KR20010101005A - Ａ형 간염-홍역 복합 백신 및 그의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

A형 간염-홍역 복합 생 백신, 보관 안정성이 향상된 그의 동결 건조된 제형, 및 A형 간염 바이러스 및 홍역 바이러스의 바이러스 원료를 혼합하거나 또는 상기 두 바이러스를 동일한 이배체 세포 기질 상에서 증식시킴에 의한 그의 제조 방법을 개시한다. 상기와 같이 제조된 복합 생 백신은 A형 간염과 홍역에 의한 감염을 이들의 혼합 또는 공동-배양으로 인한 상기 두 바이러스의 항원성 간의 어떠한 간섭도 일으키지 않으면서 임의의 심각한 부작용도 없이 예방하는데 유용한 백신이다.

Description

Ａ형 간염-홍역 복합 백신 및 그의 제조 방법{Combined hepatitis A-measles vaccine and its production}
잘 알려진 바와 같이, 전염성 질병에 대한 보호를 위한 면역은 현대 의학에서 가장 성공적이고 비용 효과적인 실행들 중 하나이다. 모든 국가들 및 지역들, 특히 개발 도상국가 및 지역에서 백신의 사회적인 수용과 사용을 증가시키는 일련의 전체적인 예방 접종을 총괄적으로 관리하기 위해서, 보다 새롭고, 안정하며 비용 효과적인 다가의 백신을 제공함을 포함하는 수단들이 획득되어야 한다. 이를 위해서, 보다 새로운 백신 및 안정성이 개선된 백신들을 개발하기 위한 매우 많은 연구 노력들이 세계의 많은 실험실들에서 광범위하게 수행되어 왔으며, 따라서 1991년에 유엔 아동 기금(UNCF) 및 세계 보건 기구(WHO)에 의해 “아동의 백신 개시”(CVI)가 주창되었다. 이러는 가운데, 복합 백신의 개발 및 덜 침습적인 접종 기술의 도입을 통한 보다 사용자-친화적인 백신의 제조에 많은 이목이 집중되었다.
복합 백신의 대중화는 백신의 수 및 제조 비용을 감소시켰고 질병에 대한 면역성을 증가시켰으며, 따라서 세계적으로, 특히 중국을 포함한 개발 도상국가들에서 백신 적용범위가 대단히 증가되었다.
다수의 복합 백신들이 허가되었으며 면역화 실행에 사용되었다. 일례로, 과거 수 십년간 유아 및 아동을 위한 통상적인 예방 접종 스케줄에는 홍역, 볼거리 및 풍진용의 감독된 3 가 생 백신, 및 디프테리아, 파상풍 및 백일해용 3 가 생 백신(DTP) 등의 예방 접종이 포함되었다. 최근, 어린이 예방 접종 시리즈에서 4 회 용량으로 사용하기 위한 디프테리아 및 파상풍 변성 독소 및 무세포성 백일해 백신(DTaP-Hib)과 재조성에 의해 결합되는 호 혈액성 세균 b 결합 백신이 미국 식품 의약청(FDA)에 의해 허가되었다. 또한, TriH1Bit(상표명)는 미국에서 PTaP가 호 혈액성 세균 b 결합 백신과 결합된 복합 백신으로 인가된 최초의 백신일 것이다. 그러나, A형 간염과 홍역 바이러스를 포함하는 복합 백신, 및 2 개 이상의 상이한 바이러스를 동일한 세포 기질 상에서 증식시킴으로써 복합 백신을 제조하는 방법에 대한 보고는 없다.
발명의 요약
본 발명은 예방학적 유효 역가의 감독된 A형 간염 생 바이러스 및 예방학적 유효 역가의 감독된 홍역 생 바이러스를 이들 바이러스용의 안정화제와 함께 또는 상기 없이 포함하는 A형 간염-홍역 복합 백신(HM)을 제공하며, 상기 백신에 의해 A형 간염 바이러스 및 홍역 바이러스와 관련된 감염을 상기 두 바이러스의 혼합 또는 공동-배양으로 인한 이들 바이러스의 항원성 간에 어떠한 간섭도 일으키지 않으면서 예방할 수 있다.
본 발명에 따른 A형 간염-홍역 복합 백신에서, 상기 A형 간염 바이러스의 바이러스 역가는 106.0CCID50/㎖(바이러스 원료 물질 ㎖ 당 50% 세포 배양액 감염 용량) 이상이고 홍역 바이러스의 바이러스 역가는 103.5CCLD50/㎖ 이상이다.
본 발명의 범위 내에서, A형 간염-홍역 복합 백신은 동결건조되거나 동결건조되지 않은 형태로 제공된다.
본 발명은 또한 바이러스 성분과 안정화제 성분을 포함하는 안정화된 A형 간염-홍역 복합 백신 제형을 제공하며, 이때 상기 바이러스 성분은 예방학적 유효 역가의 A형 간염 생 바이러스 및 홍역 생 바이러스를 포함하고, 상기 안정화제 성분은 동결 건조 전의 상기 안정화된 생 백신 제형 중의 농도 항으로 0 내지 2%(w/v)의 인간 혈청 알부민(HSA), 0.5 내지 1%(w/v)의 젤라틴, 5 내지 10%(w/v)의 트레할로즈, 0.75 내지 1.5%(w/v)의 글루탐산 나트륨, 0.05 내지 0.55%(w/v)의 아스코르브산, 0.5 내지 2.8%(w/v)의 우레아, 5 내지 10%(w/v)의 만니톨 또는 솔비톨 또는 이들의 1:1 혼합물, 및 0.5 내지 1%(w/v)의 노시톨로 필수적으로 이루어지며, 상기 안정화된 복합 백신은 임의로 동결건조되거나 동결건조되지 않는다.
본 발명에 따라, 107.0CCID50/㎖ 이상의 바이러스 역가를 갖는 감독된 A형 간염 생 바이러스의 원료 물질을 104.5CCID50/㎖ 이상의 바이러스 역가를 갖는 감독된 홍역 생 백신의 원료 물질과 적합한 비율로 혼합함으로써 복합 백신 원료 현탁액(여기에서 상기 A형 간염 바이러스의 바이러스 역가는 106.5CCID50/㎖ 이상이고, 상기 홍역 바이러스의 바이러스 역가는 104.0CCID50/㎖ 이상이다)을 수득함을 포함하는 A형 간염-홍역 복합 백신의 제조 방법을 제공한다.
상기와 같이 제조된 복합 백신은 면역원 효능의 임의의 감소 및 그의 성질의 임의의 저하 없이 A형 간염과 홍역 모두에 의한 감염을 예방하는데 사용될 수 있는 유용한 백신이다. 더욱 또한, 상기 복합 백신은, 특히 동물들에 대한 복합 백신의 경우에 흔히 관찰되는 상기 바이러스들의 혼합에 기인한 바이러스 항원성들간의 간섭을 결코 유발시키지 않는다.
