JP2002523086A - 温度感受性、及び、寒冷適合ヒトパラインフルエンザウイルス２型（ｈｐｉｖ−２）並びに、このようなウイルスを基礎としたワクチン - Google Patents
温度感受性、及び、寒冷適合ヒトパラインフルエンザウイルス２型（ｈｐｉｖ−２）並びに、このようなウイルスを基礎としたワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は生ワクチン製剤に有用な、ヒトパラインフルエンザウイルス２(ＨＰＩＶ-２)の単離された弱毒ウイルス株に関する。これらの株は、接種された哺乳動物において重篤な症状を生じることなく、防護免疫応答を刺激するのに有用な温度感受性、及び、寒冷適合表現型を示す。
Description
【０００１】 背景技術 本発明は生ワクチン製剤に有用な、ヒトパラインフルエンザウイルス２(ＨＰ
ＩＶ-２)の単離された弱毒ウイルス株に関する。これらの株は野生型のウイルス
により引き起こされる重篤な症状を生じることなく、接種した哺乳動物において
防護免疫応答を刺激するのに有用な温度感受性、及び、寒冷適合(cold adaption
)表現型を示す。
ＩＶ-２)の単離された弱毒ウイルス株に関する。これらの株は野生型のウイルス
により引き起こされる重篤な症状を生じることなく、接種した哺乳動物において
防護免疫応答を刺激するのに有用な温度感受性、及び、寒冷適合(cold adaption
)表現型を示す。
【０００２】 ヒトパラインフルエンザウイルス(ＨＰＩＶ)の1型、2型、及び3型は、幼児及
び幼い子供にとって重大な病原体である。ＨＰＩＶはごく普通に中耳炎、咽頭炎
、及び、一般的な風邪を引き起こす。これらの上気道感染症(ＵＲＩ)は一般的に
起こり、クループ、肺炎及び細気管支炎を含む下部気道感染症(ＬＲＩ)と関連し
ている場合がある。幼い子供での初期の感染は下部気道の疾病と関連しており、
それによりしばしば入院することとなる。グループとしては、パラインフルエン
ザウイルスは入院が許可される気管支系感染症で2番目に一般的な原因であり、
幼い子供における重大な病原体としては呼吸器多核体ウイルスに次いで2番目で
ある。パラインフルエンザウイルス3型はパラインフルエンザウイルスの中でも
、年齢が6ヶ月に満たない幼児を一般に感染させる能力において独特なものであ
る。この型に感染した幼児において細気管支炎、及び、肺炎は一般的なものであ
り、この点に関しては、ＨＰＩＶ-３は呼吸器多核体ウイルスと類似している。
これらのウイルス感染の多様な局面に関する、ＨＰＩＶについての多数の総説が
最近、発表されている(Ray及びCompans、1990年;Kingsbury、1991年;Hendrickso
nら、1994年)。
び幼い子供にとって重大な病原体である。ＨＰＩＶはごく普通に中耳炎、咽頭炎
、及び、一般的な風邪を引き起こす。これらの上気道感染症(ＵＲＩ)は一般的に
起こり、クループ、肺炎及び細気管支炎を含む下部気道感染症(ＬＲＩ)と関連し
ている場合がある。幼い子供での初期の感染は下部気道の疾病と関連しており、
それによりしばしば入院することとなる。グループとしては、パラインフルエン
ザウイルスは入院が許可される気管支系感染症で2番目に一般的な原因であり、
幼い子供における重大な病原体としては呼吸器多核体ウイルスに次いで2番目で
ある。パラインフルエンザウイルス3型はパラインフルエンザウイルスの中でも
、年齢が6ヶ月に満たない幼児を一般に感染させる能力において独特なものであ
る。この型に感染した幼児において細気管支炎、及び、肺炎は一般的なものであ
り、この点に関しては、ＨＰＩＶ-３は呼吸器多核体ウイルスと類似している。
これらのウイルス感染の多様な局面に関する、ＨＰＩＶについての多数の総説が
最近、発表されている(Ray及びCompans、1990年;Kingsbury、1991年;Hendrickso
nら、1994年)。
【０００３】 ＨＰＩＶ-２感染症は米国では、年に1回発生する(Downhamら、1974年)。この
病原体は秋から初冬にかけて最高の発病率を有し、ＨＰＩＶ-１と比べてやや長
い「活動期」を有する。クループがこのウイルスにより最も頻繁に引き起こされ
るＬＲＩであるが、また、ＨＰＩＶ-１と関連した他の呼吸器系疾患のいずれを
も起こし得る。生まれてから2年目でＨＰＩＶ-２感染症の発病率が最高になり、
5歳より幼い子供で感染症のおよそ60％が起こる。ＨＰＩＶ-１または３により引
き起こされるＬＲＩよりもＨＰＩＶ-２により引き起こされるＬＲＩが、男の子
よりも女の子で示されたという試験の観察は興味深いものである(Downhamら、19
74年)。ＨＰＩＶ-２によるＬＲＩは、ＨＰＩＶ-１及びＨＰＩＶ-３によるものよ
りも少なくしか報告されていない。このウイルスについての報告が少ないことに
は、地理的な相違、または、単離及び検出技術の違いに関係があるかもしれない
ことが近頃の報告で示唆された(Downhamら、1974年;Hendricksonら、1994年)。1
991年の流行病の間、米国ではＨＰＩＶ-２感染症の5歳より幼い子供157,000人が
救急室で見られ、35,000人の子供が病院に入院を認められた。この流行病では、
ＨＰＩＶ-１と-２とを合せて、ほぼ2億ドルの直接的な患者介護料が必要とされ
た。
病原体は秋から初冬にかけて最高の発病率を有し、ＨＰＩＶ-１と比べてやや長
い「活動期」を有する。クループがこのウイルスにより最も頻繁に引き起こされ
るＬＲＩであるが、また、ＨＰＩＶ-１と関連した他の呼吸器系疾患のいずれを
も起こし得る。生まれてから2年目でＨＰＩＶ-２感染症の発病率が最高になり、
5歳より幼い子供で感染症のおよそ60％が起こる。ＨＰＩＶ-１または３により引
き起こされるＬＲＩよりもＨＰＩＶ-２により引き起こされるＬＲＩが、男の子
よりも女の子で示されたという試験の観察は興味深いものである(Downhamら、19
74年)。ＨＰＩＶ-２によるＬＲＩは、ＨＰＩＶ-１及びＨＰＩＶ-３によるものよ
りも少なくしか報告されていない。このウイルスについての報告が少ないことに
は、地理的な相違、または、単離及び検出技術の違いに関係があるかもしれない
ことが近頃の報告で示唆された(Downhamら、1974年;Hendricksonら、1994年)。1
991年の流行病の間、米国ではＨＰＩＶ-２感染症の5歳より幼い子供157,000人が
救急室で見られ、35,000人の子供が病院に入院を認められた。この流行病では、
ＨＰＩＶ-１と-２とを合せて、ほぼ2億ドルの直接的な患者介護料が必要とされ
た。
【０００４】 全てのヒトパラインフルエンザウイルスは構造的、物理化学的、及び、生物学
的特徴において非常に類似している。ＨＰＩＶビリオンの原型は、宿主細胞由来
の脂質外被に囲まれた負の極性の一本鎖ＲＮＡから成る。これらは、平均直径が
150〜250ｎｍの多型的(pleiomorphic)、または、多形(multi-formed)ウイルスで
ある。典型的なＨＰＩＶゲノムは、およそ15,000ヌクレオチドの遺伝子情報を含
み(Storeyら、1984年)、少なくとも6個のウイルス蛋白質をコードする(3"-NP-P(
+C)M-F-HN-L-5')(Storeyら、1984年)。さらに、ＨＰＩＶ-１、２及び３は追加の
非構造蛋白質「Ｃ」を、ＨＰＩＶ-２は蛋白質「Ｖ」をコードする。これらの蛋白質
はＰ遺伝子内の重複するリーディングフレームから製造され、ｍＲＮＡの組換え
を必要とするかも知れない(Matsuokaら、1991年)。ＨＰＩＶ-２の完全なヌクレ
オチド配列は、これまで公開されていない。
的特徴において非常に類似している。ＨＰＩＶビリオンの原型は、宿主細胞由来
の脂質外被に囲まれた負の極性の一本鎖ＲＮＡから成る。これらは、平均直径が
150〜250ｎｍの多型的(pleiomorphic)、または、多形(multi-formed)ウイルスで
ある。典型的なＨＰＩＶゲノムは、およそ15,000ヌクレオチドの遺伝子情報を含
み(Storeyら、1984年)、少なくとも6個のウイルス蛋白質をコードする(3"-NP-P(
+C)M-F-HN-L-5')(Storeyら、1984年)。さらに、ＨＰＩＶ-１、２及び３は追加の
非構造蛋白質「Ｃ」を、ＨＰＩＶ-２は蛋白質「Ｖ」をコードする。これらの蛋白質
はＰ遺伝子内の重複するリーディングフレームから製造され、ｍＲＮＡの組換え
を必要とするかも知れない(Matsuokaら、1991年)。ＨＰＩＶ-２の完全なヌクレ
オチド配列は、これまで公開されていない。
【０００５】 ヒトパラインフルエンザウイルスはパラミクソウイルス属に分類される。この
属には5つの主要な血清型がある：ＨＩＰＶ1〜4型、及び、おたふくかぜ。ＨＰ
ＩＶ血清型は抗原性により2つの区分に分けることができる：(1)パラミクソウイ
ルス属内のＨＰＩＶ-１及びＨＰＩＶ-３、そして(2)ルブラウイルス属内のＨＰ
ＩＶ-２及びＨＰＩＶ-４(Collinsら、1996年)。全てのＨＰＩＶは共通の抗原を
有し、感染の間、変動するレベルの異型抗体(heterotypic antibody)がしばしば
検出される。従って、異型反応(heterotropic responses)が過去の感染症を反映
するものであるか、または、血清試験の間の類似の抗原に対する単なる交差反応
であるのかを決定するのは困難である。しかしながら、過去においては特異的過
