CN107417689A - 一种从鸭嘴花中提取高纯度鸭嘴花碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的就是要提供一种方法能够从鸭嘴花中提取高纯度鸭嘴花碱的方法,经微生物发酵后,再用乙醇溶液提取、过滤、脱脂、减压浓缩、亲和层析、离子交换层析、结晶等方法制得高纯度鸭嘴花碱。本发明的产品具有显著的子宫兴奋作用、减弱心肌收缩力、减少冠脉流量、轻度降低血压,对支气管也有强的扩张作用。
Description
技术领域
本发明属于天然产物加工领域,涉及一种从鸭嘴花中提取高纯度鸭嘴花碱的方法。
背景技术
鸭嘴花又叫大还魂、大驳骨、大接骨等,为爵床科鸭嘴花属常绿灌木,主要分布于亚洲东南部,在我国广东、广西、海南、澳门、香港、云南等地有产,或栽培,或野生。该植物主要特征是:大灌木,高达1-3米;枝圆柱状,灰色,有皮孔,嫩枝密被灰白色微柔毛。叶纸质,矩圆状披针形至披针形,或卵形或椭圆状卵形,长15-20厘米,宽4.5-7.5厘米,顶端渐尖,有时稍呈尾状,基部阔楔形,全缘,上面近无毛,背面被微柔毛;中脉在上面具槽,侧脉每边约12条;叶柄长1.5-2厘米。茎叶揉后有特殊臭气。穗状花序卵形或稍伸长;花梗长5-10厘米;苞片卵形或阔卵形,长1-3厘米,宽8-15毫米,被微柔毛;小苞片披针形,稍短于苞片,萼裂片5,矩圆状披针形,长约8毫米;花冠白色,有紫色条纹或粉红色,长2.5-3 厘米,被柔毛,冠管卵形,长约6毫米;药室椭圆形,基部通常有球形附属物不明显。蒴果近木质,长约0.5厘米,上部具4粒种子,下部实心短柄状。
鸭嘴花是传统中药材,全株切段、晒干或鲜用入药,是我国华南地区使用的地方药材大驳骨,也是云南省西双版纳等地区的传统傣族医药。中医认为其味辛、微苦、性平,归肝、脾经;有祛风活血、散瘀止痛、接骨续伤等功效。临床上主治筋骨伤折,扭伤,淤血肿痛,风湿痹病,腰痛,月经过多,崩漏,内服或外用均可。
歨穬学成分主要含有生物碱类和黄酮类化合物,也含有多种糖苷类和多糖类化合物以及挥发油成分,其中以生物碱类化合物为主,包括鸭嘴花酚碱(Vasicinol)、鸭嘴花醇碱 (Vasicol)、去氧鸭嘴花酮碱(Deoxyvasicinone)、鸭嘴花酮碱(Vasicinone)、鸭嘴花碱(Vasicine)、去氧鸭嘴花碱(Deoxypeganine)、脱氢鸭嘴花碱(Vaskin)、羟基骆驼蓬碱(Hydroxypenganine)、甜菜碱(Betaine)、鸭嘴花考林碱(Vasicoline)、鸭嘴花考林酮碱(Vasicolinone)、安妮索碱 (Anisotine)、鸭嘴花定碱(Adhatodine)和大驳骨酮碱(Adhavasinone)。在每年不同生长时期,其生物碱含量和组分存在差异,生物碱的总含量约2%(无水生物碱),在8~10月份时,鸭嘴花碱约占95%,在微量生物碱中约有3%去氧鸭嘴花碱和痕迹量的鸭嘴花酮碱。
现代医学研究证明,鸭嘴花碱有显著的子宫兴奋作用有显著的局部麻醉作用;可减弱心肌收缩力,减少冠脉流量、轻度降低血压;对支气管有强的扩张作用,特别对组胺所致支气管收缩有显著的解痉作用,但较肾上腺素弱;对金黄色葡萄球菌、志贺菌、变形杆菌和伤寒杆菌等有中度抗菌作用;脱氢鸭嘴花碱对实验动物无显著毒性。目前,国外对鸭嘴花的研究较多,印度用含有鸭嘴花提取物的制剂常被用于治疗呼吸系统方面的疾病,如咳嗽、感冒、哮喘、支气管炎、肺结核等;德国HF医药研究有限公司就去氧鸭嘴花碱及其盐在我国申请了3项专利,用以治疗抑郁症(尤其是与痴呆、酒精或尼古丁滥用有关的抑郁症)、精神分裂性精神病以及治疗大脑、中枢神经机能丧失或失调;国内对鸭嘴花的研究报道却较少。
现阶段,有关提取鸭嘴花碱的研究有少量报道,例如从骆驼蓬中提取鸭嘴花碱和鸭嘴花酮碱,而有关鸭嘴花中提取鸭嘴花碱的报道甚少,从中提取高纯度鸭嘴花碱的报道基本为空白,到目前为止,也未有鸭嘴花中提取鸭嘴花碱的专利申请,这在很大程度上制约了这种传统药物的进一步发展。