본 발명에 따라, 본 발명의 발명자들은 하기의 단계들을 포함하는 A형 간염-홍역 복합 백신의 또 다른 제조 방법을 제공할 수 있다:
(a) 각각 미리 준비된 A형 간염 바이러스 및 홍역 바이러스의 종자 바이러스를 제공하는 단계;
(b) 상기 단계(a)로부터 수득된 A형 간염 바이러스의 종자 바이러스를 인간 태아 폐 이배체 섬유아세포 배양액에 접종한 다음 상기 세포를 배양하여 상기 바이러스를 증식시키는 단계;
(c) A형 간염 바이러스-감염된 양성 세포가 75% 이상인 경우, 상기 단계(a)로부터 수득된 홍역 바이러스의 종자 바이러스를 상기 A형 간염 바이러스가 증식된 동일한 세포 단층 상에 접종하고, 상기 세포를 연속적으로 배양하는 단계;
(d) A형 간염 바이러스-감염된 양성 세포가 면역 형광법(IF)으로 탐지 시 90% 이상이고 홍역 바이러스-감염된 양성 세포가 세포병원성 효과(CPE)에 의해 탐지 시 90% 이상인 때에 상기 두 바이러스로 감염된 세포들을 수확하고 상기 두 바이러스를 함유하는 백신 원료 물질을 수거함으로써 목적하는 복합 백신을 수득하는 단계.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 이배체 세포에 대한 양성 감염율 및 A형 간염 바이러스의 바이러스 역가를 면역 형광법 및 효소면역측정 분석을 포함하는 HAV-특이적인 탐지 시스템에 의해 탐지한다.
본 발명의 더욱 바람직한 실시태양에서, 상기와 같이 정의된 방법은 더욱 또한 상기 수득된 A형 간염-홍역 복합 백신의 원료 물질을 감독된 생 백신용 안정화제와 약 1:1의 부피 비로 적절히 혼합하고, 이어서 생성된 제형을 동결건조시킴으로써 A형 간염-홍역 복합 백신의 동결건조된 제제를 수득함을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 상기 안정화제는 동결 건조된 생 백신 제형 중의 농도 항으로 0 내지 2%(w/v)의 인간 혈청 알부민, 0.5 내지 1.1%(w/v)의 젤라틴, 5 내지 10%(w/v)의 트레할로즈, 0.75 내지 1.5%(w/v)의 글루탐산 나트륨, 0.05 내지 0.55%(w/v)의 아스코르브산, 0.5 내지 2.8%(w/v)의 우레아, 5 내지 10%(w/v)의 만니톨 또는 솔비톨 또는 이들의 1:1 혼합물, 및 0.5 내지 1%(w/v)의 이노시톨로 필수적으로 이루어진다.
본 발명은 더욱 또한 하기의 단계들을 포함하는 동결건조된 A형 간염-홍역 복합 백신의 제조 방법을 제공한다:
(a) 각각 예방학적 유효 역가의 감독된 A형 간염 생 바이러스 및 감독된 홍역 생 바이러스를 포함하는 원료 물질을 제공하고, 이어서 이들을 혼합하여 혼합된 백신 원료를 수득하는 단계;
(b) 상기 단계(a)의 혼합된 백신 원료에 안정화제 모액을 약 1:1(v/v)의 비로 가하고 이들을 함께 혼합하여 복합 백신 제형을 수득하는 단계;
(c) 상기 단계(b)로부터 수득된 복합 백신 제형을 동결건조시키는 단계.
본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 상기 동결건조 단계(c)는 수성 현탁액 형태의 복합 백신 제형을 3 내지 6 시간에 걸쳐 상기 현탁액의 공융 온도 이하로 예비 냉각시키고, 이어서 상기 온도를 8 내지 20 시간에 걸쳐 -35 ℃에서 35 ℃로점진적으로 증가시켜 승화에 의해 상기 냉각된 현탁액으로부터 물을 제거함을 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 감독된 A형 간염 바이러스의 예방학적 유효 역가는 동결건조된 복합 백신에서 106.0CCID50/㎖ 이상이고, 상기 감독된 홍역 바이러스의 예방학적 유효 역가는 103.5CCID50/㎖ 이상이다.
본 발명은 복합 백신, 그의 제조 방법 및 용도, 특히 바이러스 성분으로서 예방학적으로 유효한 역가의 A형 간염 바이러스(HAV) 및 홍역 바이러스(MV), 및 상기 바이러스 성분을 안정화시키는데 유효한 안정화제 성분을 포함하는 A형 간염-홍역 복합 백신 제형에 관한 것이다. 상기 복합 백신은 상기 두 바이러스의 면역 반응 및 면역원성, 및 탁월한 보관 안정성의 획득에 대해 어떠한 간섭도 유발시키지 않으며, 따라서 상기 복합 백신을 주변 온도에서 장시간 동안 보관할 수 있고 수용자, 특히 유아 및 어린이의 상기 두 감염성 질병에 대한 예방에 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 2 개의 상이한 바이러스들을 혼합하거나 또는 상기 바이러스들을 동일한 이배체 세포 기질 상에서 증식시킴으로써 동결 건조되거나 동결건조되지 않은 복합 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.
필수적으로, 본 발명에 따라 예방학적 유효 역가의 감독된 생 HAV 및 감독된 생 MV로 이루어진 A형 간염-홍역 복합 백신을 제공하며, 이때 상기 백신은 상기 두 바이러스 항원들 간의 면역 반응 및 면역원성에 대해 어떠한 상반성 또는 상호 간섭을 유발시키지 않으며, 임의로 안정화제 또는 동결보호제(lyoprotectant)를 함유한다.
홍역은 홍역 바이러스(MV)에 의해 야기되는 인간 숙주에 대해 알려진 가장 전염성인 질병이다. 상기 질병의 공격에 따른 홍역에 대한 면역은 일생을 통해 나타난다. 홍역 백신 접종 후의 면역성은 유사하게 수년간 지속되며 추정상 일생 동안 지속된다. 홍역의 대부분은 홍역에 대한 면역이 없는 인간에서 발생하며, 1 회의 홍역 백신 투여에 반응하지 않는 사람들도 소수 있다. 이러한 이유로, 1989년 이래로 2 회의 홍역 백신 투여가 권장되었다. 따라서, 한 살 이상의 모든 아동들은 1 회의 홍역 백신을 접종해야 하며, 입학 시(4 내지 6 세) 또는 10 세 내지 11 세에 2 차 홍역 백신을 접종해야 한다. 또한, 대학 신입생, 입대자 및 보건 전문 학교 입학생, 또는 아동기에 병력이 없거나 면역이 없는 사람들은 2 차 예방 접종을 받아야 한다. 홍역 감염 연령의 상향 이동에 비추어, 이번 가을에 학교에 복학하는 청년들에게 최근의 2 회의 홍역 백신 투여가 특히 중요하다.
A형 간염(HA)은 A형 간염 바이러스(HAV)에 의한 감염에 의해 발병되는 세계적으로 분포된 급성 전염성 질병이다. 주로 변/경구 경로를 통해 전염되는 다른 장 질병들처럼, A형 간염은 전형적으로 불량하고 사람들이 많이 모인 환경과 관련 있는 아동기 감염 질병이다. 아동의 A형 간염은 일반적으로 매우 온화하지만, 잠재적으로 감염된 아동은 상기 바이러스를 면역이 없는 개인들에게 옮길 수 있기 때문에 아동들은 A형 간염의 유포에 매우 중요한 역할을 한다. 개선된 위생 및 생활 상태가 일부 집단 그룹들 간의 상기 바이러스의 유포를 감소시켰지만, 보다 어린 세대들은 여전히 감염되기 쉬우며 A형 간염 격증의 병소로서 작용할 수 있다. 항-HAV 혈청이환율이 증가된 지역에 있는 탁아소의 예방 접종이 유리한 것으로 나타났으며, 이는 아동의 통상적인 A형 간염 예방 접종 프로그램이 HAV 감염 억제에 가장 효과적인 수단임을 제시하였다.
