JPH10510708A

JPH10510708A - 連続継代したアフリカミドリザル腎臓細胞

Info

Publication number: JPH10510708A
Application number: JP51889396A
Authority: JP
Inventors: ロバートエムチャノック; ロバートエイチパーセル; アルバートゼットカピキャン; ルイスポタッシュ
Original assignee: National Institutes of Health NIH
Current assignee: National Institutes of Health NIH
Priority date: 1994-11-30
Filing date: 1995-11-30
Publication date: 1998-10-20
Also published as: US6025182A; EP0790836A4; EP0790836A1; GR970300041T1; ES2107984T1; AU708482B2; WO1996016672A1; DE790836T1; US5646033A; US6117667A; US5911998A; AU4285796A

Abstract

(57)【要約】ここに記載されている発明は、新規アフリカミドリザル腎臓(AGMK)細胞基体の選択、その培養及び連続継代、並びにそれに続く特性決定の方法を提供するものである。本発明はさらに多数のウィルス、特にロタウィルス、エンテロウィルス、呼吸器ウィルス及びＡ型肝炎ウィルスの単離、生育及び連続継代における上記細胞基体の使用方法を提供する。生及び死菌ウィルスワクチンの製造に上記AGMK細胞基体を利用する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】連続継代したアフリカミドリザル腎臓細胞連邦が後援する研究開発の下に成された本発明に対する権利についての告示本発明の開発中に行われた研究の一部は米国政府基金を利用した。米国政府は本発明において一定の権利を有する(国立アレルギー及び感染疾患学会契約 No． N01-AO-35154)。発明の分野本発明は、ヒト及び動物のロタウィルス；アストロウィルス；セービン弱毒化生ポリオウィルスワクチン菌株、Ａ型肝炎ウィルス、並びに呼吸器合胞体ウィルス、パラインフルエンザ・ウィルス、及びインフルエンザＡ及びＢウィルスのような呼吸器ウィルスを含む、エンテロウィルスの効率的な複製を維持する新規のアフリカミドリザル腎臓(AGMK)細胞基体(cell substrate)に関する。本発明はまたヒトの免疫化を行うためのワクチンへの使用に適したウィルス懸濁液の製造に有用である。発明の背景ロタウィルスはヒトの急性胃腸炎の主な原因病原体であり、世界中に分布している。エンテロウィルスは胃腸管、呼吸器系の感染症及び無菌性髄膜炎に関係が取り沙汰されてきた。呼吸器合胞体ウィルス(RSV)、パラインフルエンザ・ウィルス及びインフルエンザ・ウィルスはクループ、細気管支炎及び肺炎のような重症の小児科疾患の主要な原因病原体であることが示されており、一方インフルエンザ・ウィルスは成人の重症の発熱性気道疾病の主な原因である。Ａ型肝炎ウィルスは肝臓の主要な感染性疾患の一つであるＡ型肝炎の原因である。ロタウィルス感染は世界中に見られ、これを原因とするものは生命を脅かすほど重症でしばしば致命的な下痢性疾患のうちの大きな割合を占めている。多くのロタウィルス疾患は４種類の主なヒト・ロタウィルス血清型によって起きるが、他の血清型も継続的に発見されている。後者の地理的な分布は通常限られているが、いずれ大きな問題となるであろう。世界中で、ヒト・ロタウィルスは乳幼児における重症急性胃腸炎の主な原因病原体であり、時折成人に衰弱するほどの下痢を起こすこともある。世界保健機関の評価では、ロタウィルスは発展途上国で毎年 100万人の乳幼児に致命的な下痢性疾病を起こす原因となっている。子供の重症ウィルス性呼吸器疾病の原因のうち最も重要なものは呼吸器合胞体ウィルス(RSV)である。これに関しては、パラインフルエンザ・ウィルス、インフルエンザ・ウィルス及びアデノウィルスも重要である。特に呼吸器合胞体ウィルス(RSV)の場合、これには２種類の主なサブグループＡ及びＢがあるが、免疫が長続きしないらしく、再感染が幼年期から就学前の期間を通じてさらに成年期もずっと高い頻度で起こり得るし実際に起きる。パラインフルエンザ・ウィルスは、４種類の主要な型、すなわち１、２、３及び４があるが、乳幼児におけるクループ、細気管支炎及び肺炎の重要な原因とされてきた。これらのウィルスは重症のウィルス性気道疾患の原因としてはRSV に次ぐものである。成人では、インフルエンザ・ウィルスが急性又は慢性の心臓又は肺疾患を持つ高齢者における死亡率の主な原因である。インフルエンザ・ウィルス感染による重症の全身性疾患の発現はよく知られており、血清型［A/H1N1、A/H3N2及び B］における抗原性がしばしばシフトすることから毎年のワクチン調製品に含まれるウィルス種組成を変える必要がある。エンテロウィルスは、ポリオウィルス、コクサッキー・ウィルス及びエコウィルスから成るピコマウィルスのサブグループであるが、幅広い種類の疾病を引き起こすことが示されている。これらの疾病としては衰弱性の後遺症をもたらす何らかの感染を伴う麻痺性疾患、脳炎、無菌性髄膜炎、胸膜痛、発疹、及び心膜炎が挙げられる。Ａ型肝炎ウィルスは、これもピコマウィルスの一つであり、伝染性肝炎と共に散発性肝炎の主な原因である。慣例に従って、二倍体であって実験室で達成できる継代回数に関しては限定された長命と言える半連続的細胞系統を細胞株と呼び、異数体であって実験室で無期限に継代することができる（すなわち、不死の）連続的細胞系統を細胞系と呼ぶ。これらの感染性病原体の幾つかによって起きる疾病と戦うためのワクチンの開発を制限する要因は、ワクチン製造への使用に適した濃度までこれらのウィルスが生育するのを維持することができる許容しうる細胞株又は細胞系を利用できないことであった。相対的に高い分離比率を用いて培養する（すなわち、一つの培養体から複数の組織培養容器を調製する）ことができて食品医薬品局(FDA)の生物評価研究センター(CBER)によってヒトでの使用認可が得ることができて感染させやすく便利な細胞株及び／又は細胞系が、現状では管理できないある種の医学的に重要なウィルスに対するワクチンの開発を可能且つ容易にするためには必要である。ハイブリッド・ロタウィルスの生育を維持することができる半連続的又は連続的細胞培養系統を以後ヒトx動物ロタウィルス・リアソータント(reassortant)と呼ぶが、これらにはサル細胞株である FRhL-2 並びにサル細胞系である CV-I 及び Vero が挙げられる。これらの細胞中で製造された生ウィルスワクチンはCBER ，FDAによりフェーズＩ及びII試験の認可を受けている。今後、本発明者らはこれらの細胞株又は細胞系を認定細胞株又は細胞系として、それらをヒト・ワクチンの製造に対する認可を受けている細胞株又は細胞系とは区別する。現在のところ、両方ともヒトの胎児二倍体細胞株であるWI-38 及び MRC-5というわずかに２種類の半連続的細胞培養系統が、ウィルスワクチンへの使用が認可されているにすぎない。これらの細胞株は認可細胞株と呼ぶことにする。現在までに認可された連続的細胞系はない。上記の認定細胞株又は細胞系(FRhL-2、CV-1及び Vero)は完全に相同なヒト・ロタウィルス、すなわち、11 RNA遺伝子セグメントがそれぞれヒト・ロタウィルスに由来しているロタウィルスの生育を維持する能力に限界がある。又、最大1: 3の分割比が可能な FRhL-2 細胞株は重要な RSVの生育を維持する能力に限界がある。最大 1:4の分割比が可能な CV-1 細胞は、多くのウィルス性病原体でワクチン製造に十分なレベルまでの生育を維持することはなかった。分割比が 1:6- 1:10 のVero細胞はいくつかのエンテロウィルスの生育を維持する能力に限界があるし、完全に相同なヒト・ロタウィルスの効率的な生育を維持することはできない。エンテロウィルスの遠縁にあたるピコマウィルスであるＡ型肝炎ウィルス(HAV )の天然発現株は初代単離ではいずれの型の細胞中においてもうまく生育せず、ワクチン開発及び製造に必要なウィルス複製レベルが達成できるようにする前に霊長類由来の細胞中における生育に適応させなければならない。ヒト胎児線維芽細胞 MRC-5細胞中で生育させた不活性化全ウィルスHAV ワクチンは開発されているが、これらの細胞が要求する 1:2という低い分割比、得られるウィルス力価の低さ、及び最大収率のウィルス抗原を得るために必要な２週間に及ぶ長い培養時間がこのようなワクチンを高価なものにしている。サル CV-1、FRhK-4（アカゲザル胎児腎臓細胞系）、FRhK-6（別のアカゲザル胎児腎臓細胞系）及びVero 細胞における HAVの生育は株及びウィルスの継代レベルによって変動しており、一般に最適状態に及ばない。最も良い生育は FRhK-4 細胞に由来するクローン 11- 1 と呼ばれるクローニング細胞系中で得られているが、これらの細胞はウシ乳頭腫ウィルス配列を含み、そのためワクチン開発には適していない。弱毒化HAV 生ワクチン及び不活性化HAV ワクチンの候補が上記ウィルスを初代アフリカミドリザル(AGMK)細胞中における生育に適応させることにより開発されているが、サル由来の外来性ウィルス病原体を含まない初代 AGMK 細胞を十分に得ることが非常に難しいことからそのようなワクチンは経済的に不可能である。弱毒化HAV 生ワクチン及び不活性化HAV ワクチンの候補がヒト胎児二倍体細胞株である MRC-5細胞中における生育に適応化されているが、このような適応化は一貫して、それぞれ、ヒト用の弱毒化生ウィルスの過剰弱毒化及び不活性化ウィルスワクチンの相対的に乏しい収率を導いてしまう。よって、ヒト・ロタウィルス、エンテロウィルス、HAV 、並びに RSV、インフルエンザ・ウィルス及びパラインフルエンザ・ウィルスを含む医学的に主要な重要性を持つ呼吸器ウィルスのような多数のヒト・ウィルス病原体の効率的な生育を維持することができる細胞株又は細胞系に対する必要性は依然として存在する。このような細胞株又は細胞系は経済的に有用且つ有効なワクチンの開発及び製造を容易にすると考えられる。乳児、子供、成人及び高齢者の重症ウィルス疾患を予防するためにこれらのウィルスに対するワクチンを開発する緊急の必要性がある。