MXPA01002197A - Virus de parainfluenza humana tipo 2 (hpiv-2) adaptado al frio y sensible a la temperatura y vacunas a base de dicho virus. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a cepas virales atenuadas, aisladas de virus de parainfluenza humana 2 (HPIV-2), que son utiles en preparaciones de vacunas vivas; estas cepas exhiben un fenotipo adaptado al frio y sensible a la temperatura util para estimular una respuesta inmunologica protectora en un mamifero inoculado sin producir sintomas graves.

Description

VIRUS DE PARAINFLUENZA HUMANA TIPO 2 (HPIV-2) ADAPTADO AL FRIÓ Y SENSIBLE A LA TEMPERATURA. Y VACUNAS A BASE DE DICHO VIRUS ANTECEDENTES DE LA INVENCION La presente invención se refiere a cepas virales aisladas, atenuadas de virus de parainfluenza humana tipo 2 (HPIV-2), que son útiles en preparaciones de vacuna viva. Estas cepas presentan un fenotipo adaptado al frío y sensible a la temperatura útil para estimular una respuesta inmunológica protectora en un mamífero inoculado sin producir los síntomas graves provocados por el virus de tipo silvestre. Los virus de parainfluenza humana (HPIV), tipos 1 , 2 y 3, son patógenos importantes en infantes y niños pequeños. El HPIV provoca habitualmente otitis media, faringitis y el resfriado común. Estas infecciones del tracto respiratorio superior (URI) ocurren comúnmente y pueden asociarse con infecciones del tracto respiratorio inferior (LRI) incluyendo crup, neumonía, y bronquiolitis. La infección primaria en niños pequeños es asociada con enfermedades del tracto respiratorio inferior y con frecuencia conduce a hospitalización. Como grupo, los virus de parainfluenza son la segunda causa más común de admisión al hospital por infecciones respiratorias y son secundarios únicamente para virus sincitial respiratorio como un patógeno importante en niños pequeños. La parainfluenza tipo 3 es única entre los virus de parainfluenza en su capacidad de infectar comúnmente niños pequeños de menos de 6 meses de edad. La bronquiolitis y neumonía son comunes en infantes infectados con este tipo; a este respecto, HPIV-3 es similar al virus sincitial respiratorio. Algunos reportes sobre el HPIV han sido recientemente publicados (Ray y Compans, 1990; Kingsbury, 1991 ; Henrickson et al., 1994) con respecto a los diversos aspectos de las ¡nfecciones por virus. La infección por HPIV-2 ocurre en brotes anuales en los Estados Unidos (Downham eí al., 1974). Este patógeno tiene una incidencia pico en el otoño a principios de invierno con una "estación" ligeramente más larga que el HPIV-1. El crup es la LRI más frecuente provocada por este virus, pero también puede provocar cualquiera de las enfermedades respiratorias asociadas con HPIV-1. La incidencia pico de infecciones por HPIV-2 ocurren en segundo año de vida con aproximadamente el 60% de infecciones presentándose en niños de menos de 5 años de edad. Resulta interesante la observación en un estudio que más niñas que niños eran sintomáticos con LRI provocada por HPIV-2, que LRI provocada por HPIV-1 ó 3 (Downham eí al., 1974). La LRI provocada por HPIV-2 ha sido reportada con menos frecuencia que por HPIV-1 y HPIV-3. Informes recientes han indicado que las diferencias geográficas o las diferencias en técnicas de aislamiento y detección pueden jugar un papel importante en la escasa información de este virus (Downham eí al., 1974; Henrickson eí al., 1994). Se ha calculado que durante la epidemia de 1991 , 157,000 niños de menos de 5 años de edad se observaron en salas de emergencia, y 35,000 ingresaron a hospitales de los Estados Unidos con infección con HPIV-2. Esta epidemia dio como resultado en casi $200 millones de costos directos para el cuidado de pacientes para HPIV-1 y HPIV-2 combinados. Todos los virus de parainfluenza humana son muy similares en características estructurales, físico-químicas y biológicas. Un virión de HPIV prototípico está compuesto de una sola cadena de ARN de polaridad negativa rodeada por un sobre lípido de origen de célula hospedero. Estos son virus pleiomórficos, o multiformados, que tienen un diámetro promedio de 150-250 nm. El genoma de HPIV típico contiene aproximadamente 15,000 nucleótidos de información genética (Storey eí al., 1984) y codifica por lo menos para seis proteínas virales (3"-NP-P(+C)M-F-HN-L-5') (Storey eí al., 1984). Además, HPIV-1 , 2, y 3 codifica para una proteína no estructural adicional, "C" y HPIV-2 una proteína "V". Estas proteínas son producidas a partir del traslapo de marcos de lectura dentro del gen P y pueden requerir edición del ARNm (Matsuoka et al., 1991). La secuencia completa de nucleótidos del genoma de HPIV-2 no ha sido publicada. Los virus de parainfluenza humana son clasificados dentro de los Paramixoviridae. Existen cinco serotipos principales dentro de este grupo: los HIPV's 1-4, y el virus pauperal. Los serotipos de HPIV pueden agruparse antigénicamente en dos divisiones: (1) HPIV-1 y HPIV-3, dentro del género Paramixovirus, y (2) HPIV-2 y HPIV-4, dentro del género Rubulavirus (Collins eí al., 1996). Los HPIVs que comparten antígenos comunes y niveles variables de anticuerpo heterotípico son frecuentemente detectados durante la infección. Por lo tanto, es difícil determinar si las respuestas heterotípicas son reflejo de infecciones pasadas, o simplemente son reacciones cruzadas a antígenos similares durante la prueba serológica. Sin embargo, el suero de animal hiperinmune específico en el pasado y, más recientemente, anticuerpos monoclonales han sido empleados para diferenciar estos virus en pruebas estándares (Sarkkinen et al., 1981). Las membranas mucosas de la nariz y garganta son el sitio inicial de la infección por virus de parainfluenza. Los pacientes con enfermedad ligera pueden tener también implicación limitada de los bronquios. La laringe y la traquea superior se involucran en infecciones más extensas con HPIV-1 y HPIV-2, y resultan en el síndrome de crup. Las ¡nfecciones también pueden extenderse a la traquea inferior y bronquios, con acumulación de mucosa espesa y atelectasis