CN107382940A - 一种从鸭嘴花中提取鸭嘴花碱和槲皮素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的就是要提供一种方法能够同步从鸭嘴花中提取鸭嘴花碱和槲皮素的方法：干燥过后的鸭嘴花茎叶经微生物发酵后，再用乙醇和氯仿溶液提取、分馏、过滤、减压浓缩、吸附柱层析、离子交换层析、脱色结晶制得纯度大于95％的槲皮素和鸭嘴花碱纯品。其操作条件简单，提取效率高。

Description

一种从鸭嘴花中提取鸭嘴花碱和槲皮素的方法

技术领域

本发明属于天然产物加工领域，涉及一种从鸭嘴花中提取鸭嘴花碱和槲皮素的方法。

背景技术

鸭嘴花又叫大还魂、大驳骨、大接骨等，为爵床科鸭嘴花属常绿灌木，主要分布于亚洲东南部，在我国广东、广西、海南、澳门、香港、云南等地有产，或栽培，或野生。该植物主要特征是：大灌木，高达1-3米；枝圆柱状，灰色，有皮孔，嫩枝密被灰白色微柔毛。叶纸质，矩圆状披针形至披针形，或卵形或椭圆状卵形，长15-20厘米，宽4.5-7.5厘米，顶端渐尖，有时稍呈尾状，基部阔楔形，全缘，上面近无毛，背面被微柔毛；中脉在上面具槽，侧脉每边约12条；叶柄长1.5-2厘米。茎叶揉后有特殊臭气。穗状花序卵形或稍伸长；花梗长5-10厘米；苞片卵形或阔卵形，长1-3厘米，宽8-15毫米，被微柔毛；小苞片披针形，稍短于苞片，萼裂片5，矩圆状披针形，长约8毫米；花冠白色，有紫色条纹或粉红色，长2.5-3 厘米，被柔毛，冠管卵形，长约6毫米；药室椭圆形，基部通常有球形附属物不明显。蒴果近木质，长约0.5厘米，上部具4粒种子，下部实心短柄状。

鸭嘴花是传统中药材，全株切段、晒干或鲜用入药，是我国华南地区使用的地方药材大驳骨，也是云南省西双版纳等地区的传统傣族医药。中医认为其味辛、微苦、性平，归肝、脾经；有祛风活血、散瘀止痛、接骨续伤等功效。临床上主治筋骨伤折，扭伤，淤血肿痛，风湿痹病，腰痛，月经过多，崩漏，内服或外用均可。

鸭嘴花化学成分主要含有生物碱类和黄酮类化合物，也含有多种糖苷类和多糖类化合物以及挥发油成分，其中以生物碱类化合物为主，包括鸭嘴花酚碱(Vasicinol)、鸭嘴花醇碱 (Vasicol)、去氧鸭嘴花酮碱(Deoxyvasicinone)、鸭嘴花酮碱(Vasicinone)、鸭嘴花碱(Vasicine)、去氧鸭嘴花碱(Deoxypeganine)、脱氢鸭嘴花碱(Vaskin)、羟基骆驼蓬碱(Hydroxypenganine)、甜菜碱(Betaine)、鸭嘴花考林碱(Vasicoline)、鸭嘴花考林酮碱(Vasicolinone)、安妮索碱 (Anisotine)、鸭嘴花定碱(Adhatodine)和大驳骨酮碱(Adhavasinone)。在每年不同生长时期，其生物碱含量和组分存在差异，生物碱的总含量约2％(无水生物碱)，在8～10月份时，鸭嘴花碱约占95％，在微量生物碱中约有3％去氧鸭嘴花碱和痕迹量的鸭嘴花酮碱。

鸭嘴花碱为吡咯类生物碱，化学名为：(R)-1，2，3，9-四氢吡咯并[2，1-b]喹唑啉-3-醇，易溶于水、醇、稀酸和稀碱中，也可溶于氯仿。

现代医学研究证明，鸭嘴花碱有显著的子宫兴奋作用有显著的局部麻醉作用；可减弱心肌收缩力，减少冠脉流量、轻度降低血压；对支气管有强的扩张作用，特别对组胺所致支气管收缩有显著的解痉作用，但较肾上腺素弱；对金黄色葡萄球菌、志贺菌、变形杆菌和伤寒杆菌等有中度抗菌作用；脱氢鸭嘴花碱对实验动物无显著毒性。目前，国外对鸭嘴花的研究较多，印度用含有鸭嘴花提取物的制剂治疗哮喘，德国HF医药研究有限公司就去氧鸭嘴花碱及其盐在我国申请了3项专利，用以治疗抑郁症(尤其是与痴呆、酒精或尼古丁滥用有关的抑郁症)、精神分裂性精神病以及治疗大脑、中枢神经机能丧失或失调；国内对鸭嘴花的研究报道却较少。国外，鸭嘴花在印度应用较多，常被用于治疗呼吸系统方面的疾病，如咳嗽、感冒、哮喘、支气管炎、肺结核等。