従って、重大な数の子供及び成人疾患の原因となる上記のようなウィルス病原体の効率的な複製を維持することができる単一細胞株又は細胞系が利用できれば多面的な意義を有するワクチンの処方及び製造に大きな前進をもたらすものと考えられる。発明の要約本発明はこれまでの樹立細胞株又は細胞系の持つ限界を実質的に克服した細胞基体（cell substrate）に関する。本発明の連続継代細胞はアフリカミドリザルの対になった腎臓に由来し、医学的に重要なヒト・ロタウィルス；アストロウィルス；セービン弱毒化生ポリオウィルスワクチン菌株、Ａ型肝炎ウィルス、並びに呼吸器合胞体ウィルス、パラインフルエンザ・ウィルス、及びインフルエンザＡ及びＢウィルスのような呼吸器ウィルスを含むエンテロウィルスのようなピコマウィルスの効率的な生育を維持する。本発明の AGMK 細胞は現時点では細胞株又は細胞系を構成するかどうかが明確ではないために細胞基体として作られている。上記細胞は異数体であり、異数体であることは細胞系の必須且つ定義となる性質であるから、それらはおそらくは細胞系である。しかしながら、AGMK細胞はわずかに 30 回の連続継代がなされているに過ぎず、細胞系の定義となる別の特徴の一つである細胞不死性の指定には 50 回以上の連続継代が必要である。 30回目の継代時に生存力、又は生育能力は減少しておらず、他の外面的な老化の兆候も存在しなかった。さらに、これらの各継代において AGMK 細胞は 1:4又は 1:8に分割されており、この分割比は細胞系の特徴を成すものであって通常1: 2より多くに分割できない細胞株とは異なる。本発明の重要な利点は、上記細胞基体が現在交付されているガイドライン（すなわち、「生物製剤の製造に使用される細胞系の特性決定における考察点」（19 93年５月））及び最新式試験法に基づいて、検出可能な二次的微生物病原体を含まないことが証明されていることである。この特徴により上記細胞基体は、組織培養宿主の範囲が非常に限定されて狭いヒト・ロタウィルス及びＡ型肝炎ウィルスのようなウィルスの生育に用いることができる。本発明以前にはこのような汚染のない細胞システムが利用できなかったことがこれらのウィルスに対するワクチン開発を妨げてきた。又、上記細胞基体はサルの二次病原体を含まないサル腎臓細胞の培養が必要な研究に用いることもできる。市販のサル腎臓細胞培養体はしばしばこれらの病原体に汚染されており、それは得られる結果を打ち消したり混乱させたりし、またヒトに投与予定のワクチンにそれらの培養体を使用できなくさせる。本発明はさらに、トリプシン処理が可能で容器サイズ及びワクチン製造期限によって要求される時間的制約によって 1:4から1:8 までの範囲の比率で分割することができる細胞基体の利点を提供するものである。本発明の他の特徴及び利点は以下に続く記載に示されているが、或いは本発明の実施により知ることができる。実現及び達成される本発明の目的及び他の利点は添付の図面と共に説明の記載及びこの請求の範囲に特記されることになる。これらの利点及び他の利点を達成するために、又本発明の目的に従って、態様が示され幅広く記述されるように、本発明はアフリカミドリザルの対をなす腎臓に由来する細胞系を提供するものであって、この細胞系は証明可能な二次微生物病原体(adventitious microbial agents)を含まない。本発明は又、アフリカミドリザルの対をなす腎臓を酵素的に構成要素に分離し、得られた細胞を連続的に培養することにより細胞系を樹立する方法を提供する。さらに、本発明は後にウィルスワクチンの製造に使用することができる細胞系において特定のウィルスを回収して連続的に増殖させる方法を提供する。発明の詳細な説明本発明は一対のアフリカミドリザル腎臓に由来する細胞系を提供するものである。この細胞系は証明可能な生存可能な二次微生物病原体を含まない。さらに、この細胞系はヒト・ロタウィルス、アストロウィルス、エンテロウィルス、呼吸器ウィルス及びＡ型肝炎ウィルスのようなウィルスの生育を維持することができ、そのため、数多くの効果的なワクチンをそのようなワクチンを商業的に成り立つスケールで製造及び処方するのに必要なウィルスを繁殖させるのに有用である。とりわけ、本発明は倍数列の染色体数を持ちメスの Cercopithecusアフリカミドリザルからの対を成す腎臓を酵素的に構成要素に分離することから始まる異数体細胞基体に関する。上記細胞系の寄託は継代 No．13，Lot 6500 としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、12301 パークローン・ドライブ、ロックビル、MD 20852、USA に 11 月４日になされ、受け入れ No．ATCC# CRL 117 56の指定を受けている。本発明は又、アフリカミドリザルからの腎臓を酵素的に構成要素に分離することから始められる少なくとも 30 回の連続継代が可能な細胞基体を樹立する方法を提供する。さらに、本発明はその後のワクチン製造にとって必要な最初の工程である特定のウィルスの回収及び生育を行う方法を提供する。本発明の細胞基体及びその使用には本発明の意図及び範囲から逸れることなく多様な修正及び変更が可能なことは当業者には明らかであろう。従って、本発明は添付の請求項及びそれに相当するものの範囲内にある限りはこの発明の修正及び変更を包含することが意図されている。本発明をこれまでは一般的な形で説明してきたが、一定の実施例を参照することによってより良く理解することができるであろう。但し、これらの実施例は単に例証を目的としており、他に明記されない限りはそれに限定する意図はない。実施例１ AGMK 細胞基体の誘導材料：細胞基体はバルバドスに確立されたコロニーのアフリカミドリザルの腎臓から得た。この細胞は証明できるような生存可能な二次微生物病原体(demonstra tive viable adventitious microbial agents)を含まない。微生物病原体としては細菌、真菌、ミコバクテリア、マイコプラズマ並びにレトロウィルス、フォーミー・ウィルス、HAウィルス、ヘルペス様ウィルス及び多核又は合胞体ウィルスのようなサル病原体が挙げられるが、それらに限定されるものではない。腎臓は通常の酵素的構成要素分離法を用いて処理した。得られた腎臓細胞懸濁液を３個の初代フラスコ［T150 cm²］培養の開始に用い、残りを凍結 #2129として複数のアンプルに分けて液体窒素冷凍器中に凍結保存した。Ａ、Ｂ及びＣとラベルした初代フラスコ培養には、以下のような処理を行った：フラスコＡ：14日目に 1:2に分けた＝ 1-A-1及び 1-A-2、これらのフラスコの一方を28日目に 1:2に分けた＝ 2-A-1及び 2-A-2 フラスコＢ：21日目に 1:2に分けた＝ 1-B-1及び 1-B-2、これらのフラスコの一方を35日目に 1:2に分けた＝ 2-B-1及び 2-B-2 フラスコＣ：分割せず。イーグル最小必須培地（EMEM）+ 5%ウシ胎児血清（56℃、30分間の加熱不活性化）+ 1%グルタミン（200 mM）から成る維持培養液を用いた。フラスコ培養には全て、最初の接種日から起算して９週間の全インキュベーション期間中一週間毎に新しい 100 ml の維持培養液を再供給した。上記培養は血球吸着及び CPE（細胞変性効果）は陰性であり、後者は固定及び染色して顕微鏡試験により測定した。１本のアンプルからマスター・シード・セル・バンク（MSCB）及びマスター・ワーキング・セル・バンク（MWCB）の調製品に至る継代経歴を図１に描く。培養体はクラス100 層流フード中の通常の組織培養体及び／又はワクチン用細胞システムだけを培養している領域内で取り扱った。培養体は 36 ℃± 1℃の温度で1: 4ないし 1:6の分割比を用いて以下の手法を利用して連続継代した：１．細胞薄膜を Ca⁺⁺及び Mg⁺⁺を含まないハンクス緩衝塩類溶液（HBSS）で洗浄した。２．薄膜にトリプシン-EDTA 溶液を加えて 36 ℃± 1℃で 4-5分間インキューベートして構成要素を分離させた。３．薄膜を素早くピペッティングしてばらばらにし、細胞を増殖培地[EMEM + 10 % ウシ胎児血清 + 1% グルタミン]に懸濁して適当なサイズの培養容器中に接種した。 MWCBのひとつのアンプルから製造後試験までの継代経歴を図２に略図で示す。実施例２マスター・ワーキング・セル・バンク - 継代 7A、Lot #4214 の試験１．核型分類及び種同定：継代 7A、Lot 94214 をギムザ・バンド染色体分析法並びに種特異的抗血清反応及びイソ酵素分析により特性決定した。ａ．細胞質特性決定：分裂中期 100個当たりの染色体数の倍数性分布を測定するために通常の染色体染色法（非バンド）を利用した。同定可能なマーカー及び異常型を分裂中期 50 個当たりで分析した。トリプシン−ギムザによる染色体バンド法を核型分類の分析及び特異的染色体マーカーの同定に利用した。種の確認はＧバンドパターン及び染色体形態によって行った。使用した手順はピーターソンら（Peterson，W.D.,Jr.，Simpson，W.F .，and Hukku，B.，「細胞培養特性：細胞同定のためのモニタリング（Cell cul ture characteristics: Monitoring for cell identification）」ジャコビーら (Jakoby，W.B．and Pastan，I.H.)編，Methods in Enzymology 58:164-178,1979 ; 及びシーブライト(Seabright，M.)，「ヒト染色体の高速バンド法（Arapid ba nding technique for human chromosomes)」，Lancet，ii:971-972,1971に述べられているものを修正して用いた。上記細胞系は倍数列の染色体数を持つ異数体のメス Cercopithecus（アフリカミドリ）ザル(XX)と同定された。ほとんどの染色体は正常であり、それぞれ２個のコピーで存在した。正常な染色体Ｄは単染色体性であり、単一のマーカーＤ染色体が観察された。ｂ．細胞培養の種の同定：試験細胞調製品の種特異的抗血清との反応能力を上記のピーターソンら(Peterson et al.)が述べている蛍光抗体法を用いて測定した。上記細胞はサル抗血清とは反応したが、マウス又はハムスターの抗血清とは反応しなかった。ｃ．イソ酵素分析：試験品細胞から酵素調製品を作製した。これらの酵素の電気泳動移動距離を、ハルトンら（Halton，D.M.，Peterson，W.D.,Jr.，and Hukku, B．