KR810001234B1

KR810001234B1 - 호흡 합포체 왁진의 제조방법

Info

Publication number: KR810001234B1
Application number: KR7801342A
Authority: KR
Inventors: 버나뜨 부이낙 유진; 랄프 힐맨 모리스
Original assignee: 제임스 에프 · 너우톤; 맬크 앤드 캄파니, 인코포레이티드
Priority date: 1978-05-03
Filing date: 1978-05-03
Publication date: 1981-09-30

Abstract

내용 없음.

Description

호흡 합포체 왁진의 제조방법

본 발명은 인간의 2배체페 섬유아세포에서 호흡 합포체 왁진(syncytial Waccine)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세히 설명하면, 더욱 상세히 설명하면, 본 발명은 인간의 2배체페 섬유아세포에 계대통과시킨 후 생 감독(減毒) 호흡 합포체 바이러스 왁진을 전개하는 방법에 관한 것이다. 원래 단일 인간페로부터 유도된 WI-138 섬유아세포는 생물학적, 생화학적, 바이러스학적 및 유전학적으로 광범위한 특징이 있었다. 마찬가지로, 또한 단일인간페로부터 유도되였기는 하나 상이한 기체로부터 유도된 MRC-5섬유아세포 또한 표준화되었다. WI-38 섬유아세포는 Exper·Cill Res·25,585(1961)에 기술되어 있으며 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC CCL-75)으로 공탁되어 있다. MRC-5 섬유아세포는 Nature 227,168 (1970년 7월 11일)에 기술되어 있다. 인간의 2배체페 섬유아세포는 번식은 문헌에 기술된 표준방법 중 어느 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예컨대 인간의 2배체페 섬유아세포는 생장매체로서 10%의 가열하지 않은 송아지 혈청으로 보충시킨 BME(GIB-Diploid)를 사용한 유리병에서 재조되었다. 36℃에서 48-72시간 접종 후에 배지는 연속통과나 왁진접종에 사용될 수 있다.

본 발명의 공정은 가) 배지에서 어떤 다양한 세포에 있는 유독성 바이러스를 분리한 다음 인간의 2배체페 섬유아세포로 개작하고; 나) 다수의 계대통과에 의하여 인간의 2배체페 섬유아세포에서 감독(減毒)생바이러로 전재시키고; 다) 상술한 감독 생 바이러스로부터 왁진을 제조하는 단계로 구성되어 있다. 이들 공정단계를 각각 설명하면 다음과 같다.

가) 유독성 바이러스의 분리 및 개작

호흡 합포체 바이러스의 분리 및 개작은 예컨데 원숭이 신장과 같은 다른 류의 세포배지에서 공지방법으로 이미 번식시킨 바이러스를 사용하여 인간의 2배체페 섬유아세포에서 성취시킬 수 있다. 원숭이 신당과 같은 세포 배지에서의 분리는 임상물질(예, 후드 스위브(Swab))로부터 할 수 있다. 분리는 그와같은 배지에서 한번 또는 그 이상의 계대통과에 의하여 수행될 수 있다. 분리 후 바이러스를 인간의 2배체페 섬유아세포에서 약 3-30계대통과, 바람직하기로는 약 4-15계대통과시킨다. 이들 계대통과에 의하여 바이러스가 개작 및 감독된다. 인간의 2배체페 섬유아세포에서의 감염 배지의 접종은 약 30-38℃, 바람직하기로는 약 30-34℃(최적 온도는 약 32℃), 또는 약 35-38℃(최적 온도는 약 36℃)사이에서 실시할 수 있다.

나) 감독 생 호흡 합포체 왁진의 전개

가)에서 기술한 바와 같이 분리 및 개작한 바이러스를 인간의 2배체페 섬유아세포를 함유하고 있는 유리병에 가하였다. 배지는 세포생장을 돕는 것 중의 어느 것일 수 있으며, 이것은 예컨데 공지 독수리의 기초 매체(Eagle's basal medium)(BME) 또는 미리 스크린한 송아지 혈정으로 보충시킨 독수리의 균형 염용액(Eagle's balanced salt solution)(BSS) 중의 독수리의 최초필수매체(MEM)이다. 바이러스 첨가후, 감염세포 배지를 바이러스는 감독시키나 항원성 및 면역성을 보지하기에 효과적인 약 30-38℃에서 수회 계대통과시켜 접종한다. 일반적으로, 약 30-34℃, 바람직하기로는 약 30-34℃(최적 온도는 약 32℃) 또는 약 35-38℃(최적 온도는 약 36℃)에서 약 3-30계대통과 중에 바이러스는 다량(多量)으로 되어 감독된다.

상기 계대통과는 희석시키지 않았거나 희석시킨 접종물을 사용하여 수행하며, 다양한 간격으로 많은 수집물을 모은다. 적정은 관이나 팔콘 마이크로타이터 플레이트(Falcon microtiter plate)에서 HEP-2 세포 배지에서 수행한다.

수집한 바이러스는 냉동 또는 낮은 온도에서 저장하여 역가를 보존한다. 냉동시키기 전에 예컨데 솔비톨 또는 젤라틴과 같은 적당한 안정제 또는 적당한 안정제의 혼합물을 냉동 및 동결건조시킨 바이러스 생성물에 대한 안정성 시험으로부터 측정한 적당한 양으로 가한다.