resultante (expansión de pulmones incompleta) y neumonía. La contribución posible de la respuesta ¡nmunológica a la patogénesis de esta enfermedad es sugerida por la observación de que infantes y niños que desarrollan crup por virus de parainfluenza producen anticuerpos IgE específicos de virus, locales más rápidamente y en cantidades más grandes que los pacientes de edad comparable que desarrollan ¡nfecciones restringidas al tracto respiratorio superior (Welliver eí al., 1982). Se ha indicado que las respuestas inmunológicas mediadas por células a los antígenos virales de parainfluenza, así como respuestas de anticuerpos IgE específicos de virus de parainfluenza, son mayores entre los infantes con bronquiolitis de virus de parainfluenza que entre los infantes infectados que sólo desarrollan enfermedades de tracto respiratorio superior. Un estado prolongado de HPIV-3 se observa en pacientes con bronquitis crónica y enfisema (Gross eí al., 1973). Se ha sugerido que los adultos sanos pueden alojar virus infecciosos intermitentemente e infectar individuos susceptibles; además, los investigadores también han sugerido que puede ocurrir infección persistente (Parkinson et al., 1980). El hámster provee un modelo animal reconocido para la infección por HPIV. Los animales infectados desarrollan cambios patológicos reconocibles en el pulmón que no son alterados por la administración pasiva de anticuerpos (Glezen y Femald, 1976). Los hámsters infectados no muestran signos visibles de enfermedades respiratorias o una pérdida de peso importante durante la infección. Además, los monos pueden utilizarse como un modelo animal de infección, como se demuestra en los ejemplos 4-6 posteriores. Una variedad de vacunas han sido desarrolladas con el transcurso de los años para prevenir diversas infecciones virales en animales y humanos. Dos tipos principales de vacunas han sido utilizados: virus muertos y virus vivos atenuados. Un virus muerto es típicamente inactivo por tratamiento químico o físico, pero es generalmente menos efectivo para estimular una respuesta inmunológica durable que un virus vivo atenuado. Los virus vivos atenuados son típicamente más efectivos, pero pueden regresar a su estado virulento mientras estén en el cuerpo. El tiempo y los costos involucrados para desarrollar vacunas muertas o vivas es importante. Las vacunas atenuadas, vivas pueden obtenerse directamente de virus de progenie aislado de animales infectados. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 3,927,209 a Straub describe una vacuna de parainfluenza tipo 3 como una cepa de virus a partir de un tracto respiratorio de bovino. Las vacunas atenuadas vivas también pueden obtenerse pasando en frío repetidas veces una cepa de tipo silvestre a través de cultivos adecuados hasta que el virus ha perdido sus propiedades patogénicas originales. Un "pasaje en frío" es el crecimiento de un virus a través de un ciclo de vida completo (infección de la célula hospedero, proliferación en la célula hospedero y escape de la célula hospedero) a una temperatura inferior de la que el virus normalmente se replica. Por ejemplo, cp45, una cepa sensible a temperatura, adaptada al frío se obtuvo pasando el virus de tipo silvestre (cepa JS) de HPIV-3, 45 veces a temperaturas reducidas. (Beishe y Hissom, 1982). La cepa cp45 sensible a temperatura se encuentra actualmente bajo evaluación para usarse como una vacuna candidato para HPIV-3 en humanos. (Karron et al. 1995; Hall et al. 1993; Beishe et al. 1992; Clements et al 1991); Crookshanks-Newman y Beishe 1986). Evaluaciones recientes en niños han revelado que la cepa Cp45 es sumamente atenuada y efectiva para estimular una respuesta inmunogénica. (Karron et al. 1995; Beishe et al. 1992). Aunque las técnicas de pasaje en frío también han sido utilizadas para producir cepas de vacuna de influenza A y B, no se ha descrito un pasaje en frío similar exitoso de un virus de HPIV-2. La disminución en una cepa de vacuna particular es evaluada comúnmente con respecto a tres fenotipos de la cepa: adaptación al frío, sensibilidad a la temperatura y tamaño de placa o producción en cultivo de tejido. La adaptación al frío (ca) se refiere a la capacidad del virus para crecer a temperaturas reducidas de alrededor de 25°C y la sensibilidad a la temperatura (ts) se refiere a si dicho crecimiento es inhibido a temperaturas de alrededor de 40°C. Los títulos de placa son una prueba para evaluar cuantitativamente el grado de crecimiento de virus, y se utilizan comúnmente para evaluar el grado de fenotipos que se adaptan al frío y/o sensibles a la temperatura. Otros métodos para determinar si la vacuna es atenuada involucran administrar la vacuna a primates. Por ejemplo, la disminución de lotes de nuevas vacunas de polio es típicamente probada en monos antes de aceptar su venta por la FDA. Dada la propensión de la enfermedad por HPIV-2 para provocar sufrimiento respiratorio severo en infantes y niños pequeños, una vacuna que evitará la infección grave, y la necesidad resultante de hospitalización y tratamiento, es muy conveniente. Aunque la necesidad de una vacuna de HPIV-2 ha sido reconocida durante dos décadas, y a pesar de los éxitos en aislar cepas de vacuna para HPIV-3 a principios de los años 80, actualmente no hay una vacuna disponible para inmunizar niños contra HPIV-2. Antes del descubrimiento de los solicitantes, el HPIV-2 no se había hecho pasar en frío con éxito. La dificultad en aislar cepas atenuadas del virus HPIV-2, en comparación con el virus HPIV-3, puede explicarse por las diferencias morfológicas y fenotípicas considerables entres los dos virus. Aunque son antigénicamente similares, el HPIV-2 es más difícil de adaptar a condiciones de crecimiento in vitro y a temperaturas reducidas en comparación con HPIV-3.