免疫性動物血清が、そしてより最近ではモノクローナル抗体がこれらのウイルス
を区別するのに標準的な分析において使用されてきた(Sarkkinenら、1981年)。
属には5つの主要な血清型がある：ＨＩＰＶ1〜4型、及び、おたふくかぜ。ＨＰ
ＩＶ血清型は抗原性により2つの区分に分けることができる：(1)パラミクソウイ
ルス属内のＨＰＩＶ-１及びＨＰＩＶ-３、そして(2)ルブラウイルス属内のＨＰ
ＩＶ-２及びＨＰＩＶ-４(Collinsら、1996年)。全てのＨＰＩＶは共通の抗原を
有し、感染の間、変動するレベルの異型抗体(heterotypic antibody)がしばしば
検出される。従って、異型反応(heterotropic responses)が過去の感染症を反映
するものであるか、または、血清試験の間の類似の抗原に対する単なる交差反応
であるのかを決定するのは困難である。しかしながら、過去においては特異的過
免疫性動物血清が、そしてより最近ではモノクローナル抗体がこれらのウイルス
を区別するのに標準的な分析において使用されてきた(Sarkkinenら、1981年)。
【０００６】 鼻、及び、喉頭の粘膜がパラインフルエンザウイルス感染の最初の部位である
。軽症の患者では場合によっては、気管支も限られた範囲で関与しているかもし
れない。喉頭、並びに、上部気管がＨＰＩＶ-１及びＨＰＩＶ-２によるより広範
囲の感染に係っており、クループ症候群につながる。感染はまた濃縮された粘液
の蓄積、及び、それによる肺拡張不全(不完全な肺拡張)、並びに、肺炎を伴って
、下部の気管、及び、気管支に広がるかもしれない。この疾病の病因において免
疫応答が貢献している可能性が、パラインフルエンザウイルスクループになる幼
児、及び、子供は、対応する年齢で上気道に制限された感染症にかかる患者と比
べて、より早く、そして多量に局所的にウイルス特異的ＩｇＥ抗体を産生する(W
elliverら、1982年)という観察により示唆されている。パラインフルエンザウイ
ルス細気管支炎の幼児では、上気道疾病のみを起こす感染した幼児よりも、パラ
インフルエンザのウイルス抗原に対する細胞性免疫応答、そしてまた、パライン
フルエンザウイルス特異的ＩｇＥ抗体応答が多いことが報告されている。慢性の
細気管支炎、及び、気腫の患者では、ＨＰＩＶ-３の長引く保有者状態が観察さ
れる(Grossら、1973年)。健康な成人が感染性のウイルスを断続的に放出し感受
性の人を感染させることが示唆されてきており、さらに、研究者らは、永続的な
感染が起こるのかもしれないと示唆してきた(Parkinsonら、1980年)。
。軽症の患者では場合によっては、気管支も限られた範囲で関与しているかもし
れない。喉頭、並びに、上部気管がＨＰＩＶ-１及びＨＰＩＶ-２によるより広範
囲の感染に係っており、クループ症候群につながる。感染はまた濃縮された粘液
の蓄積、及び、それによる肺拡張不全(不完全な肺拡張)、並びに、肺炎を伴って
、下部の気管、及び、気管支に広がるかもしれない。この疾病の病因において免
疫応答が貢献している可能性が、パラインフルエンザウイルスクループになる幼
児、及び、子供は、対応する年齢で上気道に制限された感染症にかかる患者と比
べて、より早く、そして多量に局所的にウイルス特異的ＩｇＥ抗体を産生する(W
elliverら、1982年)という観察により示唆されている。パラインフルエンザウイ
ルス細気管支炎の幼児では、上気道疾病のみを起こす感染した幼児よりも、パラ
インフルエンザのウイルス抗原に対する細胞性免疫応答、そしてまた、パライン
フルエンザウイルス特異的ＩｇＥ抗体応答が多いことが報告されている。慢性の
細気管支炎、及び、気腫の患者では、ＨＰＩＶ-３の長引く保有者状態が観察さ
れる(Grossら、1973年)。健康な成人が感染性のウイルスを断続的に放出し感受
性の人を感染させることが示唆されてきており、さらに、研究者らは、永続的な
感染が起こるのかもしれないと示唆してきた(Parkinsonら、1980年)。
【０００７】 ハムスターは、ＨＰＩＶ感染の認可された動物モデルとなる。感染した動物は
、抗体の受動的な投与によっては改善されない、認知できる病理学上の変化を肺
で起こす(Glezen及びFemald、1976年)。感染の間、感染したハムスターは呼吸器
疾患の目に見える徴候、または、明かな体重減少を示さない。さらに、以下の実
施例４〜６で示すように、感染の動物モデルとしてサルを用いることもできる。
、抗体の受動的な投与によっては改善されない、認知できる病理学上の変化を肺
で起こす(Glezen及びFemald、1976年)。感染の間、感染したハムスターは呼吸器
疾患の目に見える徴候、または、明かな体重減少を示さない。さらに、以下の実
施例４〜６で示すように、感染の動物モデルとしてサルを用いることもできる。
【０００８】 長年にわたって、動物、及び、ヒトでの種々のウイルス感染を防ぐための多様
なワクチンが開発されてきた。2つの主な型のワクチンが用いられてきた：殺さ
れたウイルス(killed virus)、及び、弱毒化生ウイルスである。殺されたウイル
スは典型的には化学的、または、物理的な処置により不活性化されているが、一
般的に弱毒化生ウイルスと比べ、持続された免疫応答を刺激する効果が少ない。
弱毒化生ウイルスは一般的にはより効果的であるが、体内にある間に毒性の状態
に戻る可能性がある。殺された、または、生ワクチンを開発するのに必要とされ
る時間、及び、費用は重大である。
なワクチンが開発されてきた。2つの主な型のワクチンが用いられてきた：殺さ
れたウイルス(killed virus)、及び、弱毒化生ウイルスである。殺されたウイル
スは典型的には化学的、または、物理的な処置により不活性化されているが、一
般的に弱毒化生ウイルスと比べ、持続された免疫応答を刺激する効果が少ない。
弱毒化生ウイルスは一般的にはより効果的であるが、体内にある間に毒性の状態
に戻る可能性がある。殺された、または、生ワクチンを開発するのに必要とされ
る時間、及び、費用は重大である。
【０００９】 弱毒化生ワクンは、感染した動物から単離した後代のウイルスから直接得るこ
とができる。例えば、Straubの米国特許第3,927,209号は、ウシの気道からのウ
イルス株として単離されたパラインフルエンザ3型ワクチンを開示する。弱毒化
生ワクチンはまた、ウイルスが本来の病原性の性質を失うまで、野生型株を繰り
返し適当な培養物中で寒冷継代(cold passaging)することにより得ることができ
る。「寒冷継代(cold passage)」とは、通常ウイルスが複製するよりも低い温度
における、全生活環を通したウイルスの生育である(宿主細胞の感染、宿主細胞
の増殖、及び、宿主細胞からの脱出)。例えば、低温適合、温度感受性株ｃｐ４
５は、ＨＰＩＶ-３の野生型ウイルス(ＪＳ株)を45回、低くした温度で継代する
ことにより得られた(Belshe及びHissom、1982年)。温度感受性ｃｐ４５株は、ヒ
トのＨＰＩＶ-３に対する候補ワクチンとしての使用が現在、評価されている(Ka
rronら、1995年；Hallら、1993年；Belsheら、1992年；Clementsら、1991年；Cr
ookshanks-Newman及びBelshe、1986年)。子供での最近の評価では、ｃｐ４５株
が高度に弱毒されており、免疫応答を刺激するのに効果的であることが明かにさ
れた(Karronら、1995年；Belsheら、1992年)。また、インフルエンザＡ、及び、
Ｂワクチン株を産生するのに寒冷継代技術が使用されたが、ＨＰＩＶ-２ウイル
スについて、同様の成功した寒冷継代は報告されていない。
とができる。例えば、Straubの米国特許第3,927,209号は、ウシの気道からのウ
イルス株として単離されたパラインフルエンザ3型ワクチンを開示する。弱毒化
生ワクチンはまた、ウイルスが本来の病原性の性質を失うまで、野生型株を繰り
返し適当な培養物中で寒冷継代(cold passaging)することにより得ることができ
る。「寒冷継代(cold passage)」とは、通常ウイルスが複製するよりも低い温度
における、全生活環を通したウイルスの生育である(宿主細胞の感染、宿主細胞
の増殖、及び、宿主細胞からの脱出)。例えば、低温適合、温度感受性株ｃｐ４
５は、ＨＰＩＶ-３の野生型ウイルス(ＪＳ株)を45回、低くした温度で継代する
ことにより得られた(Belshe及びHissom、1982年)。温度感受性ｃｐ４５株は、ヒ
トのＨＰＩＶ-３に対する候補ワクチンとしての使用が現在、評価されている(Ka
rronら、1995年；Hallら、1993年；Belsheら、1992年；Clementsら、1991年；Cr
ookshanks-Newman及びBelshe、1986年)。子供での最近の評価では、ｃｐ４５株
が高度に弱毒されており、免疫応答を刺激するのに効果的であることが明かにさ
れた(Karronら、1995年；Belsheら、1992年)。また、インフルエンザＡ、及び、
Ｂワクチン株を産生するのに寒冷継代技術が使用されたが、ＨＰＩＶ-２ウイル
スについて、同様の成功した寒冷継代は報告されていない。
【００１０】 特定のワクチン株の弱毒化は、一般に株の3つの表現型で評価する：寒冷適合
、温度感受性、及び、プラークの大きさ、または、組織培養の収量。寒冷適合(
