節序列及視情況選用之天然或人工內含子的DNA分子或可為cDNA分子。其可具有其初始密碼子或可具有最佳化密碼子使用，其特別適用於表現於所需宿主細胞或宿主生物體中。根據本發明之一個實施例，如上文所定義，本發明之核酸呈基本上分離之形式。

本發明之核酸亦可呈以下形式：存在於載體中及/或作為載體之一部分，例如質體、黏質體或YAC，其同樣可呈基本上分離之形式。載體可尤其為表現載體，亦即可提供多肽之活體外及/或活體內(例如在適合之宿主細胞、宿主生物體及/或表現系統中)表現之載體。該表現載體通常包含至少一種可操作地連接至一或多種適合之調節元件，諸如啟動子、強化子、終止子及其類似者的本發明之核酸。適用於表現本發明之多肽或表現本發明之多肽所需的該等調節元件及其他元件，諸如整合因子、選擇標記、信號或前導序列、報導基因及其類似者之特定實例揭示於例如WO2006/040153之第131頁至第133頁上。

可以本身已知的方式(例如藉由自動DNA合成及/或重組DNA技術)，基於本文中所給出的本發明之多肽的胺基酸序列之資訊來製備或獲得本發明之核酸。

根據另一實施例，本發明係關於一種表現或能夠表現本發明之多肽；及/或含有編碼本發明之多肽的核酸的宿主或宿主細胞。根據一尤其較佳實施例，該等宿主細胞為細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。

對於行業規模之製造而言，用於免疫球蛋白單一可變域多肽及含有其之蛋白質治療劑的(行業)製造之較佳異源宿主包括大腸桿菌之菌株、甲醇酵母及釀酒酵母，其適合於大規模表現、製造及醱酵，且尤其適合於大規模(生物)醫藥表現、製造及醱酵。

如上文所述的產生於細胞中之本發明之多肽可以胞內方式(例如在胞溶質中、在外周胞質中或在包涵體中)產生且可隨後自宿主細胞分離且視情況進一步加以純化；或其可以胞外方式(分泌至其中培養宿主細胞之介質中)產生，且隨後自培養基分離且視情況進一步加以純化。

用於重組製造多肽之其他方法及試劑，諸如適合之表現載體、轉型或轉染方法、選擇標記、蛋白質表現之誘導方法、培養條件及其類似者為此項技術中已知的。類似地，適用於本發明之多肽的製造方法中的蛋白質分離及純化技術已為熟習此項技術者所熟知。

相比於通常需要昂貴哺乳動物細胞培養物設施的習知抗體，在適宜重組宿主生物體，諸如大腸桿菌及酵母中經由醱酵製造本發明之多肽具有成本效益。此外，可達成之表現水準較高且本發明之多肽的產量在1g/l至10g/l範圍內(大腸桿菌)且高達10g/l(酵母)且高於10g/l。

實例 實例1：用LRP5及LRP6免疫接種駱馬以誘導體液性免疫反應

針對LRP5/LRP6交叉反應性結合VHH域之鑑別所需要設計且實施的駱馬之免疫接種的若干協定：用LRP6及LRP5蛋白(人類及小鼠)之重組胞外域對駱馬進行初始免疫接種。然而，上述LRP5重組蛋白之功能性特徵顯示，僅Wnt1類結合抗原決定基得到恰當摺疊。對比而言，並未指示LRP5-Wnt3a類結合域之恰當摺疊。因此，需要進行進一步研究以產生適合免疫接種之抗原。作為解決方案，用經人類LRP5或人類LRP6穩定轉染之HEK293細胞免疫接種駱馬。然而，隨後，藉由短暫轉染或藉由穩定轉染且使用不同細胞株(HEK293、CHO及NIH-3T3細胞)，亦僅可達成人類LRP5之極低表現。因此，需要進行甚至進一步研究以達成LRP5之足夠表現。最後，且在一些失敗之試誤法之後，可藉由制定涉及HEK293細胞與MesDC-2之穩定共轉染的協定來達成此，該MesDC-2為意欲增加外源性LRP5表現之伴隨蛋白。即使隨後，亦即在產生經LRP5穩定轉染之細胞株期間共表現MesDC-2後，仍反覆地觀測到蛋白質表現之不穩定性。此導致LRP5表現可能會在免疫接種及選擇期間消失之問題。為解決此另一問題，儘可能限制表現LRP5的細胞之繼代且進行另外細胞分選以富集表現LRP5之細胞。

在存在及不存在hMesDC-2伴隨蛋白之情況下另外用LRP5編碼DNA及LRP6編碼DNA在相對側腹中對駱馬進行免疫接種。伴隨增加鑑別LRP5/LRP6交叉反應性VHH域之機會的目標，向若干駱馬遞送另外增強免疫以試圖增強交叉反應性免疫反應。

以規律時間間隔獲取免疫血液(PBL)樣本，測定血清反應，且由分離之PBL製備全部RNA。用重組蛋白免疫接種後，相比於對LRP5之低血清反應，觀測到對LRP6之中等血清反應。觀測到用DNA免疫接種之駱馬的中等LRP5免疫反應。對比而言，觀測到針對細胞免疫之極低免疫反應。此外，亦探索合成庫。然而，繼續進行如實例2中所概述之隨後步驟，可最終達成庫之足夠多樣性。

實例2：LRP5及LRP6結合單價VHH域(VHH)之分離 庫建構：

緊隨免疫組織之收集進行提取全部RNA，且檢驗RNA完整性及濃度。 cDNA樣本由此等RNA製劑製得。在單步RT-PCR反應中自cDNA樣本擴增編碼VHH之核苷酸序列。自樣本中之IgG2及IgG3 cDNA特異性擴增之700bp擴增子自瓊脂糖凝膠分離且隨後用作巢式PCR反應中之模板。隨後用SfiI及BstEII消化PCR產物且將該等產物接合至噬菌質體載體pAX50之相應限制位點。將接合混合物電穿孔至大腸桿菌TG-1中。所得轉化體庫構成噬菌體展示庫之基因多樣性。

pAX50為衍生自pUC119之表現載體，其含有安比西林(ampicillin)抗性基因及lac啟動子，之後為框內pIII蛋白信號肽之編碼序列，其具有下游VHH域選殖位點。在具有VHH域編碼序列之框內，載體編碼C末端Myc及六組胺酸標記及大腸桿菌噬菌體pIII蛋白。在具有輔助噬菌體之大腸桿菌TG-1庫純系感染之後，pAX50之存在使得可由此等純系產生噬菌體粒子，使個別VHH域顯示為具有pIII蛋白之融合蛋白質。

選擇：

建構VHH域-噬菌質體庫且用於選擇。鑒於整個物種(在駱馬與人類LRP5及LRP6之間)中之物種同源性極高，因而不確定駱馬中提高之免疫反應是否將提高VHH域之足夠多樣性。因此，在選擇期間平行於免疫庫使用兩個合成庫。

在選擇期間使用如下不同策略：

-交替LRP5及LRP6衍生工具以增強鑑別LRP5/LRP6交叉反應性VHH域之機會，例如，用LRP6衍生蛋白對來自經LRP5免疫接種之駱馬的庫進行選擇或在對合成庫之選擇期間使用LRP5及LRP6蛋白。

-交替物種源以選擇人類/小鼠LRP5/LRP6交叉反應性VHH域(在相同臨床前模型中(亦即異種移植腫瘤小鼠模型)中，允許評估治療窗評定所需的功效，亦即腫瘤生長抑制及安全性概況的該LRP5及LRP6拮抗劑的小鼠交叉反應性)。

-用重組蛋白「在溶液中(in solution)」選擇以使抗原決定基保持其天然構形：作為另外阻礙，發現若直接塗佈於ELISA結合培養盤上，則LRP5及LRP6重組蛋白會失去其恰當摺疊。因此，生物素標記重組蛋白，且在功能性分析中確定恰當摺疊之後，將其用於「在溶液中」選擇。

-使用過度表現LRP5或LRP6之細胞進行選擇，以具有受體之天然構形。出人意料地表明此為重要策略，尤其為改良對LRP5之Wnt3a類結合域的結合子選擇所需要的，因為重組蛋白之功能性資料顯示缺少Wnt3a結合抗原決定基之恰當摺疊。

實例3：單價VHH之篩選

選擇之後，使純系在96深孔培養盤(1mL體積)中生長，且藉由添加IPTG誘導VHH表現。如例如WO2011/107507中所報導，根據標準方法製備單一純系之周質提取物，且針對結合至人類LRP6及LRP5進行篩選。首先，在結合ELISA分析中使用重組LRP5及LRP6篩選周質提取物，當與基於FACS之結合分析相比時，該等分析表示靈敏、穩健及高通量分析。純化之後，使用結合FACS分析進一步表徵ELISA分析中所鑑別之VHH以確認純化VHH結合至呈其天然構形之LRP5及LRP6受體。