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Por lo tanto, es un objeto de la invención proveer cepas de vacuna de HPIV-2 que pueden utilizarse para inmunizar mamíferos, incluyendo humanos, contra infección por HPIV-2 de tipo silvestre. Otro objeto de la invención es proveer cepas de vacuna que se reducen en gran medida en síntomas producidos por la infección de cepa de vacuna, en comparación con la infección con una cepa de virus HPIV-2 de tipo silvestre. Otro objeto de la invención es proveer una cepa de vacuna de HPIV-2 que generará una respuesta inmunológica protectora en el paciente al que se le administre. Los solicitantes han desarrollado y aislado cepas de vacuna adaptadas al frío de HPIV-2 de la cepa de HPIV-2 de tipo silvestre de la Saint Louis University designada SLU 7255. Ahora diversas cepas atenuadas han sido aisladas que tienen el fenotipo deseable de adaptación al frío y sensibilidad a la temperatura.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a cepas atenuadas, aisladas de HPIV-2 que presentan las propiedades fenotípicas de adaptación al frío y sensibilidad a la temperatura. Las cepas aisladas preferidas con estas características son aquellas designadas C3396, C3464, C3440 y C3444. Las cepas aisladas más preferidas son aquellas designadas C3464, C3490 y C3440. Además, ia presente invención se refiere a cepas atenuadas, aisladas de HPIV-2 que presentan los fenotipos de sensibilidad a la temperatura y adaptación al frío que son la progenie o los sub-clones de las cepas aisladas designadas C3396, C3464, C3490, C3440 y C3444. Además, la presente invención se refiere a composiciones de vacuna para usarse como vacunas atenuadas, vivas que comprenden cualquiera de las cepas virales de HPIV-2 descritas con anterioridad y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones también pueden incluir cualquier excipiente, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La presente invención también se refiere a un método para producir una respuesta inmunológica protectora en un mamífero inoculando el mamífero con una cepa viral, atenuada viva de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un diagrama de pasaje en frío que muestra el lineamiento de cepas virales aisladas C3440 y C3490, descritas en la descripción. La figura 2 es una gráfica que muestra los títulos virales activos de lavados nasales recolectados de hámsters que han sido inoculados con las cepas C3490 (B), C3440 (D), C3464 (4-), o la cepa de tipo silvestre, grupo 453 (0). La figura 3 es una gráfica que muestra los títulos virales activos de lavados bronquiales/pulmonares recolectados de hámsters que han sido inoculados con la cepa C3490 (B), C3440 (D), C3464 (*•), o con la cepa de tipo silvestre, grupo 453 (0).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION A diferencia del HPIV-3, las cepas de tipo silvestre de HPIV-2 que pueden cultivarse y mantenerse in vitro exitosamente han probado ser difíciles de aislar. Los solicitantes evaluaron alrededor de cincuenta cepas de virus de tipo silvestre recogidas de diversos antes de descubrir una cepa de tipo silvestre que podría mantenerse exitosamente en un cultivo in vitro. Como se muestra en la descripción posterior, los solicitantes han desarrollado cepas virales aisladas sensibles a la temperatura (ts) y adaptadas al frío (ca) a partir de cepas virales de HPIV-2 de tipo silvestre (wt) no adaptadas al frío y no sensibles a la temperatura. Como se muestra en la figura 1 , el solicitante modificó exitosamente la cepa de tipo silvestre de HPIV-2 para cultivar a temperaturas reducidas, creando cepas preferiblemente adaptadas a menos de 30°C, muy preferiblemente a menos de 26°C, y todavía muy preferiblemente a menos de aproximadamente 24°C. Estas cepas adaptadas al frío son evaluadas para confirmar que son apropiadamente sensibles a la temperatura. Los solicitantes han descubierto que una fracción de las cepas adaptadas al frío exhibirán sensibilidad a la temperatura al grado necesario para evitar crecimiento viral y proliferación en el tractor respiratorio inferior, y los síntomas graves acompañantes de enfermedades por HPIV-2. La combinación de fenotipos ca y ts de estas cepas desarrolladas las convierte en cepas excelentes atenuadas para usarse como vacunas vivas contra la infección por HPIV-2, ya que son capaces de crecer sin restricción a temperaturas de producción más frías, y son atenuadas en el paciente en el que son administradas. Aunque una cepa de tipo silvestre de HPIV-2 particular se utilizó para desarrollar las cepas descritas posteriormente, se cree que cualquier cepa wt que pueda mantenerse como un cultivo in vitro puede utilizarse para desarrollar una cepa atenuada de ts y ca de HPIV-2 utilizando los métodos demostrados por el solicitante. Las células de pulmón de mono Rhesus fetal (FRhL-2) son preferidas como hospederos para pasar en frío, ya que son células muy bien caracterizadas utilizadas en estudios de vacuna. Sin embargo, otras células hospedero de mamífero cultivadas se contemplan para usarse en la producción de cepas virales atenuadas de la presente invención. Asimismo, un experto en la técnica podrá elegir modificar la técnica de pasaje en frío, utilizando diferentes temperaturas o números de pasadas en frío a cada temperatura. Sin embargo, dicha modificación preferiblemente mantendrá temperaturas gradualmente escaladas, similares a las que se describen posteriormente por los solicitantes. La cepa SLU 7255 del virus de parainfluenza tipo 2 (HPIV-2) se aisló de un niño de 6 meses de edad hospitalizado con crup y neumonía (depositado con el ATCC, número de acceso ). Aunque originalmente se aisló en células de riñon de mono Rhesus (RMK), SLU 7255 se adaptó para crecer en células de pulmón de Rhesus fetal (FRhL-2), una línea de células diploides utilizada para estudios de vacuna. Después de la adaptación de las células FRhL, SLU 7255 se hizo pasar en frío en forma serial (<30°C) para producir candidatos de vacuna en un modo similar a la cepa JS de HPIV-3, descrita en Beishe and Hissom, 1982, incorporada en la presente como referencia. La cepa de tipo silvestre se pasó primero 6 veces a 30°C, luego 6 veces a 28°C, luego 8 veces a 26°C, luego 13 veces a 24°C. Véase la figura 1 para un diagrama del procedimiento de