다) 감독 바이러스로부터 왁진의 제조

계대통과, 전형적으로 약 3-10회 통과를 반복한 후 수집한 호흡 합포체 바이러스는 원숭이 및 설치류 동물에 대하여 비 병원성이며, 인간의 감수성에 있어서 거의 또는 전혀 임상반응이 나타나지 않으며, 만족스러운 중성항체 수준을 나타내었다. 적정하여 역가를 측정한 후 바이러스 풀(pool)을 세분한 후 사용하기 위하여 적당한 바이알(Vial)에 채웠다. 생성물은 냉동시켜 저장할 수 있으며, 또는 냉동상태로부터 건조시켜 수분이 없이 저장하는 것이 바람직하다.

본 발명을 실시예에 의거 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

감독 생 바이러스 왁진의 제조에 사용된 호흡 합포체 바이러스의 맬크(Merck)균주(287)를 후드 스워브 견본(National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institute of Health의 Dr. R. Chanock로부터 수령한 것)으로부터 분리하였다. 이 초기 접종물을 원숭이 신장세포 배지에 두 번, WI-38: 인간의 2배체페 섬유아세포에 4번 통과시켰다. WI-38 인간의 2배체페 섬유아세포를 생장매체로서 10%의 가열하지 않은 태아송아지 혈청으로 보충한 BME를 사용한 유리병에서 제조하였다. 이식한 지 2일 후 생장매체를 딸아버린 다음 매병당 5.0ml의 희석하지 않은 제4번째 통과한 종자 바이러로 접종하였다(필요에 따라 희석한 종자 바이러스를 사용할 수도 있음). 30-34℃에서 1시간 흡착시킨 다음 2%의 가열하지 않은 태아송아지 혈청을 함유한 MEM 100ml를 각 병에 가하고, 30-34℃에서 재접종하였다. 접종 3-4일 후 병의 배지를 한크르 비비에스(Hank's BBS)(100ml/1회)로 4회 세척하였다. 세척후 인간의 알부민과 같은 적당한 바이러스 안정제를 함유한 100ml의 MEM을 각 병에 가하고 배지를 30-34℃에서 접종하였다. 50mcg/ml 농도의 네오마이신을 생장 및 보육 배지에 혼합시켰다. 2-4일 간격으로 많은 수화물을 수집하고 병의 배지를 안정제를 함유한 새로운 보육배지로 제공급하였다. 동일부(part)의 솔비톨과 젤라틴의 혼합물로 구성된 바이러스 안정제를 쉘(Shell) 냉동전에 가하고 -70℃(전기로 작동시켜)에서 저장하였다. 감염성 적정을 완료후 하나 또는 그 이상의 적당한 수집물을 선택하였다. 선택한 물질을 냉동기로부터 꺼내어 해방시켰다. 시료를 억제 및 안전도 시험을 하기 위하여 꺼내었다. 나며지 액체는 정화시키고, 시료를 원숭이 안전도 시험을 하기 위하여 꺼내었다. 액체를 각각의 바이알(Vial)에 분배하고 냉동건조시켰다. 냉동 건조 후 바이알은 무균수(주사용 물, U.S.P)를 가하여 왁진으로서 재 복원시키기 위하여 갭을 씌워 봉하여 보존하였다.

생성물의 역가는 HEP-2 세포배지에서 감염도 적정에 기초한 것이다.

[실시예 2]

WI-38 인간의 2배체 섬유아세포에 4번이 아닌 9번의 계대통과를 사용한 것 이외에는 실시예 1의 공정을 반복하였다.

[실시예 3]

호흡 합포체 바이러스의 배양온도가 30-34℃가 아닌 35-38℃인 것 이외에는 실시예 1의 공정을 반복하였다.

[실시예 4]

전에 호흡 합포체 바이러스 감염이 없었던 8마리의 병아리에 비 경구적으로 실시예 1의 감독 호흡 합포체 바이러스 왁진의 용량으로 투여하였다. 왁진 접종후 6주 내에 근본적으로 이들 모든 병아리는 상당한 수준의 중성 항체로 전개되었다. 임상반응은 순조로웠다.

[실시예 5]

전에 호흡 합포체 바이러스 감염이 없었던 7마리의 병아리에 비 경구적으로 실시예 2의 감독 호흡 합포체 바이러스 왁진의 용량으로 투여하였다. 왁진 접종후 6주 내에 근본적으로 이들 모든 병아리는 상당한 수준의 중성 항체로 전개되었다. 임상반응은 순조로웠다.

[실시예 6]

실시예 1 및 2에서 기술한 방법으로 제조한 바이러스 시료를 냉동시켜 18개월 이상 -70℃에서 저장하였다. 해빙하여 시료의 역가를 측정해 본 결과 근본적으로 변하지 않았었다.

[실시예 7]

실시예 1 및 2에서 기술한 방법으로 제조한 바이러스 시료를 냉동건조시켜 18개월 이상 -20℃에서 저장하였다. 재복원 후 시료의 역가를 측정해 본 결과 근본적으로 변하지 않았었다.

Claims

바이러스를 감독(減毒)시키나 항원성 및 면역원성은 보지하기에 효과적인 약 30-38℃의 배양온도에서 수회에 걸쳐 인간의 2배체페 섬유아세포 중에서 호흡 합포체(合胞體)바이러스를 계대통과시키고 얻어진 바이러스를 수집하는 것으로 되는 감독 호흡 합포체 바이러스의 제조방법.