CN100428934C

CN100428934C - 香豆素类化合物在制备诱导神经干细胞定向分化药物中的应用

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Publication number: CN100428934C
Application number: CNB2006100309171A
Authority: CN
Inventors: 何成; 张卫东; 徐晓辉; 张薇; 苏娟; 张川
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2006-09-07
Filing date: 2006-09-07
Publication date: 2008-10-29
Anticipated expiration: 2026-09-07
Also published as: CN1923195A; WO2008040153A1; US20090170930A1

Abstract

本发明属医药技术领域，具体为一种香豆素类化合物在制备诱导神经干细胞定向分化药物中的应用。该香豆素类化合物比较典型的有如下几种：秦皮乙素、7-羟基香豆素、双白瑞香素、结香素、七叶内酯苷、东莨菪内酯。试验表明，该香豆素类化合物具有明显的诱导神经干细胞定向分化的作用。因此，可以用于制备诱导神经干细胞定向分化的药物。所制备的药物可双是以该香豆素类化合物为活性成分，且含有药学上可以接受的载体的组合物，活性成分的重量含量为0.1-99.5%。药物剂型可以是片剂、粉剂、粒剂和注射剂等。

Description

香豆素类化合物在制备诱导神经干细胞定向分化药物中的应用

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种香豆素类化合物在制备诱导神经干细胞定向分化药物中的应用。

背景技术

神经干细胞作为主要干细胞的一种，是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞的能力，能自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞。近年来的研究发现证明，成年哺乳动物中枢神经神经系统中广泛存在神经干细胞，在成年哺乳动物的脑内能终生产生神经元而且增殖活跃的2个区域是前脑室下带和海马齿状回的亚颗粒。

由于神经干细胞具有终生自我更新能力，可以保持数量上的恒定，体外培养时不需要饲养细胞层，仅仅依靠悬浮培养即可大量扩增，而且纯度极高；并且扩增的神经于细胞在接触培养时即迅速分化为三种成熟的神经组织细胞即神经元，星形胶质细胞和寡突胶质细胞。在体移植的神经干细胞具有迁移、分化的能力，多分化潜能能诱导分化为神经系统的各种细胞，种属特异性低，基本无致瘤性危险。这些特点就为不同疾病移植治疗提供了可能。

神经干细胞在移植部位分裂增殖，并在局部微环境的作用下分化成相应的细胞来补充替代受损的细胞，恢复中枢神经系统的正常结构和功能，移植后产生的细胞也可以自主释放神经递质(如多巴胺、乙酰胆碱或C2氨基丁酸)，产生神经营养因子或神经保护因子，从而抑制神经变性或者促进神经再生。通过调控神经干细胞向特定神经元分化，替代治疗因神经退变引起神经系统疾患。

但是由于移植部位环境的影响，在成年动物中枢神经系统非神经元生发区(包括脊髓)移植时种经干细胞绝大部分分化为形成不利的胶质疤痕的星形胶质细胞，而不分化为有成髓鞘功能的寡突胶质细胞和有传递信息功能的神经元。

在神经系统疾病中，脱髓鞘疾病和脊髓损伤等在当今仍然是不治之症，患了此种疾病的病人唯一的归宿就是等死，一般在1-10年内视病程进展快慢不同陆续死亡。一般的治疗方法不能阻止病程的进展。这种病症最主要的病理现象就是中枢神经系统中包裹轴突的的成熟的成髓鞘细胞大量死亡，造成中枢神经传导障碍，自身又无法产生新的寡突胶质细胞前体使脱髓鞘的轴突重新成髓鞘。

现代细胞移植疗法对脱髓鞘疾病和脊髓损伤的治疗打开了一条新的通路，但是因为无法获得大量的、廉价的、纯化的寡突胶质细胞前体细胞，因此细胞移植疗法一直停留在实验阶段而无法用于临床。

因此对神经干细胞的定向分化调控的研究就成为今天研究的热点，迫切需要寻找到一些物质，它们能使神经干细胞高比例的定向分化为具有成髓鞘功能的寡突胶质细胞。

发明内容

本发明的目的在于提出一种香豆素类化合物在制备诱导神经干细胞定向分化药物中的应用。

本发明进一步还提供一组以该香豆素类化合物为活性成分的，用于治疗脱髓鞘疾病和脊髓损伤的药物组合物。

本发明提出的用于制备诱导神经干细胞定向分化药物的香豆素类化合物，具有下述两种结构通式：

式中R₁为氢、羟基、烷氧基、苯基、异戊烯基或1～5个单元的糖苷键。

这两类香豆素类化合物分布在植物界的许多种植物中，可以从植物中提取分离制备而得，也可以用化学合成方式获得。

所述的香豆素类化合物，比较典型的有：秦皮乙素、7-羟基香豆素、双白瑞香素、结香素、七叶内酯苷、东莨菪内酯。

中药是我国的国粹，在治病强身方面有着神奇的疗效已被世界所承认。有些中药在治疗神经系统疾病方面有着很好的优势，我国利用传统中药研究神经干细胞的研究为神经干细胞分化的研究开辟了一条新的道路。最近研究发现：鹿茸多肽在体外可明显促进神经干细胞向神经元分化，银杏内酯B亦具有促进神经干细胞分化为神经元的作用。