전염병학적 태양에서 HAV 및 MV의 상당한 유사성과 A형 간염 및 홍역 백신 모두의 유사한 2 회 투여 면역 스케줄에 비추어, A형 간염-홍역 복합 백신의 바람직함 및 유용성은 명백하다.
지금까지, 중국에서 일반적으로 사용된 홍역 생 백신은 병아리 배 세포의 초기 배양액에서 생체 외 이행에 적합한 Chang-47 및 Hu-191 단리 균주로부터 개발되었다. 그러나, 본 발명자들의 연구에 의해 세포 기질로서 사용된 인간 태아 폐 이배체 세포 단층 또는 세포 현탁액이 상기 바이러스의 증식 및 바이러스 항원성의 유지에 유리할 것이며, 또한 외래 인자들, 예를 들어 난 단백질 등으로부터의 오염을 방지할 것임이 밝혀졌다.
다른 한편으로, A형 간염 생 백신은 본 발명자들에 의해 인간 이배체 섬유아세포에서 일련의 생체 외 이행에 의해 환자의 대변으로부터 단리되었고 중국에서 실제적인 사용 및 산업적 규모의 생산이 허가된 야생형 HAV 균주 L-A-1으로부터 개발되었다. A형 간염 노출에 고 위험군인 8 천만 명 이상이 지금까지 상기 백신을 접종받았으며, 추적 조사 결과 1 차 투여 후 85%의 혈청 보호를 나타내었고, 오직 두 번째 예방 주사 후에만 100%의 혈청 보호를 나타내었다.
본 발명의 발명자들은 그들의 장기적인 연구 및 제조 실행 기간 동안, 인간 태아 폐 이배체 섬유아세포(균주 2BS)가 A형 간염 바이러스뿐만 아니라 홍역 바이러스에도 탁월한 숙주이며, 홍역 바이러스는 이들 세포 기질 상에서 보다 급속하게 증식함을 발견하였다. 특히, 본 발명의 발명자들은 뜻밖에도 HAV의 종자 바이러스를 상기 이배체 세포 배양액에 접종하고 이들 세포를 배양 배지에서 2 내지 3 주간 배양한 후에, 홍역 바이러스의 추가적인 접종 및 배양을 수행할 수 있으며, 동시에 HAV의 감염 효능이 충분히 높은 수준에 도달함을 발견하였다. 추가로 약 1 주일 후에, 상기 두 바이러스를 높은 회수율 및 높은 감염 효능으로 거의 동시에 수확할 수 있었다. 이러한 발견은 상기 2 개의 감독된 생 바이러스를 동일한 숙주 세포 기질 상에서 증식시킴으로써 본 발명의 HM 복합 백신을 제조하는 방법의 기초를 구성하였다.
HAV 및 MV의 원료 물질을 제조하는 경우에, 생 바이러스의 각 원료 물질들을 희석하고 적합한 부피 비로 혼합하여, 예방학적 유효 역가의 HAV 및 MV를 포함하는 수성 현탁액 형태의 복합 생 백신을 수득할 수 있다. 여기에서, 상기 예방학적 유효 역가는 HAV에 대해서 106.0CCID50이상 및 MV에 대해서 103.5CCID50이상의 바이러스 효능을 지칭한다.
본 발명은 하기의 단계들을 포함하는 A형 간염-홍역 복합 백신의 제조 방법을 추가로 제공한다:
(a) 각각 감독된 A형 간염 생 바이러스 및 감독된 홍역 생 바이러스의 종자 바이러스들을 제공하는 단계;
(b) 상기 단계(a)로부터 수득된 A형 간염 바이러스의 종자 바이러스를 인간 태아 폐 이배체 섬유아세포 배양액에 접종한 다음 상기 세포를 배양하여 상기 바이러스를 증식시키는 단계;
(c) A형 간염 바이러스-감염된 양성 세포가 75% 이상인 경우, 상기 단계(a)로부터 수득된 홍역 바이러스의 종자 바이러스를 상기 A형 간염 바이러스가 증식된 동일한 세포 단층 상에 접종하고, 상기 세포를 연속적으로 배양하는 단계;
(d) A형 간염 바이러스-감염된 양성 세포가 면역 형광법으로 탐지 시 90% 이상이고 홍역 바이러스-감염된 양성 세포가 세포병원성 효과에 의해 탐지 시 90% 이상인 때에 상기 두 바이러스로 감염된 세포들을 수확하고 상기 두 바이러스를 함유하는 백신 원료 물질을 수거함으로써 목적하는 복합 백신을 수득하는 단계.
상기 HM 복합 백신을 제조하기 위해서, 본 발명에 따라 HAV의 백신 원료 물질을 중국 특허 제 92114998.0 호에 개시된 방법에 의해 HAV 균주 L-A-1으로부터 제조할 수 있으며, MV의 백신 원료 물질은 중국의 생물학적 생성물의 필요조건의 “홍역 생 백신에 대한 필요조건”에 따른 통상적인 방법에 의해 MV 균주 Chang-47로부터 제조할 수 있다.
임상적인 물질로부터 단리된 HAV를, 비록 상대적인 증식 계수는 낮지만, 다수 유형의 배양된 세포 배양액에서 생육 및 증식시킬 수 있으며, 상기는 형태학적으로 가시적인 세포병원성 변화를 일으키지 않을 수 있다. 대조적으로, MV를 상대적으로 보다 짧은 복제 주기로 다수 유형의 1 차 세포 배양액 또는 2 차 배양액에서 생육 및 증식시킬 수 있으며, 전형적인 다핵 대 세포뿐만 아니라 다른 유사한 세포-형태학적 변화를 현미경 검사로 관찰할 수 있다. 본 발명의 발명자들은 인간 이배체 세포가 HAV 및 MV 모두에 대해 탁월한 감수성 숙주이며, 따라서 상기 이배체 세포 주 2BS를 본 발명의 HM 복합 백신의 제조에 사용되는 바람직한 통상의 숙주 세포로서 선택함을 밝혔다.
A형 간염-홍역 복합 백신을 제조하기 위해서, 인간 이배체 세포 주 2BS를 세포의 증식 및 유지를 위해서 배양하고, 롤러 병 용기 장치에서 농후한 융합성 세포 단층을 형성시킨다. 이어서, HAV의 종자 바이러스를 상기 세포 배양액에 0.02내지 10의 감염 배수(m.o.i.)로 접종한 다음 약 32 내지 35 ℃에서 배양한다. 상기 바이러스를 배양하는 동안, 감염된 세포의 면적이 바이러스의 증식에 따라 점차적으로 확장되며, 양성 감염 세포의 면적%를 면역 형광법으로 감시한다.