pasaje en frío. Los solicitantes se sorprendieron al encontrar que la temperatura de pasaje en frío debía ser disminuida gradualmente para poder adaptar exitosamente el virus HPIV-2, a diferencia de HPIV-3, que puede hacerse pasar en frío inmediatamente a 22°C. Después de la adaptación en frío, los clones se seleccionaron pasando una pipeta de Pasteur a través de un depósito de agarosa utilizando una técnica de ensayo de placa estándar en células de riñon de mono verde africano primarias (AGMK), aspirando el cúmulo de agar, e inoculando el clon en un tubo de cultivo de tejido que contenía células AGMK primarias. Después de una selección primaria de clones, los clones C2450 y C2768 se hicieron pasar en frío adicionalmente alrededor de 18-30 veces a 23-24°C para producir los clones aislados C3464 (depositados con el ATCC, No. de acceso ), C3440 (depositado con el ATCC, No. de acceso ), y C3490 (depositado con el ATCC, No. de acceso J (subclonado posteriormente para producir C3605). Previamente no se había descrito un pasaje en frío exitoso del virus HPIV-2. Para determinar si los clones de HPIV-2 eran sensibles a la temperatura, los títulos de cada clon a 32°C y 39°C se compararon utilizando el ensayo de placa de hemadsorción. Un clon es considerado como "sensible a la temperatura" cuando presenta una disminución de > 100 veces en título a 39°C en comparación con su título a 32°C, y, por el contrario, se considera como un virus de tipo silvestre si presenta una disminución de <100 veces en título a 39°C en comparación con 32°C. Preferiblemente, un clon tiene un título de <1.0 pfu/ml a 39°C. Los resultados de la fenotipificación ts utilizando el ensayo de selección de hemadsorción mostraron que la mayoría de los clones evaluados presentaban el fenotipo ts. Para determinar si los clones poseían la propiedad de adaptarse al frío, se comparó su crecimiento a 23°C con su crecimiento a 32°C. Véase cuadro 1. Cada uno de los clones se inoculó en monocapas de tubo de cultivo de tejido de células Vero o células AGMK primarias (no se muestran datos) y se incubaron a 23°C o a 32°C. Los cultivos en tubo se cosecharon a partir de cada uno de los clones en el día 7 y el día 14 después de la inoculación cuando se incubaron a 23°C y en el día 7 después de la inoculación cuando se incubaron a 32°C. El título de virus en sobrenadantes de cultivo se determinó por ensayo de placa en placa probada a 32°C sobre células Vero. Las placas se visualizaron tiñendo las células con hematoxilina y eosina después de 5 días. Un clon que tenía un título a 23°C que estaba dentro de cien veces su título a 32°C se consideró como adaptado al frío (ca). Seis de los clones probados se adaptaron en frío, sin embargo, uno de ellos, C3252, no creció a ninguna temperatura. En contraste con los clones adaptados a frío (C3396, C3464, C3490, C3457, C3440, y C3444), el control progenitor de tipo silvestre, grupo 453, no creció en células Vero a 23°C. La eficacia de ensayos de placa (EOP) se llevó a cabo para determinar la temperatura de corte de cada clon. Cada candidato de vacuna se analizó para su capacidad de producir placas en células Vero a 32°C, 37°C, 38°C, y 39°C. Véase cuadro 2. C3464, C3490, C3457, C3440, y C3252 exhibieron una temperatura de corte de 38°C al mismo tiempo que dos de los clones (C3396 y C3252) se restringieron a 1000 veces en crecimiento a 39°C en comparación con su crecimiento a 32°C.

Clones distintos de C3396, C3464, C3490, C3457, C3440, y C3444 que son desarrollados y aislados del virus HPIV-2 de tipo silvestre de manera similar a la que se describe por el solicitante y que también presentan el fenotipo ts y ca están dentro del alcance de la presente invención. Siguiendo ios ejemplos y enseñanzas establecidas en esta descripción, un experto en la técnica será capaz de desarrollar y aislar clones ts y ca de virus HPIV-2 de tipo silvestre utilizando métodos tradicionales. De manera adicional, dentro de las habilidades de un experto en la técnica de virología está comprendido pasar en frío subclones de las cepas descritas preferidas, o adaptar estas cepas para cultivo en otras células hospedero utilizando métodos establecidos. Por lo tanto, los subclones y progenie de las cepas anteriores preferidas también están dentro del alcance de la presente invención. Como se muestra en los ejemplos más adelante, las cepas virales aisladas de la presente invención son útiles en composiciones de vacuna para inducir una respuesta inmunológica protectora en mamíferos. Una cepa viral de HPIV-2 atenuada, aislada de la presente invención se administra preferiblemente como una vacuna viva en una cantidad efectiva que permite cierto crecimiento y proliferación del virus, para poder producir la respuesta inmunológica deseada, pero que no producirá síntomas de enfermedad por HPIV-2. La cantidad apropiada del virus para usarse en la vacuna viva dependerá de diversos factores, incluyendo: la virulencia o dureza de la cepa de HPIV-2 atenuada, aislada particular; la edad del paciente al cual se administra la vacuna; la masa corporal y la salud general del paciente al cual se le administrará la vacuna; y si el sistema inmunológico del paciente al cual se le administrará la vacuna está comprometido. Las cepas atenuadas, aisladas de HPIV-2 de la presente invención pueden formularse en composiciones de vacuna para administración a un paciente mediante cualquier ruta normal (como una inyección intraperitoneal o intravenosa, formulación tópicamente aplicable, formulación de administración oral, etc.), pero preferiblemente se formula como una aspersión o lavado para aplicación a la mucosa del tracto respiratorio superior. Dicha aplicación ayudará a estimular la inmunidad mucosa local, que ofrecerá una mayor protección contra infección posterior por el virus de tipo silvestre de HPIV-2. Dichas formulaciones de vacuna comprenden el virus aislado, atenuado de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina estéril. Además, la formulación de vacuna puede comprender