CN111073861A

CN111073861A - 人呼吸道合胞病毒毒株、应用、抗体或杂交瘤细胞或抗血清

Info

Publication number: CN111073861A
Application number: CN201811223029.0A
Authority: CN
Inventors: 傅生芳; 马超; 王婉; 汪洲
Original assignee: Lanzhou Institute Of Biological Products Co ltd
Current assignee: Lanzhou Institute Of Biological Products Co ltd
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2020-04-28
Anticipated expiration: 2038-10-19
Also published as: CN111073861B

Abstract

本发明涉及一种呼吸道合胞病毒(HRSV)毒株、应用、抗体或杂交瘤细胞或抗血清。本发明所述的人呼吸道合胞病毒毒株为B亚型毒株，并且其保藏编号为CCTCC NO:V201821。本发明所提供的病毒株具有如下优点：在体外细胞中增殖水平高、遗传稳定性好，免疫动物后，免疫原性强，对A亚型标准株有较好的交叉反应性和中和活性；此毒株可进一步用于RSV减毒活疫苗和组分疫苗的开发，还可以用于抗RSV抗体的制备，并且可用作攻毒用病毒株，从而用于疫苗保护率的评价以及RSV病毒感染机制的研究和感染动物模型的建立。

Description

人呼吸道合胞病毒毒株、应用、抗体或杂交瘤细胞或抗血清

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及一种人呼吸道合胞病毒(HRSV)毒株、应用、抗体或杂交瘤细胞或抗血清。

背景技术

人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory syncytial virus，HRSV)是一种有包膜的单股负链RNA病毒，属于副粘病毒科，肺炎病毒属。HRSV共10个基因编码11种蛋白，包括非结构蛋白(NS1和NS2)、大聚合酶(L)、磷蛋白(P)、核衣壳蛋白(N)、基质蛋白(M1)、外膜糖蛋白(SH、G和F)、转录因子(M2-1)和附属蛋白(M2-2)。其中吸附蛋白(G)和融合蛋白(F)是可以诱导中和抗体的两个主要保护性抗原。G蛋白高度糖基化，在病毒吸附到宿主细胞的过程中起重要作用。当病毒穿入细胞后，F蛋白介导细胞膜的融合和合胞体的形成。

HRSV感染率极高，是在全球范围内引起0至2岁婴幼儿下呼吸道感染最常见的病原微生物之一。特别地，HRSV感染在1岁的婴儿中非常普遍，2岁的幼儿至少有过一次感染经历，其中50％的幼儿有过两次感染经历。据报道，在全球范围内婴幼儿急性下呼吸道感染中HRSV的相关感染率约占22％，仅次于肺炎链球菌和流感嗜血杆菌。

预防RSV感染最有效的途径就是接种RSV疫苗。自上世纪60年代福尔马林灭活疫苗在婴幼儿体内进行免疫失败后，包括亚单位疫苗、核酸疫苗、VLP疫苗、病毒载体疫苗和减毒活疫苗等等在内的多种疫苗相继被开发，甚至少数候选疫苗进入临床研究，但是至今为止全世界还没有可用上市且安全有效的RSV疫苗。减毒活疫苗鼻腔滴鼻免疫类似于自然感染，现被认为是适用于婴幼儿的最安全有效的疫苗，尤其对于0至2岁龄的婴幼儿而言减毒活疫苗尤为安全。目前，绝大部分疫苗的研究多以HRSV原型株A2和Long株为基础在开展，其中A2是1961年分离自澳大利亚墨尔本的毒株，Long株是1956年分离自美国马里兰的毒株，两个均属于RSV A亚型毒株。国内外每年均会在NCBI的Genebank中公布一些新流行RSV毒株的核苷酸序列，但是都仅限于基因序列的公布，却鲜少能获得遗传稳定性好且可以用于疫苗开发的病毒株，尤其是B亚型病毒株，在全球范围内几乎没有看到能用于疫苗制备的B亚型RSV。B亚型RSV原型株主要有两种：CH-18537和9320病毒株，其中CH-18537是1962年分离自美国华盛顿的病毒株，9320是1977年分离自美国马萨诸塞的病毒株。然而，目前也没有成功开发出基于B亚型RSV的疫苗。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种人呼吸道合胞病毒毒株、应用、抗体或杂交瘤细胞或抗血清。