通常，期望ELISA與FACS結合分析之間的良好相關性。然而，在當前情況中，ELISA分析中之最佳LRP5及LRP6結合VHH(亦即具有與重組LRP5或LRP6胞外域之高親和力)並未在FACS結合分析中顯示與人類LRP5及LRP6之任何結合或與人類LRP5及LRP6之結合極弱，如圖2中之側圖「2」結合子所示。不同塗佈緩衝液(dPBS與碳酸氫鹽緩衝液)及ELISA 設定中之阻斷溶液(Marvel與BSA)之使用並未解決所觀測到之差異。實際上，已發現ELISA中之極弱結合子在使用LRP5及LRP6表現細胞之結合FACS分析中顯示出對LRP5及LRP6之高親和力，如圖2之側圖「1」結合子中所示。因此，此等其他資料及實驗使得可進行識別兩種受體之天然構形的高親和力結合子之選擇。此外，此等高親和力結合子識別構形依賴性抗原決定基而非LRP5及LRP6蛋白質中之線性抗原決定基由此得到確認。因此，此等其他非常規資料及實驗使得可進行治療相關性LRP5及LRP6結合子之選擇，其應具有對質膜上所表現的呈其天然構形之LRP5及LRP6的高親和力。

因此，儘管(i)FACS結合分析通量低，(ii)分析設定較不穩健，及(iii)歸因於過表現LRP5之細胞繼代後重組蛋白表現缺失而遇到上述困難，仍隨後將此等分析用於高親和力VHH結合子之其他選擇及表徵中。簡言之，在4℃下在培養盤震盪器上用純化VHH稀釋液培育細胞(1μM至1pM最終濃度之1：5連續稀釋液最終濃度)1.5小時。用由1×磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)+10%胎牛血清(FBS)+0.05%疊氮化鈉組成的FACS緩衝液洗滌細胞5次之後，在4℃下用結合至VHH之構架區且因此結合至所測試之所有LRP5及/或LRP6結合子的多株小鼠抗體培育30分鐘至1小時。用FACS緩衝液洗滌細胞3次之後，在4℃下用標記二次抗體(抗小鼠PE)培育細胞持續30分鐘至1小時，之後進行用FACS緩衝液洗滌3次之步驟。使用FACS陣列(BD)量測螢光。

基於結合FACS資料及序列分析，自免疫庫及合成源鑑別總共一百種LRP5/LRP6交叉反應性VHH家族/群集。其代表性實例藉由其序列進一步顯示且界定於下文中。在大腸桿菌中表現VHH且加以純化。以防證明大腸桿菌中之表現不足，VHH產生於甲醇酵母中。VHH之表現及純化之簡要說明進一步報導於下文中。

VHH在大腸桿菌中之一般表現：

將編碼序列選殖於pAX100表現載體中且在大腸桿菌中表現為c-Myc六組胺酸標記之蛋白質。使含有相關VHH構築體之大腸桿菌TG-1細胞在搖瓶中在補充有康微素且藉由添加1mM IPTG以誘導表現之TB培養基中生長(37℃，250rpm)。旋轉細胞培養物之後，藉由冷凍-解凍丸粒且再懸浮於dPBS中來製備周質提取物。

VHH在甲醇(P.)酵母中之一般表現：

將編碼序列選殖於pAX159表現載體中且在甲醇酵母中表現為c-Myc六組胺酸標記之蛋白質。使含有相關VHH構築體之甲醇酵母X-33細胞在BGCM(緩衝甘油複合培養基；Invitrogen)中生長(30℃，250rpm)。在第三天，將培養基切換為BMCM(緩衝甲醇複合培養基；Invitrogen)且使培養物進一步生長且藉由添加0.5vol%甲醇(100%)對培養物進行定期誘導。旋轉細胞培養物之後，收集清液層(含有經分泌之VHH)。

VHH純化：

在Tecan EVO150上藉由固定金屬親和性層析(RoboColumns 100ul Nickel Sepharose^TM 6 FF,Atoll)純化六組胺酸標記之VHH，自具有250mM咪唑之管柱溶離且隨後經dPBS去鹽。藉由SDS-PAGE及/或西方墨點法使用抗Myc及抗VHH偵測檢驗VHH之純度及完整性。

實例4：純化單價VHH之活體外表徵

VHH篩選之後，藉由使用如下文所述之若干功能性及生物物理學分析來表徵對表現LRP5及LRP6之細胞具有高親和力之純化VHH：

4.1 LRP5及LRP6結合效能及交叉反應性：基於FACS之DKK1競爭分析

在LRP5/LRP6交叉反應性單價VHH之表徵期間，觀測到結合FACS分析中所獲得之資料未必總是與Wnt1及Wnt3a報導分析中所觀測到之效能相關，其最可能歸因於VHH中之一些的快速解離速率。因此，需要確立此另外分析(亦即DKK1競爭FACS)，經證明，其對於選擇性及結合效能測定及LRP5與LRP6結合之間的對比為較可信賴的。目標在於選擇以相似效能結合至LRP5及LRP6之功能性VHH，以便在同一濃度下達成對兩種受體之阻斷。因此，在DKK-1競爭FACS中，經鑑別之Wnt1及Wnt3a功能性VHH之特徵如下：對於基於FACS之DKK1競爭分析而言，使用具有人類LRP5或人類LRP6之穩定過度表現的HEK293細胞。以1nM之恆定最終濃度將人類重組DKK1(rhDKK1-R&D Systems，Cat 5439-DK/CF)添加至細胞中。在4℃下在培養盤震盪器上用rhDKK1及LRP5及/或LRP6結合子稀釋液(純化VHH之1：5連續稀釋液)培育細胞1.5小時。用FACS緩衝液洗滌細胞3次之後，在4℃下在培養盤震盪器上用經生物素標記之山羊抗人類DKK1(R&D Systems，Cat BAF1096)對其培育30分鐘。用FACS緩衝液洗滌細胞3次之後，在4℃下在培養盤震盪器上於暗處用Streptavidin PE(BD Biosciences，Cat 554061)對其培育30分鐘至1小時。用FACS緩衝液洗滌細胞兩次，且使用FACS陣列(BD)量測螢光且報導MCF值。

LRP5/LRP6交叉反應性VHH預期與人類DKK1競爭結合至過度表現人類LRP5之HEK293，且競爭結合至過度表現人類LRP6之HEK293。對比而言，LRP5特異性VHH將與人類DKK1競爭結合至過度表現人類LRP5之HEK293細胞，但不會或會以極低效能(>200nM)競爭結合至過度表現人類 LRP6之HEK293細胞(且反過來，其將適用於LRP6特異性VHH)。作為此實驗之結果，可顯示，本發明LRP5/LRP6交叉反應性VHH會與人類DKK1競爭結合至過度表現人類LRP5之HEK293細胞以及過度表現人類LRP6之HEK293細胞(亦即，在所測試之最高濃度下，伴隨對應於60 MCF值之DKK1結合之完全抑制，結合子之濃度增加，MCF值降低)。

4.2 物種交叉反應性：小鼠及食蟹獼猴

為測定LRP5/LRP6交叉反應性VHH之選擇組是否能夠結合至小鼠源之LRP5及LRP6及食蟹獼猴源之LRP5及LRP6，DKK1競爭FACS進行如下：在1nM及0.3nM hDKK1(濃度分別低於小鼠及食蟹獼猴之EC50值)之存在下與穩定表現小鼠LRP5、食蟹獼猴LRP5、小鼠LRP6或食蟹獼猴LRP6之HEK293細胞一起培育VHH之連續稀釋液。如上所述，使用具有Streptavidin-PE的經生物素標記之抗DKK1抗體偵測DKK1與細胞之結合作為第二偵測。其結果是，可顯示該交叉反應性。

4.3 抗原決定基分組

對阻斷LRP5/LRP6交叉反應性VHH之最強效Wnt1信號傳遞進行分組實驗以鑑別不同抗原決定基組。詳言之，使用基於FACS之分析，分析個別VHH與其他經生物素標記之VHH(稱為參照VHH)競爭結合LRP5及LRP6受體之能力。在穩定表現人類LRP5或LRP6之HEK293上培育個別VHH以及200pM或500pM經生物素標記之參照VHH之連續稀釋液(濃度小於EC50值)。使用streptavidin-PE偵測經生物素標記之參照VHH與細胞之結合。與參照VHH競爭結合至LRP5及LRP6之VHH顯示使用FACS陣列所量測之螢光降低。