黄酮类化合物是一类天然产物，在自然界中普遍存在，具有广泛的生理和药理活性，毒副作用低，在食品、化妆品、医药、保健品等领域具有广阔的应用前景。

黄酮类成分包括山柰酚(Kaempferol-3-β-D-glucoside)、槲皮素(Quercetin)、2′-羟基 -4-葡萄糖氧基查尔酮(2′-hydroxy-4-gluxosyloxy chalcone)以及牡荆葡基黄酮(Vitexin)、异牡荆黄素(Isovitexin)、2′-O-木糖基牡荆素(2′-O-xylosylvitexin)、5，7，4′-三羟(基)黄酮(Apigenin)。

槲皮素(Quercetin)是一种多羟基黄酮类化合物，化学名为3，3’，4’，5，7-五羟基黄酮，黄酮类物质中较具代表性的化合物。槲皮素溶于热乙醇、冷乙醇，也可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶等，不溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿中，几乎不溶于水。

槲皮素以其药用价值日益受到医药工作者的重视。槲皮素药理作用很广泛，它具有抗氧化及清除自由基的作用，还具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖降压、免疫调节及心血管保护作用等作用。

鸭嘴花是我国华南地区重要的药用野生植物，它的开发有助于传统中药材的现代化应用。

现阶段，但是有关提取鸭嘴花总生物碱的研究较少，而从鸭嘴花中提取鸭嘴花碱和槲皮素仍然为空白，这在很大程度上制约了这一传统药物的进一步发展。

因此，研究设计出一种能够从鸭嘴花中提取鸭嘴花碱和槲皮素的工艺，是十分重要的，可以有更加有效的利用植物资源，将为中药利用的现代化和有效成分利用提供更好的基础。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种方法能够从鸭嘴花中提取鸭嘴花碱和槲皮素的方法：干燥过后的鸭嘴花茎叶经微生物发酵后，再用乙醇和氯仿溶液提取、分馏、过滤、减压浓缩、吸附层析、脱色结晶制得鸭嘴花碱和槲皮素纯品。

本发明采用的微生物菌种，糙孢曲霉(Aspergillus asperescens)来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号分别为CGMCC No.3.4369。其特征在于：

1、于每年8～10月采集鸭嘴花茎叶，晒干，粉碎，过20目筛，加入5-10％糙孢曲霉培养液，在28～30℃条件下好氧固体发酵3～5天。

2、在20～40℃下，用质量分数为80％的乙醇溶液超声提取3次，每次30min，每次提取液用量(体积/mL)为植物样量(质量/g)的8～10倍；超声功率为超声的频率为45-65KHz，功率为50-150W。用陶瓷膜过滤，3次滤液合并。将滤液减压浓缩并真空干燥除去乙醇，得干燥物I。

3、将干燥物I用氯仿溶解浸提4-5h，用陶瓷膜过滤，滤渣经真空干燥得干燥物II(黄酮)，滤液减压浓缩并真空干燥除去氯仿，经真空干燥得干燥物III。

4、干燥物II用水溶解，用陶瓷膜过滤，滤液用D101型或AB-8型大孔树脂纯化；依次用去离子水、质量分数30％、50％和70％的乙醇洗脱；收集质量分数70％的乙醇相的浸膏，经减压浓缩后用无水乙醇重结晶并干燥，用热乙醇溶解结晶，加活性炭脱色，过滤，冻干后得槲皮素纯品。

5、干燥物III用1％盐酸水溶液溶解，滤液用D101型或AB-8型大孔树脂纯化，依次用去离子水、质量分数30％的乙醇洗脱，减压浓缩质量分数30％的乙醇相的浸膏，得到含鸭嘴花碱的浸膏。

6、用酸性乙醇(乙醇2mL，0.5N盐酸30mL)溶解鸭嘴花碱浸膏，用陶瓷膜过滤，滤液用强酸性阳离子树脂DOWEX 50WX2纯化，用2-3倍柱床体积的去离子水、含氨水浓度为2.0N的80％乙醇溶液对树脂吸附的生物碱成分进行洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩得到高纯度鸭嘴花碱浸膏。

