CN118064456A - 一种针对人合胞病毒的新型的RSV B mRNA疫苗 - Google Patents

一种针对人合胞病毒的新型的RSV B mRNA疫苗 Download PDF

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CN118064456A CN202410233995.XA CN202410233995A CN118064456A CN 118064456 A CN118064456 A CN 118064456A CN 202410233995 A CN202410233995 A CN 202410233995A CN 118064456 A CN118064456 A CN 118064456A
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Abstract

本发明公开了重组人合胞病毒mRNA,相关疫苗组合物及其应用。本发明通过对合胞病毒编码序列的优化,获得了多个合胞病毒的mRNA序列。进一步成功制备mRNA/LNP纳米颗粒复合物。将所述复合物免疫小鼠,在小鼠体内诱导出病毒特异性抗体,诱导的抗体具有中和病毒,阻止病毒感染的能力。肺部干扰实验表明,纳米颗粒复合物可以明显抑制小鼠和棉鼠肺部病毒的数量,恢复小鼠和棉鼠的体重,能够对肺部感染的小鼠和棉鼠起到保护作用。棉鼠中,疫苗组肺脏炎性浸润综合评分呈现显著降低趋势。对已经感染过RSV病毒的动物进行免疫,则极大地提高了抗体含量,具有非常好的病毒保护效果。本发明提供的mRNA疫苗制备简单,具有较高的抗病毒效果以及安全性。

Description

一种针对人合胞病毒的新型的RSV B mRNA疫苗
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域。具体涉及到一种针对人合胞病毒的新型的RSV BmRNA疫苗的设计及应用,属于免疫药物技术领域。
背景技术
基于核酸等生物大分子的细胞内递送技术,近年来得到了创新药研发领域的广泛关注,其中,基于mRNA技术的新型疫苗在紧急需求之下,研发、临床试验及上市批准被迅速推进,向世界第一次展现了mRNA技术平台的临床有效性,安全性和商业价值。与传统的直接以蛋白质或多肽作为药物活性成分的药物相比,mRNA技术有诸多优势:
1)更高的生物活性与安全性:mRNA技术的药物,其蛋白表达、相关结构的糖基化、末端修饰、去甲基化等复杂的蛋白修饰过程皆于人体自身细胞内且按照天然路径完成。无论是从合成原料的分子结构还是合成环境上考虑,都与人体高度同源。因此,相比于传统蛋白质制剂体外细菌体系或细胞体系,基于mRNA序列的内源性蛋白质产物具有更准确的作用特异性,更高的亲和力和与之伴随的更值得期待的生物活性。
2)更长的生物半衰期:现有实验结果证实,包括抗体在内,通过mRNA来生成的蛋白质,尤其是采用自复制核酸或环状核酸,可以维持较长时间的有效血液浓度,从而降低用药频率和用药量,降低药物副作用,提高患者顺应性。
3)更多的应用场景:通过基于递送技术的剂型和多样化的给药方式的开发,mRNA制剂可以接触到多种临床作用靶点,提高药物活性成分的局部区域浓度和药效,在丰富了新药开发的范围的同时,也丰富临床上患者治疗方式的选择。
4)更低的生产成本:相较于蛋白质,mRNA工业化生产中最显著的优势在于流程短,较少的中间产物和较短的生产周期,更容易纯化和质控,表现出更高的生产效率。
5)快速响应:mRNA疫苗在产品开发流程中应用到的技术多为基本的分子生物学方法,技术转移相对容易。一个成熟的mRNA平台,从针对不同病原体的基因测序、设计至生产,只需要数周的时间,在对于时间要求比较紧急的疫情中能迅速应对,及时发挥疫苗的重要作用。
人类呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,hRSV)是副粘病毒科肺病毒属的一种有包膜的不分节段负链RNA病毒,是一种长期全球高度流行的,传染性很强的呼吸道病毒。其传染性和致病性仅次于流感,导致婴儿患细支气管炎、成人患普通感冒,以及老年人和免疫功能低下者患上更严重的呼吸道疾病,例如肺炎。每年在世界范围内影响超过6400万人。由于2023年以前没有预防性疫苗或有效的抗病毒药物,RSV感染带来巨大的健康隐患和经济负担。每年因RSV感染造成全球超过300万人住院,近6万人死亡,其中近一半发生在6个月以内的婴儿。仅在美国,老年人的RSV感染每年导致17.7万人住院,1.4万人死亡,住院费用超过10亿美元。
RSV基因组总长约为15,000个核苷酸,由10个基因组成,编码11种蛋白质,其中表面的融合蛋白(fusion protein,F)和糖蛋白(glycoprotein,G)最引人注意。根据F和G表面蛋白对单克隆抗体的反应性,RSV分为两种抗原亚型:A和B,这些亚型往往在当地流行病中同时传播。
F蛋白序列在菌株之间高度保守,并以多种构象形式存在。在融合前状态(Pre-F),蛋白质以三聚体形式存在,并包含主要抗原位点在与宿主细胞表面的靶标结合后,Pre-F会发生构象变化,/>会丢失,最终的构象转变导致蛋白质的形式更加稳定(融合后,Post-F)。RSV病毒颗粒的内部是核蛋白(N)、磷酸化丙酯(P)和大聚合酶蛋白(L)结合病毒RNA组成,它被基质蛋白(M)包围,并被包裹在脂质双层中,融合蛋白(F),附着蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)。其中,由于F基因的跨株型保守性,蛋白稳定性,和较少的糖基修饰性,F蛋白在RSV进入宿主细胞过程中发挥着重要作用,最终成为疫苗的热门抗原。
自然界中,RSV F蛋白最初表达为单一多肽前体F0,在弗林蛋白酶样蛋白酶切下,产生F1、F2和Pep27多肽。其中F1和F2通过两个二硫键连接,形成成熟的F蛋白,并以三聚体的结构锚定在病毒膜中。感染前,F三体是以亚稳态的预融合构象存在的,而这一形态正是F蛋白特异性抗体识别和结合F蛋白的状态。当病毒通过F蛋白接触到有受体的靶细胞,该构象被触发,发生变化,将病毒膜和细胞膜拉近并融合,这时候的F蛋白构象,被称作融合后F。由于RSV F蛋白在RSV进入细胞过程中发挥着重要作用,因此它是中和抗体的目标,也是疫苗开发的主体。然而,与其他RSV抗原一样,先前基于RSV F蛋白的疫苗开发努力已被证明并不成功。