作為此等實驗之結果，Wnt1阻斷子可分類為三組。對於Wnt3a阻斷子而言，VHH之較低親和力不允許進行抗原決定基分組實驗。

4.4 Wnt1及Wnt3a報導分析

在功能性Wnt1及Wnt3a分析中測試LRP5/LRP6交叉反應性VHH抑制Wnt信號傳遞之能力。就此而言，亦未確立可使用之協定，但需要嘗試若干嘗試以確立生物化學功能性分析，諸如Wnt1/Wnt3a-LRP5/LRP6阻斷分析：除了重組LRP5及LRP6蛋白質所碰到之困難(參見實例1)以外，功能性重組Wnt1配位體(包括市售)亦不可用。Wnt蛋白質含有諸多保守半胱胺酸且經單不飽和脂肪酸(棕櫚油酸)修飾，附接至保守絲胺酸。此等轉譯後修飾需要高效信號傳遞及Wnt分泌。結構性分析顯示，含有棕櫚油酸脂質之域中之一者需要結合至Frizzled受體，其引起使得Wnt配位體與細胞表面上之LRP5及LRP6相互作用之構形變化。因此，結果表明該轉譯後修飾需要進行涉及此蛋白質之功能性研究，但同時，該基於脂質之轉譯後修飾使得此等蛋白質非常難以表現及純化(低可溶性)。因此，此變成生物化學分析之主要障礙。

因此，研發出一種基於細胞之功能性分析以表徵純化VHH：Wnt β-內醯胺酶報導基因分析。詳言之，對於Wnt1路徑抑制而言，用人類Wnt1轉染CellSensor LEF/TCF-bla FreeStyle 293F細胞(Invitrogen,Cat.K1677)，且選擇具有人類Wnt1之穩定過度表現的純系。為了測試Wnt3a路徑抑制，生成具有人類Wnt3a之穩定過度表現的CellSensor LEF/TCF-bla FreeStyle 293F細胞。在Wnt誘導性LEF/TCF啟動子之控制下，CellSensor® LEF/TCF-bla FreeStyle^TM 293細胞株含有β-內醯胺酶報導基因，其穩定地整合於FreeStyle^TM 293細胞(Invitrogen)中。此等細胞中的Wnt1或Wnt3a之表現因此產生組成性表現，且因此，產生β-內醯胺酶之酶活性。使用 LRP5/LRP6交叉反應性功能性VHH之處理因此預期引起對Wnt1及Wnt3a路徑之抑制，其引起對β-內醯胺酶酶活性之抑制。

對於該分析而言，將具有Wnt1或Wnt3a之過度表現的1E06/ml細胞接種至384孔組織培養物培養盤中且在37℃下培育隔夜。第二天，製備不同LRP5/LRP6交叉反應性VHH溶液之連續稀釋液且在LiCl存在下以10nM之最終濃度添加至細胞中。以200nM之最終濃度將DKK1作為陽性對照添加至細胞中。DKK1處理引起對Wnt1及Wnt3a路徑之完全抑制，且因此完全抑制β-內醯胺酶酶活性。在37℃下培育細胞隔夜。第二天，根據製造商之說明書(Invitrogen,Cat K1085)量測β-內醯胺酶酶活性。對於螢光發射而言，使用標準螢光盤讀取器及針對所指示之處理繪製的460/530nm發射率獲得460nm及530nm處之值。相對於陽性對照(DKK1；200nM最終濃度)計算功效。

選擇具有完全功效及比50nM更佳之效能的總共12個LRP5/LRP6交叉反應性Wnt1阻斷子。鑑別出14個大部分具有低效能之交叉反應性Wnt3a阻斷子。僅一個Wnt3a阻斷子顯示良好效能(小於5nM)。

4.5 Wnt1及Wnt3a磷酸化分析

隨後在Wnt1及Wnt3a依賴性LRP5及LRP6磷酸化分析中測試由Wnt1阻斷子之各組引起之最強效及有效性及最強效及有效Wnt3a阻斷子。將經編碼Wnt1或Wnt3a之表現載體共轉染的來自Invitrogen之Cellsensor LEF/TCF 293F細胞(cat K1677)用於磷酸化分析中。由於Wnt-Frizzled-LRP5或Wnt-Frizzled-LRP6複合體形成引起LRP5或LRP6磷酸化及後續下游信號傳遞，因而磷酸化之量化可用於量測該信號傳遞。為獲得LRP5及LRP6特定讀出結果，溶解細胞且用(針對兩種受體之胞內域之)LRP6或LRP5選擇性抗體進行免疫沈澱。在西方墨點法中，使用多株抗磷酸LRP6(Ser1490)抗體(細胞信號傳遞技術)偵測經磷酸化之LRP6或LRP5，該抗體偵測LRP6及LRP5磷酸化蛋白質。以10nM至100nM之最終濃度測試純化Wnt1及Wnt3a阻斷VHH之選擇組，其含有來自各組之至少一個代表性VHH。詳言之，在細胞溶解及LRP5及LRP6免疫沈澱前在阻斷VHH存在下培育細胞隔夜。相對於陽性對照(DKK1，最終濃度為1μM)，經由量化蛋白質印跡帶來計算阻斷LRP5及LRP6磷酸化中Wnt1及Wnt3a阻斷VHH之功效。

4.6 生物物理學表徵

如實例3中所報導，針對在大腸桿菌中及在甲醇酵母中之表現及純化進一步表徵LRP5/LRP6交叉反應性VHH。詳言之，若單價主組VHH之表現產量超過0.1mg/L，則其視為可接受的。所選LRP5/LRP6交叉反應性VHH在大腸桿菌中顯示介於0.1mg/L與8.2mg/L之間的表現量且在甲醇酵母中較高(>1mg/L)。藉由SDS-PPAGE分析評估表現。

在基於螢光之熱位移分析(TSA)中使用Lightcycler(Roche)測定單價LRP5/LRP6交叉反應性VHH之熱穩定性。在Sypro橙(Sypro Orange)存在下在不同pH值下培育VHH且施用溫度梯度。熱誘導之去摺疊後，Sypro橙所結合的蛋白質之疏水片暴露，引起螢光強度增加(Ex/Em=465/580nm)。螢光強度曲線之第一導數之反曲點充當熔融溫度(Tm)之量度。對於所有VHH而言，Tm隨pH增加而增加且在pH 6下穩定，其為針對VHH所發現之典型Tm型樣。針對LRP5/LRP6交叉反應性Wnt1阻斷子VHH及Wnt3a阻斷子VHH，在pH 7下獲得82℃之平均值。

藉由分析性尺寸排外層析法(SEC)研究可能出現的LRP5及LRP6 VHH之聚集及多聚化。為此目的，經由Dionex Ultimate 3000裝置在Agilent SEC-3管柱上注入呈0.5mg/mL之8μg純化VHH樣本。將L-精胺酸緩衝液(10mM磷酸鹽、300mM Arg-HCl，pH 6.0)用作移動相且施加1mL/min之流動速率。LRP5/LRP6 VHH中無一者在SEC分析期間顯示嚴重的聚集問題：曲線指示大部分樣本之超過95%之單體。

實例5：半衰期延長之雙抗體結合部位構築體之產生及表徵

LRP5/LRP6交叉反應性Wnt1及Wnt3a VHH用作構築嵌段以產生如圖1中所描繪之雙抗體結合部位構築體。與血清白蛋白結合VHH之基因融合用作半衰期延長方法。三個構築嵌段(Wnt1阻斷子、Wnt3a阻斷子及白蛋白結合子)經由彈性連接子連接。如實例3中所述，在甲醇酵母中產生VHH且加以純化。根據如例如WO2012/131078中所報導的標準程序，在甲醇酵母表現載體pAX159中選殖所得構築體，亦即雙抗體結合部位、半衰期延長之LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體，其呈C末端cMyc六組胺酸標記之VHH構築體形式。探索構築嵌段之不同定向及不同連接子，尤其GS連接子。基於反映LRP6中潛在Wnt1與Wnt3a結合位點之間的延長之表面積的模型化資料(亦即，並非非常接近於β-螺旋槳3之β-螺旋槳1及β-螺旋槳2)選擇相對較長GS連接子。藉由將人類血清白蛋白/HSA結合VHH置放於中間在組合Wnt1及Wnt3a報導分析中獲得關於效能之最佳結果。使用35個GS連接子，且以較佳次序排列Wnt1及Wnt3a VHH阻斷子。