「高速イソ酵素特性決定による細胞培養品質調整」In Vitro 19:16-24,1983 ；オッテンブライトら（Ottenbreit，M.J.，Halton，D.M.，and Peterson，W.D. ,Jr.，「アガロース電気泳動による細胞培養の高速イソ酵素分析」、Ｉ．種間同定（J．Tissue Culture Methods，6:107-110，1982）；及びII.ヒト細胞系の種内同定」J．Tissue Culture Methods，8:125-130，1986）に述べられている種々の哺乳動物種における酵素の既知の移動距離と比較した。上記試験細胞から調製した抽出物中に存在する酵素類：グルコース -6-リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PD)、ヌクレオシド・ホスホリラーゼ(NP)、マレイン酸デヒドロゲナーゼ(MDH)及びラクテート・デヒドロゲノーゼ(LDH)の電気泳動移動度はセルコピテカス(Cercopithecus)（アフリカミドリ）ザル対照細胞調製品のそれに匹敵するものであった。上記細胞培養のもの以外の種の細胞の存在を示唆するようなそれ以外のバンドは電気泳動フィルム上には観察されなかった。提示培養体(MWCB、継代 7A 、Lot# 4214)のもの以外の細胞はイソ酵素分析又は細胞質評価のいずれによっても上記培養体中には検出されなかった。２．レトロウィルスの検出ａ．電子顕微鏡検査によるレトロウィルス粒子の検出：試験品細胞(MWCB、継代 7A、Lot# 4214)の細胞ペレットを調製して透過型電子顕微鏡でウィルス粒子を調べた。観察した 200細胞中にレトロウィルス様の粒子は見られなかった。ｂ．DNA-依存性 DNAポリメラーゼの存在下におけるレトロウィルス逆転写酵素の検出：試験品(MWCB、継代 7A、Lot# 4214)をＢ、Ｃ及びＤ型のレトロウィルス逆転写酵素並びに細胞性 DNAポリメラーゼ活性の存在について分析した。レトロウィルス逆転写酵素が存在する証拠は観察されなかった。結果を表Ｉ−Ａ、Ｂ及びＣに示す。実施例３製造後細胞試験１．核型分類及び種同定：継代 17A、Lot #4706 のAGMK細胞をギムザ・バンド染色体分析法並びに種特異的抗血清反応及びイソ酵素分析により特性決定した。上記細胞は低二倍体ないし高二倍体範囲の染色体数を持つ異数体のメスセルコピテカス(Cercopithecus)（アフリカミドリ）ザル(XX，XXX)と同定された。検査した全ての核型が単一の正常セルコピテカス(Cercopithecus)サル・マーカー染色体（グループＤ）及び第二の部分欠損セルコピテカス(Cercopithecus)サルＤグループ・マーカー染色体を含んでいた。上記試験細胞から調製した抽出物中に存在する酵素類：G6PD、NP、MDH 及びLD Hの電気泳動移動度はセルコピテカス(Cercopithecus)（アフリカミドリ）ザル対照細胞調製品のそれに匹敵するものであった。上記細胞培養体中の異なる種の細胞の存在を示唆するようなそれ以外のバンドは電気泳動フィルム上には観察されなかった。上記細胞はサル抗血清と反応したが、ネズミ抗血清とは反応しなかった。提示培養体(継代 17A、Lot# 4706)のもの以外の細胞は抗血清反応、イソ酵素分析又は細胞質評価のいずれによっても上記培養体中には検出されなかった。染色体パターンは MWCB、継代 7A 、Lot# 4214 の細胞に先に観察されたものに類似しており、これらの細胞(継代 17A、Lot# 4706)を前者に明確に関連付けるものであった。２．レトロウィルスの検出ａ．試験品、AGMK 継代 17A、Lot# 4706 をＢ、Ｃ及びＤ型のレトロウィルス逆転写酵素並びに細胞性 DNAポリメラーゼ活性の存在について分析した。細胞は30 μg/mlブロモデオキシウリジンの存在下で 24 時間（０日目及び１日目）生育させ、誘導物質を含まない培地を再供給した。培養液（非濃縮及び20倍濃縮）を２、３及び４日目に採収した。レトロウィルス逆転写酵素活性が存在する証拠は上記試験品中には観察されなかった。結果を表II−Ａ、Ｂ及びＣに示す。ｂ．電子顕微鏡検査によるレトロウィルス粒子の検出検査：４日目に採収した処理済及び未処理培養体から細胞ペレットを調製して透過型電子顕微鏡でウィルス粒子の存在を検査した。観察した 200細胞中にレトロウィルス様の粒子は見られなかった。ｃ．試験品（AGMK、継代 17A、Lot# 4743）におけるサル T- 向リンパ球(lympho tropic)ウィルス(STLV)のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法による検出：ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、増幅させないと検出することができないような非常に少数のウィルス性核酸配列を検出する方法を提供するものである。プレPCR逆転写酵素工程と組み合わせると RNA配列を増幅することができ、遊離のウィルスの検出が可能になる。使用したプロトコールは DNA又は RNA 由来の STLV-特異的配列の増幅ができる。この PCT産物をサザン・ブロッティングにより化学ルミネセンス酵素結合プローブのブロットへのハイブリダイゼーションを用いて試験した。 STLV polプライマー SK110/SK111を用いて試験した場合、STLV- 特異的産物はそれぞれが上記試験品から抽出した核酸 1.0μg である試験品反応液中には検出されなかった。STLV(STLV_mn103)を感染させた細胞系から抽出した 0.001μg 、0 .01μg 、0.1 μg 又は 1μg 当量の核酸を含む陽性対照系列では、STLV- 特異的産物は全ての反応液中に検出された。STLVプライマーとの反応性が検出されなかったということに基づいて、上記試験品は STLV 核酸配列に関しては陰性であると判定された。ｄ．試験品(AGMK、継代 18A、Lot# 5506)におけるサル免疫不全ウィルスの検出：全細胞DNA を上記試験品から抽出した後 LTRの 200 bp フラグメントを増幅するプライマーを用いて SIV_agmウィルス配列の存在について試験した。これには以下のようなネスティッド・セットのプライマーを用いるPCR が含まれた：これらのプライマーは LTRの保存されている U5 及び R領域用に設計されており、SIV_agmの全てのサブタイプを増幅することができる。予測された 200 bpフラグメントが慢性-SIV_agm感染細胞系（SIV_agm115CEM_ss）から抽出したDNAから増幅されたが、アフリカミドリザル細胞はサザンブロット分析で検出できるSIV_agm 配列を持たなかった。３．無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍形成性上記細胞は 150日間の臨床評価の後に腫瘍形成性を持たないことがわかった。無胸腺ヌードマウスに約１ｘ10⁷試験品細胞(AGMK、継代 17A、Lot# 4889)を皮下接種した。同様に無胸腺ヌードマウスに陽性対照細胞を接種した。陽性対照を接種したマウスは10匹全てについて接種部位に腫瘍が生じた。上記試験品を接種したマウスの接種部位（皮膚）、肺、リンパ節、肝臓、腎臓、脾臓又は脳に転移は観察されなかった。実施例４製造後の微生物無菌テスト１．液体チオグリコレート培地中における細菌に関する無菌状態：10本の培養試験管（１試験管当たり 9-10 mlの培地）のそれぞれに、およそ 5 x 10⁵細胞/ml を含む AGMK 細胞懸濁液（継代 17A、Lot# 4706）1.0 ml を接種した。５本の試験管にはそれぞれ元の増殖培地 1.0 ml を接種した。非接種対照として 10 個の培養体を用いた。全培養体をボルテックスで混合して 32 ℃±2 ℃で 21 日間インキュベートして、１、３、６、８、10、13、15、17、20及び21日目に観察した。25個の培養体のいずれにも生育は観察されなかった。２．大豆カゼイン分解培地中における真菌に関する無菌状態：10本の培養試験管 (１試験管当たり 9-10 mｌの培地)のそれぞれに、およそ 5 x 10⁵細胞/ml を含む AGMK 細胞懸濁液（継代 17A、Lot# 4706）1.0 ml を接種した。５本の試験管にはそれぞれ元の増殖培地 1.0 ml を接種した。非接種対照として 10 個の培養体を用いた。全培養体をボルテックスで混合して 22 ℃±2 ℃で 21 日間インキュベートして、１、３、６、８、10、13、15、17、20及び21日目に観察した。25 個の培養体のいずれにも生育は観察されなかった。３．ローエンステイン−ジェンセン卵培地中におけるマイコバクテリアに関する無菌状態：10本の斜面培養試験管のそれぞれに、およそ 5 x 10⁵細胞/ml を含む AGMK 細胞懸濁液（継代 17A、Lot# 4706）0.5 ml を接種した。10本の斜面培養にはそれぞれ元の増殖培地 0.5 ml を接種した。非接種対照として６個の培養体を用いた。全培養体を 36 ℃±1 ℃で最初の24時間は水平にしてインキュベートし、８週間の観察期間の残りの期間は垂直にしてインキュベートし、１週間毎に生育を観察した。28 日目に細胞懸濁液を接種した培養体１本にカビの混入が見出された。８週間の後、残りの 25 本の培養体のいずれにも生育は観察されなかった。このアッセイは AGMK 継代 18A、Lot# 4918 で反復したが、元の増殖培地を接種した斜面培養は６本用いた。８週間の後、22本の培養体のいずれにも生育は観察されなかった。以上の微生物無菌アッセイの結果は表III に要約する。４．マイコプラズマに関する無菌性：マイコプラズマに関するアッセイをおよそ 5 x 10⁵細胞/ml を含む AGMK 細胞懸濁液(継代 17A、Lot# 4706)を用いて直接的ブロス・エンリッチメント寒天法及び間接的指標細胞培養法の両方によって行った。この細胞懸濁液はマイコプラズマに関して陰性であることが全方法により見出された。実施例５生存可能な二次微生物病原体の検出に関する In Vitro 組織培養純度及び安全性試験これらのアッセイは以下の組織培養系の試験管回転培養によって行った：連続継代アフリカミドリザル腎臓(AGMK);初代ヒト羊膜(PHA)；Vero；初代ウサギ腎臓 (PRK)；全ヒト胎児線維芽細胞(F1 5000);及びヒト咽頭癌(H.Ep-2)。培養は2-10% のウシ胎仔血清（ガンマ照射）プラス抗生物質：ゲンタマイシン,100μg/ml；ネオマイシン,50 μg/ml；及びフンギゾン，2.5 μg/mlを含む EMEM 培地上で維持した。