7、浓缩后的鸭嘴花碱浸膏用无水乙醇重结晶，用热乙醇溶解结晶，加活性炭脱色，用陶瓷膜过滤，得到纯度大于95％的鸭嘴花碱纯品。

所述过滤过程都是采用陶瓷膜过滤，膜孔孔径大小为0.22μm。

技术效果

1、本发明的工艺方法简单，可同步从鸭嘴花中提取鸭嘴花碱和槲皮素，极大的提高了鸭嘴花的利用率，同时也简化了工艺流程，有利于降低生产成本；

2、该工艺过程中的树脂、溶剂、洗脱剂均可以重复使用，工艺成本低，易于工业化生产。

3、采用曲霉进行发酵处理，有效降低了鸭嘴花中淀粉和纤维对提取有效物质的影响，提高了鸭嘴花碱和槲皮素的溶出率和产量。

4、采用乙醇和氯仿同步提取槲皮素和鸭嘴花碱，快速获得多种活性成分。

5、采用离子交换层析纯化鸭嘴花碱可进一步提高鸭嘴花碱的纯度。

6、采用醇浸提后所得到发酵废渣可直接用于肥料的制备，降低了向环境排放废弃物的可能。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例1

粉碎已干燥好的鸭嘴花茎叶原料至10目～20目，称取100Kg，加入10L糙孢曲霉培养液，在28～30℃条件下好氧固体发酵3～5天。发酵后鸭嘴花中加入80％乙醇溶液800L，于常温下超声提取3次，每次30min，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤一次，合并滤液，将滤液减压浓缩并真空干燥除去乙醇，得干燥物I 6.2kg。将干燥物I用氯仿浸提4-5h，陶瓷膜过滤，滤渣经真空干燥得干燥物II(黄酮)1.41kg；滤液减压浓缩并真空干燥除去氯仿，经真空干燥得干燥物III 3.72kg。将干燥物II用水溶解，陶瓷膜过滤，滤液用D101型或AB-8 型大孔树脂纯化，收集质量分数70％的乙醇相的浸膏，经减压浓缩后用无水乙醇重结晶并干燥，用热乙醇溶解结晶，加活性炭脱色，过滤，冻干后得槲皮素纯品512g。

干燥物III冻干后用1％盐酸水溶液溶解，用D101型大孔树脂纯化，依次用去离子水、质量分数30％的乙醇洗脱，减压浓缩质量分数30％的乙醇相的浸膏，得到含鸭嘴花碱的浸膏2.07kg。用酸性乙醇溶解鸭嘴花碱浸膏，经陶瓷膜过滤后，滤液用强酸性阳离子树脂DOWEX 50WX2纯化，用去离子水、含氨水浓度为2.0N的80％乙醇溶液对树脂吸附的生物碱成分进行洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩得到高纯度鸭嘴花碱浸膏2.03kg。将含有鸭嘴花碱的乙醇溶液放置在4℃过夜结晶，得到淡黄色晶体，抽滤，得到鸭嘴花碱粗品，重结晶得到鸭嘴花碱1910g纯品，纯度大于98.42％。

对照实施例

粉碎已干燥好的鸭嘴花茎叶原料至10目～20目，称取100Kg，加入80％乙醇溶液800L，于常温下超声提取3次，每次30min，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤一次，合并滤液，将滤液减压浓缩并真空干燥除去乙醇，得干燥物I 5.92kg。将干燥物I用氯仿浸提4-5h，陶瓷膜过滤，滤渣经真空干燥得干燥物II(黄酮)1.21kg；滤液减压浓缩并真空干燥除去氯仿，经真空干燥得干燥物III 3.41kg。将干燥物II用水溶解，陶瓷膜过滤，滤液用D101型或AB-8型大孔树脂纯化，收集质量分数70％的乙醇相的浸膏，经减压浓缩后用无水乙醇重结晶并干燥，用热乙醇溶解结晶，加活性炭脱色，过滤，冻干后得槲皮素纯品406g，经HPLC检测为93.65％。