但是单靠中药治则去发现可以决定性地影响神经干细胞定向分化的中药单体的可能性是微乎其微，只有依靠新药筛选的模式大规模，高通量的检测才有可能发现有效的中药单体。做到这一点需要两方面条件的支撑：一是要建立快速、微量、细胞水平的体外筛选模型和测试方法。二是要有大量可供筛选的样品资源，包括新合成的化合物和天然化合物。神经干细胞具有自我更新、多分化和高增值潜能，这些属性决定了它是最适于高通量筛选的模型。

我们通过多年的基础研究积累了2000多种化合物，并建立了天然产物库，通过对库中化合物进行高通量筛选，结果发现了上述香豆素类化合物具有诱导神经干细胞定向分化的作用。又通过确证性实验证明，该香豆素类化合物具有诱导神经干细胞定向向寡突胶质细胞分化的作用。

本发明提出的药物组合物含有治疗有效量的香豆素类化合物为活件成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。其中，活性成分的重量含量为0.1-99.5％。

本发明的化合物和药物组合物可用于制备诱导神经干细胞定向分化为寡突胶质细胞的体细胞的药物，用以治疗脱髓鞘疾病和脊髓损伤修复。

上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释刑、赋形剂如水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等或制成液体制剂如水或油悬浮剂，或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂、鼻喷雾剂和注射剂。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

附图说明

图1为(a)7-羟基香豆素、(b)双白瑞香素和(c)DMSO诱导神经干细胞定向分化的细胞形态图。

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：制备7-羟基香豆素和双白瑞香素

11Kg黄瑞香(Daphne giraldii Nitsche.)药材的根皮和茎皮，粉碎后以95％乙醇回流提取3次，合并提取液，减压回收乙醇至体积为10L，过滤，滤液依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，收集各萃取部分并浓缩成浸膏，其中乙酸乙酯萃取部分浸膏200g，以甲醇溶解过滤后进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇进行梯度洗脱，用薄层层析检查洗脱流分，具有相同单一斑点的流分合并，浓缩，得流分1、2、3、4、5、6、7、8、9，其中流分2经进一步硅胶层析分离纯化，得到白色粉末，结构鉴定为7-羟基香豆素；其中流分5经进一步硅胶层析和葡聚糖凝胶层析分离纯化，得到淡黄色粉末，结构鉴定为双白瑞香素。

7-羟基香豆素的结构式如下：

双白瑞香素的结构式如下：

实施例2：制备东莨菪内酯

5Kg毛瑞香(Daphne odora Thunb.var atrocaulis Rehd.)药材的根皮，粉碎后以75％乙醇渗漉提取，得到提取液50L，浓缩后依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液浓缩成浸膏。利用硅胶柱色谱、聚酰胺色谱、Sephadex LH-20和制备HPLC等手段对各萃取部位进行系统的化学成分分离和鉴定。氯仿部位分离得到12个化合物，经结构鉴定，其中1个浅黄色粉末为东莨菪内酯。

东莨菪内酯的结构式如下：

实施例3：制备结香素

5Kg结香药材的根茎粉碎后以80％乙醇浸泡24hr，收集浸泡液，浓缩至无醇味，加适量水稀释成流浸膏，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，收集各萃取部位，浓缩成浸膏。对各部位的浸膏进行系统的化学成分分析，结果氯仿部位分离得到12个化合物，经过结构鉴定，其中1个淡黄色粉末为结香素。

结香素的结构如下：

实施例4：制备秦皮乙素和七叶内酯苷

取辽宁产苦枥白蜡树的茎干皮15kg，切碎磨成粉，用乙醇40L连续加热提取10～12h，提取液减压浓缩，残渣用水约4L温热溶解，用等体积氯仿洗涤2次。水层蒸去其中的氯仿，再用乙酸乙酯提取2次。乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏，浸膏以甲醇溶解后上硅胶柱进行层析，以氯仿-甲醇梯度洗脱，用薄层层析检查洗脱流分，具有相同单斑点的流分合并，浓缩，得到5个化合物，经结构鉴定其中一个为秦皮乙素，另一个为七叶内酯苷。