接種前に 2 ml の維持培地を培養体に再供給した。試験手順：細胞懸濁液（およそ 5 x 10⁵細胞/ml を含むLot #4742/3 、#4755 又は #4889）を各組織培養系当たり 28 本の回転式試験管のそれぞれに0.5 mlずつ接種した。培養体を 36 ℃±1 ℃で 14日間インキュベートし、何らかの細胞変性効果(CPE)及び／又は細胞変質について定期的に顕微鏡検査を行った。細胞薄膜の統合性を維持するために必要な場合には、2 ml の新しい維持培地を培養体に再供給した。各組織培養系当たり 28 本の回転式試験管からなる別のグループを非接種対照として用いた。インキュベーションの７−８日目に、各系列（接種及び対照）から６−９本の試験管を取り出し、３種類の赤血球(RBC)懸濁液（PBS，pH 7.2 中のモルモット0 .1%、ニワトリ 0.075%、又はヒト 0.1%)による血球吸着を試験した。リン酸緩衝食塩水(PBS)で薄膜を１回すすいだ後、RBC 当たり２−３本の試験管を用いて RB C懸濁液１ml を加えた。最初に、最低 30 分間２℃−８℃でインキュベートして何らかの血球吸着の兆候を顕微鏡で検査した。手で振って攪拌した後、試験管を最低 30 分間35℃−37℃でインキュベートして血球吸着を顕微鏡で再検査した。３種類の懸濁液及び両方の温度とも、全ての培養体が血球吸着に関して陰性であった。14日目に最終顕微鏡試験を行った後、最終試験用に特定の組織培養系に応じて培養体を分けた。AGMK、PHA 及び F15000 試験管培養体は以下のように分けた：１．各系列から９本の試験管は上記のように７−８日目に３種類のRBC 懸濁液で血球吸着を試験した；２．各系列から４本の試験管は 5% グルタルアルデヒド＋0.025%クリスタルバイオレット溶液で固定及び染色し、乾燥させた後、何らかのCPE の兆候について顕微鏡で検査した；３．各系列から８本の試験管は干渉現象を通じて非-CPE発現病原体及び／又は潜伏病原体を検出するためにコクサッキー A-9ウィルス(10^-2、10^-3、10^-4又は10^- ⁵ 希釈液を用いて各２試験管ずつに 0.2 ml)で攻撃(challenge)した；さらに４．各系列から１本の試験管をウィルス攻撃用の非接種対照として用いた。 Vero、PRK 及び H.Ep-2 試験管培養体は以下のように分けた：１．各系列から12本の試験管は上記のように７−８日目に３種類のRBC 懸濁液で血球吸着を試験した：２．各系列から７本の試験管は 5% グルタルアルデヒド＋0.025%クリスタルバイオレット溶液で固定及び染色し、乾燥させた後、何らかのCPE の兆候について顕微鏡で検査した。コクサッキー A-9ウィルスによる攻撃試験は、この病原体がこれらの細胞系においては認知できるような CPEは全く発現しないので行わなかった。これらのin vitro 組織培養純度及び安全性アッセイの結果を表IV-ＡからＦに要約する。実施例６生存可能な二次微生物病原体を検出するための In Vivo試験継代 17A（Lot #4706、#4742、#4755 及び #4788）に由来する細胞懸濁液を用いて以下の試験を行った。これらのアッセイはそれらが生育してきた培地中に懸濁したおよそ 1 x 10⁷細胞/ml から成る接種体を用いて行った。１．動物試験ａ．幼マウス・アッセイ：異なる同産（母獣当たり10匹）からランダムに選んだ全部で10匹の新生 CD-1 マウス（24時間齢未満）にLot #4706からの細胞懸濁液を大脳内（I.Cer.）に 0.01 ml、及び腹腔内（I.P.）に0.1 ml 接種した。10匹の幼獣から成る別のランダム抽出グループに抽出グループに同様の方法で元の培地を接種した。10匹の幼獣から成るランダム抽出グループを非接種対照として用いた。全ての幼獣を14日間、死亡及び／又は病気若しくは苦痛の兆候について毎日観察した。２日目に、各接種グループから１匹の幼獣が行方不明となり、共食いされたものと見なした。他に死亡は見られず、いずれの幼獣もこの最初の14日間の観察期間中病気又は苦痛の兆候は示さなかった。 14日目に、以下のグループの乳化組織（皮膚及び内蔵を除く）のプールを１つずつ調製した：(a)AGMK接種若獣(n=9)；(b)培養液接種若獣(n=9)；及び(c)非接種対照（n=10）。I.Cer.及び I.P．経路を通じて各プールによる新生 CD-1マウスへのブラインド継代を行った：各プールを混合同産からの新生児 10 匹に用いた。10匹の幼獣から成る別の同産をこのブラインド継代の非接種対照として用いた。全ての幼獣を14日間、死亡及び／又は病気若しくは苦痛の兆候について毎日観察した。AGMK若しくは培地接種若獣又は非接種対照グループに死亡記録はなかった：しかしながら、３日目に(c)継代対照グループで４匹の幼獣が行方不明となり、共食いされたものと見なした。他の幼獣はこの最後の14日間の観察期間中病気又は苦痛の兆候は示さなかった。 AGMK細胞懸濁液又は培地接種幼獣は１匹も、伝染性病原体又はコクサッキー・ウィルス感染若しくは他のウィルス感染の兆候を示さなかったこと、さらにこれらの接種幼獣の＞90%（20 匹中19匹）が観察期間全体を通じて健康を維持して生存したことから、幼マウスでのこのアッセイは満足できるものと考えられた。ｂ．成獣マウス・アッセイ：20匹の成獣 CD-1 マウス（VAF 、各 15-20グラム）に細胞懸濁液 Lot #4788を I.Cer．で 0.03 ml、及び I.P．で 0.5 ml をそれぞれ接種した。別の５匹のマウスに同様の方法で元の培地を接種した。４匹のマウスを非接種対照として用いた。マウスを21日間、死亡及び／又は病気若しくは苦痛の兆候について毎日観察した。死亡記録はなく、全マウスが 21 日間の観察期間全体を通じて生存し、リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス感染又は他のウィルス感染の証拠は見られなかった。成獣でのこの試験は満足できるものと考えられた。ｃ．成獣モルモット・アッセイ：５匹のハートレイ系モルモット（VAF、各350-4 50 グラム）のそれぞれに細胞懸濁液 Lot #4755を I.Cer．で 0.1 ml、及びI.P ．で 5.0 ml をそれぞれ接種した。別のモルモットに同様の方法で元の培地を接種した。モルモット１匹を非接種対照として用いた。全動物を６週間、死亡及び／又は病気若しくは苦痛の兆候について毎日観察したところ、何も記録されなかった。21日目に開始して屠殺する時まで、全モルモットについてデジタル温度計で直腸内温度を測定して記録した（およそ 0900 時間）。AGMKを接種したモルモットでの平均温度（℃）は 39.26、39.30 、39.40 、39.46 及び 39.53；培地接種モルモットでは 39.32；対照では 39.37であった。細菌又はウィルスのいずれかの感染を示す有意の温度上昇はなかった。全てのモルモットは外観上健康であり、42日間の観察期間全体を通じて生存したが、その時点でハロタンによる麻酔及び放血の後に剖検した。顧問獣医による腹腔及び胸腔の視診から大きな病変又は病的変化は確認されなかった。成獣モルモットでのこのアッセイは満足できるものと考えられた。ｄ．成獣ウサギ・アッセイ：ニュージーランド白ウサギ（各 1500-2500 g）にAG MK 細胞懸濁液 Lot #4788を皮内（I.D.）の 10 カ所にそれぞれ 0.1 ml、及び皮下（S.Q.）に 9.0 ml をそれぞれ接種した。１匹のウサギに同様に元の培地を接種した。１匹のウサギを非接種対照として用いた。動物を28日間、死亡、病気、苦痛及び／又は接種部位の病変について毎日観察した。死亡記録はなく、全ウサギが病気若しくは苦痛又は接種部位の病変のいずれの兆候も示すことなく健康であった。成獣ウサギでのこの試験は満足できるものと考えられた。これらの in vivo動物安全性試験の結果を表Ｖ−Ａ及びＢに要約する。２．発育卵における試験これらの研究を行うために、特定病原体を含まない発育卵を SPAFAS 社、レインホールズ、PAから入手した。これらの卵は Flock L061-E 産であった。ａ．尿膜腔接種：10日齢の発育卵に尿膜経路から 0.5 ml の AGMK 懸濁液 Lot # 4706を接種した。別の５個の卵に同様の方法で元の培地を接種した。５個の卵を非接種対照として用いた。卵を 36 ℃± 1℃で 72時間インキュベートした後、明かりに透かして死亡例を調べ（培地接種の５例のうち１例）、2-8 ℃で一晩冷蔵した。尿膜液を個々に採収し、37℃の水浴上で 60 分間インキュベートして吸着している病原体を溶離し、20℃で 15 分間、2500 rpmで遠心して不純物を除去した。個々の各採収液から同じ容量を用いて３組の卵のそれぞれについてプールを調製した。このプールを PBS（pH 7.2）中の以下の赤血球：モルモット(0.6%) ; ニワトリ(0.4%); 及びヒト(0.6%)を用いて 2-8℃及び室温(15-30℃)でインキュベートして非希釈及び 1:10 希釈の両方について血球凝集をアッセイした。全ての液体が両方の希釈状態及び両方の温度において３種類の RBC懸濁液の全てについて血球凝集は陰性であった。サンプル・プールを 0.5 ml の量で 10 日齢の発育卵中に尿膜経路から以下のように二次継代した：AGMK細胞懸濁液接種グループからのプールを卵 10 個中に；培地接種グループからのプールを卵５個中に；及び非接種卵からのプールを卵５個中に。さらに５個の卵を非接種対照として用いた。これらの卵を 36 ℃±1 ℃で 72時間インキュベートした後、明かりに透かして死亡例を調べ（死亡記録なし）、2-8 ℃で一晩冷蔵した。尿膜液を採収し、上記のように処理して試験した。４種類のプール全てが両方の希釈状態及び両方の温度において３種類のRBC 懸濁液の全てについて血球凝集は陰性であった。 AGMK細胞懸濁液を接種した卵のいずれにも死亡は記録されなかった。採収液はいずれもモルモット、ニワトリ及びヒトのRBC に対して試験した際に血球凝集を示さなかったので、発育卵における試験はこの点において満足できるものと考えられた。ｂ．卵黄嚢接種：10個の６日齢発育卵のそれぞれの卵黄嚢中に 0.5 ml の AGMK 細胞懸濁液 Lot #4742を接種した。５個の卵に同様の方法で元の培地を接種し、５個の卵を非接種対照として用いた。卵は 36 ℃［± 1℃］で９日間インキュベートし、定期的に明かりに透かして死亡例を調べた。