ｃａ)はおよそ25℃に低めた温度におけるウイルスの生育能力に関係付けられ、
温度感受性(ｔｓ)はこのような生育がおよそ40℃の温度で妨げられるかどうかに
関係付けられる。プラーク力価は、ウイルスの生育程度を量的に評価するための
分析であり、寒冷適合、及び/または温度感受性表現型の程度を評価するのに一
般的に用いられる。ワクチンが弱毒化されているかどうかを決定する他の方法に
は、ワクチンを霊長類に投与することが含まれる。例えば、新しいポリオワクチ
ンロットの弱毒化は、ＦＤＡにより販売が認可される前に典型的にはサルで試験
される。
、温度感受性、及び、プラークの大きさ、または、組織培養の収量。寒冷適合(
ｃａ)はおよそ25℃に低めた温度におけるウイルスの生育能力に関係付けられ、
温度感受性(ｔｓ)はこのような生育がおよそ40℃の温度で妨げられるかどうかに
関係付けられる。プラーク力価は、ウイルスの生育程度を量的に評価するための
分析であり、寒冷適合、及び/または温度感受性表現型の程度を評価するのに一
般的に用いられる。ワクチンが弱毒化されているかどうかを決定する他の方法に
は、ワクチンを霊長類に投与することが含まれる。例えば、新しいポリオワクチ
ンロットの弱毒化は、ＦＤＡにより販売が認可される前に典型的にはサルで試験
される。
【００１１】 幼児、及び、幼い子供においてＨＰＩＶ-２疾病が重篤な呼吸器疲労を引き起
こす傾向を考慮すると、重篤な感染、並びに、それによる入院、及び、処置の必
要性を妨げるワクチンは非常に望ましい。ＨＰＩＶ-２ワクチンの必要性が20年
以上にわたって認識され、1980年代初期にＨＰＩＶ-３のワクチン株の単離が成
功していたにも係らず、子供をＨＰＩＶ-２に対して免疫化するワクチンは現在
のところ存在しない。出願人らの発見より前には、ＨＰＩＶ-２は成功裏に寒冷
継代されていない。ＨＰＩＶ-３ウイルスと比べ、ＨＰＩＶ-２ウイルスの弱毒株
を単離する困難性は、これら2つのウイルスの少なからぬ形態、及び、表現型の
相違により説明することができる。これらの抗原性は類似しているにも係らず、
ＨＰＩＶ-３に比べて、ＨＰＩＶ-２はイン・ヴィトロでの生育条件、及び低くし
た温度に適合させるのが難しい。
こす傾向を考慮すると、重篤な感染、並びに、それによる入院、及び、処置の必
要性を妨げるワクチンは非常に望ましい。ＨＰＩＶ-２ワクチンの必要性が20年
以上にわたって認識され、1980年代初期にＨＰＩＶ-３のワクチン株の単離が成
功していたにも係らず、子供をＨＰＩＶ-２に対して免疫化するワクチンは現在
のところ存在しない。出願人らの発見より前には、ＨＰＩＶ-２は成功裏に寒冷
継代されていない。ＨＰＩＶ-３ウイルスと比べ、ＨＰＩＶ-２ウイルスの弱毒株
を単離する困難性は、これら2つのウイルスの少なからぬ形態、及び、表現型の
相違により説明することができる。これらの抗原性は類似しているにも係らず、
ＨＰＩＶ-３に比べて、ＨＰＩＶ-２はイン・ヴィトロでの生育条件、及び低くし
た温度に適合させるのが難しい。
【００１２】発明の概要 よって、野生型ＨＰＩＶ-２感染に対し、ヒトを含む哺乳動物を免疫化するの
に用いることができるＨＰＩＶ-２のワクチン株を提供することが本発明の目的
である。さらに、野生型ＨＰＩＶ-２ウイルス株の感染と比べ、ワクチン株の感
染により生じる症状が多いに低減されたワクチン株を提供することも本発明の目
的である。さらに、投与された患者で防護免疫応答を生じるであろうＨＰＩＶ-
２のワクチン株を提供することも本発明の目的である。
に用いることができるＨＰＩＶ-２のワクチン株を提供することが本発明の目的
である。さらに、野生型ＨＰＩＶ-２ウイルス株の感染と比べ、ワクチン株の感
染により生じる症状が多いに低減されたワクチン株を提供することも本発明の目
的である。さらに、投与された患者で防護免疫応答を生じるであろうＨＰＩＶ-
２のワクチン株を提供することも本発明の目的である。
【００１３】 出願人らは、SLU7255と呼ばれるセントルイス大学のＨＰＩＶ-２の野生型株か
らＨＰＩＶ-２の寒冷適合ワクチン株を創り出し、単離した。現在では、寒冷適
合、及び温度感受性の所望の表現型を有する幾つかの弱毒株が単離されている。
らＨＰＩＶ-２の寒冷適合ワクチン株を創り出し、単離した。現在では、寒冷適
合、及び温度感受性の所望の表現型を有する幾つかの弱毒株が単離されている。
【００１４】 従って、本発明は寒冷適合、及び、温度感受性の表現特性を示すＨＰＩＶ-２
ウイルスの単離された弱毒株に関する。これらの特徴を有する好ましい単離され
た株はC3396、C3463、C3490、C3440及びC3444と呼ばれるものである。より好ま
しい単離された株はC3464、C3490及びC3449と呼ばれるものである。さらに本発
明はC3396、C3464、C3490、C3440及びC3444と呼ばれる単離された株の後代、ま
たは、サブクローンである寒冷適合、及び、温度感受性の表現型を示すＨＰＩＶ
-２の単離された弱毒株に関する。
ウイルスの単離された弱毒株に関する。これらの特徴を有する好ましい単離され
た株はC3396、C3463、C3490、C3440及びC3444と呼ばれるものである。より好ま
しい単離された株はC3464、C3490及びC3449と呼ばれるものである。さらに本発
明はC3396、C3464、C3490、C3440及びC3444と呼ばれる単離された株の後代、ま
たは、サブクローンである寒冷適合、及び、温度感受性の表現型を示すＨＰＩＶ
-２の単離された弱毒株に関する。
【００１５】 さらに本発明は、弱毒生ワクチンとしての、上述のいずれかのＨＰＩＶ-２ウ
イルス株、及び、医薬的に許容される担体を含むワクチン組成物の使用に関する
。これらの組成物はまた、医薬的に許容されるいずれかの賦形剤、希釈剤、及び
/または、アジュバントを含んでもよい。
イルス株、及び、医薬的に許容される担体を含むワクチン組成物の使用に関する
。これらの組成物はまた、医薬的に許容されるいずれかの賦形剤、希釈剤、及び
/または、アジュバントを含んでもよい。
【００１６】 本発明はまた、哺乳動物に本発明の弱毒生ウイルス株を接種する、哺乳動物に
おいて防護免疫応答を誘導する方法に向けられる。
おいて防護免疫応答を誘導する方法に向けられる。
【００１７】図面の簡単な説明 図１：明細書中に記載の単離されたウイルス株C3440、及び、C3490の系統を示
す、寒冷継代の一覧。 図２：このグラフは、株C3490(■)、C3440(□)、C3464(◆)、または、野生型
株のプール453(◇)を接種したハムスターから集めた鼻腔洗浄液の活性ウイルス
力価を示す。 図３：このグラフは、株C3490(■)、C3440(□)、C3464(◆)、または、野生型
株のプール453(◇)を接種したハムスターから集めた気管支/肺洗浄液の活性ウイ
ルス力価を示す。
す、寒冷継代の一覧。 図２：このグラフは、株C3490(■)、C3440(□)、C3464(◆)、または、野生型
株のプール453(◇)を接種したハムスターから集めた鼻腔洗浄液の活性ウイルス
力価を示す。 図３：このグラフは、株C3490(■)、C3440(□)、C3464(◆)、または、野生型
株のプール453(◇)を接種したハムスターから集めた気管支/肺洗浄液の活性ウイ
ルス力価を示す。
【００１８】発明の詳細な説明 ＨＰＩＶ-３とは異なり、イン・ヴィトロで培養、及び、維持することが首尾よ
くできるＨＰＩＶ-２の野生型は、単離するのが難しいことが証明された。出願
人らは多数のところから集めた野生型ウイルスの50種以上の株を試験し、ようや
く、イン・ヴィトロの培養でうまく維持することができる野生型株を発見した。
以下の開示で示すように、出願人らは単離された温度感受性(ｔｓ)、及び、寒冷
適合(ｃａ)ウイルス株を、非温度感受性、及び、非寒冷適合野生型(ｗｔ)ＨＰＩ
Ｖ-２ウイルス株から創り出した。図１に示すように、出願人はＨＰＩＶ-２の野
生型株をより低い温度で生育するようにうまく変化させ、30℃よりも低い温度、
より好ましくは26℃よりも低い温度、最も好ましくは約24℃よりも低い温度に適
合する株を製造した。その後、これらの寒冷適合株が適切に温度感受性であるこ
とを確認するために分析した。出願人らは、寒冷適合株の画分が下部気道でのウ
イルスの生育及び増殖、並びに、それに伴う重篤なＨＰＩＶ-２疾病の症状を防
止するのに必要な程度、温度感受性を示すことを発見した。より低い生産温度で
制限なしに生育することができ、それを投与した患者で弱毒化されるので、これ
らの製造された株のｃａ、及び、ｔｓ表現型の組合せは、ＨＰＩＶ-２感染に対
する生ワクチンとして使用するための素晴らしい弱毒株とする。
くできるＨＰＩＶ-２の野生型は、単離するのが難しいことが証明された。出願
人らは多数のところから集めた野生型ウイルスの50種以上の株を試験し、ようや
く、イン・ヴィトロの培養でうまく維持することができる野生型株を発見した。
以下の開示で示すように、出願人らは単離された温度感受性(ｔｓ)、及び、寒冷
適合(ｃａ)ウイルス株を、非温度感受性、及び、非寒冷適合野生型(ｗｔ)ＨＰＩ
Ｖ-２ウイルス株から創り出した。図１に示すように、出願人はＨＰＩＶ-２の野
生型株をより低い温度で生育するようにうまく変化させ、30℃よりも低い温度、
より好ましくは26℃よりも低い温度、最も好ましくは約24℃よりも低い温度に適