약 2 내지 3 주 후에 HAV-감염된 세포의 75% 이상이 양성 면역 형광성을 나타내면 배지를 10% 송아지 태아 혈청(FCS) 또는 0.01 내지 0.25%(w/v) HSA를 함유하는 영양 배지로 바꾸고, MV 균주의 종자 바이러스를 동일한 세포 배양액에 0.01 내지 10의 m.o.i.로 추가 접종한다. 이어서, HAV 및 MV 모두로 감염된 인간 이배체 세포 배양액을 3 내지 5일 간격으로 배지를 새로 바꾸면서 계속해서 배양하고, 상기 세포의 형태학적 변화를 날마다 검사한다. 소위 세포병원성 효과(CPE)로서의 MV-감염된 세포의 특이적인 형태학적 변화 및 따라서 바이러스의 증식 정도를 측정할 수 있다. 세포 배양액 단층의 전체 부분을 통해서 CPE가 거의 관찰되고(약 90%) 양성 HAV-감염된 세포가 또한 약 90% 이상인 때에, 바이러스 배양을 마친다. 그 후에, 세포 배양액을 1 내지 3 일간 바이러스의 저온 방출을 위해서 2 내지 8 ℃에서 보관하고, 이어서 감염된 세포를 수거하여 -20 ℃ 이하의 온도에서 보관할 수 있다.
세포를 해동시킨 후에, 생성된 세포 현탁액에 3 회의 동결-해동 주기를 가하고 후속적으로 세포 파괴를 위해서 빙 수 욕에서 초음파처리한 다음, 원심분리시켜 세포 찌꺼기를 제거하고 상기 현탁액으로부터 상등액을 분리시킨다. HAV 및 MV를 함유하는 상등액을 수거하여 A형 간염-홍역 복합 백신의 원료 물질을 수득한다.
상기 언급한 바와 같이, HM 복합 백신을 간단한 혼합 공정에 의해 수득할 수있음은 명백하다. 혼합된 백신을 제조하기 위해서, 생 백신들의 각각의 원료 물질을, 각 바이러스의 투여 수준이 상기 바이러스들의 감염에 대한 면역 반응의 도출에 사용되는 일반적으로 정해진 항원 활성을 유지하도록 희석하고 혼합한다.
본 발명은 더욱 또한 하기의 단계들을 포함하는 동결 건조된 A형 간염-홍역 복합 백신의 제조 방법을 제공한다:
(a) 각각 예방학적 유효 역가의 감독된 A형 간염 생 바이러스 및 감독된 홍역 생 바이러스를 포함하는 원료 물질을 제공하고, 이들을 혼합하여 혼합된 백신 원료를 수득하는 단계;
(b) 상기 단계(a)의 혼합된 백신 원료에 안정화제 모액을 약 1:1의 부피비로 가하고 이들을 함께 혼합하여 복합 백신 제형을 수득하는 단계;
(c) 상기 단계(b)로부터 수득된 복합 백신 제형을 동결건조시키는 단계.
바람직한 실시태양에서, HAV 및 MV의 원료 물질 및 동결 건조된 복합 백신용 안정화제를 적합하게 희석하고 약 1:1(v/v)의 비로 혼합할 수 있으며, 이어서 생성된 예방학적 유효 역가의 HAV 및 MV, 및 백신 제형 중에 상기 바이러스들을 열 불활성화에 대해 안정화시키기에 충분한 농도로 포함된 안정화제를 포함하는 수성 제형을 동결 건조시켜, 상기와 같이 수득된 HM 복합 백신을 주변 온도에서 그의 감염 효능을 손상시키지 않으면서 장기간 동안 보존할 수 있으며, 이에 의해 보다 편리하고, 효능적으로 양호한 순응성 및 보다 낮은 투여 비용을 제공할 수 있다.
감독된 생 백신의 안정화제는 HSA를 제외한 각각의 성분들을 간단히 혼합하고, 생성된 혼합물을 약 37 ℃에서 24 내지 48 시간 동안 예열시키고, 상기 혼합물용액을 약 32 ℃로 냉각시키고, 상기 혼합물 용액에 일련의 한외여과에 의해 멸균시킨 HSA를 가함으로써 제형화할 수 있다.
그 후에, 상기와 같이 수득된 안정화제를 HM 복합 백신의 바이러스 원료와 적합한 비율, 예를 들어 약 1:1(v/v)의 비로 혼합할 수 있다.
그러나, 당해 분야의 통상적인 숙련가는 안정화제 대 백신의 부피 비 변화를 청구된 발명의 실행에 적용할 수 있으며, 차례로 이는 안정화제 성분들의 농도 변화를 요할 것임을 잘 알 것이다. 본 발명은 동결 건조를 위한 최종 백신 제형을 생성시키기 위해서 안정화제/바이러스 배합 비를 단지 명시된 1:1로만 한정하지 않는다. 따라서, 숙련가들은 상이한 비율을 선택하거나 또는 상기 바이러스 제제의 원료를 안정화제의 제조에 사용된 화학적 성분들을 농도 변화시켜 함께 사용할 수도 있다.
백신을 제형화한 후에, 생성된 복합 백신의 수성 현탁액을 동결 건조에 의해 건조시킬 수 있다. 간단히, 동결 건조는 상기 수성 현탁액을 상기 현탁액의 공융 온도 이하(-30 ℃ 이하)에서 약 3 내지 6 시간 동안 예비 냉각시키고, 이어서 상기 냉각된 현탁액으로부터 승화에 의해 물을 제거하여 동결 건조된 백신을 제조하는 단게를 포함한다. 하나의 바람직한 실시태양 내에서, 제형화된 백신 현탁액의 분액들에 8 내지 20 시간의 기간 동안 온도를 약 -35 ℃에서 35 ℃로 점진적으로 상승시키면서 동결-건조 장치의 냉각 챔버에서 다단계 동결-건조 공정을 가한다.
안정화제의 존재로부터 생성된 생 백신의 열-안정성 및 보관 안정성의 개선을 입증하기 위해서, 본 발명을 HM 복합 백신에 의해, 예를 들어 상기 HM 복합 백신의 동결 건조 전 및 후의 바이러스 역가를 탐지하여 상기 복합 생 백신의 보관 안정성에 대한 안정화제의 유효성을 관찰함으로써 예시한다. 그 결과, 본 발명의 백신 제형에 상기 생 바이러스 백신을 열 불활성화에 대해 안정화시키기에 충분한 농도로 포함된 안정화제가 CCID50에 의해 측정 시 안정화제가 없는 대조용 백신 제형에 비해 동결 건조된 백신의 열 안정성을 현저하게 개선시키는 것으로 나타났다.
특히 바람직한 실시태양에서, 안정화제는 동결 건조된 생 백신 제형 중의 농도 항으로 0 내지 2%(w/v)의 인간 혈청 알부민, 0.5 내지 1%(w/v)의 젤라틴, 5 내지 10%(w/v)의 트레할로즈, 0.75 내지 1.5%(w/v)의 글루탐산 나트륨, 0.05 내지 0.55%(w/v)의 아스코르브산, 0.5 내지 2.8%(w/v)의 우레아, 5 내지 10%(w/v)의 만니톨 또는 솔비톨 또는 이들의 1:1 혼합물, 및 0.5 내지 1%(w/v)의 이노시톨로 필수적으로 이루어진다.