培地接種卵のうちの２個が死亡し（２日目及び５日目に各１個）、AGMK接種卵のうち２個が不注意から壊れた。他に死亡または損失は記録されなかった。各グループの卵黄嚢（AGMKグループ = 8; 培地グルーブ = 3; 対照 = 5）を採収してプールし、PBS で洗浄して、すりつぶして乳化し、20℃で20分間、2500 rpmで遠心して不純物を除去した。３種類の浄化した懸濁液を同じ経路から新たな６日齢の発育卵中に以下のように二次継代した：AGMKグループから卵 10 個中に；培地グループから卵５個中に；対照グループから卵５個中に。さらに５個の卵を非接種対照として用いた。これらの卵は全て 36 ℃± 1℃で９日間インキュベートし、定期的に明かりに透かして死亡例を調べた。７日目に３個の卵が死亡していることがわかった；２個は AGMKグループからのもので１個は培地グループからのものであった。他に死亡齢は記録されなかった。 AGMK細胞懸濁液を接種した（初代継代及び二次継代）発育卵の全体のうち80% 以上（18個中16個）が生存し、卵の生育力が確認されたために、発育卵における試験はこの点において満足できるものと考えられた。実施例７ (1) ヒト・ロタウィルス類の単離及び生育；及び(2)そのようなウィルスを含む生ワクチンの製造；を目的とした特性決定された AGMK 細胞基体の使用 AGMK細胞は現在までに試験されて、ワクチン目的に適しており且つ完全に相同なヒト・ロタウィルス類、すなわち、その 11 個の遺伝子セグメントがそれぞれヒト・ロタウィルスに由来しているロタウィルス類の効率的な生育を維持する唯一の特性決定された細胞である。表Ｖに示すものを含めて幾つかの相同なヒト・ロタウィルス・ワクチン株の候補となるものが現在開発中であるためにこれは特に重要である。表Ｖに示されるように、新生児から採収されたＧ血清型１又はＧ血清型３の２種類のヒト・ワクチン・ロタウィルス候補は AGMK 細胞中でやや高い又は高い力価で生育することが観察されたが、これらの新生児ロタウィルス株はそれぞれ、ワクチン製造に認定されている２つの型の細胞、すなわち FRhL₂又は Vero 細胞中では生育力が著しく制限されていた。さらに、これらの新生児ロタウィルス株の一つはワクチン製造用の認可を受けているヒト胎児線維芽細胞株MRC-5 中における複製能力も著しく制限されていた。同様の観察が、生ウィルスワクチン株の有望な候補であるヒト・ロタウィルスのＧ血清型１又はＧ血清型２の２種類の低温適応(ca)変異体についても得られた。これらのヒト・ロタウィルス変異体は AGMK 細胞中では効率よく生育したが、認定細胞 FRhL₂及び Vero 中では生育が有意に又は著しく制限された。Ａ．ヒト新生児ロタウィルス株の単離及び連続継代最初に、試験を行う AGMK 細胞に対して、新たに調製した各精製トリプシンの毒性を測定した。既知の陽性糞抽出液を室温で 60 分間、抗生物質（200 μg/ml ゲンタマイシン; 100 μg/mlネオマイシン; 及び 5μg/mlフンジゾン）で前処理した。予め決められた濃度、例えば 10 μg/mlのトリプシン及び糞抽出液の等容量を混合して水浴中で 30 分間インキュベートさせた。その間に、血清成分がトリプシン活性を不活性化するのを防ぐために、接種する培養体を適当な容量（例えば、回転式試験管には 3 ml、T25 フラスコには 10 ml、T75 フラスコには30 ml及び T175 フラスコには 100 ml)の血清フリー培地で３回洗浄して増殖培地中に存在した血清を希釈する。回転式試験管培養物に 0.5 ml 容量の糞／トリプシン混合液を接種して、36℃ ± 1℃で 60 分間回転ドラム装置で回転させて吸着させる。培養物を１回洗浄して、１% の 10X SPG(スクロース，2.18 M; KH₂PO_4, 0.038 M; K₂HPO_4, 0.072M; 及びグルタミン酸１ナトリウム，0.054 M)及び 1μg/mlトリプシンを含むEMEM を 3 ml 加えた。トリプシン効果の対照を取るためにトリプシンを除いた細胞培養物も用いた。インキュベーションは36℃± 1℃で行う。培養物を基本的に毎日顕微鏡で検査し、75ないし 100% の細胞に細胞変性効果 (CPE)が明らかになった時点で培養物を採収する。ウィルス及び対照培養物を同様に 10%の 10X SPG(v/v)で処理し、採収前に１回の凍結−解凍サイクルにかけ、無菌テスト、貯蔵用分配、及び連続継代を行う。その後の継代は全て、前処理及び最終的な被覆の両方におけるトリプシン濃度を変える以外は同様の方法を用いて回転式試験管培養又は 25 cm²フラスコ培養のいずれかで行う。その後のワクチン開発に用いる均質集合のウィルスを得るためのプラーク精製をウィルスに行うことができるような、AGMK 細胞中でウィルスプラークを製造する効率的なシステムを当技術分野で日常的な方法を用いて作りだす。採収した液をサル MA-104 細胞中で通常の方法で力価測定し、得られたウィルス収量を測定する。その後ウィルスを AGMK 細胞中で３回プラーク精製して、得られたクローンを順次大きな組織培養容器を用いて連続継代して増幅する。単離クローンの後代について、前処理及び最終的な被覆の両方に用いたトリプシン濃度に基づいて最大収量が得られる条件を当技術分野で周知の方法を用いて決定する。Ｂ．ヒト新生児ロタウィルス又は他のヒト・ロタウィルス株の適応化及び連続継代ヒト・ロタウィルス類は非常に狭い組織培養宿主範囲しか示さない。そのため、種々の株の単離及び連続継代はサル MA-104 又は初代サル腎臓のような市販の実験用細胞培養体中で通常行われるが、これらは両方ともワクチン製造には適していない。前者の細胞はワクチン製造用の基体として確認されておらず、後者の細胞はレトロウィルスを含む多様なサル微生物病原体が混入していることがよく知られている。MA-104又は初代サル腎臓細胞に対して、サル FRhL₂及び Vero 細胞のようなワクチン製造に認定されている細胞基体は完全に相同なヒト・ロタウィルスの生育を維持することができないか又はごくわずかな生育しか行えないかのいずれかである。よく特性決定された多くのロタウィルスが、ワクチン製造に適していない市販の実験用細胞培養系において単離、連続継代及び３回プラーク精製されている。ワクチン開発にこのようなウィルスを使用する必要がある例では、その後ワクチン開発及び製造に認定されている細胞基体中でウィルスを継代及び生物学的クローニングした。典型的には、ワクチンに使用するウィルスはワクチン製造の条件に合うと認定された組織培養細胞中でのみ単離及び継代するべきである。本発明の AGMK 細胞は完全に相同なヒト・ロタウィルスの効率的な生育を維持するのでこの必要条件を満たしている（表Ｖ）。ワクチンを開発するための日常的な試験は前処理及び最終的な被覆の両方に必要なトリプシン濃度を含む最大収量が得られる条件を決定するためにフラスコ培養で行われる。ワクチンウィルスの AGMK 細胞基体への適応化が達成されたら、採収したウィルスをエーテルで処理して（エーテル１に対してウィルス懸濁液４の割合で室温で 60 分間置いた後に 30 分間 N₂をバブリングしてエーテルを飛ばして）元の臨床種に存在したか又はワクチン開発に着手する以前に細胞培養体を継代する間に後で得られたエーテル感受性ウィルスを除去する。生ウィルスワクチン及び／又は懸濁液製造ワクチンを製造するには、以下のようにウィルスのバックアップ・プールを幾つか調製することも好ましい：１．初代種ウィルスプール：ウィルス及び、10% 10X SPG(v/v)を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製し、無菌性を確認して効力を測定した後、この液体を少量のアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵して、最終的なワクチン製造の第３レベルバックアップとして用いる。全量で 30 mlないし 100 ml の範囲でよい。２．二次種ウィルスプール：ウィルス及び、10% 10X SPG(v/v)を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製する。無菌性を確認して効力を測定した後、この液体を少量のアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵して、最終的なワクチン製造の第２レベルバックアップとして用いる。全量で 100 ml ないし 300 ml の範囲でよい。３．マスター種ウィルスプール又は製造前種ウィルスプール：ウィルス及び、10 % 10X SPG(v/v)を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製する。無菌性を確認して効力を測定し、血清学及び電気泳動パターンの両方によって同一性を確認した後、この液体を複数のサイズのアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵する。これらのプールは最終的な製造の第１レベルバックアップとして用いる。これらの液体はワクチン・ロットと同時に組織培養純度（安全性）試験にかける。全量で 500 ml ないし 1リットルの範囲でよい。４．生ウィルスワクチン製造：製造する容量は必要な用量及び容器の数を基準として、安全性試験用の粗液体として最低 400 ml をプラスする。ウィルスプールの他に、継代組織培養対照液の少量プール（200 - 400ml）を作って粗ウィルス採収物と共にその後の安全性試験にかけることが勧められる。10% 10X SPG(v/v) を添加した培養容器液を個々の採収及び無菌試験の前に１回の凍結解凍サイクルにかける。サンプルプールを調製して効力をアッセイする。血清学及び電気泳動パターンの両方によって同一性を確認する。個々の採収物を -70℃以下で貯蔵する。無菌性、効力及び同一性が確認されたら、粗採収物を解凍してプールする。約 400 ml のサンプルを安全性試験用に取り出す。残りの液体は５℃で 20 分間、1200 gで遠心して不純物を除去し、再プールして、最終容器中に分配する。実施例８ヒトx 動物リアソータント・ロタウィルスの特性決定された AGMK 細胞基体中における生育及び連続継代への適応化、並びにそのような細胞の生ウィルスワクチン製造への使用弱毒化ロタウィルス生ワクチンは、その11個の遺伝子セグメントのうち10個が動物の親ロタウィルスに由来し、わずか１個の遺伝子セグメント（通常、主要な防御抗原VP7 をコードする遺伝子）がヒトの親ロタウィルスに由来するリアソータント・ロタウィルスを使用して作ることができる。