excipientes, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables que ayudan a producir una respuesta inmunológica protectora en el paciente. Los excipientes que pueden utilizarse en las formulaciones de vacuna de la presente invención incluyen agentes que ayudarán a adherir el virus a la mucosa y esparcirlo a lo largo de la de la superficie del tracto respiratorio superior, tales como gomas o almidones. Las cepas aisladas, atenuadas de HPIV-2 de la presente invención pueden administrarse en formulaciones de vacuna a pacientes mamíferos para poder producir una respuesta inmunológica protectora. Después de la vacunación, el sistema inmunológico del paciente presentará una respuesta inmunológica iniciada a desafíos con un virus de HPIV-2 de tipo silvestre, moderando la gravedad de la infección y enfermedad por HPIV-2. Aunque las cepas de vacuna de la presente invención pretenden usarse con pacientes humanos, el uso con otros mamíferos que presentan síntomas perjudiciales con infección por HPIV-2 también es contemplado dentro del alcance de la invención. Las cepas de vacuna de la presente invención se administran preferiblemente al paciente a una edad joven para poder evitar infecciones por HPIV-2 más graves, que con frecuencia ocurren en la infancia. Aunque se anticipa actualmente que una sola administración de la cepa de vacuna de la presente invención será suficiente para inducir una respuesta inmunológica iniciada a desafíos posteriores con el virus de HPIV-2 de tipo silvestre, más de una administración puede indicarse con base en los factores similares a aquellos para dosificación, listados anteriormente. Un experto en la técnica será capaz de seleccionar el régimen de dosificación apropiado para un paciente particular sin experimentación indebida. A continuación se ilustran diversos ejemplos del uso de las cepas de HPIV-2 atenuadas, aisladas de la presente invención. Deberá apreciarse que se ofrecen como ilustraciones de la invención, y no intentan limitar las modalidades de la invención de ninguna manera.

EJEMPLO 1 Con base en sus características fenotípicas, 3 de los clones de ts y ca, C3440, C3464, y C3490, se seleccionaron para evaluación en hámsters. El cuadro 3 ilustra el fenotipo ts y ca de estos clones seleccionados y el progenitor wt de estos candidatos de vacuna de HPIV-2. Los hámsters destetados se anestesiaron profundamente y se inocularon intranasalmente con el virus de tipo silvestre progenitor o uno de los candidatos de vacuna. El título del inoculo recibido por los hámsters se muestra en el cuadro 4. Cada animal recibió un inoculo total de 0.1 ml (0.05 ml/fosa nasal) utilizando una micropipeteador con puntas de pipeta resistentes de aerosol para evitar contaminación cruzada. Grupos de veinte hámsters se inocularon con uno de los candidatos de vacuna o el virus progenitor de tipo silvestre. Cuatro hámsters de cada grupo se sometieron a eutanasia a cinco puntos de tiempo, día 1 , 2, 3, 4 y 7 después de la inoculación. Diez animales sin inocular se sometieron a eutanasia (dos en cada uno de los cinco puntos de tiempo) como un grupo de control. Se recogió sangre por punción cardiaca y los turbinados nasales y pulmones se removieron de cada animal en el día de la cosecha. Cada homogenato de tejido se probó para virus mediante ensayo de placa sobre células Vero a 32°C durante 5 días. Las monocapas Vero se fijaron con formaldehído y se tiñeron con hematoxilina y eosina para visualizar placas de virus.

El HPIV-2 progenitor de tipo silvestre creció bien tanto en los turbinados nasales como en los pulmones de los hámsters (véanse figuras 2 y 3). La duración de la difusión de virus fue de 4 días con un título pico de 5.5 pfu/gm de tejido (todos los valores pfu/gm en estos ejemplos son en log-io) en turbinados nasales en el día 3 y un título pico promedio de 5.2 pfu/gm de tejido en los pulmones en el día 2. El clon 3490, cp51 , se difundió desde el día 3 al día 7 en los turbinados nasales de los hámsters. El título pico promedio de C3490 fue de 4.5 pfu/gm de tejido recuperado en el día 7. HPIV-2 se recuperó de sólo algunos animales inoculados con C3440 o C3464 indicando que los clones eran poco infecciosos. El virus no se recuperó de los pulmones de ningún animal inoculado con uno de los tres clones adaptados al frío. Estos tres clones sensibles a la temperatura y adaptados al frío se atenuaron en hámsters y pueden utilizarse para caracterización in vivo adicional.

EJEMPLO 2 Cada uno de los clones evaluado en hámsters también se probó para estabilidad genética in vivo. Se llevó a cabo una prueba de tensión sobre cada uno de los clones pasándolos en forma serial una vez a la semana durante cuatro semanas a la temperatura permisiva (32°), una temperatura intermedia permisiva (35°C), y la temperatura restrictiva (39°C), para determinar si los virus podían revertir el fenotipo de tipo silvestre bajo presión selectiva contra el fenotipo ts. Los resultados de la prueba de tensión se muestran en el cuadro 5. Después de cada pasada, el virus se título a 32° y a 39°C para detectar cambios en el fenotipo ts. Cada uno de los clones retuvo su fenotipo ts después de un pasaje serial a 39°C indicando que son genéticamente estables. Además de la prueba de tensión se seleccionaron placas de cada uno de los tres virus pasados en frío para determinar si había una mezcla de fenotipos de virus dentro de los grupos de virus (cuadro 6). Cada uno de los 10 subclones seleccionados del grupo 474 (clon 3490) eran evidentemente ts y presentaron un corte completo a 39°C. Dos de los 10 subclones del grupo 477 (clone 3440) exhibieron cierto crecimiento a 39°C pero tenían títulos de por lo menos 100 veces menos a 39°C en comparación con 32°C. Los 6 subclones del grupo 484 (clon 3464) tenían un corte completo a 39°C y retuvieron su fenotipo ts. Estos resultados indican que el clon 3490 y clon 3464 tenían un solo fenotipo en contraste con el clon 3440 que tenía una mezcla de fenotipos. Se seleccionó un subclon (C3605) a partir de C3440 para poder tener un candidato de vacuna más homogéneo.