具体而言，本发明提供：

(1).一种人呼吸道合胞病毒毒株，其中所述毒株为B亚型毒株，并且其保藏编号为CCTCC NO:V201821。

(2).根据(1)所述的人呼吸道合胞病毒毒株，其中所述毒株的全基因序列为SEQID No.:1所示的序列。

(3).根据(1)或(2)所述的人呼吸道合胞病毒毒株用于制备人呼吸道合胞病毒减毒株的应用。

(4).根据(1)或(2)所述的人呼吸道合胞病毒毒株在制备用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。

(5).根据(4)所述的应用，其中所述药物为疫苗。

(6).根据(5)所述的应用，其中所述药物为减毒活疫苗或蛋白组分疫苗。

(7).一种抗体或杂交瘤细胞或抗血清，其中所述抗体或杂交瘤细胞或抗血清是以根据(1)或(2)所述的人呼吸道合胞病毒毒株作为免疫原对动物进行免疫而制备得到的。

(8).根据(7)所述的抗体或杂交瘤细胞或抗血清，其中所述动物为小鼠或兔。

(9).根据(1)或(2)所述的人呼吸道合胞病毒毒株在建立呼吸道合胞病毒感染的动物模型中的应用。

(10).根据(9)所述的应用，其中所述人呼吸道合胞病毒毒株用作攻击毒株。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1.本发明从近些年RSV流行感染的800多份临床样本中成功分离得到一株经克隆纯化能够稳定传代并且病毒增殖能力很强的HRSV野生型毒株(命名为RSV B/LZ11/12)，该毒株经基因鉴定、蛋白质鉴定及形态学鉴定确定为RSV，经基因序列测定确定为B亚型RSV。该毒株在体外细胞中增殖水平高、遗传稳定性好，免疫动物后，免疫原性强，对A亚型标准株有较好的交叉反应性和中和活性。

2.本发明分离得到的RSV B/LZ11/12病毒株由于能诱发好的免疫原性且遗传稳定性好，因此可以以此毒株为母株进行减毒株的选育，筛选安全且免疫活性有效的减毒株，可进一步用于RSV减毒活疫苗的开发。

3.本发明分离得到的RSV B/LZ11/12病毒株可以在实验动物体内诱导强的针对A亚型和B亚型的中和抗体反应，因此可以将该毒株的主要保护性抗原F和G蛋白作为组分，从而用于开发组分疫苗。

4.本发明所提供的RSV B/LZ11/12病毒株毒力强，可用作攻毒用病毒株，从而用于疫苗保护率的评价以及RSV病毒感染机制的研究等。

5.本发明所述的病毒株还可以用于人呼吸道合胞病毒感染动物模型的建立，能够提供稳定的动物模型，为人呼吸道合胞病毒疫苗研制和抗病毒药物的筛选以及RSV病毒感染机制的研究提供了基础。

生物材料保藏信息

本发明提供的人呼吸道合胞病毒RSV B/LZ11/12(Human ResipiratorySyncytial Virus B/LZ11/12)毒株已于2018年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC NO:V201821。

附图说明

图1示出了RSV B/LZ11/12株在MRC-5细胞中的致细胞病变效应(CPE)，其中左侧图为对照组，右侧图为RSV B/LZ11/12株感染后的细胞；

图2示出了MRC-5细胞的RT-PCR检测结果，其中，泳道1：MRC-5细胞对照；泳道2：MRC-5中培养的RSV B/LZ11/12株；泳道M：100bp分子量标记；

图3示出了RSV B/LZ11/12株在MRC-5细胞中的免疫荧光检测结果，其中左侧图为对照组，右侧图为RSV B/LZ11/12株感染后的细胞；

图4示出了RSV B/LZ11/12株全长核苷酸序列同源性比对结果；

图5示出了RSV全基因序列系统发生树；

图6示出了G基因序列系统发生树；

图7示出了G基因序列比对结果；

图8A至图8F示出了主要糖蛋白基因及氨基酸序列比对结果；图8A：G基因核苷酸序列同源性比对；图8B：G蛋白序列同源性比对；图8C：F基因核苷酸序列同源性比对；图8D：F蛋白序列同源性比对；图8E：SH基因核苷酸序列同源性比对；图8F：SH蛋白序列同源性比对；