自1957年RSV首次在人群中被发现,对RSV疫苗的尝试几十年来从未间断过。然而,由于技术的滞后,从灭活疫苗造成更为严重的感染,到后来的蛋白疫苗,病毒载体疫苗,研究者一直在效价,G蛋白,F蛋白,还是N蛋白作为抗原,主要是诱导T细胞的细胞免疫还是B细胞的体液免疫,等诸多问题上纠结,积累了大量的经验,但始终没有获得成功的RSV疫苗,直至2023年,美国食品和药物管理局(FDA)批准了最初二款RSV蛋白疫苗(GSK和Pfizer)。
近半个世纪以来,RSV疫苗的研发一直是呼吸道疫苗领域的热点,从灭活疫苗,到蛋白疫苗,重组疫苗,尝试了许多不同的方法,但在临床试验阶段屡屡受挫,达不到所需的保护率。近年来,随着结构分子生物学的介入,人们对疫苗的工作原理有了突破性的认识。我们的设计,正是结合了最新的抗原蛋白结构生物学发现和对病毒流行病学和毒株的深入的了解,设计和合成了我们独有的RSV mRNA/LNP疫苗。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中RSV疫苗不足,安全性较低的问题,提供一种新的、高效的、高安全性的RSV B mRNA疫苗。
为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
本发明公开了一种重组人合胞病毒mRNA,所述mRNA的编码序列选自如SEQ ID NO:1-15所示的序列。
优选的,所述mRNA的编码序列如SEQ ID NO:2-6,13-15所示。#009系列,包括JY-B-009-ggg,JY-B-009-agg,JY-B-009-120,JY-B-009-better,JY-B-009-better plasmid,以及JY-B-021,JY-B-022,JY-B-023。
本发明公开了表达载体,所述表达载体表达所述的mRNA分子。
本发明公开了细胞,所述细胞包含所述的表达载体。
本发明公开了重组蛋白,所述重组蛋白由所述的mRNA翻译获得。
本发明公开了重组蛋白,所述重组蛋白由所述的mRNA在体内翻译获得。
本发明公开了重组核苷酸,所述重组核苷酸编码所述的重组蛋白。
本发明公开了质粒,所述质粒包含所述的重组核苷酸。
本发明公开了mRNA/LNP复合物,包括所述的mRNA分子和脂质纳米颗粒。
本发明公开了mRNA/LNP复合物的制备方法,包括如下步骤:
1)将所述的mRNA溶解在醋酸盐缓冲液中;
2)将可电离阳离子、DSPC、胆固醇、PEG-2000按比例配置成混合溶液;
3)将步骤2)中的混合溶液与步骤1)中的含有mRNA的缓冲液在微流控设备中混和,并进行稀释和提升pH值,获得mRNA/LNP复合物。
优选的,所述醋酸盐缓冲液的pH值为4.5。
优选的,所述可电离阳离子为SM-102。
本发明公开了mRNA/LNP复合物,所述复合物按照所述的方法制备得到。
本发明公开了疫苗组合物,所述疫苗组合物包括所述的质粒和/或所述的表达载体和/或所述的合成的mRNA和/或合成的蛋白和/或所述的mRNA/LNP复合物。
优选的,还包括佐剂。
所述的mRNA和/或所述的表达载体和/或所述的重组蛋白和/或所述的重组核苷酸和/或所述的质粒和/或所述的mRNA/LNP复合物在制备人合胞病毒疫苗组合物中的应用。
本发明通过对合胞病毒株的筛选以及病毒F蛋白编码序列和前后协助蛋白表达序列的优化,获得了多个合胞病毒的mRNA疫苗设计序列。将获得的序列质粒合成后,在体外转录后成功制备获得mRNA/LNP复合物。将RSV mRNA/LNP纳米颗粒转染至293T细胞,成功检测到高表达的重组蛋白,将复合物免疫小鼠,可在小鼠体内诱导出的病毒特异性抗体,并且诱导的抗体具有中和病毒,阻止病毒感染的能力。
RSV F mRNA/LNP纳米颗粒免疫后再对小鼠和棉鼠进行RSV感染,测试肺部感染RSV的情况,可以明显抑制小鼠和棉鼠肺部病毒的数量,恢复小鼠和棉鼠的体重,能够对肺部感染的小鼠和棉鼠起到保护作用。尤其对于棉鼠,疫苗组肺脏炎性浸润综合评分呈现显著降低趋势。
本发明的mRNA/LNP纳米颗粒疫苗,对已经感染过RSV病毒的动物进行加强疫苗注射,极大地提高了抗体含量,预示着具有非常好的病毒保护效果。在人群中给予加强免疫,可以极大的控制RSV病毒感染。
附图说明
图1.Western Blot检测RSV F mRNA/LNP纳米颗粒#009-better转染至293T细胞后在细胞中的表达。
其中,第一天,在24孔板中铺上2x105/孔293T细胞;第二天,将3ug RNA量的RSV FmRNA/LNP,9B转染至细胞,24,48,72小时后收取细胞上清,并用离心滤管浓缩4倍,10ul上样。一抗为含有抗RSV F蛋白的血清(1:100稀释),二抗为山羊抗鼠(1:1000稀释),ECL显色。
图2.RSV F mRNA/LNP疫苗在小鼠体内诱导出较强的抗体反应。
图3.RSV F mRNA/LNP疫苗在小鼠体内诱导出的抗体具有持久性,低剂量,独立表达抗原的特性。
图4.比较RSV F mRNA/LNP疫苗在小鼠体内的免疫次数效应。
图5.RSV F#009-better mRNA/LNP疫苗在小鼠体内诱导出的抗体表现出抗原独立性的特性。
图6.中和试验检测RSV F mRNA/LNP疫苗在小鼠体内诱导出特异的抗病毒抗体。
图7.RSV F mRNA/LNP疫苗可以明显降低RSV在小鼠肺部的感染。其中,A)小鼠感染后体重变化;B)小鼠感染后第四天取肺,肺匀浆提取RNA,反转录成cDNA,以qPCR扩增N基因来定量病毒载量。
图8.RSV F mRNA/LNP疫苗可以明显降低RSV在棉鼠肺部的感染。