秦皮乙素的结构式如下：

七叶内酯苷的结构式如下：

实施例5：制备香豆素类化合物的制剂

片剂：活性成分 20mg

乳糖 177mg

玉米淀粉 50mg

硬脂酸镁 3mg

制备方法：将活性成分、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，活性成分含量为20mg。

实施例6：香豆素类化合物诱导神经干细胞定向分化实验

1、实验方法

1.1材料新生1～3d的SD大鼠，第二军医大学实验动物中心提供。细胞培养试剂：DMEM：F12、2％B27(Gibco，美国)；碱性成纤维细胞生长因子(basic fib rob last grow thfacto r，bFGF)和表皮生长因子(epiderm al growth factor，EGF)，(Sigma，美国)；胎牛血清(杭州四季青公司)。抗体：抗巢蛋白(nestin)单抗(Chemicon，美国)，抗胶质纤维酸性蛋白(glial fib rillary acidic p ro tein，GFA P)多抗(武汉博士德生物工程公司)、寡突胶质细胞前体细胞标志蛋白(NG2，Chemicon，美国)、FITC，罗丹明标记的驴抗小鼠和兔二抗。

1.2脑组织单细胞悬液的制备：取新生1-3d SD大鼠，取头，除去头皮及头骨，剥离硬脑膜，分离出大脑半球，取皮层将其移至另一个含有解剖液的无菌青霉素瓶中，剪成尽量小的小块，加入胰蛋白酶边消化边用经火焰抛光的滴管吹打混匀。然后过200目尼龙筛网，离心，弃上清，台盼蓝染色后作活细胞计数，5*10⁵个细胞1瓶，每瓶25ml神经干细胞培养液悬浮(DMEM：F12、2％B27，20ng bFGF，20ng EGF)培养。

1.3神经干细胞的传代培养：胚胎大鼠神经干细胞在培养5-6天后可形成神经球克隆。神经球克隆呈悬浮状，用经火焰抛光的窄口吸管吹打克隆球形成单细胞悬液，将部分细胞接种到新的培养瓶中，5*10⁵个细胞1瓶。以后每6天传代1次，每3天换液1次，培养条件不变。

1.4神经干细胞的诱导分化：收集培养的神经干细胞集落，加入少量培养液后吹打，使细胞尽量分散，计数细胞，40～50个细胞集落/35mm培养皿(预先涂多聚赖氨酸)分散培养，培养条件为：DMEMPF12(1∶1)，0.5％胎牛血清，1×B27，1×非必需氨基酸。置37℃5％CO₂，10天换液2次。

1.5化合物的添加：神经干细胞的诱导分化培养基中加入各种筛选化合物终浓度为10uM，收集培养的神经干细胞集落，40～50个细胞集落/35mm培养皿(预先涂多聚赖氨酸)，加入培养基，五天后光镜下观察，换液一次，十天后固定后免疫组化定性，GFAP阳性与NG2阳性细胞计数，结果统计分析。

2.实验结果

2.1细胞形态：神经干细胞在包被有多聚赖氨酸的24孔培养板上经3天无血清培养基的培养即可自动分化为3种细胞：胞体圆，折光性强，突起长的神经元；胞体扁平，折光性极差，突起较短的星形胶质细胞；胞体较圆，折光性强，突起短的寡突胶质细胞前体。DMSO对照品分化出来的细胞大多成胞体扁平，折光性极差，突起较短的星形胶质细胞；6个香豆素处理组多处现胞体较圆，折光性强，突起短的寡突胶质细胞前体。

2.2免疫表达结果：DMSO对照组分化出来的细胞星型胶质细胞标志蛋白GFAP免疫阳性的细胞占70％左右，寡突胶质细胞前体细胞标志蛋白(NG2)免疫阳性的细胞约20％。6个香豆素处理组分化出来的细胞NG2免疫阳性的细胞占70％左右，星型胶质细胞标志蛋白GFAP免疫阳性的细胞低于10％。

实验结果表明，一些香豆素类成分能诱导神经细胞定向分化为寡突胶质细胞前体细胞，对脱髓鞘疾病和脊髓损伤的修复具有较好的效果。

Claims

1、一种香豆素类化合物在制备诱导神经干细胞定向分化药物中的应用，该香豆素类化合物具有以下结构通式之一种：

式中R₁为氢、羟基、烷氧基、苯基、异戊烯基或1～5个单元的糖苷键；

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的香豆素类化合物从植物中提取或化学合成得到。

3、根据权利要求1所述的应用，其特征在于所说的药物为治疗脱髓鞘疾病或脊髓损伤的药物。

4、根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物由作为活性成分的香豆素类化合物和药学上可以接受的载体组成。

5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述药物中活性成份的重量含量为0.1-99.5％。