為了選擇最佳VHH結合子及結合子組合，生成庫，其中人類血清白蛋白(HSA)結合VHH置放於LRP5/LRP6 Wnt1-Wnt3a阻斷子之間。詳言之，將在Wnt1或Wnt3a分析(報導分析及磷酸化分析)中具有高效能及功效之高親和力結合子之組用於庫中以產生如圖1中所描繪的經設計之半衰期延長之雙抗體結合部位構築體。在甲醇酵母中表現(如實例3中所報導)接著純化之後，隨後在Wnt1及Wnt3a報導分析(描述於實例4中)中在30μM HSA存在下以三個稀釋度(1/100、1/1000、1/7000)篩選半衰期延長之雙抗體結合部位構築體，以評定功效及相對效能。一般而言，在Wnt1及Wnt3a報導分析中之資料之間觀測到良好相關性且諸多格式量測到高功效。考慮報導分析中之功效及Wnt1及Wnt3a阻斷子之多樣性，選擇總共11個半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5及LRP6構築體以進行進一步表徵。此進一步表徵分析描述於下文中。

Wnt1/Wnt3a報導分析：

在30μM HSA最終濃度之存在下，如實例4.4中所述進行Wnt1及Wnt3a報導分析。以12個稀釋度，自2.5μM開始測試純化雙抗體結合部位LRP5/LRP6構築體。

如下表IV中所示，在報導分析中，大多數構築體顯示介於1.7nM與0.16nM之間的高效能及完全功效。其中所述的個別Wnt1及Wnt3a抑制VHH域之序列提供於下表V中：

(附註：此表V中所述之分子包括myc-六組胺酸標記(帶下劃線)，使得可較易於進行經重組表現之多肽的純化；此標記無需且通常不會干擾分子與其靶向物之結合)

實例6：VHH及VHH構築體之序列最佳化

序列最佳化為其中使親本序列突變以使其與人類IGHV3-IGHJ生殖系共同序列一致之方法。舉例而言，以應保留蛋白質結構、活性及穩定性之方式將構架區中之特異性胺基酸(除所謂標誌殘基之外)換為其人類對應物。

此等突變可分類如下：

1.標準：預期此等位置之序列最佳化不會顯著改變VHH之穩定性或活性或親和力，且其由此均同時改變，產生基本變異體。

2.特有：並不知曉此等位置之序列最佳化是否影響VHH之穩定性或活性或親和力，且因此於基本變異體之頂部上在獨立基礎上對其進行研究。

已知標誌殘基對於VHH之穩定性、活性及親和力至關重要且因此不進行突變。

此外，以使得PTM位點不活化同時蛋白質結構、活性及穩定性應保持完好之方式，改變實驗證明對轉譯後修飾(PTM)敏感的CDR中所存在之胺基酸。針對抗體所描述之最常見轉譯後修飾及VHH列於下表VI中。在加速應力研究中分析轉譯後修飾之VHH之敏感度，其應用若干標準條件，包括用以分析甲硫胺酸氧化反應之H₂O₂處理、高溫、高pH及研究天冬醯胺脫醯胺及天冬胺酸異構化之長時間儲存。根據標準程序量測氧化反應、脫醯胺及異構化之百分比且與參考樣本(在-20℃下儲存之VHH)進行比較。進行逆相層析(RPC)中之整個蛋白質分析及使用質譜(MS)之肽映射以鑑別潛在敏感之殘基。在應力測試之後在VHH中觀測到轉譯後修飾之情況下，相應胺基酸發生突變。

因此，將若干突變引入以上所述之構築體中，在三個構築體中產生上表III中所示之以上者，其經選擇以進行進一步活體外及活體內表徵，如下文實例中進一步闡述。

實例7：三個半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體之活體外表徵；與其他LRP6結合分子之對比

在VHH序列最佳化之後，重組表現且純化三個半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體，且藉由使用如下文所述之若干功能性及生物物理學分析對其進行表徵。

7.1 FACS結合分析

如圖3A及圖3B中所報導，藉由FACS分析在細胞上測定與人類LRP5及LRP6之結合。詳言之，在具有人類LRP5之穩定過度表現之HEK293細胞上測試與人類LRP5之結合。對於人類LRP6結合而言，使用具有人類LRP6之穩定過度表現的HEK293細胞。在4℃下在培養盤震盪器上用LRP5及LRP6結合子稀釋液(與圖3A及圖3B中所指示之最終濃度相對應的結合子之1：5連續稀釋液)培養細胞1.5小時。在用FACS緩衝液(1×PBS(Invitrogen目錄號141190-094)+10% FBS(Sigma目錄號F7524)+0.05%疊氮化鈉)洗滌細胞5次之後，在4℃下用結合至VHH之構架區的多株小鼠抗體培育該等細胞1小時。在用FACS緩衝液洗滌細胞3次之後，在4℃下用經標記之二次抗體(抗小鼠PE(115-116-071)培育細胞1小時，隨後進行用FACS緩衝液洗滌3次之步驟。使用FACS陣列(BD)量測螢光。在所測試之最高濃度下，與人類LRP5及LRP6之結合與600 MCF值相對應。陰性對照由非靶向結合子(結合至HEK293細胞中並未表現之細菌性蛋白質的VHH構築體)組成。如圖3A及圖3B中所示，分別在三個半衰期延長之雙抗體結合部位 LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體之最高測試濃度下，與人類LRP5及LRP6之結合分別與600 MCF值及1600 MCF值相對應。此等資料證實，經格式化的、雙抗體結合部位且經序列最佳化之結合分子在細胞分析系統中結合至呈其天然構形之人類LRP5及人類LRP6兩者。結合至hLRP5及hLRP6之EC50值報導於下表VII中。

7.2 FACS-DKK1競爭分析

使用如實例4.1中所述的基於FACS之DKK1競爭分析進一步分析三個LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體之效能及功效。用LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體之連續稀釋液(與圖4A及圖4B中所指示之最終濃度相對應的1：5連續稀釋液)培育具有人類LRP5或人類LRP6之穩定過度表現的HEK293細胞。如圖4A及圖4B中所示，LRP5/LRP6交叉反應性VHH分別與人類DKK1競爭結合至過度表現人類LRP5之HEK293細胞以及過度表現人類LRP6之HEK293細胞。在最高測試濃度(10nM)下達成DKK1結合之完全抑制且與60之MCF值相對應。對比而言，LRP5特異性VHH將與人類DKK1競爭結合至過度表現人類LRP5之HEK293細胞，但不會或會以極低效能(>200nM)結合至過度表現人類LRP6之HEK293細胞(且反過來，其將適用於LRP6特異性VHH)。作為此實驗之結果，可顯示，本發明LRP5/LRP6交叉反應性VHH會與人類DKK1競爭結合至過度表現人類LRP5之HEK293細胞以及過度表現人類LRP6之HEK293細胞(亦即，在所測試之最高濃度下，伴隨對應於60 MCF值之DKK1結合之完全抑制，結合子之濃度增加，MCF值降低)。針對三個LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體的與hLRP5及hLRP6之結合的DKK1競爭之IC50值報導於下表VIII中。此等資料證實三個LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體與人類LRP5及人類LRP6之結合且顯示兩種受體之間的極相似親和力(藉由DKK1競爭分析中之IC₅₀效能值界定)。此外，該資料強化了經格式化、雙抗體結合部位且經序列最佳化之結合分子結合至呈其天然構形之人類LRP5以及人類LRP6的觀點。

7.3 組合Wnt1及Wnt3a報導分析

使用組合Wnt1及Wnt3a報導分析來分析經格式化、雙抗體結合部位且經序列最佳化之結合分子的效能及功效以允許在同一分析中對Wnt1及Wnt3a阻斷子進行功能性測試。組合Wnt1及Wnt3a報導分析係基於伴隨協定中之以下變化的實例4.4中所述之分析。在500ng/ml之最終濃度下用重組人類Wnt3a(重組人類Wnt3a：R&D #5036-WN/CF)處理接種至384孔組織培養物培養盤中的具有Wnt1之過度表現的1E06/ml細胞，且隨後在37℃下培育細胞隔夜。第二天，製備不同LRP5/LRP6雙抗體結合部位交叉反應VHH溶液之連續稀釋液且在LiCl存在下以10nM之最終濃度添加至細胞中。以200nM之最終濃度將DKK1作為陽性對照添加至細胞中。DKK1處理引起對組合Wnt1及Wnt3a路徑之完全抑制，且因此完全抑制β-內醯胺酶酶活性。在37℃下培育細胞隔夜。第二天，根據製造商之說明書量測β-內醯胺酶酶活性。如實例4.4.中所報導，對於螢光發射而言，使用標準螢光盤讀取器及針對所指示之處理繪製的460/530nm發射率獲得460nm及530nm處之值。藉由用陽性對照(DKK1；200nM最終濃度)之處理測定，圖5A中報導為「基線」的螢光比[460/535nm]之值與Wnt1及Wnt3a路徑之完全抑制相對應。由Wnt1過度表現細胞(亦即，不經重組人類Wnt3a處理)測定，報導為「Wnt1」的螢光比[460/535nm]之值僅與Wnt1路徑之活化相對應。藉由用重組人類Wnt3a對Wnt1過度表現細胞進行的處理測定，報導為「Wnt1+Wnt3a」的螢光比[460/535nm]之值與Wnt1及Wnt3a路徑之組合活化相對應。如圖5A中所示，藉由用三個LRP5/LRP6交叉反應性、經格式化、雙抗體結合部位且經序列最佳化之結合分子處理，完全抑製得以達成(亦即，與基線相對應之螢光比[460/535nm])。此外，如下表IX中所示亦藉由IC50值報導高效能。