비교 실험에서, 본 발명의 발명자들은 동결 건조 주기 변수들을 적합하게 조절할 수 있다면 HSA 성분이 없는 안정화제 용액을 생 바이러스(특히 일부의 무막 바이러스, 예를 들어 HAV, MV 및 소아마비 바이러스) 백신 제형에 사용하는 경우 유사한 결과가 관찰될 수 있음을 밝혔다.
본 발명의 A형 간염-홍역 복합 백신이 MA 및 HAV의 혈청 중화(NT) 시험 또는 바이러스 동정에 의해 생체 외에서 입증되는 바와 같이 탁월한 특이성을 나타내었음을 실험적으로 보일 수 있다. 결과는 본 발명의 복합 백신 제형에 확인가능한 감염 용량으로 포함된 HAV 및 MV 바이러스를 각각의 특이적인 항혈청에 의해 완전하게 중화시킬 수 있음을 나타냈다.
더욱이, HM 복합 백신을 사용하여 붉은털 원숭이를 접종하고 이들 고등 영장류에서의 상기 백신의 안전성 및 면역원성을 입증하기 위해서 일련의 생체내 실험을 수행하였다. 상기 백신을 접종한 동물들은 마비 또는 임의의 다른 편재된 중추 신경계(CNS) 증상들을 전혀 나타내지 않았으며, 상기 동물들 중 어느 것도 CNS 및 간염 조직에서 조직 변화를 나타내지 않았다. 똑같이 중요하게, 상기 감염된 동물들에서 혈청전환과 일시적으로 관련된 조직 변화가 없었으며, 또한 상기 접종물에 기인한 생 효소의 비정상적인 상승도 없다. 다른 한편으로, HAV와 MV 모두에 감염된 5 마리의 동물 모두 접종 후 2 내지 4 주 째에 효소면역측정 분석(ELISA)에 의해 탐지가능한 IgM 항-HAV 및 IgM 항-MV를 나타내고 상기 혈청 항체들은 8 및 9 주째에 사라지는 것으로 나타났다.
더욱 또한, 상기 동물들의 반이 2 주 째에 특이적인 항-HAV 항체 및 항-MV 응집 억제(IH) 항체 모두를 나타내었으며, 항-HAV 및 항-MV 모두의 혈청전환율(혈청이환율)은 접종 후 4 주째에 100%이다. 최종적으로, A형 간염-홍역 2가 복합 생 백신의 유효성 및 임상적인 유용성을 추가로 입증하기 위해서, A형 간염 생 백신을 홍역 생 백신과 동시에 투여하고, 중국에서 일반적인 보급이 허가된 1 가 A형 간염 백신 및 1 가 홍역 백신의 단독 투여와 비교하는 임상적인 실험을 수행한다.
총 275 명의 8 내지 12 개월된 건강한 유아들을 3 개의 그룹으로 나누고, 3개의 예방 접종안에 대한 임상적인 항체 반응을 비교하기 위해서 A형 간염 백신과 홍역 백신을 함께 1 회 투여하고, A형 간염 백신 및 홍역 백신을 각각 1 회 단독 투여한다. 접종 후 72 시간의 관찰 기간 동안, 이들 대상자들 중 누구도 국소적이고 일반적인 반응들을 나타내지 않았으며, HA 백신과 홍역 백신의 동시 또는 단독 투여 그룹들간에 부작용 발생 비율의 현저한 차이가 없었다. 특히, 변경된 ELISA 분석에 의해 측정 시, HA 백신 또는 홍역 백신, 및 HM 복합 백신의 두 투여 그룹들간에 항-HAV 및 항-MV에 대한 양성 혈청전환율, 및 항-HAV 및 항-MV 항체들의 기하학적 평균 역가(GMT)에 있어서 통계학적으로 현저한 차이가 관찰되지 않았다.
요약하면, A형 간염 생 백신과 홍역 생 백신은 모두 유아 및 어린이들에 대해 유사한 예방 접종 스케줄을 가질 뿐만 아니라 평가를 위해 동일한 면역분석을 사용하여 입증된 바와 같이 면역 반응 및 면역원성에 있어서 어떠한 상호 간섭도 없다. 본 명세서의 실시예 4 및 5에 개시된 결과는 HM 복합 백신의 현저한 안전성과 면역원성을 확인시키며 상기 두 바이러스 감염에 대한 사전노출 예방에서의 그의 용도를 지지한다. 따라서, A형 간염-홍역 복합 백신을 기존의 바이러스 항원들의 간단한 혼합, 예를 들어 동일한 세포 배양액 상에서의 2 개 이상의 감독된 생 바이러스의 공동-배양보다 훨씬 많은 기법들을 포함하는 상기 개략된 방법들에 의해, 비록 상기 방법들에는 바이러스 유전자로부터 발생된 다수의 있음직한 문제들이 존재하고 해결해야 할 분자 생물학이 존재하지만, HAV 및 MV의 바이러스 원료로부터 제조할 수 있으며, 상기 두 질병의 억제를 간단히 실행하고 그 허용성을증가시키며 개선하기 위해서 상기 백신을 아동의 백신 개시에 반영시킬 수 있을 것이라 기대된다.
본 발명에 따라, A형 간염-홍역 복합 생 백신을 A형 간염과 홍역에 대한 이중 보호를 제공하기 위해서 1 차 예방 접종으로서 10 내지 13 개월된 유아에게 투여하거나, 또는 2 차 예방 접종으로서 입학 시기의 아동(만 4 세) 또는 10 내지 11 세의 아동에게 투여할 수 있다. 또한, 대학 입학생, 입대자 및 보건 전문 학교 입학생, 또는 아동기 병력이 없거나 면역이 없는 사람들에게 상기 복합 백신을 2 차 투여해야 한다. 홍역과 A형 간염의 감염 연령 상향 이동에 비추어, 학교에 복학하는 청년들에게 상기 복합 백신을 2 회 투여하는 것이 특히 중요하다.
본 발명을 하기의 실시예를 참고로 보다 상세하게 추가로 예시할 것이다. 그러나, 이들 실시예를 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석해서는 안됨은 물론이다.
실시예 1
A형 간염-홍역 복합 백신의 제조
인간 태아 폐 이배체 섬유아세포(2BS)를 상기 세포의 증식과 유지 모두를 위해서 이글스 최소 필수 배지(EMEM)를 사용하여 37 ℃에서 배양한다. 5 일 후에, 중국 특허 제 92114998.0 호에 개시된 A형 간염 바이러스 균주 L-A-1의 종자 바이러스를 상기 이배체 세포의 융합 세포 단층 상에 약 4.5의 m.o.i.로 도말한 다음, 1 주일 간격으로 새로 보충되는 유지 배지(2 내지 5% FCS 함유 EMEM)를 사용하여 3 주간 연속 배양하고, HAV-감염된 양성 세포를 간접적인 면역형광 분석법(IFA)에 의해 주기적으로 감시한다. 3 주 후에, HAV-감염된 세포의 약 75%가 양성 면역형광성을 나타내는 때에, 상기 배지를 10% FCS가 보충된 새로운 영양 배지로 바꾸고 홍역 바이러스 균주 Chang-47의 종자 바이러스를 약 4.5의 m.o.i.로 동일한 세포 배양액에 추가 접종한다.