合する株を製造した。その後、これらの寒冷適合株が適切に温度感受性であるこ
とを確認するために分析した。出願人らは、寒冷適合株の画分が下部気道でのウ
イルスの生育及び増殖、並びに、それに伴う重篤なＨＰＩＶ-２疾病の症状を防
止するのに必要な程度、温度感受性を示すことを発見した。より低い生産温度で
制限なしに生育することができ、それを投与した患者で弱毒化されるので、これ
らの製造された株のｃａ、及び、ｔｓ表現型の組合せは、ＨＰＩＶ-２感染に対
する生ワクチンとして使用するための素晴らしい弱毒株とする。
【００１９】 以下に開示する株を製造するのに特定のＨＰＩＶ-２ｗｔ株を用いたが、出願
人により示される方法を用い、イン・ヴィトロ培養物として維持することができ
るいずれのｗｔ株をもＨＰＩＶ-２のｔｓ、及びｃａ弱毒株を製造するのに用い
ることができる。ワクチン研究において用いられる、よく特徴付けられた細胞で
あるので、アカゲザル胎児の肺(ＦＲｈＬ-２)細胞が寒冷継代の宿主として好ま
れる。しかしながら、他の培養哺乳動物宿主細胞も、本発明の弱毒ウイルス株の
製造において用いることが意図される。同様に、当業者であれば寒冷継代技術を
、異なる温度、または、各温度における異なる寒冷継代数を用いて変えるという
選択することもできる。しかしながら、このような変更は、以下に出願人が記載
するのと同様な、徐々に段階的にした(stepped)温度を好ましくは保持するであ
ろう。
人により示される方法を用い、イン・ヴィトロ培養物として維持することができ
るいずれのｗｔ株をもＨＰＩＶ-２のｔｓ、及びｃａ弱毒株を製造するのに用い
ることができる。ワクチン研究において用いられる、よく特徴付けられた細胞で
あるので、アカゲザル胎児の肺(ＦＲｈＬ-２)細胞が寒冷継代の宿主として好ま
れる。しかしながら、他の培養哺乳動物宿主細胞も、本発明の弱毒ウイルス株の
製造において用いることが意図される。同様に、当業者であれば寒冷継代技術を
、異なる温度、または、各温度における異なる寒冷継代数を用いて変えるという
選択することもできる。しかしながら、このような変更は、以下に出願人が記載
するのと同様な、徐々に段階的にした(stepped)温度を好ましくは保持するであ
ろう。
【００２０】 パラインフルエンザウイルス２型(ＨＰＩＶ-２)のSLU7255株を、クループ及び
肺炎で入院した月齢6月の子供から単離した(ATCCアクセッション番号 で
寄託)。元々は、初代アカゲザル腎臓(ＲＭＫ)細胞から単離したが、SLU7255はワ
クチン研究に用いられるディプロイドセルラインであるアカゲザル胎児肺(ＦＲ
ｈＬ-２)細胞での生育に適合させた。ＦＲｈＬ細胞への適合に続いて、Belshe及
びHissom(1982年)(該文献は本明細書の一部を構成する）に記載のＨＰＩＶ-３の
ＪＳ株と同じ様な方法で、SLU7255を連続的に冷気(≦30℃)中で継代し、ワクチ
ン候補を製造した。ｗｔ株をまず30℃で6回継代した後、28℃で6回、26℃で8回
、その後、24℃で13回継代した。寒冷継代工程の一覧については図１を参照せよ
。出願人らは、すぐに22℃で継代することができるＨＰＩＶ-３とは異なり、Ｈ
ＰＩＶ-２をうまく適合させるのに寒冷継代温度を段階的に下げていく必要があ
ったことに驚いた。冷気適合後、初代ミドリザル腎臓(ＡＧＭＫ)細胞で標準的な
プラーク分析技術を用いて、パスツールピペットをアガロース被膜に通し、寒天
栓(agar plug)を吸引し、クローンを初代ＡＧＭＫ細胞を含む組織培養チューブ
中に接種することによりクローンを選択した。クローンの1次スクリーニングの
後、クローンC2450及びC2768を23〜24℃で約18〜30回、さらに寒冷継代し、単離
クローンC3464(ＡＴＣＣアクセッション番号 で寄託)、C3440(ＡＴＣＣ
アクセッション番号 で寄託)、及びC3490(ＡＴＣＣアクセッション番号
で寄託)(後にC3605を得るのにサブクローニングした)を得た。ＨＰＩＶ
-２ウイルスの成功した寒冷継代は以前には開示されていない。
肺炎で入院した月齢6月の子供から単離した(ATCCアクセッション番号 で
寄託)。元々は、初代アカゲザル腎臓(ＲＭＫ)細胞から単離したが、SLU7255はワ
クチン研究に用いられるディプロイドセルラインであるアカゲザル胎児肺(ＦＲ
ｈＬ-２)細胞での生育に適合させた。ＦＲｈＬ細胞への適合に続いて、Belshe及
びHissom(1982年)(該文献は本明細書の一部を構成する）に記載のＨＰＩＶ-３の
ＪＳ株と同じ様な方法で、SLU7255を連続的に冷気(≦30℃)中で継代し、ワクチ
ン候補を製造した。ｗｔ株をまず30℃で6回継代した後、28℃で6回、26℃で8回
、その後、24℃で13回継代した。寒冷継代工程の一覧については図１を参照せよ
。出願人らは、すぐに22℃で継代することができるＨＰＩＶ-３とは異なり、Ｈ
ＰＩＶ-２をうまく適合させるのに寒冷継代温度を段階的に下げていく必要があ
ったことに驚いた。冷気適合後、初代ミドリザル腎臓(ＡＧＭＫ)細胞で標準的な
プラーク分析技術を用いて、パスツールピペットをアガロース被膜に通し、寒天
栓(agar plug)を吸引し、クローンを初代ＡＧＭＫ細胞を含む組織培養チューブ
中に接種することによりクローンを選択した。クローンの1次スクリーニングの
後、クローンC2450及びC2768を23〜24℃で約18〜30回、さらに寒冷継代し、単離
クローンC3464(ＡＴＣＣアクセッション番号 で寄託)、C3440(ＡＴＣＣ
アクセッション番号 で寄託)、及びC3490(ＡＴＣＣアクセッション番号
で寄託)(後にC3605を得るのにサブクローニングした)を得た。ＨＰＩＶ
-２ウイルスの成功した寒冷継代は以前には開示されていない。
【００２１】 ＨＰＩＶ-２クローンが温度感受性であるかどうか決定するために、各クロー
ンの32℃、及び、39℃における力価を血球吸着プラーク分析を用いて比較した。
32℃での力価と比べて39℃における力価が100倍以上の減少を示す場合にクロー
ンが「温度感受性」であると見なし、逆に、32℃と比べて39℃での力価が100倍
より小さい減少を示す場合にｗｔウイルスであると見なした。より好ましくは、
クローンは39℃で＜1.0ｐｆｕ/ｍｌの力価を有する。血球吸着スクリーニング分
析を用いたｔｓ表現型決定の結果により、試験されたクローンの大部分がｔｓ表
現型を示すことが示された。
ンの32℃、及び、39℃における力価を血球吸着プラーク分析を用いて比較した。
32℃での力価と比べて39℃における力価が100倍以上の減少を示す場合にクロー
ンが「温度感受性」であると見なし、逆に、32℃と比べて39℃での力価が100倍
より小さい減少を示す場合にｗｔウイルスであると見なした。より好ましくは、
クローンは39℃で＜1.0ｐｆｕ/ｍｌの力価を有する。血球吸着スクリーニング分
析を用いたｔｓ表現型決定の結果により、試験されたクローンの大部分がｔｓ表
現型を示すことが示された。
【００２２】 クローンが寒冷適合特性を有するかどうかを決定するために、23℃における生
育を、32℃における生育と比較した。表１参照。ヴェロ細胞、または、初代ＡＧ
ＭＫ細胞のどちらかの単層の組織培養チューブに、各クローンを接種し(データ
示さず)、23℃、または32℃で培養した。23℃で培養した場合に接種後7日目、及
び、14日目に、そして、32℃で培養した場合には接種後7日目に、各クローンか
らチューブ培養物を回収した。培養上清中のウイルスの力価を32℃、ヴェロ細胞
でのプラーク分析によりプラーク分析した。5日後に細胞をヘマトキシリン、及
び、エオシンで染色することによりプレートを可視化した。23℃での力価が32℃
での力価の100倍以内であったクローンを、寒冷適合(ｃａ)されたと見なした。
育を、32℃における生育と比較した。表１参照。ヴェロ細胞、または、初代ＡＧ
ＭＫ細胞のどちらかの単層の組織培養チューブに、各クローンを接種し(データ
示さず)、23℃、または32℃で培養した。23℃で培養した場合に接種後7日目、及
び、14日目に、そして、32℃で培養した場合には接種後7日目に、各クローンか
らチューブ培養物を回収した。培養上清中のウイルスの力価を32℃、ヴェロ細胞
でのプラーク分析によりプラーク分析した。5日後に細胞をヘマトキシリン、及
び、エオシンで染色することによりプレートを可視化した。23℃での力価が32℃
での力価の100倍以内であったクローンを、寒冷適合(ｃａ)されたと見なした。
【００２３】 試験したクローンのうち6個が寒冷適合されていたが、その内の1つ、C3252は
どちらの温度でも生育しなかった。寒冷適合されたクローン(C3396、C3464、C34
90、C3457、C3440、及び、C3444)に比べ、野生型親コントロールであるプール45
3は23℃で、ヴェロ細胞中では生育しなかった。
どちらの温度でも生育しなかった。寒冷適合されたクローン(C3396、C3464、C34
90、C3457、C3440、及び、C3444)に比べ、野生型親コントロールであるプール45
3は23℃で、ヴェロ細胞中では生育しなかった。
【００２４】 各クローンの遮断温度(cut-off temperature)を決定するために、プラーク形
成効率(ＥＯＰ)分析を行った。ヴェロ細胞中、32℃、36℃、37℃、38℃、及び、