隨後，將LRP5/LRP6交叉反應性、經格式化、雙抗體結合部位且經序列最佳化之結合分子的效能及功效與先前揭示的WO2011/138391及WO2011/119661中所報導之LRP6結合分子進行比較：在WO2011/138391中，揭示了結合至LRP6且抑制螺旋槳1(例如，Wnt1)及螺旋槳3(例如，Wnt 3)之多價抗體。此等多價LRP6結合抗體為由作為第一受體結合域之IgG抗體及作為第二受體結合域之scFv片段組成的雙抗體結合部位LRP6結合分子，其中IgG抗體與scFv片段藉由連接子連接在一起。在WO2011/138391中，據報導，所有LRP6結合分子在Wnt1及 Wnt3a報導分析(WO2011/138391之圖18)中均具有大致相同之效能。因此，可選擇彼等多價LRP6結合分子中之任一者用於比較實驗。因此，決定使用「901」構築體(稱為MOR08168IgG1LALA 6475 scfv；亦展示於WO2011/138391之圖27中)作為第一比較化合物。

此「901」構築體之衍生物展示於WO2013/067355中。具體言之，揭示了命名為801T及802T之化合物(參見該說明書之第132頁上之揭示內容)，該等化合物具有兩個LRP6結合scFv域，加上一個半衰期延長部分。由於801T及802T呈現具有相同活體外效能及生物物理學特徵，因此下文中所述之實驗中僅包括其中之一者──變異體802T。

在WO2011/119661中，揭示了結合至LRP6且藉由多種Wnt同功異型物抑制信號傳遞之雙特異性抗體。此等雙特異性抗LRP6抗體結合至LRP6之兩個不同區域且抑制藉由Wnt同功異型物，尤其Wnt1及Wnt3a誘導之信號傳遞。杵臼結構工程改造(Atwell等人「Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library」.J Mol Biol.1997；270(1)：26-35)用於構建此等雙特異性抗LRP6抗體。WO2011/119661之實例11揭示一種具有YW211.31.62及YW210.09重鏈雜二聚體之IgG雜交體。因此，出於比較目的，使用杵臼結構工程改造技術，亦即用經工程改造之胺基酸變化在YW210.09之重鏈之CH3上形成杵，且在YW211.31.62之重鏈之CH3上形成臼或反之亦然而產生具有YW211.31.62及YW210.09重鏈雜二聚體之兩個雙特異性IgG雜交抗體，且該等抗體在本文中分別稱為Knob HC YW210.09及Knob HC YW211.31.62。在根據實例4.4之Wnt1及Wnt3a報導分析中表徵此等兩個構築體。如所預期，具有YW211.31.62及YW210.09重鏈雜二聚體之兩個雙特異性IgG雜交體在Wnt1及Wnt3a分析中顯示相似效能，如下表X中所報導。因此，針對下文進一步展示之比較實例，選擇Knob HC YW210.09作為第二比較化合物。

使用組合Wnt1及Wnt3a報導分析，將半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體之效能及功效與MOR08168IgG1LALA 6475 scfv雙抗體結合部位LRP6結合分子、Knob HC YW210.09雙特異性抗LRP6分子及802T雙特異性抗LRP6分子進行比較。如圖5B中所示，與LRP5/LRP6交叉反應性、經格式化、雙抗體結合部位且經序列最佳化之結合分子F013500571類似，藉由用Knob HC YW210.09(具有YW211.31.62及YW210.09重鏈雜二聚體之雙特異性IgG雜交抗體)處理會達成完全抑制(亦即，與圖5B中之基線相對應之螢光比[460/535nm])。然而，如下表XI中所報導，F013500571顯示較高效能。取而代之，MOR08168IgG1LALA 6475 scfv及802T雙抗體結合部位LRP6結合分子顯示缺乏對Wnt1及Wnt3a之完全抑制(亦即分別在圖5B及圖5C中，螢光比[460/535nm]顯著高於基線)。此等資料指示，當相較於F013500571時，MOR08168IgG1LALA 6475 scfv及802T雙抗體結合部位LRP6結合分子在Wnt1及Wnt3a路徑抑制中具有顯著較低功效。因此，選擇Knob HC YW210.09作為如下文進一步描述之活體內實驗(實例9；活體內功效)的比較化合物。

實例8：三個半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體對癌細胞株中之Wnt信號傳遞及存活率之作用

如先前所述，使用具有活性Wnt信號傳遞之癌細胞株進一步表徵半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體抑制活性Wnt信號傳遞之能力(Bafico等人「An autocrine mechanism for constitutive Wnt pathway activation in human cancer cells」.Cancer Cell 2004；6(5)：497-506；DeAlmeida等人「可溶性wnt受體Frizzled8CRD-hFc抑制活體內畸胎瘤之生長」.Cancer Res.2007；67(11)：5371-9)；Akiri等人「包括自分泌Wnt活化之Wnt路徑畸變以高頻率出現在人類非小細胞肺癌中」.Oncogene.2009；28(21)：2163-72)。簡言之，將具有活性Wnt信號傳遞之癌細胞株PA-1及PA-TU-8988S接種於12孔培養盤中且以1μM之最終濃度用LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體處理兩天。藉由抑制軸蛋白2，內源Wnt靶基因之mRNA表現來偵測抑制Wnt信號傳遞之能力。使用標準RNA技術進行qPCR表現分析：根據由QIAGEN提供之協定使用QIAGEN RNeasy Mini Kit進行RNA分離；使用SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen，目錄號11754050)進行cDNA合成；且使用具有軸蛋白2 TaqMan引子/探針(Hs00610344_m1 AXIN2 FAM，Life Technologies)及真核18s內源對照VIC-MGB(4319413E-1307061，Applied Biosystems)之TaqMan基因表現分析進行qPCR。

如圖6A中所示，當與未經處理(對照)細胞相比時，用三個半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體處理之PA-TU8988S及PA-1癌細胞顯示顯著降低之軸蛋白2相對mRNA水準(亦即標準化為內源對照)。此等資料顯示半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體抑制具有活性Wnt信號傳遞之癌細胞株中的Wnt信號傳遞之能力。此外，在PA-TU8988S及YAPC癌細胞株中研究Wnt信號傳遞阻斷對細胞存活率之影響，先前已報導該等癌細胞株之增殖視活性Wnt信號傳遞而定(Jiang等人「RNF43之失活突變賦予胰管腺癌中之Wnt依賴性」.Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(31)：12649-54)。在用半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體(最終濃度為1μM)或用比較化合物802T(最終濃度為1μM)處理十天後，藉由進行Alamar Blue分析(Invitrogen，目錄號DAL1100)量測細胞存活率。如圖6B中所示，當與未經處理(對照)細胞比較時，用三個半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體處理之PA-TU8988S癌細胞顯示顯著降低之活細胞百分比(降低75%)。用802T處理後，未偵測到對細胞存活率之影響(圖6B，右側圖)。此等資料證明半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體抑制視活性Wnt信號傳遞而定的癌細胞之細胞增殖的能力，且當與802T比較時，其亦顯示此等構築體之優良作用。

此外，如上所述，在PA-TU8988S(圖6C)及YAPC(圖6D)癌細胞株中，與802T相比較來評定F013500571之細胞存活率的劑量依賴性。在用F013500571處理後偵測細胞存活率之劑量依賴性降低。對比而言，在用比較化合物802T處理後，未在PA-TU8988S及YAPC癌細胞株中顯示對細胞存活率之影響。此等資料顯示，當與802T比較時，半衰期延長之雙抗體結合部位LRP5/LRP6交叉反應性VHH構築體具有優良作用。