图9A至图9F示出了RSV病毒电镜观察结果，其中图9A-D示出B/LZ11/12株电镜形态观察结果；图9E-F示出Long株电镜观察结果；

图10A至图10D示出了RSV蛋白western Blot分析结果，其中图10A示出F蛋白单克隆抗体(AB96968)反应，其中泳道1，RSV(MRC-5)(接种RSV的MRC-5细胞培养液经超速离心后沉淀的复溶液)；泳道2，MRC-5(未接种RSV的MRC-5细胞培养液经超速离心后沉淀的复溶液)；图10B示出N蛋白单克隆抗体(AB94806)反应，其中泳道1，RSV(MRC-5)；泳道2，MRC-5；图10C示出M2-1蛋白单克隆抗体(AB94805)反应，其中泳道1，MRC-5；泳道2，RSV(MRC-5)；图10D示出F蛋白单克隆抗体(AB43812)反应，其中泳道1，MRC-5；泳道2，RSV(MRC-5)；

图11示出了B/LZ11/12病毒株的F蛋白糖基化修饰分析结果；

图12示出了B/LZ11/12病毒株的M2-1蛋白磷酸化化修饰分析结果；

图13示出了B/LZ11/12病毒株在Vero细胞中形成的空斑，图13A-I依次分别为病毒原液10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9和10^-10稀释度接种Vero细胞后噬斑形成情况，图13K为没有接种病毒的Vero细胞对照；

图14示出了B/LZ11/12病毒株在MRC-5和Vero细胞中的增殖曲线；

图15示出了在不同感染时间，B/LZ11/12病毒株基因片段的RT-PCR检测结果，其中泳道1-10分别为在MRC-5细胞中感染后第1、2、3、4、5、6、7、8、9和10天的结果；泳道12-21分别为在Vero细胞中感染后第1、2、3、4、5、6、7、8、9和10天的结果；

图16A至图16D示出了Vero细胞中B/LZ11/12不同传代次数后主要糖蛋白的核苷酸及氨基酸序列比对结果，其中图16A为G基因核苷酸比对结果，16B为G基因氨基酸比对结果，16C为F基因核苷酸比对结果，16D为F基因氨基酸比对结果，图中1表示第0代，2表示第10代，3表示第20代；

图17示出了用RSV B/LZ11/12感染小鼠后，小鼠的肺脏病理变化；图17A至图17E为病毒感染组小鼠，图17F为Vero细胞感染对照组小鼠；其中图17A中观察到弥漫性肺泡腔内红细胞渗出；图17B中观察到局灶肺泡间隔坏死脱落；图17C中观察到局灶支气管黏膜上皮坏死脱落；图17D中观察到局灶肺泡腔内有渗出物，间质有中性粒细胞、淋巴细胞浸润；图17E中观察到肺泡膈毛细血管扩张，局灶肺泡腔内有巨噬细胞和渗出物；图17F中观察到肺泡膈毛细血管扩张。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

在本发明中，所述的“攻击毒株”、“攻毒用毒株”或“攻毒株”是指能引起动物发病的病毒株。本发明的人呼吸道合胞病毒病毒株既可用作攻毒株，也可经减毒或经培养后提取纯化保护性抗原后用于制备人呼吸道合胞病毒疫苗。

本发明的发明人在历经多年进行大量地选育与传代工作后，从800多份临床样本中出人意料地筛选出了一种野生型RSV强毒株，经详细严谨的基因和蛋白分析鉴定确定为B亚型RSV。该毒株在体外细胞中增殖水平高、遗传稳定性好、免疫原性高，能刺激机体产生高效价的特异性血清反应抗体和病毒中和抗体，可以用于相关减毒活疫苗和蛋白组分疫苗的开发。此外，该毒株诱导产生的抗体可以同时与B亚型和A亚型RSV发生强的交叉反应，并且对本型病毒和A亚型病毒具有强的中和活性，因此可以用于开发可同时针对两个亚型RSV的减毒活疫苗和蛋白组分疫苗。本发明人在上述发现的基础上，进一步得到了本发明的技术方案。