EJEMPLO 3 Tres clones de SLU 7255 que surgieron como los candidatos de vacuna más prometedores, C3464 (cp50), C3490 (cp63) y C3605 (cp47, un subclon de C3440). Estos tres se evaluaron en monos Rhesus seronegativos. Los grupos de virus se prepararon en células Vero para cada uno de los clones y el virus de tipo silvestre. Los títulos de los grupos utilizados en los siguientes ejemplos se muestran en el cuadro 7.

EJEMPLO 4 El objetivo de este experimento era evaluar la capacidad de HPIV2 de tipo silvestre (wt) para infectar monos rhesus seronegativos. Cada uno de los monos rhesus involucrados en este y los dos siguientes experimentos se seleccionó con base en el estado de anticuerpo HAI de suero contra HPIV2 wt. Los monos se consideraron como elegibles para inclusión si tenían un título de anticuerpo HAI de <1 :8 a antígeno de HPIV2 de wt. Un total de 20 monos rhesus habían sido involucrados con los tres experimentos. Dieciséis de ellos recibieron el HPIV de wt o uno o dos de los candidatos de vacuna ca/ts y los otros cuatro animales recibieron placebo. Dos de los cuatro monos participaron como animales de placebo en más de un experimento. Cada experimento tenía dos animales de control de placebo. Los grupos del progenitor de HPIV2 de wt y los clones ca/ts, C3490 y C3605, se prepararon en células Vero. C3605 es un subclon de cepa aislada C3440. El personal de New Iberia diluyó los virus en el tiempo de inoculación para los primeros dos experimentos, sin embargo se cambió el procedimiento cuando la titulación del post inoculo del ejemplo 5 se determinó que era de <2.0 pfu/ml cuando se suponía que era de 6.0 pfu/ml. El inoculo para el ejemplo 6, tanto el candidato de vacuna ca/ts C3605 como el virus de desafío de HPIV2 wt se prepararon en Saint Louis University y se enviaron congelados a New Iberia a la dosis indicada. Las muestras de lavado nasal (NW) y lavado bronquial (BL) se recogieron de cada uno de los monos en el día 0 (antes de la inoculación) y en los días 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 y 21 después de la inoculación intranasal e ¡ntratraqueal de 105.5 pfu de virus o placebo. Las muestras se mezclaron con medios de transporte, se formaron en alícuotas, se congelaron en un baño de hielo seco/alcohol, y se almacenaron a -70°C. Las muestras de suero se recogieron de cada mono antes de inoculación en los días 7, 14, 21 , 28, 42, y 56 después de la inoculación. Las muestras se inocularon en tubos de cultivo de tejido de riñon de mono rhesus primarios duplicados y se incubaron a 32°C. Los tubos de RMK se hemadsorbieron en los días 5, 9 y 14 con eritrocitos de conejillo de Indias. Los tubos positivo de hemadsorción se identificaron utilizando ¡nmunofluorescencia (IF). Cada muestra se cuantificó por ensayo de placa sobre monocapas de células Vero a 32°C. Las muestras de suero se probaron para anticuerpos HPIV2 de tipo silvestre por inhibición de hemaglutinación (HAI). Todas las muestras se evaluaron en el mismo ensayo siguiendo el tratamiento con enzima destructora de receptor (RDE) y activación por calentamiento. Resultados: El HPIV2 de tipo silvestre se recuperó de muestras NW y BL de cada uno de los cuatro monos rhesus se inocularon en el primer experimento. Véase cuadro 8. Títulos similares de HPIV2 se recuperaron de ambas muestras NW y BL con el título pico promedio de >1.73 pfu/ml en el día 7 para muestras NW y >1.53 pfu/ml en el día 5 para muestras BL. Una respuesta de anticuerpo HAI a HPIV2 de tipo silvestre se observó en cada uno de los cuatro animales durante el día 21 siguiendo la inoculación. Ninguno de los recipientes de placebo difundieron virus o tuvieron una respuesta de anticuerpo HAI.

EJEMPLO 5 El propósito de este experimento era determinar el crecimiento, atenuación, estabilidad genética e inmunogenicidad de candidatos de vacuna de HPIV2 en monos rhesus seronegativos. Se evaluaron dos candidatos de vacuna HPIV2 ca/ts, C3490 y C3605. Véanse cuadros 9A y 9B. Se aisló el virus de las muestras de lavado nasal (NW) de cada uno de los cuatro monos que recibieron C3490 aunque dos de estos se difundieron sólo por un día (95N148 y 95N139). Se recuperó el virus de NW de 3 de los 4 animales que recibieron C3605 (grupo 502). Uno de los animales en el grupo C3605, 95N152, difundió virus en dos días aunque el animal era seropositivo (título HAI=32) en el tiempo de vacunación. El título pico promedio del virus recuperado de NW de animales que difundían HPIV2 fue de 1.5 pfu/ml en el día 7 para C3490 y de 1.4 pfu/ml en el día 7 para C3605. Ninguno de los 8 monos vacunados con C3490 o C3605 de candidatos de vacuna de HPIV2 ca/ts difundió virus a partir del tracto respiratorio inferior, es decir, de las muestras de lavado bronquial. HPIV2 no se aisló de los recipientes de placebo. En general, los datos de HAI muestran un incremento mínimo (<4 a 8) en dos monos a partir de grupo C3490 (95N140 y 95N139) y un incremento en el mono número 95N148 que pasó de un título HAI de 8 en el día 28 a un título de 32 en el día 42 y día 56. Sin embargo, este mono presentó títulos de 16 a partir del día 0 al día 21 , de esta manera, el incremento del título de HAI de 8 a 32 no representa un caso fuerte para una respuesta de anticuerpo. No hubo incrementos de anticuerpo HAI en el grupo que recibió C3605 o en los recipientes de placebo. Los resultados de la titulación posterior de una alícuota de la vacuna diluida indicaron que el inoculo para este experimento era muy bajo. La titulación posterior del post inoculo se determinó en aproximadamente 1.0 pfu/ml para C3490 y 2.5 pfu/ml para C3605. A partir de estos datos, puede observarse que las cepas de vacuna son atenuadas en el tracto respiratorio inferior.