干燥物III冻干后用1％盐酸水溶液溶解，用D101型大孔树脂纯化，依次用去离子水、质量分数30％的乙醇洗脱，减压浓缩质量分数30％的乙醇相的浸膏，得到含鸭嘴花碱的浸膏1.87kg。用酸性乙醇溶解鸭嘴花碱浸膏，经陶瓷膜过滤后，滤液用强酸性阳离子树脂DOWEX 50WX2纯化，用去离子水、含氨水浓度为2.0N的80％乙醇溶液对树脂吸附的生物碱成分进行洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩得到高纯度鸭嘴花碱粗品。将含有鸭嘴花碱的乙醇溶液放置在4℃过夜结晶，得到淡黄色晶体，抽滤，得到鸭嘴花碱粗品，重结晶得到鸭嘴花碱1725g纯品，纯度大于95％，经HPLC检测为94.68％。

实施例2

粉碎已干燥好的鸭嘴花茎叶原料至10目～20目，称取200Kg，加入15L糙孢曲霉培养液，在28～30℃条件下好氧固体发酵3～5天。发酵后鸭嘴花中加入80％乙醇溶液1800L，于常温下超声提取3次，每次30min，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤一次，合并滤液，将滤液减压浓缩并真空干燥除去乙醇，得干燥物I11.4kg。将干燥物I用氯仿浸提4-5h，陶瓷膜过滤，滤渣经真空干燥得干燥物II(黄酮)2.78kg；滤液减压浓缩并真空干燥除去氯仿，经真空干燥得干燥物III 7.41kg。将干燥物II用水溶解，陶瓷膜过滤，滤液用D101型或AB-8 型大孔树脂纯化，收集质量分数70％的乙醇相的浸膏，经减压浓缩后用无水乙醇重结晶并干燥，用热乙醇溶解结晶，加活性炭脱色，过滤，冻干后得槲皮素纯品1032g。

干燥物III冻干后用1％盐酸水溶液溶解，用D101型大孔树脂纯化，依次用去离子水、质量分数30％的乙醇洗脱，减压浓缩质量分数30％的乙醇相的浸膏，得到含鸭嘴花碱的浸膏4.15kg。用酸性乙醇溶解鸭嘴花碱浸膏，经陶瓷膜过滤后，滤液用强酸性阳离子树脂DOWEX 50WX2纯化，用去离子水、含氨水浓度为2.0N的80％乙醇溶液对树脂吸附的生物碱成分进行洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩得到高纯度鸭嘴花碱浸膏4.05kg。将含有鸭嘴花碱的乙醇溶液放置在4℃过夜结晶，得到淡黄色晶体，抽滤，得到鸭嘴花碱粗品，重结晶得到鸭嘴花碱3821g纯品，纯度大于98.7％。

实施例3

粉碎已干燥好的鸭嘴花茎叶原料至10目～20目，称取5Kg，加入0.5L糙孢曲霉培养液，在28～30℃条件下好氧固体发酵3～5天。发酵后鸭嘴花中加入80％乙醇溶液40L，于常温下超声提取3次，每次30min，三层纱布过滤两次、陶瓷膜过滤一次，合并滤液，将滤液减压浓缩并真空干燥除去乙醇，得干燥物I 295g。将干燥物I用氯仿浸提4-5h，陶瓷膜过滤，滤渣经真空干燥得干燥物II(黄酮)70.2g；滤液减压浓缩并真空干燥除去氯仿，经真空干燥得干燥物III 192kg。将干燥物II用水溶解，陶瓷膜过滤，滤液用D101型或AB-8 型大孔树脂纯化，收集质量分数70％的乙醇相的浸膏，经减压浓缩后用无水乙醇重结晶并干燥，用热乙醇溶解结晶，加活性炭脱色，过滤，冻干后得槲皮素纯品25.2g。

干燥物III冻干后用1％盐酸水溶液溶解，用D101型大孔树脂纯化，依次用去离子水、质量分数30％的乙醇洗脱，减压浓缩质量分数30％的乙醇相的浸膏，得到含鸭嘴花碱的浸膏102g。用酸性乙醇溶解鸭嘴花碱浸膏，经陶瓷膜过滤后，滤液用强酸性阳离子树脂DOWEX 50WX2纯化，用去离子水、含氨水浓度为2.0N的80％乙醇溶液对树脂吸附的生物碱成分进行洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩得到高纯度鸭嘴花碱浸膏99g。将含有鸭嘴花碱的乙醇溶液放置在4℃过夜结晶，得到淡黄色晶体，抽滤，得到鸭嘴花碱粗品，重结晶得到鸭嘴花碱97g纯品，纯度大于98.7％。

Claims (9)