本发明的第一方面提供了一种人呼吸道合胞病毒毒株，其中所述毒株为B亚型毒株，本发明将该病毒株命名为人呼吸道合胞病毒RSV B/LZ11/12(Human ResipiratorySyncytial Virus B/LZ11/12)(下文中也称为“RSV B/LZ11/12”或“B/LZ11/12”)。该毒株已于2018年5月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC NO:V201821。

所述病毒株的全基因序列如SEQ ID No.:1所示。现已鉴定出的RSV的两种主要亚型为A亚型和B亚型，其中主要根据G基因来区份A和B亚型，两种型之间G蛋白氨基酸同源性只有53％，因此可以通过G基因或全基因序列分析区分两个亚型；另外，针对各型特异性位点的G蛋白单克隆抗体也可以作为两个亚型的分类。在本发明中，所述呼吸道合胞病毒的新病毒株为B亚型毒株。分离培养采用了HRSV感染最适宜的呼吸道黏膜上皮细胞——人胚肺成纤维上皮细胞MRC-5作为细胞基质。

本发明分离得到的RSV B/LZ11/12病毒株由于能诱发好的免疫原性且遗传稳定性好，因此可以合理预期，此毒株能够作为母株进行减毒株的选育，并且可以用于后续的减毒培育以及将来的规模化生产，从而进一步用于减毒活疫苗的开发。另外，本发明还发现，所述病毒株可以在实验动物体内诱导强的针对A亚型和B亚型的中和抗体反应，因此可以将该毒株的保护性抗原F和G蛋白作为组分，从而用于开发组分疫苗。

因此，本发明的第二方面提供了所述的人呼吸道合胞病毒毒株用于制备人呼吸道合胞病毒减毒株的应用。

本发明的第三方面株提供了所述的人呼吸道合胞病毒毒株在制备用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。优选的是，所述的药物为疫苗。进一步优选地，所述疫苗可以是减毒活疫苗或蛋白组分疫苗。

如上文所述，本发明还发现，所述毒株诱导产生的抗体可以同时与B亚型和A亚型RSV发生强的交叉反应，并且对两个亚型的病毒都具有强的中和活性，因此可以用于开发可同时针对两个亚型RSV的减毒活疫苗和蛋白组分疫苗。

本发明的第四方面提供了一种抗体或杂交瘤细胞或抗血清，其中所述抗体或杂交瘤细胞或抗血清是以根据本发明所述的人呼吸道合胞病毒毒株作为免疫原对动物进行免疫而制备得到的。

所述动物可以为本领域常用的实验动物，例如：小鼠、大鼠、豚鼠、兔等。所述的动物优选为兔或小鼠。

所述通过免疫动物来制备抗体或杂交瘤细胞或抗血清的方法是本领域已知的。

本发明还发现，所述的RSV B/LZ11/12病毒株毒力强，可用作攻毒用病毒株，从而用于后续开发疫苗的保护率的评价以及RSV病毒感染机制的研究等。所述攻毒用病毒株进而可以用于人呼吸道合胞病毒感染动物模型的建立，能够提供稳定的动物模型，从而为人呼吸道合胞病毒疫苗研制和抗病毒药物的筛选以及RSV病毒感染机制的研究提供基础。

因此，本发明的第五方面提供了本发明所述的人呼吸道合胞病毒毒株在建立呼吸道合胞病毒感染的动物模型中的应用。

优选的是，在所述的应用中，所述的病毒株用作攻击毒株。

用本发明的人呼吸道合胞病毒建立呼吸道合胞病毒感染的动物模型的方法可以采用本领域已知的常规方法进行，例如可以包括以下步骤：

1)将所述的人呼吸道合胞病毒病毒株进行培养，从而得到病毒培养液；以及

2)将步骤1)所得的病毒培养液施用于动物，从而制备得到所述的动物模型。

所述的动物可以采用本领域常用的动物，例如：小鼠、大鼠、豚鼠、兔等。所述的动物优选为小鼠。

优选的是，所述的病毒培养液中病毒的含量为10⁵～10⁷PFU/mL，更优选10⁶PFU/mL。

优选的是，在步骤2)中，所述的病毒培养液是经鼻腔施用到动物体内的。更优选的是，所述经鼻腔施用为鼻腔滴鼻感染，所述的病毒培养液的施用量优选为每只小鼠20～40μl，更优选30μl。

以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。

实施例

以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用本领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。