图9.肺脏HE病理染色分析显示,RSV F mRNA/LNP疫苗可以明显降低RSV在棉鼠肺部的感染。其中,A)代表性肺切片;B)统计结果。T-test:*P<0.05vs.PBS Group。其中,黄色箭头:肺泡壁增厚伴炎性细胞浸润。
图10.二剂RSV F mRNA/LNP疫苗所诱导的体液免疫与感染的比较。其中,(A)和(B)是接受RSV感染或#9-better RSV-B-F mRNA/LNP疫苗的实验计划和剂量。(C)和(D)分别是是第一次和第二次取血样品的抗体Elisa检测。
图11.JY-B-008mRNA疫苗序列结构及编码信息。
图12.JY-B-009-ggg mRNA疫苗序列结构及编码信息。
图13.JY-B-009-agg mRNA疫苗序列结构及编码信息。
图14.JY-B-009-120mRNA疫苗序列结构及编码信息。
图15.JY-B-009-better mRNA疫苗序列结构及编码信息。
图16.JY-B-009-better完整质粒序列结构及编码信息。
图17.JY-B-012mRNA疫苗序列结构及编码信息。
图18.JY-B-016mRNA疫苗序列结构及编码信息。
图19.JY-B-018mRNA疫苗序列结构及编码信息。
图20.JY-B-020-1mRNA疫苗序列结构及编码信息。
图21.JY B-020-2mRNA疫苗序列结构及编码信息。
图22.JY-B-020-3mRNA疫苗序列结构及编码信息。
图23.JY-B-021mRNA疫苗序列结构及编码信息。
图24.JY-B-022mRNA疫苗序列结构及编码信息。
图25.JY-B-023mRNA疫苗序列结构及编码信息。
图26.B血清型的不同mRNA疫苗编码蛋白的序列比对。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
实施例1起始病毒株的筛选和mRNA序列优化
1.1起始病毒株筛选
RSV病毒按照传统的血清学分类,可以分成A亚型和B亚型,在流行病学中它们几乎等重,表现在流行年份和地区上的随机,致病程度上的相当。因而,无论将设计的重点放在哪个亚型,意义都是一样的。本专利主要专注于RSV B亚型,所列举的设计序列均起始于RSVB亚型。
目前病毒疫苗的通用设计是以传统的RSV最原始的菌株RSV-A2的F融合蛋白基因为起点,这样的疫苗所诱导的免疫反应,尤其是抗病毒抗体,与RSV-A2有着非常高的“钥匙与锁”的匹配关系,可以较好地中和RSV-A2病毒株,达到免疫的效果。然而,病毒基因序列是会随着病毒反复感染宿主不断地传代而发生遗传变异的,结果势必造成RSV-A2这一1962年分离出的原始菌株所诱导产生的免疫反应难以完全控制六十年以后的现代菌株。为此,我们在搜寻了几百个RSV B血清型的F基因序列后,根据病毒流行的地理位置和时间,挑选出一个临床毒株序列作为我们设计的起始点:RSV-B,18537,ATCC VR-1580。1962年发现的,广泛使用的实验室病毒株,属于B亚型。
RSV B,BE/5150/08,2008,from Belgium,GenBank:JX576730.1,临床毒株,属于B亚型。
RSV-B,WZ23 XiaMen China,2022,GenBank:OM063019.1,临床毒株,属于B亚型。
1.2序列优化:
mRNA序列设计是mRNA整个制药过程最核心最关键的问题之一,跟mRNA成药性密不可分的。序列设计至关重要,它影响mRNA体外转录的产量、mRNA分子的免疫原性、翻译效率和mRNA分子的稳定性。目前通用的mRNA是由5'cap(帽结构)、5'UTR(非编码区域)、ORF(编码蛋白的开放阅读框)、3'UTR和3'poly A尾(多聚腺苷酸尾)这5个元件构成的。
5′Cap结构可保护mRNA不被胞质外切酶Xrn1和核内Xrn2酶降解。加帽的mRNA比没有加帽的mRNA具有更长的半衰期和更高的稳定性,明显提高了细胞内蛋白质合成的产量。根据甲基化修饰的程度不同,帽可分为3种结构:Cap 0、Cap 1和Cap 2。由于未加帽mRNA或Cap 0结构会被天然免疫受体RIG-1识别,而Cap 1和Cap 2可保护其自身不被先天免疫感应器识别,我们的设计是普遍使用的Cap1结构。
真核mRNA翻译起始调控主要由5′UTR特征决定,包括二级结构、序列元件和5′UTR长度,都会影响mRNA的稳定性。我们的设计是采用蛋白表达相对高的人细胞色素B-245α多肽(CYBA)UTR。当然UTR的表现也取决于细胞类型。
T7启动子序列可以分为两个结构域:结合结构域和转录起始结构域。对于转录起始结构域来说,任何碱基的替换都会严重影响到启动子的强度。我们的设计是TAATACGACTCACTATA,后面直接接ggg或agg。Kozak是GCCGCCACC。
对RSV的蛋白序列而言,为了疫苗诱导的抗体能够更有效地阻断病毒,选用亚稳态的预融合形式是关键,它可以通过点突变来实现结构的稳定性。我们在原始序列上安排了四个点突变:DS的S155C和S290C突变,引入非天然二硫键;Cav1的S190F和V207L突变,空腔填充氨基酸。同时,为了更接近病毒天然的结构,引发均匀的更显著的免疫反应,去掉了C端的跨膜段(TM)和胞内段,替换为一个Fibritin序列,这样,F蛋白就可以以较稳固的三聚体的形式呈现。
对RSV-F的DNA序列而言,选择合适的密码子可以优化mRNA的整体翻译效率。一是整体靠拢宿主细胞,也就是人的细胞中使用频率高的同义密码子去替换病毒序列中的密码子,保证密码子使用偏向性更加契合,避免出现过多的稀有密码子。但也注意到保留少量的病毒密码子,延缓核糖体前进的速度,为蛋白质的正确折叠提供足够的时间,从而更准确地还原病毒的抗原蛋白结构。另一个注意点是GC含量,略高的GC含量,据认为是可以增加mRNA的稳定性和提高体内的蛋白表达量。最后,mRNA序列的二级结构也在考量中。据报道,二级结构的发夹结构,可以影响mRNA的降解,有助于mRNA的稳定性。
与5′UTR相似,3′UTR也包含了许多调控元件,对mRNA的稳定性、亚细胞定位和翻译效率有重要作用我们使用的3‘UTR来自human AES/TLE5 gene。