39℃でプラークを形成する能力について、各ワクチン候補を分析した。表２参照
。C3464、C3490、C3457、C3440、及び、C3444は38℃の遮断温度を示し、2つのク
ローン(C3396、および、C3444)は32℃での生育に比べ、39℃での生育が1000倍制
限されていた。
成効率(ＥＯＰ)分析を行った。ヴェロ細胞中、32℃、36℃、37℃、38℃、及び、
39℃でプラークを形成する能力について、各ワクチン候補を分析した。表２参照
。C3464、C3490、C3457、C3440、及び、C3444は38℃の遮断温度を示し、2つのク
ローン(C3396、および、C3444)は32℃での生育に比べ、39℃での生育が1000倍制
限されていた。
【００２５】 野生型ＨＰＩＶ-２ウイルスから出願人により開示されるのと同様の方法によ
り創り出され、単離されたｔｓ、及び、ｃａ表現型を示すC3396、C3464、C3490
、C3457、C3440、及び、C3444以外のクローンも本発明の範囲に含まれる。本明
細書中の実施例、及び、教示に従って、当業者であれば、野生型ＨＰＩＶ-２ウ
イルスから慣用の方法によりｔｓ、及び、ｃａクローンを創り出し、単離するこ
とができる。さらに、開示される好ましい株のサブクローンをさらに寒冷継代す
るか、または、これらの株を確立された方法を用いて他の宿主細胞中での培養に
適合させることは、ウイルス学の当業者の技術範囲内にある。従って、上述の好
ましい株のサブクローン、及び、後代もまた本発明の範囲内にある。
り創り出され、単離されたｔｓ、及び、ｃａ表現型を示すC3396、C3464、C3490
、C3457、C3440、及び、C3444以外のクローンも本発明の範囲に含まれる。本明
細書中の実施例、及び、教示に従って、当業者であれば、野生型ＨＰＩＶ-２ウ
イルスから慣用の方法によりｔｓ、及び、ｃａクローンを創り出し、単離するこ
とができる。さらに、開示される好ましい株のサブクローンをさらに寒冷継代す
るか、または、これらの株を確立された方法を用いて他の宿主細胞中での培養に
適合させることは、ウイルス学の当業者の技術範囲内にある。従って、上述の好
ましい株のサブクローン、及び、後代もまた本発明の範囲内にある。
【００２６】 以下の実施例に示すように、本発明の単離されたウイルス株は、哺乳動物にお
いて防護免疫応答を誘導するためのワクチン組成物で有用である。所望の免疫応
答を生じさせるウイルスのいくらかの生育、及び、増殖を可能にするが、ＨＰＩ
Ｖ-２疾病症状を生じさせないであろう有効な量で、本発明の単離された弱毒化
ＨＰＩＶ-２ウイルス株は生ワクチンとして好ましくは投与される。生ワクチン
中で使用するウイルスの適切な量は、特定の単離された弱毒化ＨＰＩＶ-２株の
毒性、または、強さ、ワクチンが投与される患者の年齢、ワクチンが投与される
患者の体重、及び、一般的な健康状態、並びに、ワクチンが投与される患者の免
疫系がコンプロミスドかどうかに依存するであろう。
いて防護免疫応答を誘導するためのワクチン組成物で有用である。所望の免疫応
答を生じさせるウイルスのいくらかの生育、及び、増殖を可能にするが、ＨＰＩ
Ｖ-２疾病症状を生じさせないであろう有効な量で、本発明の単離された弱毒化
ＨＰＩＶ-２ウイルス株は生ワクチンとして好ましくは投与される。生ワクチン
中で使用するウイルスの適切な量は、特定の単離された弱毒化ＨＰＩＶ-２株の
毒性、または、強さ、ワクチンが投与される患者の年齢、ワクチンが投与される
患者の体重、及び、一般的な健康状態、並びに、ワクチンが投与される患者の免
疫系がコンプロミスドかどうかに依存するであろう。
【００２７】 本発明のＨＰＩＶ-２の単離された弱毒株は、いずれかの通常の経路(腹膜内、
または、静脈注射用、局所適用用製剤、経口投与用の製剤等々)により患者に投
与するためのワクチン組成物として製剤することができるが、最も好ましくは上
気道の粘膜への適用のためのスプレー、または、洗浄液として製剤される。この
ような適用は、後のＨＰＩＶ-２野生型ウイルスによる感染に対してより大きな
防護を提供する、局部粘膜免疫を刺激するのを助ける。このようなワクチン組成
物は本発明の単離された弱毒ウイルス、及び、滅菌塩水等の医薬的に許容される
担体を含む。さらにワクチン組成物は、患者で防護免疫応答を誘導する助けとな
り得る医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、及び/または、アジュバントを含む
ことができる。本発明のワクチン製剤で使用することができる賦形剤には、ゴム
、または、澱粉等のウイルスの粘膜への付着、及び、上気道の表面に沿って広が
るのを助ける薬剤が含まれる。
または、静脈注射用、局所適用用製剤、経口投与用の製剤等々)により患者に投
与するためのワクチン組成物として製剤することができるが、最も好ましくは上
気道の粘膜への適用のためのスプレー、または、洗浄液として製剤される。この
ような適用は、後のＨＰＩＶ-２野生型ウイルスによる感染に対してより大きな
防護を提供する、局部粘膜免疫を刺激するのを助ける。このようなワクチン組成
物は本発明の単離された弱毒ウイルス、及び、滅菌塩水等の医薬的に許容される
担体を含む。さらにワクチン組成物は、患者で防護免疫応答を誘導する助けとな
り得る医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、及び/または、アジュバントを含む
ことができる。本発明のワクチン製剤で使用することができる賦形剤には、ゴム
、または、澱粉等のウイルスの粘膜への付着、及び、上気道の表面に沿って広が
るのを助ける薬剤が含まれる。
【００２８】 本発明のＨＰＩＶ-２の単離された弱毒株は、防護免疫応答を誘導する目的で
哺乳動物患者に、ワクチン製剤中に入れて投与することができる。予防接種後、
患者の免疫系は野生型ＨＰＩＶ-２ウイルスによる攻撃に対して、ＨＰＩＶ-２感
染、及び、疾病の重篤さを和らげる、準備された(primed)免疫応答を示すであろ
う。本発明のワクチン株はヒト患者での使用を意図したものであるが、ＨＰＩＶ
-２感染の有害な症状を示す他の哺乳動物もまた本発明の範囲内に含まれる。本
発明のワクチン株は好ましくは、しばしば幼年期に起こるより重篤なＨＰＩＶ-
２感染を予防する目的で、幼いうちに患者に投与される。本発明のワクチン株の
単一の投与が、野生型ＨＰＩＶ-２ウイルスによる後の攻撃に対して準備された
免疫応答を誘導するのに十分であることが一般に予想されているが、上述の投薬
と同じ様な要因に基づいて１回より多い投与を指示してもよい。当業者であれば
過度の実験を行うことなく、特定の患者についての適当な投薬レジュメを工夫す
ることができるであろう。
哺乳動物患者に、ワクチン製剤中に入れて投与することができる。予防接種後、
患者の免疫系は野生型ＨＰＩＶ-２ウイルスによる攻撃に対して、ＨＰＩＶ-２感
染、及び、疾病の重篤さを和らげる、準備された(primed)免疫応答を示すであろ
う。本発明のワクチン株はヒト患者での使用を意図したものであるが、ＨＰＩＶ
-２感染の有害な症状を示す他の哺乳動物もまた本発明の範囲内に含まれる。本
発明のワクチン株は好ましくは、しばしば幼年期に起こるより重篤なＨＰＩＶ-
２感染を予防する目的で、幼いうちに患者に投与される。本発明のワクチン株の
単一の投与が、野生型ＨＰＩＶ-２ウイルスによる後の攻撃に対して準備された
免疫応答を誘導するのに十分であることが一般に予想されているが、上述の投薬
と同じ様な要因に基づいて１回より多い投与を指示してもよい。当業者であれば
過度の実験を行うことなく、特定の患者についての適当な投薬レジュメを工夫す
ることができるであろう。
【００２９】 以下に、本発明の単離された、弱毒ＨＰＩＶ-２株の使用についての幾つかの
実施例を示す。これらが本発明の実例であって、本発明の態様を如何なる意味で
も制限することを意図したものでないことが理解されるべきである。
実施例を示す。これらが本発明の実例であって、本発明の態様を如何なる意味で
も制限することを意図したものでないことが理解されるべきである。
【００３０】実施例 １ 表現型の特徴に基づいて、3つのｔｓ及びｃａクローンC3440、C3464、及び、C
3490をハムスターでの評価に選択した。表３は、選択したクローンのｔｓ、及び
ｃａ表現型、及び、これらのＨＰＩＶ-２ワクチン候補のｗｔ親を示す。離乳し
たハムスターを深く麻酔し、鼻腔内に親ｗｔウイルス、または、ワクチン候補の
1つのどちらかを接種した。ハムスターに与えた接種物の力価を表４に示す。エ
アロゾルに耐性を有するピペットチップをクロスコンタミネーションを防ぐため
に用いたマイクロピペッターで、総接種物0.1ｍｌ(0.05ｍｌ/鼻孔)を各動物に与
えた。20匹のハムスターからなる群にワクチン候補、または、ｗｔ親ウイルスの
1つを接種した。各群からの4匹のハムスターを、接種1、2、3、4、及び、7日後
の5点で安楽死させた。10匹の接種していない動物をコントロール群として安楽
死させた(5点、各々で2匹)。心臓穿刺により血液を集め、肺、及び、鼻甲介を各
動物から採集日に得た。32℃で5日間にわたるヴェロ細胞でのプラーク分析によ
り、各組織のホモジェネートをウイルスについて試験した。ヴェロ単層をホルム
アルデヒドで固定し、ウイルスプラークを可視化するためにヘマトキシリン、及
び、エオシンで染色した。