因此,研究设计出一种能够从鸭嘴花中提取高纯度鸭嘴花碱的工艺,是十分重要的,将为中药有效成分的利用及中药利用的现代化提供更好的基础。
发明内容
本发明的目的就是要提供一种方法能够从鸭嘴花中提取高纯度鸭嘴花碱的方法,经微生物发酵后,再用乙醇溶液提取、过滤、脱脂、减压浓缩、亲和层析、离子交换层析、结晶制得鸭嘴花纯品,该方法利于操作、产品纯度高。
本发明采用的微生物菌种,糙孢曲霉(Aspergillus asperescens)来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心,编号分别为CGMCC No.3.4369。
本发明提供一种从鸭嘴花提取高纯度鸭嘴花碱的方法,其特征在于:
1、于每年8~10月采集鸭嘴花茎叶,晒干,粉碎,过20目筛,加入5-10%糙孢曲霉培养液,在28~30℃条件下好氧固体发酵3~5天。
2、发酵后的鸭嘴花在20~40℃下,用一定质量分数的乙醇溶液超声提取3次,用陶瓷膜过滤,3次滤液合并。滤液经减压回收乙醇,得到总生物碱的粗制浸膏,并于50℃下干燥;将干燥物用石油醚进行浸提,陶瓷膜过滤得滤渣,滤液在50℃下减压浓缩回收石油醚。
3、用pH=9的碱性水溶解滤渣,用陶瓷膜过滤,滤液用D101型大孔树脂纯化;依次用去离子水、pH=5的质量分数30%的乙醇洗脱,减压浓缩质量分数30%乙醇相浸膏,得到含鸭嘴花碱粗制浸膏;
4、用酸性乙醇(乙醇2mL,0.5N盐酸30mL)溶解浸膏,用陶瓷膜过滤,滤液用强酸性阳离子树脂DOWEX 50WX2纯化,用去离子水、含氨水浓度为2.0N的80%乙醇溶液对树脂吸附的生物碱成分进行洗脱,收集乙醇洗脱部分,减压浓缩得到高纯度鸭嘴花碱浸膏。
5、上述浓缩浸膏用无水乙醇重结晶,用热乙醇溶解结晶,加活性炭脱色,用陶瓷膜过滤,得到纯度大于95%的鸭嘴花碱。
所述过滤过程都是采用陶瓷膜过滤,膜孔孔径大小为0.22μm。
技术效果
1、本发明方法操作简单,极大的降低了鸭嘴花中鸭嘴花碱的生产成本,简化了生产过程。
2、采用曲霉进行发酵处理,有效降低了鸭嘴花中淀粉和纤维对提取鸭嘴花碱的影响,提高了鸭嘴花碱的溶出率,也能有效提高鸭嘴花碱的产量。
3、采用乙醇提取和柱层析方法快速获得鸭嘴花碱。
4、采用离子交换层析纯化鸭嘴花碱可进一步提高鸭嘴花碱的纯度,使鸭嘴花碱的纯度达到95.0%以上。
5、采用醇浸提后所得到发酵废渣可直接用于肥料的制备,降低了向环境排放废弃物的可能。
6、该工艺过程中的树脂、溶剂、洗脱剂均可重复使用,工艺成本低,易于工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1
粉碎已干燥好的鸭嘴花茎叶原料至10目~20目,称取100Kg,加入10L糙孢曲霉培养液,在28~30℃条件下好氧固体发酵3~5天。发酵后鸭嘴花中加入60~80%乙醇800L,于常温下超声提取3次,每次30min,三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤一次,合并滤液,50℃下减压浓缩获得干燥物6.2kg;将干燥物用45L的石油醚进行浸提,陶瓷膜过滤一次,滤液在50℃下减压浓缩回收石油醚;得滤渣3.72kg,加入3L pH=9的碱性水溶解,陶瓷膜过滤一次,滤液上大孔吸附树脂D101进行吸附分离,并将收集的30%乙醇相洗脱物减压浓缩干燥,减压浓缩获得干燥物2.07kg,加入4L的乙醇含量为70%的酸性乙醇水溶液使之充分溶解,40℃左右,再加入9L的水;将含有鸭嘴花碱的乙醇溶液放置在4℃过夜结晶,得到淡黄色晶体,抽滤,得到鸭嘴花碱粗品,重结晶得到鸭嘴花碱1925g纯品。检测设备为 Agilent1100高效液相色谱仪,色谱柱为色谱柱为C8柱,柱温25℃,流动相为乙腈-磷酸 (0.4mol·L-1)=15∶85,流速1.0mL·min-1,检测器为可变波长扫描紫外检测器(VWD),检测波长为300nm,进样量为10μL。鸭嘴花碱的保留时间为4.53min,鸭嘴花碱样品的纯度为98.36%。