Poly A尾在蛋白翻译过程中起着不可缺或的作用,它与poly A尾结合蛋白(PAPB)结合,PAPB再跟翻译起始因子eIF4G相互作用,形成“闭环”结构,募集40S翻译起始复合物到mRNA上,与5'末端帽子结构协同作用,共同刺激翻译起始。在细菌扩增过程中,携带长的聚均核苷酸序列的质粒会产生不可预测的重组事件,质粒上的poly A尾巴随着细菌的不断扩增发生缩短,这会对携带过长poly A尾巴质粒的克隆和扩增造成麻烦。有研究表明,把polyA序列间隔开来,可以显著减少质粒DNA扩增时的重组事件,维持尾巴长度,同时不影响体外转录生成的mRNA的翻译效率和半衰期。遵循这一原则,我们的polyA是30-间隔-70,或40-间隔-80。
遵循上述原则,我们共设计了15个序列(表1),或针对不同的流行病季节年度毒株情况,或代表了我们对问题不断深入的理解。在经过了多轮的细胞尤其是动物筛选,考录到有效性,实用性,跨A和B血清型,工艺放大可行性,最佳的选择是第9号系列,其中JY-B-009-ggg是起始序列,JY-B-009-better是最适合推进疫苗产品的序列。
表1:mRNA序列设计及编号
实施例2mRNA疫苗的质粒合成和DNA提取
2.1质粒合成
质粒序列设计完成后,由CRO公司合成。
2.2质粒DNA提取
2.2.1试剂配制
平板和液体LB培养基,含蛋白胨,氯化钠,酵母提取物和相应的抗生素。
2.2.2质粒转化
质粒DNA加入感受态细胞中,冰盒中静置30min;42℃水浴锅热激45s,迅速置于冰盒中2min,加入500ul无抗性LB培养液,37℃摇床培养1h;随后涂板,37℃培养过夜;然后平板挑克隆。
2.2.3质粒DNA提取
过夜培养的菌液采取大提试剂盒的方法提取。
2.3质粒DNA酶切验证
采用限制性内切酶进行单酶切,双酶切和三酶切验证。合格的质粒进入下一步实验。
实施例3体外转录
这部分的工作,包括质粒DNA线性化,体外转录和纯化。
3.1质粒DNA线性化
本设计基本采用在polyA的3’端设置反向的BspQI来线性化质粒。50℃反应过夜后,通过SDS-PAGE凝胶电泳来判断酶切是否完全。采用3M醋酸钠沉淀法进行纯化;随后Nanodrop法测定DNA浓度。
3.2体外转录(IVT)和纯化
由于相异的T7聚合酶作用原理,体外转录可分为二步法和共转录法。二步法由IVT和加帽二个反应体系完成,共转录法则由一个反应体系完成。
3.2.1二步法
二步法IVT体系中包含模板DNA,NTP(UTP为假尿嘧啶),T7转录酶,10X转录缓冲溶液,焦磷酸酶,RNA酶抑制酶,以及DEPC水,DNA模板用量和定容的体积视具体实验而定。37℃反应3小时后,加入DNase I清除DNA模板,琼脂糖凝胶判断mRNA合成和DNA模板消化情况。纯化方法为氯化锂沉淀法。
在第二步的加帽体系中,包含有mRNA,GTP,SAM,2-O-甲基转移酶,牛痘加帽酶,加帽缓冲溶液,RNA酶抑制剂,以及DEPC水,mRNA用量和定容体积视具体实验而定。mRNA有一个65℃加热10分钟的打开二级键的步骤,加帽反应为37℃1小时。反应完成后,琼脂糖凝胶电泳判断mRNA质量。纯化方法为氯化锂沉淀法。
3.2.2共转录法
共转录IVT体系中包含模板DNA,NTP(UTP为假尿嘧啶),Cap analogs,T7转录酶,10X转录缓冲溶液,焦磷酸酶,RNA酶抑制酶,以及DEPC水,DNA模板用量和定容的体积视具体实验而定。37℃反应3小时后,加入DNase I清除DNA模板,SDS-PAGE凝胶判断mRNA合成和DNA模板消化情况。纯化方法为氯化锂沉淀法。
实施例4mRNA/LNP纳米颗粒制备
本研究采用业内通用的纳米颗粒LNP的制备方法。
LNP由可电离阳离子(ionizable lipid):DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine):胆固醇(cholesterol):PEG-2000以50:10:38.5:1.5的比例,与溶解在pH4.5柠檬酸钠盐的缓冲液中的mRNA,在高对冲纳米颗粒制备设备中混匀,并随着紧接着的稀释pH提升而形成mRNA包裹在其中的脂质纳米颗粒。通过超滤离心纯化和浓缩样品。最终产物检测粒径,PDI,ZP,包封率和有效mRNA浓度。
4.1.缓冲液液配制
所有试剂121℃高压灭菌20min,使用DEPC水配制。
1)100mL 50mM pH.4.0醋酸盐缓冲盐按下表比例配制
2)1000mL Tris-HCL(25mM)缓冲盐按下表比例配制。
3)10mL 0.6g/mL蔗糖溶液按下表比例配制。
4.2脂质溶液及mRNA溶液的配置
4.2.1脂质溶液的配制
1)脂质称重之前,需恢复至室温;
2)所有成分溶解在无水乙醇中,为使溶解完全,利用超声仪。
3)将上述配置好的脂质溶液,按照1:1:1:1的比例混合,即得符合配方的12mg/mL脂质混合溶液。
3.2.2mRNA溶液的配制
按照上表所示计算方法和缓冲液种类稀释mRNA原液至所需浓度0.2mg/mL。
4.3制备LNP(以总体积4mL为例)
4.3.1迈安纳快速纳米药物制备系统INano LTM。根据需要设置参数。
4.3.2芯片的使用前润洗
准备5mL注射器3支,其中1支吸取无水乙醇,1支吸取醋酸盐缓冲液,1支空气。左侧醋酸盐缓冲液5mL→空气3次;右侧乙醇5mL→乙醇的5mL→空气3次,手推清洗芯片。清洗后将芯片装入卡槽。
4.3.3运行微流控设备制备LNP
用3ml注射器吸取上述配置mRNA溶液3mL,并排除气泡,装入机器左侧注射器卡槽。用1ml注射器吸取上述所配置脂质混合溶液1mL,并排除气泡,装入机器右侧注射器卡槽。于机器废液收集处与样品收集处各插入一只15ml离心管用于废液与样品的收集。参数确认无误后,点击“开始”,迈安纳快速纳米药物制备系统INano LTM将立即运行,即进行LNP的制备。制备结束后,取出样品收集处的离心管。
4.3.4芯片的使用后清洗
LNP制备结束后立即使用左5mL DEPC水,右乙醇5mL→乙醇5mL→空气3x的顺序,将注射器装入芯片进样口,手推清洗芯片,然后自然晾干。
4.3.5收集LNP样品的处理