實例9：活體內功效

在經Wnt驅動之腫瘤模型中活體內進一步表徵LRP5/LRP6交叉反應性雙抗體結合部位半衰期延長之VHH構築體/結合分子。進行實驗以測定此等結合分子是否抑制活體內腫瘤生長。亦使用同一經Wnt驅動之腫瘤模型來測定比較化合物Knob HC YW210.09之功效。使用小鼠乳腺腫瘤病毒LTR強化子(MMTV啟動子)的Wnt配位體之轉殖基因表現在小鼠中引起大面積的乳腺管增生，之後在6個月大之轉殖基因(TG)小鼠中引起乳腺癌。此等乳腺腫瘤藉由Wnt配位體之糖皮質激素誘導性過度表現驅動且具有與TNBC腫瘤類似之特徵，包括上皮及間葉細胞標記之表現(基底樣表型)及如藉由細胞內β-索烴素定位評定之活性Wnt信號傳遞。特定言之，衍生自MMTV-Wnt-1轉殖基因小鼠之乳腺腫瘤為Wnt1依賴性的。實際上，使用包含融合至人類Fc域(F8CRDhFc)的Frizzled8富含半胱胺酸之域(CRD)的可溶性Wnt受體阻斷Wnt活性(DeAlmeida等人「可溶性wnt受體Frizzled8CRD-hFc抑制活體內畸胎瘤之生長」.Cancer Res.2007；67(11)：5371-9)據報導會抑制活體內腫瘤生長。因此，在功效實驗開始之前，在裸小鼠中將自MMTV-Wnt1轉殖基因小鼠分離之腫瘤以腫瘤塊形式皮下繼代持續2代至5代。在植入後14天至21天之間，當腫瘤達至大約150mm³至250mm³之平均體積時，將小鼠隨機分入組(每組7隻小鼠)中且靜脈內投與化合物。每週兩次向小鼠靜脈內投與LRP5/LRP6交叉反應性雙抗體結合部位半衰期延長之VHH構築體，其中F013500571之劑量展示於圖7A中且F013500720之劑量展示於圖7B中。亦每週兩次靜脈內投與比較化合物Knob HC YW210.09，但歸因於上文所解釋之活體外實驗中經此化合物獲得之資料，要在較高劑量，亦即30mg/kg及45mg/kg(圖7C)下投與。在功效實驗期間監測腫瘤體積及體重，且中值腫瘤體積報導於圖7A至圖7C中。在功效實驗結束時測定腫瘤生長抑制(TGI)。特定言之，與對照組(在圖7A及圖7B中所展示之實驗中，用組胺酸緩衝液-20mM組胺酸pH6.5緩衝液處理小鼠；或針對圖7C中所示之實驗用檸檬酸鹽緩衝液處理小鼠)相比較測定各處理組之TGI。此外，在功效實驗結束時進行胃腸道(GI)組織病理學分析(經由對十二指腸至直腸之部分進行H&E染色)以評估LRP5及LRP6拮抗劑之潛在毒性。在表XIIA、表XIIB及表XIIC中，報導各處理組之腫瘤生長抑制(TGI)、活體內功效研究結束時之GI組織病理學分析的結果、對應於歸因於顯著體重減輕(相較於功效實驗之起始體重，體重減輕>18%)而需要處死之小鼠數目的死亡率及腫瘤消退數目(實驗結束時之腫瘤體積小於在處理開始時量測之腫瘤體積)，其分別與亦顯示於圖7A、圖7B及圖7C中之實驗及資料有關。

如根據圖7A至圖7C及上表XIIA至表XIIC可得出，使用LRP5/LRP6交叉反應性半衰期延長之雙抗體結合部位VHH構築體(在2×/週排程中，F013500571呈4mg/kg及10mg/kg且F013500720呈1mg/kg)之處理實際上引起腫瘤消退(亦即與腫瘤縮小相對應之腫瘤生長抑制(TGI)>100%；功效實驗結束時之腫瘤體積相較於實驗開始時之腫瘤體積降低)，而在GI組織病理學分析之後未報導顯著體重變化(<10%)且並無發現。重要的是，與此相反，在用LRP6特異性結合子Knob HC YW210.09處理後，即使在最大可投與之靜脈內劑量/排程下在小鼠中仍未可觀測到腫瘤消退，該最大可投與之靜脈內劑量/排程與90mg/kg及3×/週排程相對應。

為了進一步研究如以上所解釋之實驗中觀測到的活體內功效之差異，設定允許向小鼠進行甚至更高劑量之比較化合物之較頻繁投藥(3次/週)的另一實驗。簡言之，為了達成該較高暴露，如下表XIID中所指示，腹膜內投與比較化合物：

如根據表XIID中所示之資料可見，在此設定中，就TGI而言，亦未獲得顯著較強作用。換言之，此等實驗、資料及結果清楚地指示當與Knob HC YW210.09比較時半衰期延長之雙抗體結合部位VHH構築體之較高功效，及本發明之多肽不僅減慢腫瘤生長，亦甚至誘導腫瘤縮小的前所未有之能力。當然，腫瘤縮小(亦即腫瘤消退)為癌症患者之治療的所需治療性作用(亦即功效)。實際上，誘導引起病理性完全反應(pCR)之腫瘤消退的臨床研究治療在高度未被滿足醫療需求之適應症中(諸如在乳癌中)積極地導致無進展存活期及總存活期之顯著改良。

以上比較實例亦顯示LRP5/LRP6交叉反應性雙抗體結合部位半衰期延長之VHH構築體不僅就其結合特徵，諸如親和力或K_D值而言為優良的，且其在活體內環境中亦具有高度有利及優良特性。

隨後，研究化合物MOR08168IgG1LALA 6475 scfv是否可提供相似有利作用。出於此目的，在小鼠中如下進行活體內耐受性研究：以3mg/kg，每週兩次(2qw)(與WO2011/138391中之異種移植腫瘤模型中，如其中圖22中所述，偵測活體內功效之劑量/療程相同)靜脈內投與MOR08168IgG1LALA 6475 scfv化合物。在第1天使用MOR08168IgG1LALA 6475 scfv進行首次處理，且自第6天開始，在小鼠中偵測到顯著體重減輕。在第10天，用MOR08168IgG1LALA 6475 scfv化合物處理的小鼠中之一些顯示顯著體重減輕(>10%)。在第11天處死小鼠，且胃腸道(GI)組織病理學分析顯示在小鼠之結腸及盲腸中具有腐蝕作用之炎症。此等資料表明MOR08168IgG1LALA 6475 scfv在有效劑量/療程下並不具有耐受性。因此，LRP5/LRP6交叉反應性雙抗體結合部位半衰期延長之VHH構築體在治療窗方面為優良的；亦即其誘導腫瘤消退而在GI組織病理學分析之後未報導顯著體重變化(<10%)且並無發現。

實例10：活體內Wnt路徑抑制

為進一步表徵LRP5/LRP6交叉反應性雙抗體結合部位半衰期延長之VHH構築體/結合分子對Wnt信號傳遞之作用，在實例9中所述之功效實驗結束時分離腫瘤。詳言之，在最後一次注射化合物或對照治療之後16小時分離腫瘤。如實例8中所述分析，藉由降低腫瘤中軸蛋白2之mRNA表現測定Wnt信號傳遞抑制。針對F013500571之活體內功效，軸蛋白2 mRNA表現相對於對照組之倍數變化報導於圖8A中，針對F013500720之活體內功效，其報導於圖8B中。各處理組的軸蛋白2 mRNA降低之量化報導於下表XIIIA及表XIIIB中。

如根據圖8A及圖8B及表XIIIA及表XIIIB可見，相較於對照組，在用LRP5/LRP6交叉反應性結合分子處理之腫瘤中觀測到軸蛋白2 mRNA表現之顯著降低及劑量依賴性降低(尤其針對用F013500571之處理)。此等結果表明，LRP5/LRP6交叉反應性結合分子的確能夠藉由抑制腫瘤細胞中之Wnt信號傳遞來抑制腫瘤生長。

實例11：行業製造方法

11.1醱酵：可誘導型啟動子之控制下，使上表III及表V中所述的多肽中之任一者表現於不同大腸桿菌菌株，如W3110、TG1、BL21、BL21(DE3)、HMS174、HMS174(DE3)、MM294之細胞質中。此啟動子可選自lacUV5、tac、T7、trp、T5、araB。培養基較佳根據以下來限定Wilms等人，2001(Wilms,B.,Hauck,A.,Reuss,M.,Syldatk,C.,Mattes,R., Siemann,M.及Altenbuchner,J.：High-Cell-Density Fermentation for Production of L-N-Carbamoylase Using an Expression System Based on the Escherichia coli rhaBAD Promoter. Biotechnology and Bioengineering,73：95-103(2001))；DeLisa等人，1999(DeLisa,M.P.,Li,J.C.,Rao,G.,Weigand,W.A.及Bentley,W.E.：Monitoring GFP-operon fusion protein expression during high cell density cultivation of Escherichia coli using an on-line optical sensor. Biotechnology and Bioengineering,65：54-64.(1999))或同等者。然而，用如異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸及纈胺酸之胺基酸或複合培養基組分，諸如大豆蛋白腖或酵母提取物補充培養基可為有益的。以分批進料模式進行醱酵方法。條件：溫度30℃至40℃，pH6至7.5，溶解氧保持高於20%。初始C源耗盡之後，用以上所規定之進料培養基(或等效者)饋入培養物。當醱酵槽中之細胞乾重達至40g/L至90g/L時，用與所用啟動子系統相對應之合適誘導劑(例如IPTG、乳糖、阿拉伯糖)誘導培養物。誘導可以脈衝式完全誘導形式或部分誘導形式藉由歷時較長時間將相應誘導劑饋入至醱酵槽中來進行。製造階段應至少持續4小時。藉由碗式離心機、管碗式離心機或盤式堆疊離心機中之離心作用回收細胞，捨棄培養物清液層。