3490をハムスターでの評価に選択した。表３は、選択したクローンのｔｓ、及び
ｃａ表現型、及び、これらのＨＰＩＶ-２ワクチン候補のｗｔ親を示す。離乳し
たハムスターを深く麻酔し、鼻腔内に親ｗｔウイルス、または、ワクチン候補の
1つのどちらかを接種した。ハムスターに与えた接種物の力価を表４に示す。エ
アロゾルに耐性を有するピペットチップをクロスコンタミネーションを防ぐため
に用いたマイクロピペッターで、総接種物0.1ｍｌ(0.05ｍｌ/鼻孔)を各動物に与
えた。20匹のハムスターからなる群にワクチン候補、または、ｗｔ親ウイルスの
1つを接種した。各群からの4匹のハムスターを、接種1、2、3、4、及び、7日後
の5点で安楽死させた。10匹の接種していない動物をコントロール群として安楽
死させた(5点、各々で2匹)。心臓穿刺により血液を集め、肺、及び、鼻甲介を各
動物から採集日に得た。32℃で5日間にわたるヴェロ細胞でのプラーク分析によ
り、各組織のホモジェネートをウイルスについて試験した。ヴェロ単層をホルム
アルデヒドで固定し、ウイルスプラークを可視化するためにヘマトキシリン、及
び、エオシンで染色した。
【００３１】 ｗｔ親ＨＰＩＶ-２は離乳したハムスターの鼻甲介、及び、肺の両方で同じ様
によく生育した(図２、及び３参照)。ウイルス放出(virus shedding)の持続時間
は4日であり、鼻甲介では3日目に5.5ｐｆｕ/ｇ組織(これらの実施例における全
てのｐｆｕ/ｇｍ値はｌｏｇ10で示す)のピーク力価となり、肺では2日目に5.2ｐ
ｆｕ/ｇ組織の平均ピーク力価であった。クローン3490、ｃｐ51は、ハムスター
の鼻甲介から3日目から7日目の間に放出された。C3490の平均ピーク力価は、7日
目に回収された組織当り4.5ｐｆｕであった。ＨＰＩＶ-２は、C3440、または、C
3464を接種された動物のほんの少数からしか回収されず、クローンが最小限にし
か感染性でないことが示唆された。3種の寒冷適合クローンの1つを接種した動物
のいずれの肺からもウイルスは回収されなかった。これらの3種の寒冷適合温度
感受性クローンをハムスターで弱毒化した。これらはさらなるイン・ビボでの特
徴付けに用いることができる。
によく生育した(図２、及び３参照)。ウイルス放出(virus shedding)の持続時間
は4日であり、鼻甲介では3日目に5.5ｐｆｕ/ｇ組織(これらの実施例における全
てのｐｆｕ/ｇｍ値はｌｏｇ10で示す)のピーク力価となり、肺では2日目に5.2ｐ
ｆｕ/ｇ組織の平均ピーク力価であった。クローン3490、ｃｐ51は、ハムスター
の鼻甲介から3日目から7日目の間に放出された。C3490の平均ピーク力価は、7日
目に回収された組織当り4.5ｐｆｕであった。ＨＰＩＶ-２は、C3440、または、C
3464を接種された動物のほんの少数からしか回収されず、クローンが最小限にし
か感染性でないことが示唆された。3種の寒冷適合クローンの1つを接種した動物
のいずれの肺からもウイルスは回収されなかった。これらの3種の寒冷適合温度
感受性クローンをハムスターで弱毒化した。これらはさらなるイン・ビボでの特
徴付けに用いることができる。
【００３２】実施例 ２ ハムスターで評価したクローン各々をさらに、イン・ヴィトロでの遺伝的安定
性について試験した。ｔｓ表現型に対する選択的な圧力下でウイルスが野生型に
戻るかどうかを決定するため、許容温度(32℃)、中間許容温度(35℃)、及び、制
限温度(39℃)に週に1度、各クローンを各々連続的に4週間盲継代するストレステ
ストを行った。ストレステストの結果を表５に示す。各継代後、ｔｓ表現型の変
化を検出するために、ウイルスの力価を32℃、及び39℃で測定した。各クローン
ともそのｔｓ表現型を39℃での連続的な継代後にも保持しており、それらが遺伝
的に安定であることが示された。
性について試験した。ｔｓ表現型に対する選択的な圧力下でウイルスが野生型に
戻るかどうかを決定するため、許容温度(32℃)、中間許容温度(35℃)、及び、制
限温度(39℃)に週に1度、各クローンを各々連続的に4週間盲継代するストレステ
ストを行った。ストレステストの結果を表５に示す。各継代後、ｔｓ表現型の変
化を検出するために、ウイルスの力価を32℃、及び39℃で測定した。各クローン
ともそのｔｓ表現型を39℃での連続的な継代後にも保持しており、それらが遺伝
的に安定であることが示された。
【００３３】 ストレステストに加え、これらの3つの寒冷継代したウイルスからプラークを
選択し、ウイルスプール中にウイルス表現型の混合物が存在するかを決定した(
表６)。プール474(クローン3490)から選択した10個のサブクローン各々が明かに
ｔｓであり、39℃で完全な遮断(cutoff)を示した。プール477(クローン3440)か
らの10個のサブクローンのうち2個が39℃でいくらか生育したが、32℃での場合
と比べて、39℃では少なくとも100倍少ない力価であった。プール484(クローン3
464)からのサブクローンの全6個とも39℃で完全な遮断を示し、ｔｓ表現型を保
持した。これらの結果は、クローン3490、及び、クローン3464が、表現型が混合
しているクローン3440とは異なり単一の表現型を有することを示す。より均一な
ワクチン候補を得るために、C3440からサブクローン(C3605)を選択した。
選択し、ウイルスプール中にウイルス表現型の混合物が存在するかを決定した(
表６)。プール474(クローン3490)から選択した10個のサブクローン各々が明かに
ｔｓであり、39℃で完全な遮断(cutoff)を示した。プール477(クローン3440)か
らの10個のサブクローンのうち2個が39℃でいくらか生育したが、32℃での場合
と比べて、39℃では少なくとも100倍少ない力価であった。プール484(クローン3
464)からのサブクローンの全6個とも39℃で完全な遮断を示し、ｔｓ表現型を保
持した。これらの結果は、クローン3490、及び、クローン3464が、表現型が混合
しているクローン3440とは異なり単一の表現型を有することを示す。より均一な
ワクチン候補を得るために、C3440からサブクローン(C3605)を選択した。
【００３４】実施例 ３ 最も有望なワクチン候補として出現したSLU7255の3つのクローン、C3464(ｃｐ
50)、C3490(ｃｐ51)、及び、C3605（ｃｐ63、C3440のサブクローン)。これら3つ
を血清反応陰性のアカゲザルで評価した。各クローン、及び、ｗｔウイルスにつ
いてのウイルスプールをヴェロ細胞中で製造した。以下の実施例で使用したプー
ルの力価を表７に示す。
50)、C3490(ｃｐ51)、及び、C3605（ｃｐ63、C3440のサブクローン)。これら3つ
を血清反応陰性のアカゲザルで評価した。各クローン、及び、ｗｔウイルスにつ
いてのウイルスプールをヴェロ細胞中で製造した。以下の実施例で使用したプー
ルの力価を表７に示す。
【００３５】実施例 ４ この実験の目的は、野生型(ｗｔ)ＨＰＩＶ２が血清反応陰性のアカゲザルを感
染させる能力を評価することであった。この試験、及び、異化の2つの試験で必
要とされたアカゲザルは各々、ｗｔＨＰＩＶ２に対する血清ＨＡＩ抗体の状態に
基づいて選択した。ｗｔＨＰＩＶ２抗原に対し、1:8より小さいＨＡＩ抗体力価
を有しているサルを適格とした。3つの実験で、総数20匹のアカゲザルが必要と
された。そのうち16匹にｗｔＨＰＩＶか、または、2つのｃａ/ｔｓワクチン候補
の1つを与え、他の4匹にはプラシーボを与えた。4匹のうち2匹をプラシーボとし
て、1つより多い実験で用いた。各実験には、2匹のプラシーボコントロール動物
が含まれた。
染させる能力を評価することであった。この試験、及び、異化の2つの試験で必
要とされたアカゲザルは各々、ｗｔＨＰＩＶ２に対する血清ＨＡＩ抗体の状態に
基づいて選択した。ｗｔＨＰＩＶ２抗原に対し、1:8より小さいＨＡＩ抗体力価
を有しているサルを適格とした。3つの実験で、総数20匹のアカゲザルが必要と
された。そのうち16匹にｗｔＨＰＩＶか、または、2つのｃａ/ｔｓワクチン候補
の1つを与え、他の4匹にはプラシーボを与えた。4匹のうち2匹をプラシーボとし
て、1つより多い実験で用いた。各実験には、2匹のプラシーボコントロール動物
が含まれた。
【００３６】 ｗｔＨＰＩＶ２親、及び、ｃａ/ｔｓクローン、C3490、及び、C3605のプール
をヴェロ細胞で製造した。C3605は、単離された株C3440のサブクローンである。
ニューイベリアの職員は、最初の2つの試験の接種時にウイルスを希釈したが、
我々は、6.0ｐｆｕ/ｍｌと予想された実施例５の接種後の力価が2.0ｐｆｕ/ｍｌ
以下と決定された時点で方法を変更した。実施例６での接種では、ｃａ/ｔｓワ
クチン候補C3605、及び、ｗｔＨＰＩＶ２攻撃ウイルスの両方がセントルイス大
学で製造され、指定された用量でニューイベリアに凍結して出荷された。
をヴェロ細胞で製造した。C3605は、単離された株C3440のサブクローンである。
ニューイベリアの職員は、最初の2つの試験の接種時にウイルスを希釈したが、
我々は、6.0ｐｆｕ/ｍｌと予想された実施例５の接種後の力価が2.0ｐｆｕ/ｍｌ
以下と決定された時点で方法を変更した。実施例６での接種では、ｃａ/ｔｓワ
クチン候補C3605、及び、ｗｔＨＰＩＶ２攻撃ウイルスの両方がセントルイス大