收集的LNP悬浮液立即用25mM Tris-Hcl缓冲盐稀释至LNP体积的约25倍,然后超滤离心,3000rpm,4℃,1h。重复此过程至溶液体积小于等于LNP稀释前体积(3.6mL,即总体积4mL减去废液0.4mL)。接着,过0.22um滤膜除菌,并添加0.2倍溶液体积的0.6g/mL蔗糖溶液,最终得到mRNA-LNP制剂产品。
4.3.6mRNA-LNP物理性质检测
制备完成的mRNA-LNP应尽快进行物理性质检测以确定产品的质量,便于下一步的生物活性研究。检测使用马尔文Zetasizer,可获得粒径,PDI,ZP数据。
实施例5RSV F mRNA/LNP纳米颗粒转染至293T细胞的表达
为确定在脂质纳米颗粒中的mRNA能够表达出正确的蛋白,首先第一步是将特定的mRNA/LNP转染至合适的细胞,然后可以用Elisa,Western Blot,流式细胞仪等方法去检测蛋白表达的正确性。表1所例的全部质粒都经过这一步检验,合格的质粒方可移到下一步做进一步的动物体内验证。
5.1细胞转染
在转染的前一天,将293T(CRL-3216,ATCC)细胞以2x10^5/孔铺在24孔板内,完全培养基是DMEM加上10%胎牛血清及双抗,培养条件是37℃,5%CO2。第二天,吸去每孔的细胞培养液,并用PBS轻轻冲洗;加入每孔500ul完整培养基后,再向细胞中加入0.5至3ugRNA/孔不等的梯度RSV F mRNA/LNP纳米颗粒。轻轻晃匀分散纳米颗粒后,置于37℃,5%CO2培养48-72小时。
5.2Western Blot(WB)法检测抗原蛋白的表达
通过WB方法可以定性地检测mRNA/LNP在进入细胞后,翻译成正确的抗原目的蛋白。由于蛋白设计带有信号肽,故在此测定胞外蛋白。
5.2.1电泳样品准备
收集六孔板中的培养液于1.5mL离心管中,2500rpm,5min,4℃离心,取上清于新的1.5mL管中。若表达量过低,可选择合适规格的Millipore超滤管先做适度浓缩。随后进行蛋白含量测定,并将每个样品调到相同的加样量,加入6×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。上样前将样品92℃加热5min使蛋白变性。
5.2.2SDS-PAGE电泳
电泳采用10%分离胶,4%浓缩胶,样品加热后立即上样。电泳时,浓缩胶段电压110V,分离胶段电压150V。
5.2.3转膜
根据分子量的大小,选用nitrocellulose膜或PVDF膜。一般用80V转移1h,或60V转移2h,冰袋控热。转完后用1×丽春红染液染5min检测转膜效果。
5.2.4封闭与免疫反应
首先将膜用5%no fat milk 4℃摇床封闭过夜。第二天,PBST溶液洗3遍后,加适量稀释的一抗(鼠抗RSV-F)杂交,室温摇床90min。然后用PBST溶液摇床洗3遍,每次5~10分钟。二抗为抗鼠-HRP,室温摇床60min。随后也用PBST溶液摇床洗3遍,每次5~10分钟
5.2.5显影与曝光
按照ECL试剂盒说明书,将试液A和试液B按1:1混合放入膜中,在暗室中适当摇匀反应,然后在化学发光图像分析仪曝光检测。根据marker条带来确定目标蛋白大小的正确性。
图1是一个代表性结果,显示#009-better(即JY-B-009-better)转染细胞后,mRNA/LNP得以内吞入细胞,在溶酶体酸性环境下释放到细胞质,在内质网和高尔基体中完成蛋白翻译和修饰,并且在信号肽的引导下释放到胞外。编码的F抗原蛋白可以和F抗体结合,表明蛋白特异性,蛋白分子量也符合设计要求。
实施例6RSV F mRNA/LNP纳米颗粒免疫小鼠及病毒特异性抗体的表达鉴定
为检测疫苗在in vivo环境下抗原的表达和表现情况,我们采用小鼠作为动物模型来检测。所有通过细胞表达检测的设计质粒(见表1)都进入到了动物检测阶段。
6.1动物免疫
6.1.1动物
所使用的动物包括小鼠Balb/c,雌性,6周龄;棉鼠(cotton rat),雌性,6周龄。动物到达CRO生物安全二级动物房后,会在那里适应一周。
6.1.2免疫和取样
第一天,眼眶取免疫前血样;
第二天,根据实验要求肌肉注射5-20ug/mouse的各种mRNA/LNP(表一);一免后的第十四天或二十一天,第二次免疫,种类,剂量和免疫途径与第一次相同;
二免后的第七天,眼眶取血
每次取血后,样品在4℃放置2个小时,然后2500rpm,5min,4℃离心,取上清并分装。血清储存于-80℃低温冰箱。
在动物实验中,我们考察了如下几个方面:
1)一般抗原表达检测:这时mRNA/LNP的肌注给药量在10-20ug/mouse。
2)剂量效应抗原表达检测:这时mRNA/LNP的肌注给药量的梯度为5
ug/mouse,10ug/mouse,15ug/mouse,20ug/mouse。
3)多价效应抗原表达检测:这时mRNA/LNP的肌注给药量为混合疫苗的给药量是单独一种疫苗的给药量的一半。比如A是10ug/mouse,B是10ug/mouse,A+B是5+5ug/mouse
4)诱导的抗体持续时间检测:动物会在第二次免疫后的14天,一个月,三个月,六个月和十二个月取血。
6.2Elisa检测抗RSV抗体
疫苗的关键指标之一是在动物体内诱导出特异性的抗病毒抗体。我们用Elisa法来检测抗RSV-F抗体表达量。
6.2.1抗原的包被
将包被抗原(RSV-A2,F)用PBS稀释至62.5ng/mL,在96孔酶标板板中进行抗原的包被,每孔100ul,4℃,16h。
6.2.2洗板和封闭
取出已包被抗原的酶标板,用300μL/孔PBST洗板1次。随后加入100μL封闭液(5%milk),室温,30min。接着用300μL/孔PBST洗板3次。
6.2.3样品稀释及加样
将免疫小鼠的血清样品进行合适的递减4倍的梯度稀释后,取100ul加入到酶标板中,室温孵育1.5h后,用300μL/孔PBST洗板3次。
6.2.4加检测抗体
根据需要加样孔的数量,取相匹配的适量检测抗体(Goat Anti-Mouse IgG,Peroxidase-Conjugated,H+L),稀释至0.8ng/mL后,每孔加入60μL,室温孵育1h后,用300μL/孔PBST洗板5次。