후속적으로, HAV 및 MV 모두로 감염된 인간 이배체 세포 배양액을 배지를 매 5 일 마다 갈고 형태학적 현미경 검사를 위해 매일 샘플링하면서 33 내지 35 ℃에서 연속 배양한다. 전형적인 세포병원성 효과(CPE)가 약 50% MV-감염된 세포에서 관찰될 때(다핵 대 세포), 상기 영양 배지를 배양 용기로부터 버리고 잔류 FCS를 평형 염 용액으로 세척한다. 이어서, 상기 세포들을 FCS가 없는 이글스 MEM 배지에 재현탁시키고 연속 배양한다. HAV-감염된 세포가 90% 이상이고 MV-감염된 세포가 약 95%에 도달한 때에, 바이러스 배양을 멈추고 세포를 72 시간 동안 2 내지 8 ℃ 하에 놓아 세포 결합된 HAV 및 MV를 방출시키고, 이어서 -20 ℃ 이하에서 저온 보관한다.
냉동 보관된 세포에 3 회의 동결-해동 주기를 가하고 세포 파괴를 위해서 초음파 처리(10 내지 15 분)를 가한 다음, 세포 찌꺼기를 정화시키기 위해서 원심분리(2000 rpm, 4 ℃, 15 분)시키고, 이어서 현탁액을 수거하여 생 HAV 및 MV를 함유하는 바이러스 원료를 수득한다.
실시예 2
동결 건조된 A형 간염-홍역 복합 백신의 제조
동결 건조된 HM 복합 백신용 안정화제를 하기와 같이 제형화할 수 있다:
정제된 젤라틴 0.8g을 비등된 증류수 30 ㎖에 용해시키고, 생성된 용액을 오토클레이브에서 116 ℃에서 40 분간 멸균시킨다. 상기 용액을 실온으로 냉각시킨 후에, 0.22 ㎛의 밀리포어 필터를 통한 일련의 한외여과에 의해 멸균시킨 HSA 1.0 g을 젤라틴 용액에 가하여 젤라틴-HSA 용액을 수득한다. 이러는 동안, 트레할로즈 8.0 g, 글루탐산 나트륨 1.0 g, 아스코르브산 0.1 g, 우레아 2.5 g, 솔비톨 8.0 g 및 이노시톨 0.6 g을 상기 순서로 증류수 50 ㎖에 가하고, 생성된 혼합물을 교반하면서 37 ℃에서 24 시간 동안 예열한다. 다음 날, 상기 혼합물을 상기 젤라틴-HSA 용액에 가하고, 이어서 증류수를 여기에 가하여 총 부피를 100 ㎖로 만든다. 생성된 혼합물 용액의 pH를 0.1N HCl에 의해 약 7.0으로 조절하고 한외여과 멸균시켜 목적하는 안정화제 모액을 수득한다.
상기 안정화제 모액을 실시예 1에서 제조된 HM 복합 백신의 원료 현탁액과 약 1:1(v/v)의 비로 혼합하여 최종 복합 백신 제형을 제조한다. 여기에서, 안정화제는 상기 바이러스를 열 불활성화에 대해 안정화시키기에 충분한 농도로 존재한다.
이어서, 상기 백신 제형을 2 ㎖의 유리 바이알(1.2 ㎖/바이알)에 나누어 넣고 상기 바이알을 다단계 동결 건조 주기, 즉 -40 ℃에서 4 시간 동안의 예비 냉각을 위해 동결 건조기(모델 FS 150-SS 20C, Hull Co., USA)에 넣고, 이어서 보관 온도를 32 ℃로 점진적으로 증가시키고, 진공 하에서 15 시간 동안 건조시켜 동결 건조된 A형 간염-홍역 복합 백신을 수득한다.
실시예 3
동결 건조된 A형 간염-홍역 복합 생 백신의 보관 안정성 시험
상기 실험을 HM 복합 생 백신의 5 개의 일련의 생산 로트를 사용하여 수행하며, 이때 상기 백신의 샘플들을 상이한 기간 동안 2 내지 8 ℃, 25 ℃ 및 37 ℃에서 보관하고, 이어서 상기 2 가의 복합 백신 중의 HAV 및 MV의 바이러스 역가를 각각 측정한다.
이배체 세포 중의 세포병원성 효과(CPE)의 존재가 홍역 바이러스에 의해 야기되므로, 상기 홍역 바이러스를 HAV의 바이러스 역가의 탐지 전에 중화시켜야 한다. 이를 위해서, 동결 건조시킬 복합 백신의 샘플을 10 배 연속 희석하고, 10-2배 희석된 상기 샘플(0.1 ㎖)을 희석된 특이적인 항-MV 혈청(0.9 ㎖)에 가하고, 이어서 생성된 혼합물을 2 내지 8 ℃에서 밤새 배양한다. 다음 날, 중화된 백신 샘플을 10 배 연속 희석하고 10-3내지 10-8배 희석된 샘플을 융합성 이배체 세포 단층 상에 도말하고, 이어서 상기 세포를 배양한다. 4 주 후에, 상기 세포들을 수확하고 상기 개시된 방법에 의해 파괴시킨다. 원심분리에 의해 수거된 상등액을 ELISA 분석으로 HAV의 바이러스 역가를 탐지하는데 사용한다. 상기 값(Log CCID50/㎖)을 문헌[Reed, L.J. and Muench, H., Am. J. Hyg. 27:493-497, 1938]의 방법에 따라 측정한다.
다른 한편으로, 동결 건조된 HM 복합 백신 중에 존재하는 홍역 바이러스의 바이러스 역가를 측정하기 위해서, 상기 복합 백신의 각 샘플 및 홍역 바이러스 표준물(중국 베이징의 약제 및 생물학적 제품의 관리를 위한 국립 연구소에 의해 제공된 것)을 10 배 연속 희석하고, 10-2내지 10-6배 희석된 샘플을 베로(Vero) 세포 배양액 상에 접종하고, 상기 세포를 34 ℃에서 1 주일 간 배양한다.
배양을 완료한 후에, 바이러스 역가를 상기 개시된 통상적인 방법에 의해 측정한다. 결과를 하기 표 1 및 2에 나타낸다.
동결 건조용 안정화제의 존재 하에서 비록 총 5 개 로트의 HM 복합 백신이 지정된 기간 동안 지정된 온도에서 동결 건조 후 보관 시 log CCID50으로서 측정된 바이러스 역가가 약간 감소되었지만, 상기 감소는 그의 초기 동결 건조 상태(2 내지 8 ℃에서 0 일 간 보관)의 백신에 비해 0.5 log 미만임을 상기 표 1 및 2에 나타낸 데이터로부터 알 수 있다. 또한, 각각 2 내지 8 ℃에서 12 개월 간, 실온(25 ℃)에서 3 개월 간, 및 37 ℃에서 7일 간 보관된 본 발명의 동결 건조된 HM 복합 백신의 샘플들에 대해서, 상기 복합 백신 중에 함유된 HAV 및 MV는 모두 동결 건조에 이은 안정화제에 의해 제공된 탁월한 보관 안정성을 나타내었다.