学で製造され、指定された用量でニューイベリアに凍結して出荷された。
【００３７】 0日(接種前)、並びに、105.5ｐｆｕのウイルス、または、プラシーボの鼻腔内
、及び、気管内接種に続く3、5、7、10、12、14、17、19、及び21日目に、各サ
ルから鼻腔洗浄液(nasal wash;ＮＷ)、及び、気管支洗浄液(bronchial lavage;
ＢＬ)を回収した。試料を輸送培地と混合し、等分し、ドライアイス/アルコール
浴で硬く凍らせ、そして−70℃で貯蔵した。接種前、及び、接種後に続く7、14
、21、28、42、及び、56日目に各サルから血清試料を集めた。
、及び、気管内接種に続く3、5、7、10、12、14、17、19、及び21日目に、各サ
ルから鼻腔洗浄液(nasal wash;ＮＷ)、及び、気管支洗浄液(bronchial lavage;
ＢＬ)を回収した。試料を輸送培地と混合し、等分し、ドライアイス/アルコール
浴で硬く凍らせ、そして−70℃で貯蔵した。接種前、及び、接種後に続く7、14
、21、28、42、及び、56日目に各サルから血清試料を集めた。
【００３８】 試料を2つの1次アカゲザル腎臓組織培養物チューブに接種し、32℃で培養した
。ＲＭＫチューブを5、9、及び、14日目にモルモットの赤血球で血球吸着した。
血球吸着が陽性のチューブを免疫蛍光検査(ＩＦ)を用いて同定した。さらに、各
試料を32℃でのヴェロ細胞単層上のプラーク分析で定量した。血清試料をｗｔＨ
ＰＩＶ２に対する抗体について血球凝集阻害(ＨＡＩ)により試験した。受容体破
壊酵素(ＲＤＥ)、及び熱活性化の処置の後、全ての試料を同じ分析で試験した。
。ＲＭＫチューブを5、9、及び、14日目にモルモットの赤血球で血球吸着した。
血球吸着が陽性のチューブを免疫蛍光検査(ＩＦ)を用いて同定した。さらに、各
試料を32℃でのヴェロ細胞単層上のプラーク分析で定量した。血清試料をｗｔＨ
ＰＩＶ２に対する抗体について血球凝集阻害(ＨＡＩ)により試験した。受容体破
壊酵素(ＲＤＥ)、及び熱活性化の処置の後、全ての試料を同じ分析で試験した。
【００３９】 結果：野生型ＨＰＩＶ２を、最初の実験で接種した4匹のアカゲザル各々のＮ
Ｗ、及び、ＢＬ試料から回収した。表８参照。ＮＷ試料については7日目に1.73
ｐｆｕ/ｍｌ以上、そして、ＢＬ試料については5日目に1.53ｐｆｕ/ｍｌ以上の
平均ピーク力価という似たＨＰＩＶ２力価がＮＷ、及び、ＢＬ試料の両方につい
て得られた。接種に続く21日目に、各4匹の動物についてｗｔＨＰＩＶ２に対す
るＨＡＩ抗体応答が観察された。プラシーボを受けたどちらも、ウイルスを放出
せず、ＨＡＩ抗体応答を有さなかった。
Ｗ、及び、ＢＬ試料から回収した。表８参照。ＮＷ試料については7日目に1.73
ｐｆｕ/ｍｌ以上、そして、ＢＬ試料については5日目に1.53ｐｆｕ/ｍｌ以上の
平均ピーク力価という似たＨＰＩＶ２力価がＮＷ、及び、ＢＬ試料の両方につい
て得られた。接種に続く21日目に、各4匹の動物についてｗｔＨＰＩＶ２に対す
るＨＡＩ抗体応答が観察された。プラシーボを受けたどちらも、ウイルスを放出
せず、ＨＡＩ抗体応答を有さなかった。
【００４０】実施例 ５ この実験の目的は、血清反応陰性のアカゲザル中のＨＰＩＶ２ワクチン候補の
生育、弱毒化、遺伝的安定性、及び、免疫減性を決定することであった。
生育、弱毒化、遺伝的安定性、及び、免疫減性を決定することであった。
【００４１】 2つのＨＰＩＶ２ｃａ/ｔｓワクチン候補C3490、及び、C3605を試験した。表９
Ａ、及び、９Ｂ参照。C3490を与えられた4匹のサル各々の鼻腔洗浄(ＮＷ)試料か
らウイルスを単離したが、そのうち2匹は各々、1日しか放出しなかった(95N148
及び95N139)。C3605(プール502)を与えられた4匹の動物のうち3匹のＮＷからウ
イルスを回収した。C3605群のうちの1匹、95N152は、この動物が血清反応陽性(
ＨＡＩ力価＝32)であったにも係らず、接種時に2日間ウイルスを放出した。ＨＰ
ＩＶ２を放出する動物のＮＷから回収したウイルスの平均ピーク力価は、C3490
については7日目で1.5ｐｆｕ/ｍｌ、そして、C3605については7日目に1.4ｐｆｕ
/ｍｌであった。C3490、または、C3605ｃａ/ｔｓＨＰＩＶ２ワクチン候補を接種
した8匹のサルのうち、どれも下部気道、即ち気管支洗浄試料からウイルスを放
出しなかった。プラシーボを受けたどちらの動物からもＨＰＩＶ２は単離されな
かった。全体的に、ＨＡＩデータは最小限の上昇(＜4〜8)をC3490群の2匹のサル
(95N140、及び、95N139)で示し、番号95N148のサルで28日目のＨＡＩ力価8から
、42日目及び56日目に力価32への上昇が示された。しかしながら、このサルは0
〜21日目まで力価16を示したので、8から32へのＨＡＩ力価の増加は抗体応答の
ゆるぎない例を現すわけではないかも知れない。
Ａ、及び、９Ｂ参照。C3490を与えられた4匹のサル各々の鼻腔洗浄(ＮＷ)試料か
らウイルスを単離したが、そのうち2匹は各々、1日しか放出しなかった(95N148
及び95N139)。C3605(プール502)を与えられた4匹の動物のうち3匹のＮＷからウ
イルスを回収した。C3605群のうちの1匹、95N152は、この動物が血清反応陽性(
ＨＡＩ力価＝32)であったにも係らず、接種時に2日間ウイルスを放出した。ＨＰ
ＩＶ２を放出する動物のＮＷから回収したウイルスの平均ピーク力価は、C3490
については7日目で1.5ｐｆｕ/ｍｌ、そして、C3605については7日目に1.4ｐｆｕ
/ｍｌであった。C3490、または、C3605ｃａ/ｔｓＨＰＩＶ２ワクチン候補を接種
した8匹のサルのうち、どれも下部気道、即ち気管支洗浄試料からウイルスを放
出しなかった。プラシーボを受けたどちらの動物からもＨＰＩＶ２は単離されな
かった。全体的に、ＨＡＩデータは最小限の上昇(＜4〜8)をC3490群の2匹のサル
(95N140、及び、95N139)で示し、番号95N148のサルで28日目のＨＡＩ力価8から
、42日目及び56日目に力価32への上昇が示された。しかしながら、このサルは0
〜21日目まで力価16を示したので、8から32へのＨＡＩ力価の増加は抗体応答の
ゆるぎない例を現すわけではないかも知れない。
【００４２】 C3605を与えた群、または、プラシーボを与えた動物ではＨＡＩ抗体の上昇は
なかった。希釈したワクチン標本の逆滴定(back titration)の結果は、この実験
の接種物が少なすぎたことを示す。接種後の逆滴定はC3490についておよそ1.0ｐ
ｆｕ/ｍｌ、そして、C3605について2.5ｐｆｕ/ｍｌと測定された。このデータよ
り、ワクチン株が気道の株で弱毒化されることが判る。
なかった。希釈したワクチン標本の逆滴定(back titration)の結果は、この実験
の接種物が少なすぎたことを示す。接種後の逆滴定はC3490についておよそ1.0ｐ
ｆｕ/ｍｌ、そして、C3605について2.5ｐｆｕ/ｍｌと測定された。このデータよ
り、ワクチン株が気道の株で弱毒化されることが判る。
【００４３】実施例 ６ この実験の目的は、血清反応陰性のアカゲザルにおいて好ましい弱毒ＨＰＩＶ
２ワクチン候補の効力を評価することであった。4匹の血清反応陰性のアカゲザ
ルに、予め希釈したC3605の用量を気管内、及び、鼻腔内に接種した。4匹全ての
動物のＮＷ試料からC3605 ＨＰＩＶ２が放出された。ｃａ/ｔｓワクチン候補を
与えられたいずれの動物からのＢＬからもウイルスは単離されなかった。ＮＷ試
料から放出されたワクチンのピーク平均力価は、7日目で1.88ｐｆｕ/ｍｌであっ
た。どのサルも、C3605 ＨＰＩＶ２に対してＨＡＩ抗体応答を示さなかった。プ
ラシーボを与えた動物はウイルスを放出せず、ＨＡＩ抗体応答も有さなかった。
２ワクチン候補の効力を評価することであった。4匹の血清反応陰性のアカゲザ
ルに、予め希釈したC3605の用量を気管内、及び、鼻腔内に接種した。4匹全ての
動物のＮＷ試料からC3605 ＨＰＩＶ２が放出された。ｃａ/ｔｓワクチン候補を
与えられたいずれの動物からのＢＬからもウイルスは単離されなかった。ＮＷ試
料から放出されたワクチンのピーク平均力価は、7日目で1.88ｐｆｕ/ｍｌであっ
た。どのサルも、C3605 ＨＰＩＶ２に対してＨＡＩ抗体応答を示さなかった。プ
ラシーボを与えた動物はウイルスを放出せず、ＨＡＩ抗体応答も有さなかった。
【００４４】 ｃａ/ｔｓクローンC3605による最初の接種から56日目に、4匹のサル各々をｗ
ｔＨＰＩＶ２の単一の接種により攻撃した。表１１を参照。プラシーボを与えた
動物にもｗｔＨＰＩＶ２攻撃ウイルスを与えた。C3605を接種したサルのいずれ
からもウイルスは回収されなかったが、しかしながら、プラシーボを最初に与え
られた後ｗｔＨＰＩＶ２で攻撃した動物は、ＮＷ、及び、ＢＬ試料の両方でウイ
ルスを放出した。ｗｔＨＰＩＶ２攻撃ウイルスに対するＨＡＩ抗体応答は、C360
5を接種した4匹のサルのうちの3匹で非常に活発であった。ｗｔＨＰＩＶ２ウイ
ルスによる攻撃から7日目には64以上のＨＡＩ力価が明かになった。4匹目のサル
95N024は、攻撃後28日目に血清反応が変化した。プラシーボ後に攻撃ウイルスを
与えた動物は、ｗｔＨＰＩＶ２を接種した実施例４中のサルと同じ様なＨＡＩ抗