EJEMPLO 6 El propósito de este experimento era evaluar la eficacia de un candidato de vacuna de HPIV2 atenuado preferido en monos rhesus seronegativos. Cuatro monos rhesus seronegativos recibieron inoculación intratraqueal e intranasal de una dosis prediluida de C3605. Los 4 animales difundieron C3605 de HPIV2 de sus muestras NW. Véase cuadro 10. Los virus no se aislaron de BL de ningún animal que recibió el candidato de vacuna ca/ts. El título promedio pico de difusión de vacuna a partir de las muestras NW fue de 1.88 pfu/ml en el día 7. Ninguno de los monos exhibió una respuesta de anticuerpo HAI al C3605 de HP1V2. Los recipientes de placebo no difundieron virus o tuvieron una respuesta de anticuerpo HAI. Cincuenta y seis días después de la vacunación original con el clon C3605 ca/ts, cada uno de los cuatro monos se desafiaron con un solo inoculo de HPIV2 de tipo silvestre. Véase cuadro 11. Los recipientes de placebo también recibieron el virus de desafío de HPIV2 de tipo silvestre. Los virus no se recuperaron de ninguno de los monos vacunados con C3605; sin embargo, los dos animales que originalmente recibieron el placebo y fueron desafiados con el HPIV2 de tipo silvestre difundieron virus de ambas muestras NW y BL. Las respuestas de anticuerpo HAI al virus de desafío de HPIV2 de tipo silvestre fueron muy vigorosas en tres de los cuatro monos que fueron vacunados con C3605. Los títulos de HAI de >64 fueron evidentes en el día 7 siguiendo el desafío con el virus HPIV2 de tipo silvestre. El cuarto mono, 95N024, seroconvertido el día 28 siguiendo el desafío. Los animales que recibieron placebo y luego el virus de desafío presentaron una respuesta de anticuerpo HAI similar a los monos en el ejemplo 4 que fueron inoculados con HPIV2 de tipo silvestre, es decir, ambos monos seroconvertidos en el día 21 después del desafío. Las descripciones anteriores de las modalidades preferidas de la presente invención se han presentado para propósitos de ilustración y descripción. No intentan ser exhaustivas o limitar la invención a la forma precisa descrita, y muchas modificaciones y variaciones son posibles a la luz de la enseñanza anterior. Dichas modificaciones y variaciones que pueden ser evidentes para el experto en la técnica pretenden estar dentro del alcance de la invención.

CUADRO 1 Caracterización del progenitor wt v clones seleccionados de PIV-2 (SLU 7255) para la propiedad de adaptación al frío Pl n ü - Título de Virus (log pfu/ml) 23°C D7 23°C D14 32°C D7 C3252 <2 <2 <2 C3396 4.8 6.7 6.4 C3464 3.1 5.3 6.8 C3490 3.8 6.0 5.7 C3457 4.0 6.4 6.2 C3440 3.4 5.8 6.5 C3444 3.8 5.7 5.3 Grupo 453 <2 <2 6.1 (PIV-2 Tipo silvestre ) CUADRO 2 Eficacia de ensavo de placa (EOP) del progenitor de tipo silvestre (Grupo 453) v clones seleccionados de PIV-2 (SLU 7255) Nivel Título de Virus (log pfu/ml) Clon # cp 32°C 36°C 37°C 38°C 39°C C3252 38 2.8 3.0 2.5 2.7 <2 C3396 50 6.3 6.4 6.0 5.9 2.8 C3464 50 6.1 5.8 5.3 4.6 <2 C3490 63 5.2 4.9 4.5 4.4 <2 C3457 56 5.4 5.3 4.9 5.2 <2 C3440 47 4.8 4.9 4.6 4.5 <2 C3444 63 5.8 5.7 5.1 5.3 2.8 Grupo 453 0 7.0 7.2 7.1 7.0 6.9 CUADRO 3 Fenotipo adaptado al frío y sensible a la temperatura de clones seleccionados de PIV-2 CUADRO 4 Título de grupos de PIV-2 wt y ca usados para inocular hámsters CUADRO 6 Fenotipo de subclones PIV-2 Clon Subclon # Título de Virus (log pfu/mL) Progenitor # Grupo # 32°C 39°C C3490 C3591 474 4.4 <1 C3490 C3592 474 5.4 <1 C3490 C3593 474 5.3 <1 C3490 C3594 474 7.0 <1 C3490 C3595 474 6.2 <1 C3490 C3596 474 6.7 <1 C3490 C3597 474 6.3 <1 C3490 C3598 474 7.4 <1 C3490 C3599 474 6.8 <1 C3490 C3600 474 5.8 <1 C3440 C3601 477 7.2 3.1 C3440 C3602 477 6.9 <1 C3440 C3603 477 7.3 <1 C3440 C3604 477 6.6 <1 C3440 C3605 477 7.3 <1 C3440 C3606 477 6.6 <1 C3440 C3607 477 7.1 <1 C3440 C3608 477 7.1 <1 C3440 C3609 477 4.7 <1 C3440 C3610 477 6.7 4.4 C3464 C3621 484 5.5 <1 C3464 C3622 484 6.0 <1 C3464 C3623 484 5.5 <1 C3464 C3625 484 6.2 <1 C3464 C3627 484 6.9 <1 C3464 C3628 484 7.0 <1 control 491 6.4 6.2 CUADRO 7 Títulos de grupos de HPIV-2 de tipo silvestre y atenuados, SLU 7255, gue se utilizarán para la inoculación de monos Rhesus seronegativos Grupo # Clon # Nivel de Título de Virus pasaje en frío (log pfu/ml) 32°C 39°C 499 C3464 50 5.4 2.0 500 C3490 63 7.2 1.3 502 C3605* 47 7.8 <1 504 tipo silvestre 0 6.4 6.6 *C3605 es un subclon de C3440 CUADRO 8 Muestras de monos Rhesus inoculadas con HPIV-2 wt a) NW = lavado nasal b) BL = lavado bronquial * = título con base en datos RMK, un tubo positivo = 1.0, dos tubos positivos HA = > 1.5 CUADRO 9A Resultados virológicos e inmunológicos de muestras recolectadas de monos Rhesus vacunados con candidato de vacuna de HPIV2 C3490 o C3605 ? w CUADRO 9B Resultados virológicos e inmunológicos de muestras recolectadas de monos Rhesus vacunados con candidato de vacuna de HPIV2 C3490 o C3605 s a) NW = lavado nasal b) BL = lavado bronquial c) VNI = virus no aislado d) datos HAI de 5/21/98 para suero a todos los puntos de tiempo * = título con base en datos RMK, un tubo positivo = 1.0, dos tubos positivos HA = > 1.5.