실시예 4
2 가 HM 복합 백신의 안전성 및 면역원성을 입증하기 위한 동물 실험
본 실험에서, 실험 대상자로서 감수성 동물인 붉은털 원숭이를 무작위로 선택한다. HM 복합 백신의 안전성 및 면역원성을 평가하기 위해서 면역된 동물들을 생체내 실험에 사용한다. 실시예 1에 개시된 방법에 따라 제조된 동결 건조된 복합 백신 제형을 붉은털 원숭이(각 그룹은 5 마리의 동물을 포함한다)에게 정맥내(1.0 ㎖) 및 두개골내(0.5 ㎖)로 투여한다. 실험에서, 1 가의 A형 간염 백신 및 1 가의 홍역 백신을 모두 대조용 백신으로서 사용한다.
접종 후에, 마비, 및 기타 MV의 감염에 의해 야기된 CNS의 손상에 기인한 심각한 부작용들이 관찰되며, 21 일간 매일 기록한다. 간내 천자에 의해 상기 동물들로부터 수득한 일련의 간 생검법으로부터 마련된 조직 조각들을 조직의 병적인 변화에 대해 평가한다. 간 효소(글루탐산-피루브산 트랜스아미나제, GPT) 수준의 변화를 HAV의 감염에 의해 야기된 손상 수준을 평가하는데 사용한다.
생화학적 및 조직학적 조사는 상기 붉은털 원숭이들 중 어느 것도 HM 복합 백신 접종물로 인해 간 효소가 상승되지 않으며 실험 그룹의 동물들 중 어느 것도 접종 전 생검법 또는 유사한 1 가 백신 예방 접종 그룹에서 나타나는 것들보다 많은 뇌 조직 및 간 조직의 조직 병적인 변화를 나타내지 않음을 밝혔다. 똑같이, HM 백신 접종된 동물들의 뇌 및 간 조직에서 혈청전환과 일시적으로 관련된 생화학적 및 조직학적 변화는 없었다.
면역된 동물들의 혈청을 응집-억제(HI), 중화(TN) 및 효소 면역분석(EIA) 방법에 의해 시험한다. 중화 시험을 위해서, 시험할 혈청을 배양 배지로 상이한 희석율로 희석하고 56 ℃에서 30 분간 수욕에서 불활성화시킨다. 각 희석액100 ㎕를 100 CCID50/㎖을 함유하는 동일 부피의 HAV 또는 MV 현탁액과 혼합한다. 상기 혈청-바이러스 혼합물을 4 ℃에서 밤새 배양하여 중화 반응을 수행한다. 그 후에, 중화된 생성물 100 ㎕를 이배체 세포 단층 상에 접종한다. 각각의 혈청을 유사하게 시험한다. 35 ℃에서 2 시간 흡착시킨 후에, 배양 배지 15 ㎕를 가한다. 플레이트들을 35 ℃에서 28 일간 배양한다. 7, 14 및 28 일째에 상기 플레이트들을 -20 ℃ 이하에서 동결시키고 바이러스의 저온 방출을 위해 해동시킨다.
이어서, 각 세포 배양액 100 ㎕를 면역분석에 의한 HAV 또는 MV의 검출을 위해 다른 플레이트로 옮긴다(Groen, et al., J. Virological Methods 23:195-203, 1989). HI 및 EIA를 수행하고, 항-HAV 및 항-MV의 각 혈청전환율을 짝을 이루어 측정한다.
결과를 하기 표 3 및 4에 요약한다. 표 3에 제공된 데이터는 1, 3 및 5 번 로트로부터의 HM 복합 백신 접종 후 0, 2, 4 주 째의 혈청 GPT 효소 수준을 나타낸다. >25U/㎖의 혈청 GPT(SGPT) 수준은 간 효소의 비정상적인 상승으로 간주하며, 상기 두 항체들의 혈청전환율을 접종 후 0, 2, 4 주 째에 5 마리의 동물들에 대한 혈청전환율로서 나타낸다.
실시예 5
2 가 HM 복합 백신의 안전성 및 면역원성을 입증하기 위한 임상적 관찰
A형 간염-홍역 복합 백신의 안전성 및 면역원성을 평가하기 위해서 중국의 생물학적 생성물의 필요조건에 따라 예견되는 임상적 시험을 수행한다.
8 내지 12 개월 된 275 명의 건강한 유아를 3 개의 그룹으로 무작위로 나누고 하기의 각각의 백신을 투여한다: 1 가 A형 간염(그룹 M), 1 가 홍역 백신(그룹 M), 및 A형 간염과 홍역 백신(2 개의 별도의 주사기를 사용하여 동시에 또는 연속적으로 주사함)(그룹 HM). 본 실시예에 사용된 HAV 및 HV의 원료 현탁액을 HAV 균주 L-A-1 및 MV 균주 Change-47로부터 제조하며 감염 효능(바이러스 역가)은 각각 106.5및 104.0CCID50/㎖ 이상이다. 상기 백신들을 HA 백신의 경우에는 1.0 ㎖ 및 홍역 백신의 경우에는 0.2 ㎖의 투여량으로 삼각근 부위에 피하로 예방 접종한다.
예방 접종 후 72 시간 동안 국소적인 임상적 반응들(쓰림, 붉어짐 및 주사 부위의 부풀음) 및 예방 접종 후 42 일 간의 일반적인 임상적 반응(발열)에 대한 1 일 카드를 사용하여 부작용들을 기록한다. 붉어짐 및 부풀음을 1 등급(온화함)(직경<30 ㎜), 2 등급(보통)(>30 ㎜) 및 3 등급(심함)(>30 ㎜ 및 24 시간 이상 지속됨)으로 매긴다. 발열을 또한 혼화함(37.5 내지 38 ℃), 보통(>38.0 내지 39.0 ℃) 및 심함(>39 ℃)으로 등급 매긴다.
항-HAV 및 항-MV HI 항체, 및 GPT 효소를 예방 접종 전 및 예방 접종 후 4및 8 주 째에 시험한다. GPT 효소를 자동화된 효소 분석을 사용하여 발명자의 실험실에서 측정한다. 항-HAV 항체의 검출을 ELISA[애보트 캄파니 리미티드(Abbott Co., Ltd.)로부터 상업적으로 입수할 수 있음]에 의해 수행하고, 항-MV HI 항체의 검출은 상업적으로 입수할 수 있는 ELISA 키트를 사용하여 문헌[Rosen, L., Varology 13:139-141, 1961]에 따라 수행한다.
X2시험을 사용하여 그룹들 간의 국소적인 반응 및 일반적인 반응들의 발생 빈도를 비교한다. 면역원성의 비교를 위해서, 혈청전환율 및 혈청보호율, 및 항-HAV와 항-MV의 기하학적 평균 역가(GMT)를 각 그룹에 대해 계산한다. GMT들간의 차이를 스튜던츠 t-시험으로 측정한다.
관찰 결과는 HAV와 MV 백신을 동시에 접종한 103 명의 백신 접종자들 중 2 명(1.94%)이 온화한 일반적인 반응을 나타내었으며, 단지 한 사람(0.97%)만이 보통의 반응을 나타내었음을 보였다.