6.2.5显色及终止
按照1:1的比例混匀显色液A(含有H202)以及显色液B(含有TMB),每孔加入100μL,室温放置15-30分钟后,每孔加入30μL 1M HCL终止液,然后用酶标仪于450nm读数。
6.2.6.标准曲线
若需要绝对定量,将购买的抗RSV-F抗体,根据抗体蛋白量配成合适的由地到高浓度范围,与样品同时做Elisa,结果以抗体蛋白量作为横坐标,OD450作为纵坐标做图。
检测操作及结果参见图2-图5。表1所列的所有质粒均表现出mRNA/LNP疫苗可以在动物体内诱导出高浓度的病毒特异性抗体。图2是一个代表性结果,展示了RSV-B设计的JY-B-008,JY-B-009-better,JY-B-012疫苗能够在小鼠体内诱导出抗病毒特异性抗体,其中以JY-B-009-better表现最好(图2B)。重要的是,这些疫苗都具有交叉结合的特性(图2A),也就是抗RSV B抗体能够结合RSV A抗原,是交叉保护的重要基础。
为了探索疫苗剂量,免疫次数,免疫效应时间,以及免疫干扰等情况,我们进行了进一步的实验。如图3A所示,给予Balb/c小鼠二剂或三剂间隔各14天的肌注mRNA/LNP疫苗,二剂免疫足以诱导强大的病毒特异性抗体,三剂免疫会继续提升效价,但提升有限。所产生的抗体具有较长的半衰期,三个月后依然可以检测到非常高的抗体。剂量效果也体现在图4,比较了免疫一剂,二剂和三剂的效果,对于完全没有接触过这种病毒的小鼠,一剂免疫是不足以诱导具有保护作用所需量的抗体的,二次免疫(或一次免疫,一次加强)是足够的。作为疫苗,剂量是一个关键考察因素,对此我们也做了比较(图3B)。对小鼠而言,每只5ug,10ug,15ug免疫二次,所诱导的抗体呈递增趋势,但递增的量有限;5ug/只已经非常有效,但仍会建议在后面的小鼠实验中采用10ug/只的剂量。考虑到疫苗行业发展的最新趋势,多价或多联疫苗也是我们重要的发展方向。在这里我们初步考察了当二种不同病毒型的疫苗同时给予的时候,免疫系统是如何响应的。如图3C显示,#007是RSV-A型疫苗,#009是RSV-B型疫苗,当二种疫苗以总量不变给药时,小鼠所产生的病毒特异性抗体量是和单独使用相一致的。又如图5显示,一组是#009better(RSV-B)+#006(RSV-A)疫苗,另一组是#009better(RSV-B)+#071(PIV3)疫苗,当二种不同的mRNA/LNP疫苗以总量不变给药时,小鼠所产生的病毒特异性抗体量是和单独使用时相一致的。
实施例7抗体的中和病毒检测
疫苗的黄金检测指标之一,是检测在动物体内诱导出的特异性抗病毒抗体是否具有中和病毒,阻止病毒感染的能力。中和病毒检测就是为这个目的设计划的。由于RSV属于生物安全二级病毒,下面所有步骤必须在生物安全二级实验室按照相应的要求和规范完成。
7.1准备细胞
HEp-2(ATCC,CCL-23)人喉部表皮样癌细胞,是最合适的RSV生长细胞。在中和实验的前一天,将细胞消化并重悬清洗后,接种于24孔板,2x10^5/孔,MEM 10%FBS完全培养基,37℃5% CO2培养过夜。
7.2抗体与病毒中和
7.2.1血清梯度稀释
本实验室常用的血清稀释梯度和稀释方法如下表2所示,就RSV而言,血清稀释用培养基为Opti-MEM,不加胎牛血清。
表2:血清稀释度和稀释方法
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7.2.2血清抗体和病毒中和
RSV病毒的用量以30-40PFU/孔(24孔板)为好,稀释培养基为Opti-MEM,不加胎牛血清。取120ul病毒稀释液加到稀释的血清孔里,轻轻混匀。需要设置病毒对照组(即未添加稀释血清的病毒液)。置37℃培养箱孵育1h。
7.2.3接种细胞
取上述病毒抗体混合液70ul分别加到细胞已长成单层的24孔细胞培养板中,每一种稀释度接种3孔细胞。同时设4孔正常细胞对照和设4孔病毒对照组。培养板置于37℃,5%CO2培养箱中孵育1h,每隔15min轻轻摇晃一次。孵育结束后弃掉孔中混合液,加入预先配好温热的培养基500ul/孔,培养基为MEM,3%FBS,0.75%methylcellulose。37℃,5% CO2培养4天。
7.3结果显色
7.3.1病毒和细胞固定
在培养的第四天,弃掉孔中培养液,再用PBS洗一遍,然后加入预冷的85%甲醇150ul/孔,4℃固定1小时。之后弃掉孔中溶液,再用PBS洗一遍。
7.3.2封闭和洗板
加入300μL封闭液(5%milk),室温,摇床轻轻晃动,30min。接着用500μL/孔PBST洗板3次。
7.3.3加检测抗体
根据需要加样孔的数量,取相匹配的检测抗体(Anti-RSV-F IgG,H+L,HRPConjugated),合适倍数稀释后,每孔加入150μL,室温孵育90min后,用500μL/孔PBST洗板3次。
7.3.4加二抗
取相匹配的二抗,1:1000至1:5000合适倍数稀释后,每孔加入150μL,室温孵育60min后,用500μL/孔PBST洗板5次。
7.3.5显色及终止
在每孔加入150μL的TrueBlueTMPeroxidase Substrate,轻轻摇晃,病毒阳性斑块会很快出现。随后用水洗去反应液。避光干燥。第二天即可计数病毒斑块。
表1所例的质粒都用中和反应检测过设计的疫苗的中合病毒效果。图6是一个代表性结果。当小鼠经过#006(RSV A)或#009-better,15ug/只免疫,在三免之后的14天取血,血清分别去中和RSV A2和RSV B18537。可以看出,就RSV A2而言(图6A),#006是完全匹配,EC50是30k,#009-better是交叉保护,EC50是3k;就RSV B 18537而言(图6B),#009-better是相对匹配(同亚型),EC50是10k,#006是交叉保护,EC50是6k。总的来说,#006和#009-better疫苗都达到了较高的EC50。
实施例8RSV F mRNA/LNP纳米颗粒对小鼠肺部感染RSV的影响