一例として、ヒトxアカゲザル・ロタウィルス・リアソータントはワクチン開発の終わりの段階にあり、認可の申請が FDAに提出されている。現在までに研究されているヒトx動物リアソータント・ロタウィルスのワクチン候補は全て非常に幅広い組織培養宿主範囲を示しているが、これはリアソータントに11個の遺伝子セグメントのうち10個を与えている動物の親ロタウィルスに帰するものといえる。これらのワクチン候補リアソートメントはワクチン製造に認定されている他の細胞系でも高い力価で増殖することができるが、AGMK細胞基体での比較試験から AGMK 細胞基体はいずれの試験例でもウィルス生育収量において FRhL2よりも有意に優れていたことが示されている（表Ｖ）。さらに、AGMK 細胞基体はアカゲザル・ロタウィルス自身と同様にヒトxアカゲザル・ロタウィルス・リアソータントの生育については Vero 細胞よりも優れていることが分かっている（表Ｖ）。これらの例では、RRV 及びそのヒト・ロタウィルス・リアソータントは AGMK 細胞系においては FRhL2細胞におけるよりも 16-から 100- 倍高い力価に、また Vero 細胞におけるよりも 10-から 1200-倍高い力価まで生育した（表Ｖ）。AGMK 細胞基体が Vero 細胞よりも優れていなかった唯一の例としてこの二つの細胞系におけるウィルス生育収量が等しいヒトxウシ・ロタウィルス・リアソータントが挙げられた（表Ｖ）。収量に加えて AGMK 細胞基体には他の利点がある：(a)トリプシンによるウィルスの前処理が不必要なこと；(b)増殖培地中に必要なトリプシンの濃度が低いこと；(c)接種体に必要なウィルスの量が非常に少ないこと；(d)インキュベーション時間が短縮されること；及び(e)感染細胞の単層が完全に溶解されること。ワクチン製造は上に概説されているように行う。実施例９ヒト・アストロウイルスの特性決定された AGM K細胞基体中における生育、連続継代及びそれに続く生ウィルスワクチン製造への適応化これまでに、ヒト・アストロウィルスが単離又は増殖されているのは全てワクチン製造に不適当又は許容できない細胞中においてである。ヒト・アストロウィルスの２型株がサル LLCMK₂細胞系中で生育した種ウィルスから AGMK 細胞基体中における生育及び連続継代にうまく適応化された。AGMK 細胞内生育ウィルスのフラスコ培養物を研究して前処理及び最終的な被覆の両方に使用するトリプシン濃度に基づく最大収量を得るための最適条件を調べた。適応化が達成されたら、採収したウィルスをエーテルで処理して（エーテル１に対してウィルス懸濁液４の割合で室温で 60 分間置いた後に 30 分間 N₂をバブリングしてエーテルを飛ばして）市販の実験細胞培養システム中に継代及びプラーク化の間に取り込まれていることがあるエーテル感受性シミアン・ウィルスを除去した。液体製造はヒト・ロタウィルスについて概説したものと同様に行った。実施例10 弱毒化生ポリオウィルスワクチン株の特性決定された AGMK 細胞基体中における増殖セービン弱毒化経口ポリオウィルス生ワクチン株を 15 及び 16 継代してAGMK 細胞中で生育させた。各ワクチン株は AGMK 細胞中で高い力価に生育した(１型ウィルス 10^8.3TCID₅₀/ml、２型ウィルス 10^8.1TCID₅₀/ml、及び３型ウィルス 1 0^8.6TCID₅₀/ml)。これらの力価は組織培養採収物１ml 当たり 100から1000 ワクチン用量に言い換えられ、認可されている初代 AGMK 細胞及び MRC-5細胞によって製造されるウィルス量に等しい。実施例11 特性決定された AGMK 細胞基体中におけるエンテロウィルスの単離並びに／又は生育、連続継代、それに続く生ウィルス懸濁液及び／若しくはワクチン製造への適応化コクサッキー A9 ウィルスのようなエンテロウィルスを特性決定された AGMK 細胞中での生育及び連続継代に適応させた。これらの細胞を生ウィルス懸濁液及びワクチンの製造に使用した。幾つかの種ウィルス・プールを作った。生ウィルスワクチン及び／又は懸濁液製造１．初代種ウィルスプール：ウィルス及び、10% 10X SPG(v/v)を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製し、無菌性を確認して効力を測定した後、この液体を少量のアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵して、最終的なワクチン製造の第３レベルバックアップとして用いる。全量で 30 mlないし 100 ml の範囲でよい。２．二次種ウィルスプール：ウィルス及び、10% 10X SPG(v/v)を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製する。無菌性を確認して効力を測定した後、この液体を少量のアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵して、最終的なワクチン製造の第２レベルバックアップとして用いる。全量で 100 ml ないし 300 ml の範囲でよい。３．マスター種ウィルスプール又は製造前種ウィルスプール：ウィルス及び、10 % 10X SPG(v/v)を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製する。無菌性を確認して効力を測定し、血清学的に同一性を確認する。この液体を複数のサイズのアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵する。これらのプールは最終的な製造の第１レベルバックアップとして用いる。これらの液体をワクチン・ロットと同時に組織培養純度（安全性）試験にかける。全量で 500 ml ないし１リットルの範囲でよい。４．生ウィルスワクチン製造：製造する容量は必要な用量及び容器の数を基準として必要な安全性試験用の粗液体として最低 400 ml をプラスする。ウィルスプールの他に、継代組織培養対照液の少量プール（200 - 400 ml）を作って粗ウィルス採収物と共にその後の安全性試験にかけることが勧められる。10% 10X SPG( v/v)を添加した培養容器液を個々の採収及び無菌試験の前に１回の凍結解凍サイクルにかける。サンプルプールを調製して効力をアッセイし、血清学的に同一性を確認する。個々の採収物を -70℃以下で貯蔵する。無菌性、効力及び同一性が確認されたら、粗採収物を解凍してプールする。約 400 ml のサンプルを安全性試験用に取り出す。残りの液体は５℃で 20 分間、1200 gで遠心して不純物を除去し、再プールして、最終容器中に分配する。実施例12 特性決定された AGMK 細胞基体中における呼吸器合胞体ウィルス(RSV)の単離並びに生育及び連続的増殖への適応化；並びに生ウィルスワクチン製造へのこれらの細胞の使用サブグループＡ及びＢ型の呼吸器合胞体ウィルスはヒトの鼻及び／又は咽頭の分泌物から直接これらの AGMK 細胞培養体中ですでに単離されている。試料を30 00 rpm で 10 分間遠心して微粒子物質を除去した後、室温で60分間、抗生物質（200 μg/mlゲンタマイシン; 100 μg/mlネオマイシン; 及び 5μg/mlフンジゾン）で処理する。抗生物質で処理した試料を試験管回転培養の AGMK 細胞中に接種し、36℃± 1℃で回転ドラムを用いてインキュベートする。細胞変性効果が明らかになったら、培養物を採収し、さらに回転式試験管又はフラスコ培養のいずれかによって継代して連続継代及びプラーク精製を行う。その後、ウィルス変異体を化学的突然変異誘導によって作りだすか又はどちらかの例の AGMK 細胞を使用して最適条件に及ばない温度条件で継代することによって選択する。次いで生ウィルスワクチンを AGMK 細胞を用いて調製する。 AGMK 細胞中で生育した弱毒化RSV 生ワクチン株候補の最終ウィルス収量は、最も効率的な細胞基体として先にRSV ワクチン製造に認定されている Vero 細胞中で生育したこれらのウィルスよりも多かった。表VIに、低温継代された温度感受性 RSV変異体（RSV A2 cpts248/404と呼ばれる）のウィルス収量が Vero 細胞中におけるよりも AGMK 細胞系におけるほうが 4- ないし 16-倍高いことを示す例が見られる。又、ウィルスワクチン製造での使用が認可されているヒト胎児二倍体細胞系 MRC-5により製造されるRRV の量は AGMK 細胞中におけるよりも 10- ないし 100- 倍少ない。この変異体は高度に弱毒化されているが、それでもなお、感染を受ける動物であってヒトでの臨床試験を開始する前に RSV変異体の弱毒性及び防御効力を評価する際に最も適切な動物代用体であるチンパンジーにおいてRSVに対する抵抗性を誘導することができる。弱毒化RSV 生ワクチンは、生命を脅かす RSV疾患のリスクが最も大きい集団である非常に幼い幼児に使用するものとして作られている。このような幼い個体を免疫化する必要から、生ワクチンは非常に弱毒化されて（すなわち、容易に証明できるほど弱められて）いなければならない。そこで、RSV A2 cpts248/404変異体が AGMK 細胞中において高い力価を達成できることは注目に値する。明らかに、この変異体を含むワクチン及び RSV生ワクチンが成功するには一般に高レベルのウィルス収量を達成することが必要となる。生ウィルスワクチンを製造するために、良好な生育及びウィルス収量を得るためのインキュベーション時間及び接種サイズのような条件を以下のような製造法による日常的な方法によって決定する：生ウィルスワクチン及び／又は懸濁液製造１．初代種ウィルスプール：ウィルス及び、10% 10X SPG(v/v)を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製し、無菌性を確認して効力を測定した後、この液体を少量のアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵して、最終的なワクチン製造の第３レベルバックアップとして用いる。全量で 30 mlないし 100 ml の範囲でよい。２．二次種ウィルスプール：ウィルス及び、10% 10X SPG(v/v)を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製する。