对照实施例
粉碎已干燥好的鸭嘴花茎叶原料至10目~20目,称取100Kg,加入60~80%乙醇800L,于常温下超声提取3次,每次30min,三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤一次,合并滤液,50℃下减压浓缩获得干燥物5.9kg;将干燥物用50L的石油醚进行浸提,陶瓷膜过滤一次,滤液在50℃下减压浓缩回收石油醚;得滤渣3.43kg,加入3.5L pH=9的碱性水溶解,陶瓷膜过滤一次,滤液上大孔吸附树脂D101进行吸附分离,并将收集的30%乙醇相洗脱物减压浓缩干燥,减压浓缩获得干燥物1.89kg,加入4L的乙醇含量为70%的酸性乙醇水溶液使之充分溶解,40℃左右,再加入9L的水;将含有鸭嘴花碱的乙醇溶液放置在4℃过夜结晶,得到淡黄色晶体,抽滤,得到鸭嘴花碱粗品,重结晶得到鸭嘴花碱1742g纯品。检测设备为Agilent1100高效液相色谱仪,色谱柱为色谱柱为C8柱,柱温25℃,流动相为乙腈-磷酸(0.4mol·L-1)=15∶85,流速1.0mL·min-1,检测器为可变波长扫描紫外检测器(VWD),检测波长为300nm,进样量为10μL。鸭嘴花碱的保留时间为4.53min,鸭嘴花碱样品的纯度为98.21%。
实施例2
粉碎已干燥好的鸭嘴花茎叶原料至10目~20目,称取200Kg,加入15L糙孢曲霉培养液,在28~30℃条件下好氧固体发酵3~5天。发酵后鸭嘴花与60~80%乙醇1800L,于常温下超声提取3次,每次30min,三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤一次,合并滤液,50℃下减压浓缩获得干燥物11.4kg;将干燥物用90L的石油醚进行浸提,陶瓷膜过滤一次,滤液在50℃下减压浓缩回收石油醚;得滤渣7.4kg,加入7L pH=9的碱性水溶解,陶瓷膜过滤一次,滤液上大孔吸附树脂D101进行吸附分离,并将收集的30%乙醇相洗脱物减压浓缩干燥,减压浓缩获得干燥物4.15kg,加入7L的乙醇含量为70%的酸性乙醇水溶液使之充分溶解, 40℃左右,再加入10L的水;将含有鸭嘴花碱的乙醇溶液放置在4℃过夜结晶,得到淡黄色晶体,抽滤,得到鸭嘴花碱粗品,重结晶得到鸭嘴花碱3821g纯品。检测设备为Agilent1100 高效液相色谱仪,色谱柱为色谱柱为C8柱,柱温25℃,流动相为乙腈-磷酸(0.4mol·L-1) =15∶85,流速1.0mL·min-1,检测器为可变波长扫描紫外检测器(VWD),检测波长为300nm,进样量为10μL。鸭嘴花碱的保留时间为4.53min,鸭嘴花碱样品的纯度为98.25%。
实施例3
粉碎已干燥好的鸭嘴花茎叶原料至10目~20目,称取5Kg,加入0.5L糙孢曲霉培养液,在28~30℃条件下好氧固体发酵3~5天。发酵后鸭嘴花与60~80%乙醇40L,于常温下超声提取3次,每次30min,三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤一次,合并滤液,50℃下减压浓缩获得干燥物295g;将干燥物用2.5L的石油醚进行浸提,陶瓷膜过滤一次,滤液在50℃下减压浓缩回收石油醚;得滤渣187g,加入0.2L pH=9的碱性水溶解,陶瓷膜过滤一次,滤液上大孔吸附树脂D101进行吸附分离,并将收集的30%乙醇相洗脱物减压浓缩干燥,减压浓缩获得干燥物102g,加入0.2L的乙醇含量为70%的酸性乙醇水溶液使之充分溶解,40℃左右,再加入0.45L的水;将含有鸭嘴花碱的乙醇溶液放置在4℃过夜结晶,得到淡黄色晶体,抽滤,得到鸭嘴花碱粗品,重结晶得到鸭嘴花碱95g纯品。