CUADRO 10 Muestras de monos Rhesus vacunados con Grupo 502 o Placebo ? n a) NW= lavado nasal b) BL= Lavado bronquial * = título con base en datos RMK, un tubo positivo = 1.0, dos tubos positivos HA > 1.5 CUADRO 11 Muestras de monos Rhesus vacunados con Grupo 502 o Placebo y desafiadas con HPIV2 wt K a) NW= lavado nasal b) BL= Lavado bronquial * = título con base en datos RMK, un tubo positivo = 1.0, dos tubos positivos HA > 1.5 REFERENCIAS Beishe, R. B., Y Hissom, F. K. (1982). Cold adaption of parainfluenza virus type 3: Induction of three phenotypic markers. J. Med. Virol. 10, 235-242. Beishe, R. B., Karron, R. A., Newman, F. K., Anderson, E. L., Nugent, S. L., Steinhoff, M., Clemens, M. L.,Wilson, M. H., Hall, S. L., Tierney, E. L., y Murphy, B. R. (1992). Evaluation of a live attenuated, cold-adapted parainfluenza virus type 3 vaccine in children. J. Clin., Microbiol. 30, 2064-2070. Clements, et al. 1991. Evaluation of bovine, cold-adapted human, and wild-type human parainfluenza type 3 viruses ¡n adult volunteers and chimpanzees. J. Clin. Microbiol. 29:1175-1182. Collins, P. L, et al., p. 1205-1241 , Vol. 1 of Fields Viroloav. Fields, B. N., et al., Eds., 3a. ed., Raven Press, 1996. Crookshanks-Newman y Beishe. 1986. Protection of weanling hamsters from experimental ¡nfection with wild-type parainfluenza virus type 3 (para 3) by cold-adapted mutant of para 3. J. Med. Virol. 18:131-137. Downham, M. A., Mc.Quillin, J., y Gardner, P. S. (1974). Diagnosis and clinical significance of parainfluenza virus infections in children. Arch. Dis. Child. 49, 8-15.

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Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Una cepa viral atenuada, aislada de virus de parainfluenza humana 2. 2.- La cepa viral atenuada, aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque exhibe títulos en ensayos de placa sobre células Vero cuando se cosecha a aproximadamente 32°C en una célula hospedero de mamífero que es menos de aproximadamente 100 veces su título cuando se cosecha a alrededor de 23°C en la célula hospedero de mamífero, y que es menor o igual a 100 veces su títulog cuando se cosecha a aproximadamente 39°C en la célula hospedero de mamífero. 3.- La cepa viral atenuada, aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque exhibe títulos en ensayos de placa sobre células Vero cuando se cultiva a aproximadamente 39°C en la célula hospedero de mamífero que son menores o ¡guales a aproximadamente 1.0 pfu/ml. 4.- La cepa viral atenuada, aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque se selecciona del grupo de cepas virales que consiste en aquellas designadas C3396, C3463, C3490, C3457, C3440, C3444, y subclones o progenie de cualquiera de las cepas antes mencionadas. 5.- La cepa viral atenuada, aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque se selecciona del grupo de cepas virales que consiste en aquellas designadas C3463, C3490, C3440, y subclones o progenie de cualquiera de las cepas antes mencionadas. 6.- Una composición de vacuna que comprende la cepa viral atenuada, aislada de conformidad con la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 7.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. 8.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque comprende un adyuvante farmacéuticamente aceptable. 9.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque la cepa viral aislada, atenuada es la cepa de la reivindicación 2. 10.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. 11.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque comprende un adyuvante farmacéuticamente aceptable. 12.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque la cepa viral, aislada atenuada es ia cepa de la reivindicación 4. 13.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque un excipiente farmacéuticamente aceptable. 14.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque comprende un adyuvante farmacéuticamente aceptable. 15.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque la cepa viral atenuada, aislada es la cepa de la reivindicación 5. 16.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. 17.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque comprende un adyuvante farmacéuticamente aceptable. 18.- El uso de la cepa viral atenuada, aislada de conformidad con la reivindicación 1 , para la fabricación de una vacuna para inducir una respuesta inmunológica protectora en un mamífero. 19.- El uso como se reclama en la reivindicación 18, en donde la cepa viral atenuada, aislada es la cepa de la reivindicación 2. 20.- El uso como se reclama en la reivindicación 18, en donde la cepa viral, aislada atenuada es la cepa de la reivindicación 3. 21.- El uso como se reclama en la reivindicación 18, en donde la cepa viral, aislada atenuada es la cepa de la reivindicación 4. 22.- El uso como se reclama en la reivindicación 18, en donde la cepa viral, aislada atenuada es la cepa de la reivindicación 5.