無菌性を確認して効力を測定した後、この液体を少量のアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵して、最終的なワクチン製造の第２レベルバックアップとして用いる。全量で 100 ml ないし 300 ml の範囲でよい。３．マスター種ウィルスプール又は製造前種ウィルスプール：ウィルス及び、10 % 10X SPG(v/v)を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製する。無菌性を確認して効力を測定し、血清学的に同一性を確認する。この液体を複数のサイズのアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵する。これらのプールは最終的な製造の第１レベルバックアップとして用いる。これらの液体をワクチン・ロットと同時に組織培養純度（安全性）試験にかける。全量で 500 ml ないし１リットルの範囲でよい。４．生ウィルスワクチン製造：製造する容量は必要な用量及び容器の数を基準として必要な安全性試験用の粗液体として最低 400 ml をプラスする。ウィルスプールの他に、継代組織培養対照液の少量プール（200 - 400 ml）を作って粗ウィルス採収物と共にその後の安全性試験にかけることが勧められる。10% 10X SPG( v/v)を添加した培養容器液を凍結解凍サイクルにかけずに直接採収する。サンプルプールを調製して効力をアッセイし、血清学的に同一性を確認する。粗採収物をプールし、約 400 ml のアリコートを安全性試験用に取り出す。残りの液体は５℃で 20 分間、1200 gで遠心して不純物を除去し、再プールして、最終容器中に分配する。実施例13 特性決定された AGMK 細胞基体中におけるパラインフルエンザ・ウィルスの単離並びに生育及び連続的増殖への適応化；並びに生ウィルスワクチン製造へのこれらの細胞の使用１、２及び３型のパラインフルエンザ・ウィルスがヒトの鼻及び／又は咽頭の試料から直接、初代 AGMK 細胞培養体中に先に単離された。次に、１、２及び３型のウィルスを特性決定された AGMK 細胞中における生育に既に適応化させた。特性決定された AGMK 細胞基体中で単離するために、臨床試料を 3000 rpm で10 分間遠心した後、室温で 60 分間、抗生物質（200 μg/mlゲンタマイシン；100 μg/mlネオマイシン; 及び 5μg/mlフンジゾン）で処理する。抗生物質で処理した試料を試験管回転培養の AGMK 細胞基体中に接種し、36℃± 1℃で回転ドラムを用いてインキュベートする。細胞変性効果及び／又は血球吸着（PBS，pH 7.2 中で 0.1% モルモットRBC による）が明らかになったら、培養物を採収し、さらに回転式試験管又はフラスコ培養のいずれかによって継代を行い、連続継代及びそれに続くプラーク精製を行う。その後、ウィルス変異体を化学的突然変異誘導によって作りだすか又はどちらかの例の AGMK 細胞基体を使用して最適条件に及ばない温度条件で継代することによって選択する。３型パラインフルエンザ・ウィルスの低温適応(ca)弱毒化変異体（PIV3 ca 低温継代 45 と呼ばれる）は AGMK 細胞基体中で高力価にうまく生育した。この変異体の生育収量は、ヒトでの使用を目的とした生ウィルスワクチンの製造に対する認可はまだ得られていない認定サル細胞系である Vero 細胞中で得られる収量と同程度であった。しかしながら、表VII に示すように、AGMK 細胞中における最終的なウィルス収量は、一般に使用されている、ヒト用ウィルスワクチンの製造には同様に今のところまだ認可されていない認定アカゲザル胎児肺細胞株である FRhL-2 における収量よりもおよそ 30-倍高かった。現在フェーズII臨床試験中である PIV3 ca低温継代 45 変異体は、天然に存在する PIV3 にそれまでに感染したことがない幼い幼児にとっても十分に弱毒化されている。この変異体は幼い幼児において非常に弱毒化されてはいるが、それでもなお防御レベルの血清 PIV3 抗体の生産を刺激する。幼い幼児での ca 変異体の臨床試験結果に基づき、本発明者らは感染 AGMK 細胞からのウィルス収量１ml は 30 ワクチン用量の PIV3 ca低温継代 45 を含むと計算する。ワクチン製造間にこのレベルのウィルス生育が達成されるということは、PIV3 生ワクチンは免疫化の対象集団である幼児及び低年齢の子供に安全に投与できるように弱められていることから特に注目に値する。生ウィルスワクチンを製造するために、良好な生育及びウィルス収量を得るためのインキュベーション時間及び接種サイズのような条件を以下のような製造法による日常的な方法によって決定する：生ウィルスワクチン及び／又は懸濁液製造１．初代種ウィルスプール：ウィルス及び、10% 10X SPG(v/v)を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製し、無菌性を確認して効力を測定した後、この液体を少量のアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵して、最終的なワクチン製造の第３レベルバックアップとして用いる。全量で 30 mlないし 100 ml の範囲でよい。２．二次種ウィルスプール：ウィルス及び、10% 10X SPG(v/v)を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製する。無菌性を確認して効力を測定した後、この液体を少量のアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵して、最終的なワクチン製造の第２レベルバックアップとして用いる。全量で 100 ml ないし 300 ml の範囲でよい。３．マスター種ウィルスプール又は製造前種ウィルスプール：ウィルス及び、10 % 10X SPG(v/v)を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製する。無菌性を確認して効力を測定し、血清学的に同一性を確認する。この液体を複数のサイズのアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵する。これらのプールは最終的な製造の第１レベルバックアップとして用いる。これらの液体をワクチン・ロットと同時に組織培養純度（安全性）試験にかける。全量で 500 ml ないし１リットルの範囲でよい。４．生ウィルスワクチン製造：製造する容量は必要な用量及び容器の数を基準として必要な安全性試験用の粗液体として最低 400 ml をプラスする。ウィルスプールの他に、継代組織培養対照液の少量プール（200 - 400 ml）を作って粗ウィルス採収物と共にその後の安全性試験にかけることが勧められる。10% 10X SPG( v/v)を添加した培養容器液を個々の採収及び無菌試験の前に１回の凍結解凍サイクルにかける。サンプルプールを調製して効力及び同一性をアッセイする。個々の採収物を -70℃以下で貯蔵する。無菌性、効力及び同一性が確認されたら、粗採収物を解凍してプールする。約 400 ml のサンプルを安全性試験用に取り出す。残りの液体は５℃で 20 分間、1200 gで遠心して不純物を除去し、再プールして、最終容器中に分配する。実施例14 特性決定された AGMK 細胞基体中におけるインフルエンザ・ウィルスの単離及び／又は生育への適応化並びに生又は不活性化ウィルスワクチン製造へのこれらの細胞の使用Ａ型、サブタイプ H3N2 及び H1N1、並びにＢ型のインフルエンザ・ウィルスはこの特性決定された AGMK 細胞系中における生育に既に適応している。インフルエンザ・ウィルスをニワトリ発育卵よりも哺乳動物細胞系中で単離及び生育させることが著しく有利なのは、血球凝集素（インフルエンザ・ウィルスの主要な防御ウィルス性蛋白）がヒトから単離されるウィルス中に存在するのと同じアミノ酸配列及び形態を保持しているという事実による。対照的に、ウィルスを卵における生育に適応させる間には血球凝集素に影響を及ぼす変異を有する変異体が選択される。これらの変異はその変異体に卵における生育に際しての有利性を与える。生又は死菌のいずれのインフルエンザ・ウィルス・ワクチンも発育卵よりも哺乳動物組織培養系で製造するほうが有利なのは、ウィルスを哺乳動物組織培養体中で生育させた場合、インフルエンザ・ウィルス血球凝集素(HA)上の主要な防御抗原部位が保持されることによる。インフルエンザＡ又はＢウィルスをニワトリ発育卵における効率的な生育に適応させると、結果としてウィルス性 HA 上の主要な防御抗原部位の一つに影響を及ぼす変異を有するウィルス変異体をしばしば選択することになる。防御抗体を誘導するこのような HA エピトープの消失はこの形態のウィルス抗原変異体を含むワクチンの有効性を減少させる。幾つかの研究が哺乳動物細胞培養体中でのみ単離及び増殖させたインフルエンザ・ウィルスは天然に循環しているウィルスに対して卵に適応させたインフルエンザ・ウィルス株よりも抗原性の面で密接な関係にあることを示している。この理由から、これらのウィルスの主要な防御蛋白である HA の本質的な抗原性構造が維持されるように、インフルエンザＡ及びＢウィルス・ワクチン株は哺乳動物、好ましくは霊長類の細胞培養系中で単離及び維持すると有利である。表VIIIに示すように、サブタイプ H1N1 及び H3N2 の種々のインフルエンザＡウィルスが AGMK 細胞基体中において効率良く生育した。種々のインフルエンザＢウィルス株も、インフルエンザＡウィルスよりは幾分劣るものの、AGMK 細胞中で生育する。この実験では卵で増殖させたウィルスを接種体に使用したので、卵への適応は卵において効率良く生育できる変異体を選択することを考えたものであるから、表VIIIに示すウィルス収量は最小の評価である。このような変異体は、卵への適応による変異の結果として霊長類細胞においては天然に存在する元のウィルスよりも生育が劣ることが多い。 AGMK 細胞は感染しているヒトからインフルエンザＡ及びＢウィルスを単離するために使用することができ、不活性化ワクチンの製造に使用されるウィルスを製造するための細胞基体として用いることができる。或いは、AGMK 細胞は弱毒化ウィルス生ワクチン処方に用いる弱毒化変異体を誘導する際にウィルスの単離及び増殖に使用することができる。