材料：

1.病毒株、菌株和细胞株

在以下实施例中，RSV A2株、RSV Long株、MRC-5细胞和Vero细胞购自ATCC，由兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室复苏、传代并保存。大肠杆菌TOP10菌株(Escherichia coli TOP10)购自Novagen公司。

2.主要试剂

MEM、DMEM和胎牛血清均购自GIBCO公司，PrimeScriptTMOne Step RT-PCR试剂盒、100bp分子量标记、蛋白分子量标记购自TaKaRa公司；

Mini试剂盒和

quick胶提取试剂盒购自QIGEN公司；SuperScript^TMⅢOne-Step RT-PCR

Taq DNA高保真聚合酶购自Invitrogen公司；山羊抗RSV多克隆抗体(AB20745)、鼠抗人RSV F蛋白单克隆抗体(AB43812)、F蛋白单克隆抗体(AB94968)、N蛋白单克隆抗体(AB94806)和M2-1蛋白单克隆抗体(AB94805)均购自Abcom公司，抗鼠IgG和FITC标记的抗山羊IgG购自Sigma公司。

3.引物的设计与合成

根据Genebank中登录的B05株(登陆号为KF640637)和Long株(登陆号为AY911262)序列，采用DNAstar软件序列比对选择A、B亚型均相对保守的区域，并用Primer 5.0软件设计引物，用于RSV的RT-PCR鉴定(鉴定使用引物RSVD_F和RSVD_R)。设计扩增RSV B/LZ11/12毒株全基因组的特异性引物，10对特异性引物共扩增10个片段，覆盖了RSV的整个基因组。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物信息见表1。

表1RSV检测和基因扩增引物

注：RSVD_F和RSVD_R为RT-PCR鉴定引物对，其他均为全基因组扩增引物对。

实施例1：RSV B/LZ11/12病毒株的筛选、分离及纯化

在2006～2012年期间的冬春季(RSV流行季节)，从甘肃省兰州大学第一附属医院儿科门诊和住院部陆续收集支气管炎和肺炎患儿的下呼吸道分泌物共823份，收集的所有样本在MRC-5或Vero细胞细胞中进行了连续3代盲传，CPE结合RT-PCR检测为阳性的样品再进行连续7代的传代培养，第10代培养物经过CPE、RT-PCR和免疫荧光检测及基因片段测序验证均为阳性的样品再进行连续3次噬斑克隆纯化和鉴定，并经过一系列细胞和动物试验，最终筛选获得了1株增值水平高、遗传稳定性好、毒力强、免疫原性强的B亚型野生型病毒，即，本发明的RSV B/LZ11/12。下面对RSV B/LZ11/12的分离、纯化和鉴定过程进行详细描述。

所收集的各样本用DMEM培养液(不含牛血清)反复吹散后用0.2μm滤器除菌过滤，吸取0.5ml过滤液接种至细胞汇合度约为80％的人胚肺成纤维细胞MRC-5中，吸附1小时，期间每隔10-15分钟轻轻晃动。之后弃吸附液并补加3ml的MEM维持液(不含牛血清)，置5％CO₂、37℃培养箱进行培养，每日显微镜下观察致细胞病变效应(CPE)，培养6天后收获培养物，并在该细胞系中用同样的方法连续传代3次。第三代盲传培养物先通过CPE和RT-PCR检测进行初筛，疑似阳性的样品进一步分别进行7代连续培养及间接免疫荧光检测和基因片段测序确认，确定为阳性的样品再进行连续3次噬斑克隆化筛选。没有接种样本的MRC-5细胞进行同样的操作以作为对照。

结果：感染后约三天可以观察到RSV B/LZ11/12引起典型的细胞融合病变，随着感染时间的延长细胞融合面积变得更大，融合巨细胞中能观察到嗜酸性颗粒，感染后期，局部细胞开始拉网并脱落。相比而言，没有接种样本的对照细胞密度更高，没有任何致细胞病变效应。如图1所示。

RT-PCR检测

按RNA提取试剂盒(即，

Mini试剂盒)的说明提取上述盲传三代的痰标本培养物总RNA，并以此为模板，以RSVD_F和RSVD_R为引物对用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR试剂盒扩增检测目的片段，反应程序如下：42℃反转录30分钟；94℃预变性5分钟；94℃变性10秒，60℃退火和延伸30秒，进行35个循环后72℃终延伸5分钟。取5μl PCR产物在2％的琼脂糖中进行电泳分析。没有接种样本的MRC-5细胞培养物进行同样的操作以作为对照。