体応答を示した。即ち、攻撃後21日目にサルの血清反応が変化した。
ｔＨＰＩＶ２の単一の接種により攻撃した。表１１を参照。プラシーボを与えた
動物にもｗｔＨＰＩＶ２攻撃ウイルスを与えた。C3605を接種したサルのいずれ
からもウイルスは回収されなかったが、しかしながら、プラシーボを最初に与え
られた後ｗｔＨＰＩＶ２で攻撃した動物は、ＮＷ、及び、ＢＬ試料の両方でウイ
ルスを放出した。ｗｔＨＰＩＶ２攻撃ウイルスに対するＨＡＩ抗体応答は、C360
5を接種した4匹のサルのうちの3匹で非常に活発であった。ｗｔＨＰＩＶ２ウイ
ルスによる攻撃から7日目には64以上のＨＡＩ力価が明かになった。4匹目のサル
95N024は、攻撃後28日目に血清反応が変化した。プラシーボ後に攻撃ウイルスを
与えた動物は、ｗｔＨＰＩＶ２を接種した実施例４中のサルと同じ様なＨＡＩ抗
体応答を示した。即ち、攻撃後21日目にサルの血清反応が変化した。
【００４５】 本発明の先の好ましい態様は例示、及び、説明の目的で示した。それらは開示
した通りの形に発明を消尽、または、制限することを意図したものではなく、上
述の教示に従って多くの改変、及び、変化を加えることが可能である。当業者に
明かなこのような改変、及び、変化は、本発明の範囲に含まれる。
した通りの形に発明を消尽、または、制限することを意図したものではなく、上
述の教示に従って多くの改変、及び、変化を加えることが可能である。当業者に
明かなこのような改変、及び、変化は、本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９Ａ】
【表９Ｂ】
【表１０】
【表１１】
【００４７】
【表１２】
【表１３】
【図１】 明細書中に記載の単離されたウイルス株C3440、及び、C3490の系
統を示す、寒冷継代の一覧。
統を示す、寒冷継代の一覧。
【図２】 このグラフは、株C3490(■)、C3440(□)、C3464(◆)、または、
野生型株のプール453(◇)を接種したハムスターから集めた鼻腔洗浄液の活性ウ
イルス力価を示す。
野生型株のプール453(◇)を接種したハムスターから集めた鼻腔洗浄液の活性ウ
イルス力価を示す。
【図３】 このグラフは、株C3490(■)、C3440(□)、C3464(◆)、または、
野生型株のプール453(◇)を接種したハムスターから集めた気管支/肺洗浄液の活
性ウイルス力価を示す。明細書中に記載の単離されたウイルス株C3440、及び、C
3490の系統を示す、寒冷継代の一覧。
野生型株のプール453(◇)を接種したハムスターから集めた気管支/肺洗浄液の活
性ウイルス力価を示す。明細書中に記載の単離されたウイルス株C3440、及び、C
3490の系統を示す、寒冷継代の一覧。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年４月１８日（２００１．４．１８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】 各クローンの遮断温度(cut-off temperature)を決定するために、プラーク形
成効率(ＥＯＰ)分析を行った。ヴェロ細胞中、32℃、36℃、37℃、38℃、及び、
39℃でプラークを形成する能力について、各ワクチン候補を分析した。表２参照
。C3464、C3490、C3457、C3440、及び、C3252は38℃の遮断温度を示し、2つのク
ローン(C3396、および、C3444)は32℃での生育に比べ、39℃での生育が1000倍制
限されていた。
成効率(ＥＯＰ)分析を行った。ヴェロ細胞中、32℃、36℃、37℃、38℃、及び、
39℃でプラークを形成する能力について、各ワクチン候補を分析した。表２参照
。C3464、C3490、C3457、C3440、及び、C3252は38℃の遮断温度を示し、2つのク
ローン(C3396、および、C3444)は32℃での生育に比べ、39℃での生育が1000倍制
限されていた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３４】実施例 ３ 最も有望なワクチン候補として出現したSLU7255の3つのクローン、C3464(ｃｐ
50)、C3490(ｃｐ63)、及び、C3605（ｃｐ47、C3440のサブクローン)。これら3つ
を血清反応陰性のアカゲザルで評価した。各クローン、及び、ｗｔウイルスにつ
いてのウイルスプールをヴェロ細胞中で製造した。以下の実施例で使用したプー
ルの力価を表７に示す。
50)、C3490(ｃｐ63)、及び、C3605（ｃｐ47、C3440のサブクローン)。これら3つ
を血清反応陰性のアカゲザルで評価した。各クローン、及び、ｗｔウイルスにつ
いてのウイルスプールをヴェロ細胞中で製造した。以下の実施例で使用したプー
ルの力価を表７に示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４６】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９Ａ】
【表９Ｂ】
【表１０】
【表１１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B065 AA95X AC02 AC03 BA22 CA45 4C085 AA03 BA55 CC08 DD21 DD62 EE06 FF24
Claims (22)
- 【請求項１】 単離された弱毒ヒトパラインフルエンザウイルス２のウイル
ス株。 - 【請求項２】 およそ32℃、哺乳動物宿主細胞中で生育された場合に、およ
そ23℃、哺乳動物宿主細胞中で生育された場合の力価と比べて約100倍少なく、
そして、およそ39℃、哺乳動物宿主細胞中で生育された場合の力価の約100倍よ
り少ないか、または、それと等しい、ヴェロ細胞でのプラーク検定における力価
を示す、請求項１に記載の単離された弱毒ウイルス株。 - 【請求項３】 およそ39℃、哺乳動物宿主細胞中で生育された場合にヴェロ
細胞のプラーク検定で約1.0pfu/mlより少ないか、または、それと同等の力価を
示す、請求項１に記載の単離された弱毒ウイルス株。 - 【請求項４】 C3396、C3464、C3490、C3457、C3440、C3444と呼ばれるもの
からなるウイルス株、及び、前述の株の何れかのサブクローン、または、後代の
群から選択される、請求項１に記載の単離された弱毒ウイルス株。 - 【請求項５】 C3464、C3490、C3440と呼ばれるものからなるウイルス株、
及び、前述の株の何れかのサブクローン、または、後代の群から選択される、請
求項１に記載の単離された弱毒ウイルス株。 - 【請求項６】 請求項１に記載の単離された弱毒ウイルス株、及び、医薬的
許容される担体を含むワクチン組成物。 - 【請求項７】 医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項６に記載の
ワクチン組成物。 - 【請求項８】 医薬的に許容されるアジュバントをさらに含む、請求項６に
記載のワクチン組成物。 - 【請求項９】 単離された弱毒ウイルス株が請求項２に記載の株である、請
求項６に記載のワクチン組成物。 - 【請求項１０】 医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項９に記載
のワクチン組成物。 - 【請求項１１】 医薬的に許容されるアジュバントをさらに含む、請求項９
に記載のワクチン組成物。 - 【請求項１２】 単離された弱毒ウイルス株が請求項４に記載の株である、
請求項６に記載のワクチン組成物。 - 【請求項１３】 医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１２に記
載のワクチン組成物。 - 【請求項１４】 医薬的に許容されるアジュバントをさらに含む、請求項１
２に記載のワクチン組成物。 - 【請求項１５】 単離された弱毒ウイルス株が請求項５に記載の株である、
請求項６に記載のワクチン組成物。 - 【請求項１６】 医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１５に記
載のワクチン組成物。 - 【請求項１７】 医薬的に許容されるアジュバントをさらに含む、請求項１
５に記載のワクチン組成物。 - 【請求項１８】 哺乳動物において防護免疫応答を誘導する方法であって、
哺乳動物に請求項１に記載の単離された弱毒ウイルス株を防護免疫応答を誘導す
るのに十分な量で投与することを含む方法。 - 【請求項１９】 単離された弱毒ウイルス株が請求項２に記載の株である、
請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 単離された弱毒ウイルス株が請求項３に記載の株である、
請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２１】 単離された弱毒ウイルス株が請求項４に記載の株である、
請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２２】 単離された弱毒ウイルス株が請求項５に記載の株である、
請求項１８に記載の方法。
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