実施例15 特性決定された AGMK 細胞基体中におけるヒト及びサルのＡ型肝炎ウィルスの単離；並びに／又は生育、連続継代並びにそれに続く生及び不活性化ウィルスワクチン製造への適応化ヒト由来の野生型Ａ型肝炎ウィルス株は初代単離の細胞培養ではあまり生育しないか又は全く生育しない：それらは困難な連続継代処理によって細胞培養中に効率的に生育するように適応させなければならない。対照的に、サル由来の野生型HAV はある種の霊長類細胞中における初代単離ではかなりよく複製する。しかしながら、ヒト又はサル由来の HAV株の初代単離及び適応化に適した認定又は認可細胞培養系は容易には利用できないか、又は HAVの複製を高レベルには維持しない。これらの例はヒトのHAV に関するものであるが、当業者にはこの技法がサル由来の HAV株にも適用できることは明白であろう。ヒトのＡ型肝炎ウィルスであり、不活性化ワクチンの候補であると同時に弱毒化生ワクチンの候補としてふさわしい株である HM-175（HAV/7）株の複製能力を AGMK 細胞、FRhK-4（クローン 11-1、現在のところこのウィルスの複製に関して最も感受性が高い細胞系）、及び認可済 MRC-5ヒト二倍体細胞において比較した。細胞培養条件は FRhK-4 細胞中における HAVの複製に通常用いられるものとした。表IX及び図３に示すように、HAV はワクチン開発及び製造に適している AGMK 細胞基体においても、ワクチン開発に適していない FRhK-4、クローン 11-1 細胞と同じ力価及び同じ割合で複製した。さらに、ラジオイムノフォーカスアッセイにより測定されるように HAVプラークのサイズは両方の細胞型で同じであった。対照的に、HAV 株 HM-175（HAV/7）は連続継代によりさらに適応化させなければ MRC5 細胞（ワクチン開発に認可できる細胞株）において効率良く複製しなかった。生ウィルスワクチン及び／又は懸濁液製造１．初代種ウィルスプール：ウィルス及び、10% 10X SPG(v/v)を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製し、無菌性を確認して効力を測定した後、この液体を少量のアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵して、最終的なワクチン製造の第３レベルバックアップとして用いる。全量で 30 mlないし 100 ml の範囲でよい。２．二次種ウィルスプール：ウィルス及び、10% 10X SPG(v/v)を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製する。無菌性を確認して効力を測定した後、この液体を少量のアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵して、最終的なワクチン製造の第２レベルバックアップとして用いる。全量で 100 ml ないし 300 ml の範囲でよい。３．マスター種ウィルスプール又は製造前種ウィルスプール：ウィルス及び、10 % 10X SPG(v/v)を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製する。無菌性を確認して効力を測定し、血清学的に同一性を確認する。この液体を複数のサイズのアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵する。これらのプールは最終的な製造の第１レベルバックアップとして用いる。これらの液体をワクチン・ロットと同時に組織培養純度（安全性）試験にかける。全量で 500 ml ないし１リットルの範囲でよい。４．生ウィルスワクチン製造：製造する容量は必要な用量及び容器の数を基準として必要な安全性試験用の粗液体として最低 400 ml をプラスする。ウィルスプールの他に、継代組織培養対照液の少量プール（200 - 400 ml）を作って粗ウィルス採収物と共にその後の安全性試験にかけることが勧められる。10% 10X SPG( v/v)を添加した培養容器液を個々の採収及び無菌試験の前に１回の凍結解凍サイクルにかける。サンプルプールを調製して効力及び同一性をアッセイする。個々の採収物を -70℃以下で貯蔵する。無菌性、効力及び同一性が確認されたら、粗採収物を解凍してプールする。約 400 ml のサンプルを安全性試験用に取り出す。残りの液体は５℃で 20 分間、1200 gで遠心して不純物を除去し、再プールして、最終容器中に分配する。不活性化ウィルスワクチン及び／又は懸濁液製造１．初代種ウィルスプール：ウィルス及び、10% 10X SPG［v/v］を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製し、無菌性を確認して効力を測定し、少量のアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵して、最終的なワクチン製造の第３レベルバックアップとして用いる。全量で 30 mlないし 100 ml の範囲でよい。２．二次種ウィルスプール：ウィルス及び、10% 10X SPG［v/v］を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製し、無菌性を確認して効力を測定し、少量のアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵して、最終的なワクチン製造の第２レベルバックアップとして用いる。全量で 100 ml ないし 300 ml の範囲でよい。３．マスター種ウィルスプール又は製造前種ウィルスプール：ウィルス及び、10 % 10X SPG［v/v］を添加した連続継代組織培養対照液のプールを調製し、無菌性を確認して効力を測定し、同一性を確認し、複数のサイズのアリコートに分配して -70℃以下で貯蔵する。これらのプールは最終的な製造の第１レベルバックアップとして用いる。これらの液体をワクチン・ロットと同時に組織培養純度（安全性）試験にかける。全量で 500 ml ないし１リットルの範囲でよい。４．不活性化ウィルスワクチン製造：製造する容量は契約した用量及び容器の数を基準として必要な安全性試験用の粗液体として最低 400 ml をプラスする。ウィルスプールの他に、継代組織培養対照液の少量プール［200 - 400 ml］を作って粗ウィルス採収物と共にその後の安全性試験にかけることが勧められる。10% 10X SPG［v/v］を添加した培養容器液を個々の採収及び無菌試験の前に１回の凍結解凍サイクルにかける。サンプルプールを調製して効力及び同一性をアッセイし、個々の採収物を -70℃以下で貯蔵する。無菌性、効力及び同一性が確認されたら、粗採収物を解凍し、プールして、不純物を除き、精製した後、標準的な条件下でホルマリンによる不活性化を行う。その後、このワクチンを最終容器中に分配して、無菌性についての安全性試験を行う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/29 Ａ６１Ｋ 39/29 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 7/04 7/04 (72)発明者パーセルロバートエイチアメリカ合衆国、メリーランド州 20720、ボイズ、ホワイトグランドロード 17517 (72)発明者カピキャンアルバートゼットアメリカ合衆国、メリーランド州 20852、ロックヴィル、マークリフロード 11201 (72)発明者ポタッシュルイスアメリカ合衆国、メリーランド州 20814、ベテスダ、プークスヒルロード 5337

Claims

【特許請求の範囲】１．生存可能な二次微生物病原体を実質的に含まないアフリカミドリザル腎臓に由来する連続継代細胞。２．請求項１に記載の細胞基体であって、前記細胞基体が二倍体範囲の染色体数を有する異数体メスセルコピテカス(Cercopithecus)サル細胞基体である細胞基体。３．請求項１又は２に記載の細胞系であって、多数の異なるウィルスの生育を維持することができる細胞系。４．細胞基体 ATCC #CRL 11756、並びにその変異体及び変化体。５．請求項１に記載の細胞基体中にウィルスを単離する方法であって、以下の工程を含む方法： i) 前記細胞にウィルスを含むサンプルを接種すること； ii) ウィルスの前記懸濁液を増殖させるように前記接種細胞をインキュベートすること；及び iii)前記ウィルスを採収すること。６．請求項５に記載の方法であって、前記ウィルスがヒト・ロタウィルスである方法。７．請求項５に記載の方法であって、前記ウィルスがヒトX 動物ロタウィルス・リアソータントである方法。８．請求項５に記載の方法であって、前記ウィルスがヒト・アストロウィルスである方法。９．請求項５に記載の方法であって、前記ウィルスがエンテロウィルスである方法。 10．請求項５に記載の方法であって、前記ウィルスがセービン弱毒化経口ポリオ生ウィルス・ワクチン株である方法。 11．請求項５に記載の方法であって、前記ウィルスが呼吸器ウィルスである方法。 12．請求項５に記載の方法であって、前記ウィルスがＡ型肝炎ウィルスである方法。 13．請求項６に記載の方法によって製造されたロタウィルス。 14．請求項８に記載の方法によって製造されたアストロウィルス。 15．請求項９に記載の方法によって製造されたエンテロウィルス。 16．請求項10に記載の方法によって製造されたセービン弱毒化経口ポリオ生ウィルス。 17．請求項11に記載の方法によって製造された呼吸器ウィルス。 18．請求項12に記載の方法によって製造されたＡ型肝炎ウィルス。 19．ワクチンを製造する方法であって、以下の工程を含む方法： i) 請求項５に記載の方法によりワクチンを製造すること；及び ii) ワクチンを調製するために前記ウィルスを使用すること。 20．請求項19に記載の方法であって、前記ウィルスがロタウィルスである方法。 21．請求項19に記載の方法であって、前記ウィルスがヒト・ロタウィルスである方法。 22．請求項19に記載の方法であって、前記ウィルスがヒトX 動物ロタウィルス・リアソータントである方法。 23．請求項19に記載の方法であって、前記ウィルスがヒト・アストロウィルスである方法。 24．請求項19に記載の方法であって、前記ウィルスがエンテロウィルスである方法。 25．請求項19に記載の方法であって、前記ウィルスがセービン弱毒化経口ポリオ生ウィルスである方法。 26．請求項19に記載の方法であって、前記ウィルスが呼吸器ウィルスである方法。 27．請求項19に記載の方法であって、前記ウィルスがＡ型肝炎ウィルスである方法。