11.2 純化：將大腸桿菌細胞塊再懸浮於6倍至8倍量之溶解緩衝液(磷酸鹽或Tris緩衝液，pH7至8.5)中。細胞溶解較佳藉由高壓均質化，隨後在碗式、管碗式或盤式堆疊離心機中藉由離心移除細胞碎片來進行。視情況使用0.22μm至10μm濾紙過濾且經由陽離子交換層析(例如Toyopearl MegaCap^® II SP-550EC、Toyopearl GigaCap S-650M、SP瓊脂糖BB、SP 瓊脂糖FF或S HyperCel^TM)在pH7至8.5下分離含有靶蛋白之清液層。藉由線性增加之NaCl梯度在pH7至8.5下進行溶離。彙集含有靶蛋白之溶離份且隨後用5mM至10mM DTT培育，以防止藉由游離半胱胺酸殘基介導之二聚或聚集。進一步添加0.8M至1M硫酸銨或2M至3M NaCl之後，經由親水作用層析(例如苯基瓊脂糖HP、苯基瓊脂糖FF、丁基瓊脂糖HP、丁基瓊脂糖FF、丁基Toyopearl 650(S,M,C)、苯基Toyopearl 650(S,M,C))在pH7至8.5下分離溶液。在5mM DTT存在下在pH7至8.5下藉由線性降低硫酸銨或NaCl梯度進行溶離。將純度水準為最小90%的含有靶蛋白之溶離份彙集且在5mM DTT存在下藉由透濾作用脫鹽，隨後濃縮至大約5mg/ml。藉由在pH 8.5下用50mM Tris、150mM NaCl、4mM烏洛托品(Cystamin)、10mM CHAPS以1：5至1：20將蛋白質溶液稀釋至0.25mg/ml至1mg/ml之最終蛋白質濃度來進行後續再摺疊。在室溫下在攪拌下培育再摺疊溶液12小時至36小時，且隨後在pH7至8.5下藉由陽離子交換層析(例如SP瓊脂糖FF、SP瓊脂糖HP、Toyopearl SP-650(S,M,C))分離。藉由在pH7至8.5下線性增加NaCl梯度進行溶離。彙集含有單體靶蛋白之溶離份且經由透濾作用調配於25mM磷酸鈉、220mM不含內毒素之海藻糖(pH 7.5)中。藉由過濾對溶液進行滅菌且儲存在2℃至8℃下。

實例12：用於皮下投藥之醫藥調配物

可選擇以上本發明之雙抗體結合部位多肽構築體中之任一者用於製造針對皮下應用之醫藥調配物，其具有如下組成：原料藥：100mg/ml(1至3nmol/ml)

乙酸鹽緩衝液：25mM

海藻糖：220mM

Tween-20：0.02%

將原料藥調配於具有以上組成之溶液中，進行滅菌且儲存在2℃至8℃下。

實例13：人類中之醫藥用途

每兩週至每四週藉由靜脈內輸注(劑量為100mg至200mg)將如以上實例11.2中所製備之溶液施用於有需要之患者，諸如罹患對Wnt信號傳遞抑制劑敏感之癌症的人類。

實例14：活體外分析中Wnt3a信號傳遞抑制對藉由樹突狀細胞釋放之促炎性細胞介素的作用

由知情同意之健康供體獲得PBMC。人類單核球衍生樹突狀細胞(Mo-DC)如下產生：在補充有50ng/mL GM-CSF及50ng/mL IL-4之X-VIVO培養基中培養PBMC。培養24小時之後，小心地移除清液層且用補充有相同GM-CSF及IL-4之X-VIVO培養基替代。在第四天，小心地移除清液層且僅在LPS存在下或與人類Wnt3a或人類Wnt3a及LRP5/LRP6交叉反應性結合分子組合之X-VIVO培養基替代。在第二天，收集清液層且根據製造商之說明書經由ELISA進行TNF-α之分析。如先前報導(Oderup等人「Canonical and noncanonical Wnt proteins program dendritic cell responses for tolerance」.J Immunol.2013；190(12)：6126-34)，且如圖9A中所示，Wnt3a直接抑制分化樹突狀細胞(DC)之促炎性細胞介素分泌(亦即TNF-α釋放)。藉由添加LRP5/LRP6交叉反應性結合分子恢復經Wnt3a驅動的對來自DC之TNF-α釋放的遏制。

此等資料顯示經格式化、雙抗體結合部位且經序列最佳化之結合分子能夠恢復經Wnt3a處理之樹突狀細胞的TNFα分泌，由此抑制對樹突狀細胞之Wnt抑制作用。

重要的是要注意，在腫瘤微環境中阻斷樹突狀細胞中之Wnt路徑可代表針對破壞腫瘤介導之免疫抑制且加強抗腫瘤免疫性之潛在治療性方法。

為了研究DC對T細胞(效應子T細胞)之作用，在存在或不存在LRP5/LRP6交叉反應性結合分子之情況下共培養經Wnt3a預處理之DC與T細胞，自PBMC分離，如先前所述(Oderup等人「Canonical and noncanonical Wnt proteins program dendritic cell responses for tolerance」.J Immunol.2013；190(12)：6126-34)。DC/T細胞共培養3天之後，收集清液層且根據製造商之說明書經由ELISA進行IFN γ之分析。

IFNγ分泌為T細胞活化之標記。如圖9B中所示，Wnt3a介導之DC抑制引起T細胞之IFNγ分泌減少(抑制T細胞功能)，藉由用LRP5/LRP6交叉反應性結合分子處理，該分泌得到完全恢復。

總體而言，此等資料顯示LRP5/LRP6交叉反應性結合分子遏制對樹突狀細胞之Wnt抑制作用，使得T細胞功能得到恢復。

已知T細胞之連續活化/刺激會誘導最後分化，產生耗竭之T細胞表型，使得T細胞功能進行性喪失。因此，設想到LRP5/LRP6交叉反應性結合分子對藉由DC之活化介導之T細胞的作用可能會藉由T細胞耗竭受到限制。因此，將LRP5/LRP6交叉反應性結合分子之投藥與阻斷T細胞耗竭之免疫檢查點抑制劑的投藥組合的組合治療預期有助於活化且維持T細胞功能，由此改變腫瘤微環境，且由此證實本發明之分子的治療性作用。