HAV와 MV 백신의 동시적인 예방 접종 및 HAV 백신의 단독적인 예방 접종 후 8 주 째에, 상기 백신 접종자들의 92.27%가 HM 그룹에서 항-HAV 항체에 대해 혈청양성이었고 H 그룹에서는 93.6%가 혈청양성이었으며, 이들 두 그룹들 간에 현저한 차이는 없었다(X2=0.19, p>0.05). 더욱이, HM 그룹에서의 HAV 및 MV 모두에 대한 GMT와 H 그룹에서의 HAV에 대한 GMT는 각각 5.005 ± 2.538 및 4.886 ± 2.610이었으며, 이들 두 그룹 간에 현저한 차이는 발견되지 않았다(t=0.86, p>0.05).
유사하게, HAV와 MV 백신의 동시적인 예방 접종 및 HAV 백신의 단독적인 예방 접종 후 8 주 째에, 상기 백신 접종자들의 98.05%가 HM 그룹에서 항-MV 항체에 대해 혈청양성이었고 M 그룹에서는 96.66%가 혈청양성이었으며, 이들 두 그룹들 간에 현저한 차이는 없었다(X2=0.204, p>0.05). 더욱이, HM 그룹에서의 HAV 및 MV 모두에 대한 GMT와 M 그룹에서의 MV에 대한 GMT는 각각 16.22 ± 2.29 및 13.93 ± 2.59이었으며, 이들 두 그룹 간에 현저한 차이는 발견되지 않았다(t=0.86, p>0.05).

Claims (11)

  1. 면역 반응 및 면역원성에 대해 어떠한 상호 간섭도 일으키지 않는, 예방학적 유효 역가의 감독된 A형 간염 생 바이러스 및 예방학적 유효 역가의 감독된 홍역 생 바이러스를 이들 생 바이러스에 대한 안정화제와 함께 또는 상기 없이 포함함을 특징으로 하는 A형 간염-홍역 복합 백신.
  2. 제 1 항에 있어서, A형 간염의 예방학적 유효 역가가 106.0CCID50/㎖ 이상이고 홍역 바이러스의 예방학적유효 역가가 103.5CCLD50/㎖ 이상인 A형 간염-홍역 복합 백신.
  3. 제 1 항에 있어서, 동결 건조된 형태로 제공된 A형 간염-홍역 복합 백신.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 감독된 생 바이러스용 안정화제가 동결 건조 전의 안정화된 생 백신 중의 농도 항으로 0 내지 2%(w/v)의 인간혈청 알부민, 0.5 내지 1%(w/v)의 젤라틴, 5 내지 10%(w/v)의 트레할로즈, 0.75 내지 1.5%(w/v)의 글루탐산 나트륨, 0.05 내지 0.55%(w/v)의 아스코르브산, 0.5 내지 2.8%(w/v)의 우레아, 5 내지 10%(w/v)의 만니톨 또는 솔비톨 또는 이들의 1:1(v/v) 혼합물, 및 0.5 내지 1%(w/v)의 이노시톨로 필수적으로 이루어진 A형 간염-홍역 복합 백신.
  5. 107.0CCID50/㎖ 이상의 바이러스 역가를 갖는 감독된 A형 간염 생 백신의 원료 물질을 104.5CCID50/㎖ 이상의 바이러스 역가를 갖는 감독된 홍역 생 백신의 원료 물질과 적합한 부피 비로 혼합함으로써 복합 백신의 원료 현탁액을 수득함을 포함하며, 이때 상기 현탁액의 A형 간염 바이러스의 역가가 106.5CCID50/㎖ 이상이고 상기 홍역 바이러스의 역가는 104.0CCID50/㎖ 이상인, 제 1 항의 A형 간염-홍역 복합 백신의 제조 방법.
  6. (a) 각각 감독된 A형 간염 생 바이러스 및 감독된 홍역 생 바이러스의 종자 바이러스를 제공하는 단계;
    (b) 상기 단계(a)로부터 수득된 A형 간염 바이러스의 종자 바이러스를 인간 태아 폐 이배체 섬유아세포 배양액에 접종한 다음 상기 세포를 배양하여 상기 바이러스를 증식시키는 단계;
    (c) A형 간염 바이러스-감염된 양성 세포가 75% 이상인 경우, 상기 단계(a)로부터 수득된 홍역 바이러스의 종자 바이러스를 상기 A형 간염 바이러스가 증식된 동일한 세포 단층 상에 접종하고, 상기 세포를 연속적으로 배양하는 단계;
    (d) A형 간염 바이러스-감염된 양성 세포가 면역 형광법으로 탐지 시 90% 이상이고 홍역 바이러스-감염된 양성 세포가 세포병원성 효과에 의해 탐지 시 90% 이상인 때에 상기 두 바이러스로 감염된 세포들을 수확하고 상기 두 바이러스를 함유하는 백신 원료 물질을 수거함으로써 목적하는 복합 백신을 수득하는 단계
    를 포함하는 제 1 항의 A형 간염-홍역 복합 백신의 제조 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 이배체 세포에 대한 양성 감염율 및 A형 간염 바이러스의 바이러스 역가를 면역 형광법 및 효소면역측정 분석을 포함하는 HAV-특이적인 탐지 시스템에 의해 탐지하는 방법.
  8. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, A형 간염-홍역 복합 백신의 원료 물질을 감독된 생 백신용 안정화제와 약 1:1의 부피 비로 혼합하고, 이어서 생성된 제형을동결 건조시킴으로써 A형 간염-홍역 복합 백신의 동결 건조된 제제를 수득함을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 동결 건조된 생 백신용의 안정화제가 동결 건조된 생 백신 제형 중의 농도 항으로 0 내지 2%(w/v)의 인간 혈청 알부민, 0.5 내지 1%(w/v)의 젤라틴, 5 내지 10%(w/v)의 트레할로즈, 0.75 내지 1.5%(w/v)의 글루탐산 나트륨, 0.05 내지 0.55%(w/v)의 아스코르브산, 0.5 내지 2.8%(w/v)의 우레아, 5 내지 10%(w/v)의 만니톨 또는 솔비톨 또는 이들의 1:1(v/v) 혼합물, 및 0.5 내지 1%(w/v)의 이노시톨로 필수적으로 이루어지는 방법.
  10. (a) 각각 예방학적 유효 역가의 감독된 A형 간염 생 바이러스 및 예방학적 유효 역가의 감독된 홍역 생 바이러스를 포함하는 원료 물질을 제공하고, 이들을 혼합하여 혼합된 백신 원료를 수득하는 단계;
    (b) 상기 단계(a)의 혼합된 백신 원료에 안정화제 모액을 약 1:1의 부피 비로 가하고 이들을 함께 혼합하여 복합 백신 제형을 수득하는 단계;
    (c) 상기 단계(b)로부터 수득된 복합 백신 제형을 동결 건조시키는 단계
    를 포함하는 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 A형 간염-홍역 복합 백신의 동결 건조된 제형의 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 단계(c)가 복합 백신 제형을 수성 현탁액의 형태로 약 -20 내지 -50 ℃에서 3 내지 6 시간에 걸쳐 예비 냉각시키고, 이어서 상기 온도를 -35 ℃에서 35 ℃로 증가시킴으로써 상기 생 백신 제형을 동결 건조기에서 건조시킴을 포함하는 방법.
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