疫苗的终极检测指标,是检测疫苗在体内诱导出的特异免疫反应是否具有保护宿主减少病毒感染的效率。所有通过细胞表达和Elisa抗体检测的设计质粒(见表1)都进入到了动物保护检测阶段。
8.1动物模型和免疫
8.1.1动物模型
RSV的相对理想的动物模型是棉鼠,因为RSV病毒感染棉鼠后,可以在其肺部发生病毒的复制增殖,并且免疫反应也更接近人类。本专利陈述的图8-图9结果,正是采用棉鼠作为实验动物进行的。然而,棉鼠资源非常紧缺,所以在初筛阶段,我们使用了相对合适的小鼠作为模型动物。所有通过细胞表达和Elisa抗体检测的设计质粒(见表1)都进入到了小鼠检测阶段。
8.1.2免疫和取样
7周龄雌性棉鼠,在生物安全动物房进行如下表3的实验。每次操作,棉鼠都经异氟烷麻醉后进行。
表3:棉鼠的免疫操作
第一天,眼眶取免疫前血样;每次取血后,样品在4℃放置2个小时,然后2500rpm,5min,4℃离心,取上清并分装。血清储存于-80℃低温冰箱。第二天,根据实验要求肌肉注射5-20ug/rat的各种mRNA/LNP,n=5;
一免后的第二十一天,眼眶取一免后血样;
一免后的第二十二天,第二次免疫,种类,剂量和免疫途径与第一次相同;二免后的第七天,眼眶取血;
二免后的第八天,感染RSV-A2病毒,采用滴鼻方式以100μL的1×105PFU/只剂量感染呼吸合胞病毒(RSV A2);
感染后的第四天,试验终点动物吸入麻醉安乐死后,按照SOP解剖流程,取棉鼠完整肺脏并称重。
8.2肺脏病毒载量检测
8.2.1准备肺匀浆
准备冻存管,加入2mL 4℃预冷的病毒保护液;将新鲜的肺组织放于装有病毒保护液的冻存管内,同一天匀浆,避免冻融影响实验结果。使用高通量组织研磨器在保持低温状态下匀浆肺组织至无明显颗粒,吸取组织液至1.5mL EP管中,分管冻存-80℃。
8.2.2准备细胞板
病毒滴度测定的细胞是Hep-2喉上皮癌细胞。在病毒滴定的前一天,将细胞消化并重悬清洗后,接种于24孔板,2x10^5/孔,MEM 10%FBS完全培养基,37℃5% CO2培养过夜。
8.2.3病毒感染
将肺匀浆按照1:10,1:102,1:103,1:104,1:105,1:106。稀释培养基为Opti-MEM,不加胎牛血清。然后将前一天铺好的24孔板轻轻地用PBS洗一遍后,每孔加入100ul稀释的病毒液,每个浓度3复孔。同时设4孔正常细胞对照和设4孔病毒对照组。培养板置于37℃,5% CO2培养箱中孵育1h,每隔15min轻轻摇晃一次。孵育结束后弃掉孔中混合液,加入预先配好温热的培养基500ul/孔,培养基为MEM,3%FBS,0.75%methylcellulose。37℃,5%CO2培养4天。
8.2.4病毒和细胞固定
在培养的第四天,弃掉孔中培养液,再用PBS洗一遍,然后加入预冷的85%甲醇150ul/孔,4℃固定1小时。之后弃掉孔中溶液,再用PBS洗一遍。
8.2.5封闭和洗板
加入300μL封闭液(5%milk),室温,摇床轻轻晃动,30min。接着用500μL/孔PBST洗板3次。
8.2.6加检测抗体
根据需要加样孔的数量,取相匹配的检测抗体(Anti-RSV-F IgG,H+L,HRPConjugated),合适倍数稀释后,每孔加入150μL,室温孵育90min后,用500μL/孔PBST洗板3次。
8.2.7加二抗
取相匹配的二抗,1:1000至1:5000合适倍数稀释后,每孔加入150μL,室温孵育60min后,用500μL/孔PBST洗板5次。
8.2.8显色及终止
在每孔加入150μL的TrueBlueTMPeroxidase Substrate,轻轻摇晃,病毒阳性斑块会很快出现。随后用水洗去反应液。避光干燥。第二天即可计数病毒斑块。
肺脏病毒载量结果显示(图7),与对照组PBS相比,各疫苗免疫组肺脏病毒载量均显著地下降(p<0.01),整体病毒载量处于较低水平状态。
8.3肺脏病理评分
使用10%福尔马林固定肺脏组织,切片后,进行HE染色病理评分,针对肺脏细支气管、肺小动脉、肺泡、间质性肺部炎症和损伤进行评价,评分标准见下表4。
表4:肺泡炎症及损伤评分标准
评分 肺泡内炎细胞聚集/浸润评分标准
0 无炎细胞浸润和聚集
1 极轻微的,<10%的肺组织受累
2 轻微的,11-25%的肺组织受累
3 中等程度的,26-50%的肺组织受累
4 明显的,51-75%的肺组织受累
5 严重的,超过75%的肺组织受累
8.4数据分析数据在Office Excel 2013和GraphPad Prism6.0中进行整理,数据以x±M(标准误)表示。利用One-way ANOVA进行分析,分析方法选用Tukey进行组间比较差异显著性检验;两组间进行比较时,用T-test进行两组间双尾检测,当p<0.05时,两组之间具有显著性差异。
一般情况下,小鼠在感染呼吸道病毒后都会表现出体重降低的症状。图7A是接受疫苗和没有接受疫苗的小鼠在感染后的体重表现。可以看出,疫苗-病毒完全匹配的#006组体重下降较少,疫苗-病毒不匹配的JY-B-009-better组次之,二组都比对照组体重减少幅度小,体重恢复快,显示出疫苗的保护作用。究其背后的原因,见图7B,是因为疫苗所诱导的免疫反应,控制了病毒的数量,qPCR检测到的肺病毒载量,疫苗组要比对照组少近4个log,并且#006和#009 better组没有显著差别。体现出疫苗较好的保护作用。
为了进一步验证小鼠中所见的病毒保护作用在RSV最理想的模型动物棉鼠上的效果。我们接着进行了棉鼠实验。结果如图8和图9所示。8周龄雌性棉鼠,在接受二次间隔为14天的不同类型和剂量的mRNA/LNP疫苗后的第14天,以滴鼻方式感染RSV A2(1.0x10^5 PFU剂量),4天后取肺并检测病毒载量。JY-B-009-better(40 ug/只)组,JY-B-009-better(20ug/只)组,和JY-B-009-better+#006(20 ug/each)组均表现出良好的病毒控制能力(图8),病毒量比对照组降低了2个log。RSV与PIV3的双联疫苗,也有很好的病毒保护作用。同一个实验,我们也做了肺脏HE病理染色分析,结果显示PBS组肺脏存在大量的炎性细胞浸润,JY-B-009-better 40μg疫苗组肺脏炎性细胞浸润明显改善(图9A)。针对肺脏细支气管、肺小动脉、肺泡、肺泡间质的炎症病理变化进行评分,综合评分结果显示(图9B),与PBS对照组相比,JY-B-009-better 40μg疫苗组肺脏炎性浸润综合评分呈现显著降低趋势(p<0.05)。