检测设备为Agilent1100高效液相色谱仪,色谱柱为色谱柱为C8柱,柱温25℃,流动相为乙腈-磷酸(0.4mol·L-1)=15∶85,流速1.0mL·min-1,检测器为可变波长扫描紫外检测器(VWD),检测波长为300nm,进样量为10μL。鸭嘴花碱的保留时间为4.53min,鸭嘴花碱样品的纯度为98.43%。
Claims (7)
1.本发明的目的就是要提供一种方法能够从鸭嘴花中提取高纯度鸭嘴花碱的方法,其特征在于:
(1)于每年8~10月采集鸭嘴花茎叶,晒干,粉碎,过20目筛,加入5-10%糙孢曲霉培养液,在28~30℃条件下好氧固体发酵3~5天。
(2)发酵后的鸭嘴花在20~40℃下,用质量分数为60%~80%的乙醇超声提取3次,每次30min,每次乙醇用量(体积/mL)为植物样量(质量/g)的7~10倍;超声功率为超声的频率为45-65KHz,功率为50-150W。用陶瓷膜过滤,3次滤液合并。滤液经减压回收乙醇,得到总生物碱的粗制浸膏;将干燥物用石油醚进行浸提,陶瓷膜过滤得滤渣,滤液在50℃下减压浓缩回收石油醚。
(3)用pH=9的碱性水溶解浸膏,用陶瓷膜过滤,滤液用D101型大孔树脂纯化;依次用去离子水、pH=5的质量分数30%的乙醇洗脱,减压浓缩质量分数30%乙醇相浸膏,得到含鸭嘴花碱粗制浸膏。
(4)用酸性乙醇(乙醇2mL,0.5N盐酸30mL)溶解浸膏,用陶瓷膜过滤,滤液用强酸性阳离子树脂DOWEX 50WX2纯化,用去离子水、含氨水浓度为2.0N的80%乙醇溶液对树脂吸附的生物碱成分进行洗脱,收集乙醇洗脱部分,减压浓缩得到高纯度鸭嘴花碱浸膏。
(5)上述浓缩浸膏用无水乙醇重结晶,得到纯度大于95%的鸭嘴花碱。
所述过滤过程都是采用陶瓷膜过滤,膜孔孔径大小为0.22μm。
2.根据权利要求1所述的从鸭嘴花中提取高纯度鸭嘴花碱的方法,其特征在于所述的步骤(1)中加入5-10%毛霉培养液进行好氧固体发酵3~5天,得到含鸭嘴花碱混合液。
3.根据权利要求1所述的从鸭嘴花中提取高纯度鸭嘴花碱的方法,其特征在于所述的步骤(2)中将发酵后的鸭嘴花用质量分数为60%~80%的乙醇超声提取3次,每次30min,每次乙醇用量(体积/mL)为植物样量(质量/g)的7~10倍;超声功率为超声的频率为45-65KHz,功率为50-150W。过滤,3次滤液合并。滤液经减压回收乙醇,得到总生物碱的粗制浸膏并低温干燥。将干燥物用石油醚进行浸提,陶瓷膜过滤得滤渣,滤液在50℃下减压浓缩回收石油醚。
4.根据权利要求1所述的从鸭嘴花中提取高纯度鸭嘴花碱的方法,其特征在于所述的步骤(3)中用pH=9的碱性水溶解滤渣,滤液采用D101型大孔树脂纯化;依次用去离子水、pH=5的质量分数30%的乙醇进行分级洗脱,减压浓缩质量分数30%乙醇相浸膏,得到含鸭嘴花碱粗制浸膏。
5.根据权利要求1所述的从鸭嘴花中提取高纯度鸭嘴花碱的方法,其特征在于所述的步骤(4)中,用酸性乙醇(乙醇2mL,0.5N盐酸30mL)溶解浸膏,滤液用强酸性阳离子树脂DOWEX 50WX2纯化,依次用去离子水、含氨水浓度为2.0N的80%乙醇溶液对树脂吸附的生物碱成分进行洗脱,收集乙醇洗脱部分,减压浓缩得到高纯度鸭嘴花碱浸膏。
6.根据权利要求1所述的从鸭嘴花中提取高纯度鸭嘴花碱的方法,其特征在于所述的步骤(5)中,浓缩浸膏用无水乙醇重结晶后,加活性炭脱色,最终可得到纯度大于95%的鸭嘴花碱。
7.根据权利要求1的方法,其中过滤过程都是采用陶瓷膜过滤,膜孔孔径大小为0.22μm。
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