1.本发明的目的就是要提供一种方法能够从鸭嘴花中同步提取鸭嘴花碱和槲皮素的方法，其特征在于：

(1)于每年8～10月采集鸭嘴花茎叶，晒干，粉碎，筛分，加入5-10％糙孢曲霉培养液，好氧固体发酵3～5天。

(2)在20～40℃下，用质量分数为80％的乙醇溶液超声提取3次，每次30min。用陶瓷膜过滤，3次滤液合并，将滤液减压浓缩并真空干燥除去乙醇，得干燥物I。

(3)将干燥物I用氯仿溶解浸提4-5h，用陶瓷膜过滤，滤渣经真空干燥得干燥物II(黄酮)，滤液减压浓缩并真空干燥除去氯仿，经真空干燥得干燥物III。

(4)干燥物II用水溶解后，用陶瓷膜过滤，用D101型或AB-8型大孔树脂纯化；收集质量分数70％的乙醇相的浸膏，减压浓缩后用无水乙醇重结晶并干燥，得槲皮素干品。

(5)干燥物III用1％盐酸水溶液溶解，用D101型或AB-8型大孔树脂纯化；收集质量分数30％的乙醇相含鸭嘴花碱的浸膏；

(6)用酸性乙醇溶解浸膏，陶瓷膜过滤，滤液用强酸性阳离子树脂DOWEX 50WX2纯化，用去离子水、含氨水浓度为2.0N的80％乙醇溶液对树脂吸附的生物碱成分进行洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩得到高纯度鸭嘴花碱浸膏。

(7)浓缩后的鸭嘴花碱浸膏用无水乙醇重结晶并干燥，得鸭嘴花碱干品。

2.根据要求1所述的从鸭嘴花中提取鸭嘴花碱和槲皮素的方法，其特征在于所述的步骤(1)中，8～10月采集的鸭嘴花茎叶经晒干和粉碎后，加入5-10％糙孢曲霉培养液进行好氧固体发酵3～5天，得到含鸭嘴花碱和槲皮素的混合液。

3.根据要求1所述的从鸭嘴花中提取鸭嘴花碱和槲皮素的方法，其特征在于所述的步骤(2)中，提取液为量分数为80％的乙醇溶液，每次提取液用量(体积/mL)为植物样量(质量/g)的10～15倍；超声提取3次，每次30min，超声功率为超声的频率为45-65KHz，功率为50-150W。过滤，合并滤液，滤液减压浓缩并真空干燥，得干燥物I。

4.根据要求1所述的从鸭嘴花中提取鸭嘴花碱和槲皮素的方法，其特征在于所述的步骤(3)中，干燥物I用氯仿溶解浸提4-5h用陶瓷膜过滤，滤渣经真空干燥得干燥物II；滤液减压浓缩并真空干燥除去氯仿，经真空干燥得干燥物III。

5.根据要求1所述的从鸭嘴花中提取鸭嘴花碱和槲皮素的方法，其特征在于所述的步骤(4)中，干燥物II用水溶解并过滤，滤液用D101型或AB-8型大孔树脂纯化，洗脱液分别为去离子水、质量分数30％、50％和70％的乙醇溶液，收集质量分数70％的乙醇相的浸膏，经减压浓缩后用无水乙醇重结晶，用热乙醇溶解结晶，加活性炭脱色，过滤，冻干后得槲皮素干品。

6.根据要求1所述的从鸭嘴花中提取鸭嘴花碱和槲皮素的方法，其特征在于所述的步骤(5)中，干燥物III用1％盐酸水溶液溶解，滤液用D101型或AB-8型大孔树脂纯化，洗脱液依次为去离子水、质量分数30％的乙醇溶液，收集质量分数30％的乙醇相的浸膏，减压浓缩得到含鸭嘴花碱的浸膏。

7.根据要求1所述的从鸭嘴花中提取高纯度鸭嘴花碱和槲皮素的方法，其特征在于所述的步骤(6)中，用酸性乙醇溶解含鸭嘴花碱的浸膏并过滤，滤液用强酸性阳离子树脂DOWEX 50WX2纯化，洗脱液依次为去离子水、含氨水浓度为2.0N的80％乙醇溶液，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩得到高纯度鸭嘴花碱浸膏。

8.根据要求1所述的从鸭嘴花中提取高纯度鸭嘴花碱和槲皮素的方法，其特征在于所述的步骤(7)中，浓缩浸膏用无水乙醇重结晶，最终可得到纯度大于95％的鸭嘴花碱。

9.根据权利要求1的方法，其中过滤过程都是采用陶瓷膜过滤，膜孔孔径大小为0.22μm。