实施例9模拟现实世界,对已经感染过RSV病毒的动物进行免疫加强RSV病毒呼吸道感染是一个非常常见的呼吸道感染疾病,除新生婴儿周岁以内首次感染外,几乎所有人都面临着环境带来的病毒的反复感染。对于具有完善免疫系统的大部分人来说,再次感染并不是一个非常严重的问题,但对于免疫系统尚在发育中的低龄儿童,免疫系统衰退的老年人,以及免疫系统有缺陷的患者来说,RSV感染常常是一个严重的威胁。本实验设计是想了解疫苗对于曾经RSV感染过的人是否有保护作用,以及保护作用的程度。
9.1动物免疫
9.1.1动物
所使用的动物包括小鼠Balb/c,雌性,6周龄。动物到达CRO生物安全二级动物房后,会在那里适应一周。
9.1.2免疫和取样
1)第一天,眼眶取免疫前血样。每次取血后,样品在4℃放置2个小时,然后2500rpm,5min,4℃离心,取上清并分装。血清储存于-80℃低温冰箱。2)第二天,根据实验要求(图10A,B),第一组肌肉注射10ug/mouse JY-B-009-better mRNA/LNP;第二组和第三组鼻腔感染105PFU/只RSV A2;3)一免后的第十四天,第一组小鼠进行第二次免疫,种类,剂量和免疫途径与第一次相同;
4)二免后的第十四天,所有动物眼眶取血,这就是第一次血;
5)又过十四天后,第三组小鼠(先前感染过)肌肉注射10ug/mouse JY-B-009-better mRNA/LNP作为加强针;
6)十四天后,所有动物眼眶取血,这就是第二次血
9.2Elisa检测抗RSV抗体
疫苗的关键指标之一是在动物体内诱导出特异性的抗病毒抗体。我们用Elisa法来检测抗RSV-F抗体表达量。
9.2.1抗原的包被
将包被抗原(RSV-A2,F)用PBS稀释至62.5ng/mL,在96孔酶标板板中进行抗原的包被,每孔100ul,4℃,16h。
9.2.2洗板和封闭
取出已包被抗原的酶标板,用300μL/孔PBST洗板1次。随后加入100μL封闭液(5%milk),室温,30min。接着用300μL/孔PBST洗板3次。
9.2.3样品稀释及加样
将小鼠的血清样品进行合适的递减4倍的梯度稀释后,取100ul加入到酶标板中,室温孵育1.5h后,用300μL/孔PBST洗板3次。
9.2.4加检测抗体
根据需要加样孔的数量,取相匹配的适量检测抗体(Goat Anti-Mouse IgG,Peroxidase-Conjugated,H+L),稀释至0.8ng/mL后,每孔加入60μL,室温孵育1h后,用300μL/孔PBST洗板5次。
9.2.5显色及终止
按照1:1的比例混匀显色液A(含有H202)以及显色液B(含有TMB),每孔加入100μL,室温放置15-30分钟后,每孔加入30μL 1M HCL终止液,然后用酶标仪于450nm读数。
9.2.6.标准曲线
若需要绝对定量,将购买的抗RSV-F抗体,根据抗体蛋白量配成合适的由地到高浓度范围,与样品同时做Elisa,结果以抗体蛋白量作为横坐标,OD450作为纵坐标做图。
结果见图10。小鼠给予二剂免疫所诱导的抗体量和经历一次病毒感染后的抗体量相当(图3C)。然而,病毒感染后再给予加强疫苗,则极大地提高了抗体含量(图10D),预示着具有非常好的病毒保护效果。也就是说,在人群中给予加强免疫,可以极大的控制RSV病毒感染。
本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法,但本发明并不局限于上述工艺步骤,即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (12)

1.一种重组人合胞病毒mRNA,其特征在于,所述mRNA的编码序列选自如SEQ ID NO:1-15所示的序列。
2.如权利要求1,其特征在于:所述mRNA的编码序列如SEQ ID NO:5所示。
3.表达载体,其特征在于,所述表达载体表达权利要求1-2任一所述的mRNA分子。
4.细胞,其特征在于,所述细胞包含权利要求3所述的表达载体。
5.重组蛋白,其特征在于,所述重组蛋白由权利要求1所述的mRNA翻译获得。
6.重组核苷酸,其特征在于,所述重组核苷酸编码权利要求5所述的重组蛋白。
7.质粒,其特征在于,所述质粒包含权利要求6所述的重组核苷酸。
8.mRNA/LNP复合物,其特征在于,包括权利要求1-2任一所述的mRNA分子和脂质纳米颗粒。
9.mRNA/LNP复合物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)将权利要求1-2任一所述的mRNA溶解在醋酸盐缓冲液中;
2)将可电离阳离子、DSPC、胆固醇、PEG-2000按比例配置成混合溶液;
3)将步骤2)中的溶液与步骤1)中的缓冲液混匀,并进行稀释提升pH值,获得mRNA/LNP复合物。
10.mRNA/LNP复合物,其特征在于,所述复合物按照权利要求9所述的方法制备得到。
11.疫苗组合物,其特征在于,所述疫苗组合物包括权利要求1-2任一所述的mRNA和/或权利要求3所述的表达载体和/或权利要求5所述的重组蛋白和/或权利要求6所述的重组核苷酸和/或权利要求7所述的质粒和/或权利要求8所述的mRNA/LNP复合物。
12.权利要求1-2任一所述的mRNA和/或权利要求3所述的表达载体和/或权利要求5所述的重组蛋白和/或权利要求6所述的重组核苷酸和/或权利要求7所述的质粒和/或权利要求8所述的mRNA/LNP复合物在制备人合胞病毒疫苗组合物中的应用。
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