<110> 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司

<120> 在腫瘤細胞中拮抗WNT信號傳遞之雙抗體結合部位(BIPARATOPIC)多肽

<130> P12-0401-FF

<160> 47

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Wnt1-333E06mod之CDR1

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Wnt1-333E06mod之CDR2

<400> 2

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Wnt1-333E06mod之CDR3

<400> 3

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Wnt1-333G06之CDR1

<400> 4

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Wnt1-333G06之CDR2

<400> 5

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Wnt1-333G06之CDR3

<400> 6

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Wnt1-332D03mod之CDR1

<400> 7

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Wnt1-332D03mod之CDR2

<400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Wnt1-332D03mod之CDR3

<400> 9

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Wnt3a-093A01之CDR1

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Wnt3a-093A01之CDR2

<400> 11

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Wnt3a-093A01之CDR3

<400> 12

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Wnt3a-367B10之CDR1

<400> 13

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Wnt3a-367B10之CDR2

<400> 14

<210> 15

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Wnt3a-367B10之CDR3

<400> 15

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Alb11之CDR1

<400> 16

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Alb11之CDR2

<400> 17

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Alb11之CDR3

<400> 18

<210> 19

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH域Wnt1-333E06mod

<400> 19

<210> 20

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH域Wnt1-333G06

<400> 20

<210> 21

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH域Wnt1-332D03mod

<400> 21

<210> 22

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH域Wnt3a-093A01

<400> 22

<210> 23

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH域Wnt3a-367B10

<400> 23

<210> 24

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH域Alb11

<400> 24

<210> 25

<211> 435

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH構築體F013500575

<400> 25

<210> 26

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH構築體F013500571

<400> 26

<210> 27

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH構築體F013500720

<400> 27

<210> 28

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH域F0129093A01

<400> 28

<210> 29

<211> 151

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH域F0130333G06

<400> 29

<210> 30

<211> 148

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH域F0129093A03

<400> 30

<210> 31

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH域F0130333E06

<400> 31

<210> 32

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH域F0130332D03

<400> 32

<210> 33

<211> 148

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH域F0130367B10

<400> 33

<210> 34

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH域F0130378B05

<400> 34

<210> 35

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH域F0130378A04

<400> 35

<210> 36

<211> 150

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH域F0130372C08

<400> 36

<210> 37

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH構築體F013500016

<400> 37

<210> 38

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH構築體F013500018

<400> 38

<210> 39

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH構築體F013500021

<400> 39

<210> 40

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH構築體F013500026

<400> 40

<210> 41

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH構築體F013500030

<400> 41

<210> 42

<211> 460

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH構築體F013500032

<400> 42

<210> 43

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH構築體F013500033

<400> 43

<210> 44

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH構築體F013500039

<400> 44

<210> 45

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH構築體F013500046

<400> 45

<210> 46

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH構築體F013500047

<400> 46

<210> 47

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VHH構築體F013500053

<400> 47

Claims

一種多肽，其特異性結合至LRP5或LRP6，其包含第一免疫球蛋白單一可變域，其選自由包含以下CDR序列而界定之免疫球蛋白單一可變域(i)至(iii)之群：(i)：CDR1：TYTVG(=SEQ ID NO：1) CDR2：AIRRRGSSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：2) CDR3：DTRTVALLQYRYDY(=SEQ ID NO：3) (ii)：CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：4) CDR2：AIRRSGRRTYYADSVKG(=SEQ ID NO：5) CDR3：ARRVRSSTRYNTGTWWWEY(=SEQ ID NO：6) (iii)：CDR1：RYTMG(=SEQ ID NO：7) CDR2：AIVRSGGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：8) CDR3：DRRGRGENYILLYSSGRYEY(=SEQ ID NO：9)及第二免疫球蛋白單一可變域，其選自由包含以下CDR序列而界定之免疫球蛋白單一可變域(iv)及(v)之群：(iv)：CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：10) CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：11) CDR3：SPIPYGSLLRRRNNYDY(=SEQ ID NO：12) (v)：CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：13) CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：14) CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(=SEQ ID NO：15)。
如請求項1之多肽，其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含以下CDR序列：CDR1：TYTVG(=SEQ ID NO：1) CDR2：AIRRRGSSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：2) CDR3：DTRTVALLQYRYDY(=SEQ ID NO：3)且其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含以下CDR序列：CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：10) CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：11) CDR3：SPIPYGSLLRRRNNYDY(=SEQ ID NO：12)。
如請求項1之多肽，其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含以下CDR序列：CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：4) CDR2：AIRRSGRRTYYADSVKG(=SEQ ID NO：5) CDR3：ARRVRSSTRYNTGTWWWEY(=SEQ ID NO：6)且其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含以下CDR序列：CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：13) CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：14) CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(=SEQ ID NO：15)。
如請求項1之多肽，其中該第一免疫球蛋白單一可變域包含以下CDR序列：CDR1：RYTMG(=SEQ ID NO：7) CDR2：AIVRSGGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：8) CDR3：DRRGRGENYILLYSSGRYEY(=SEQ ID NO：9) 且其中該第二免疫球蛋白單一可變域包含以下CDR序列：CDR1：SYAMG(=SEQ ID NO：13) CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(=SEQ ID NO：14) CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(=SEQ ID NO：15)。
如請求項1至4中任一項之多肽，其中該等免疫球蛋白單一可變域為VHH域，且較佳為人類化VHH域。
如請求項1之多肽，其中該第一免疫球蛋白單一可變域選自具有以下序列之免疫球蛋白單一可變域(i)至(iii)之群：(i)： (=SEQ ID NO：19),(ii)： (=SEQ ID NO：20),(iii)： (=SEQ ID NO：21), 且其中該第二免疫球蛋白單一可變域選自由具有以下序列之免疫球蛋白單一可變域(iv)及(v)組成之群：(iv)： (=SEQ ID NO：22),(v)： (=SEQ ID NO：23)。
如請求項1或2之多肽，其中該第一免疫球蛋白單一可變域具有如SEQ ID NO：19中所示之胺基酸序列，且該第二免疫球蛋白單一可變域具有如SEQ ID NO：22中所示之胺基酸序列。
如請求項1或3之多肽，其中該第一免疫球蛋白單一可變域具有如SEQ ID NO：20中所示之胺基酸序列，及該第二免疫球蛋白單一可變域具有如SEQ ID NO：23中所示之胺基酸序列。
如請求項1或4之多肽，其中該第一免疫球蛋白單一可變域具有如SEQ ID NO：21中所示之胺基酸序列，及該第二免疫球蛋白單一可變域具有如SEQ ID NO：23中所示之胺基酸序列。
如請求項1至4及6中任一項之多肽，其中該第一免疫球蛋白單一可變域及該第二免疫球蛋白單一可變域藉由連接子肽共價連接，其中該連接子肽視情況包含或由第三免疫球蛋白單一可變域組成。
如請求項1至4及6中任一項之多肽，其中該多肽另外包括半衰期延長部分，其中該半衰期延長部分共價連接至該多肽且視情況選自由以下組成之群：白蛋白結合部分，諸如白蛋白結合肽或白蛋白結合免疫球蛋白域；運鐵蛋白結合部分，諸如抗運鐵蛋白免疫球蛋白域；聚乙二醇分子；人類血清白蛋白及人類血清白蛋白之片段。
如請求項11之多肽，其中該半衰期延長部分為白蛋白結合免疫球蛋白單一可變域，且較佳為Alb11域，其由SEQ ID NO：24界定。
一種多肽，其選自包含或由SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27組成之多肽之群。
如請求項1至4、6及13中任一項之多肽，其用作治療、預防或緩解人類或動物之疾病、病症或病狀的方法中之藥劑。
如請求項1至4、6及13中任一項之多肽，其用於異常Wnt信號傳遞引起的癌症，較佳乳癌、肺癌、胰臟癌、結腸直腸癌、肉瘤、卵巢癌或肝細胞癌之治療，或特發性肺病之治療，或視網膜病變之治療。
如請求項1至4、6及13中任一項之多肽，其用於三陰性乳癌(TNBC)之治療。
如請求項1至4、6及13中任一項之多肽，其用於與化學治療劑、抑制血管生成之治療活性化合物、信號轉導路徑抑制劑、EGFR抑制劑、免疫調節劑、免疫檢查點抑制劑或激素治療劑組合。
一種多肽，其包含第一免疫球蛋白結合蛋白，其能夠特異性結合至LRP5以及LRP6(LRP5/LRP6交叉反應性)且抑制經Wnt1驅動之靶基因轉錄，及第二免疫球蛋白結合蛋白，其能夠特異性結合至LRP5以及LRP6(LRP5/LRP6交叉反應性)且抑制經Wnt3a驅動之靶基因轉錄。
如請求項18之多肽，其中該第一免疫球蛋白結合蛋白及該第二免疫球蛋白結合蛋白為免疫球蛋白單一可變域。
一種如請求項1至4、6、13、18及19中任一項之多肽，其用於治療癌症。
一種如請求項1至4、6、13、18及19中任一項之多肽，其用於與選自由以下組成之群的免疫檢查點抑制劑組合：抗PD1抗體、抗PDL1抗體、抗CTLA4抗體、抗BTLA抗體、抗LAG3抗體及抗TIM3抗體，或與癌症疫苗組合來治療癌症。
一種核酸分子，其較佳呈分離形式，其編碼如請求項1至13、18及19中任一項之多肽。
一種表現載體，其包含如請求項22之核酸。
一種宿主細胞，其攜帶如請求項23之表現載體。
一種製造如請求項1至13、18及19中任一項之多肽之方法，該方法包含以下步驟如請求項24宿主細胞在允許表現如請求項1至13、18及19中任一項之多肽之條件下培養；及回收該多肽。
如請求項25之方法，該方法另外包含以下步驟純化該多肽。
一種醫藥組合物，其包含(i)如請求項1至13、18及19中任一項之多肽作為活性成分，及(ii)醫藥學上可接受之載劑，及視情況(iii)稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或穩定劑。
一種治療劑在製造用於與如請求項1至13、18及19中任一項之多肽組合之藥劑之用途，該治療劑選自由以下組成之群：化學治療劑、抑制血管生成之治療活性化合物、信號轉導路徑抑制劑、EGFR抑制劑、免疫調節劑、免疫檢查點抑制劑及激素治療劑。
一種如請求項1至13、18及19中任一項之多肽或如請求項27之醫藥組合物的用途，其用於製造用於治療癌症或特發性肺病或視網膜病變之藥劑。
一種如請求項1至13、18及19中任一項之多肽的用途，其用於製造用於藉由抑制樹突狀細胞中經Wnt1驅動及經Wnt3a驅動之靶基因轉錄而調節腫瘤微環境之藥劑。