结果：可以观察到685bp的预期目标条带。如图2所示。胶回收后进行测序，结果证实与Gene bank中登录的B亚型RSV同源性最高，初步确定为B亚型RSV。

间接免疫荧光检测

在细胞汇合度约为80％的MRC-5细胞中接种第10代培养物，于37℃吸附1小时后弃吸附液，补加MEM维持液(不含牛血清)于37℃、5％CO₂培养箱进行培养，感染后96小时后弃掉培养上清用冷甲醇固定细胞，之后用PBS(8mM Na₂HPO₄、136mM NaCl、2mM KH₂PO₄、2.6mMKCl，pH7.2-7.4)冲洗，以山羊抗RSV多克隆抗体AB20745(以1:500稀释)作为第一反应抗体，FITC标记的抗山羊IgG(以1:1000稀释)作为第二反应抗体进行间接免疫荧光反应，最后用荧光显微镜进行观察并判定结果。没有接种样本的MRC-5细胞培养物进行同样的操作以作为对照。

结果：在感染后96小时，视野中约50％的细胞都可以观察到特异性的绿色荧光反应，且可以清晰观察到RSV感染主要定位在胞浆，不在胞核；对照细胞中观察不到特异性的绿色荧光反应，如图3所示。

RSV毒株的噬斑克隆纯化

经CPE、RT-PCR和间接免疫荧光检测为RSV阳性的第3代盲传培养物继续在该细胞基质中连续传代7次，对第10代培养夜进行连续3次噬斑克隆纯化。方法如下：10倍系列稀释样品(即第6代培养夜)至10^-10，0.5ml/孔，将10^-1-10^-10的不同稀释度样品分别接种于约长成单层的MRC-5细胞(汇合度约为80％)的6孔板中，同时设置细胞对照(即不接种第6代培养夜的MRC-5细胞)，每个样2个重复，置于37℃、5％CO₂培养箱吸附1小时，期间每隔10-15分钟轻轻晃动6孔板。吸附完毕后弃吸附液并补加DMEM下胶维持液(含0.6％的琼脂糖)，2ml/孔，置于37℃、5％CO₂培养箱进行培养，每日观察细胞病变，直至能够观察到典型的CPE时补加DMEM上胶维持液(含0.8％的琼脂糖、0.15mg/ml中性红)，1ml/孔，37℃、5％CO₂培养箱染色3-6小时至出现空斑。从有空斑形成的最高稀释度孔内用毛细滴管逐个挑取空斑，并逐一接种至铺满单层MRC-5细胞(汇合度约为80％)的24孔板培养板中，置于37℃、5％CO₂培养箱进行吸附1小时，期间每隔10-15分钟轻轻晃动24孔板，最终弃吸附液并补充DMEM维持液(不含胎牛血清)1ml/孔，最后在37℃、5％CO₂培养箱进行培养，每日观察细胞病变，CPE和RT-PCR结果均为强阳的样品按照同样的方法继续进行2次连续的噬斑克隆纯化，最终筛选检测结果均为最强的阳性样品作为分离纯化的RSV毒株进行分装冻存，并命名该毒株为RSV B/LZ11/12。该病毒株已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:V201821。

实施例2：RSV B/LZ11/12毒株的鉴定

毒株全基因组克隆及序列分析

参照RNA提取试剂盒

Mini试剂盒操作说明书，提取B/LZ11/12病毒原液的总RNA。以总RNA为模板，用SuperScript^TMⅢOne-Step RT-PCR

Taq DNA高保真聚合酶分别扩增10个目的片段，反应程序如下：50℃反转录50分钟，94℃变性5分钟，94℃1分钟，50℃1分钟，68℃2分钟，进行35个循环后68℃延伸10分钟。10个扩增片段各自按照凝胶回收试剂盒Agarose Gel DNA Qiagen操作说明进行回收，分别连接至pGEM-T easy载体并转化至大肠杆菌TOP10，质粒经EcoRI酶切鉴定筛选后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。使用DNAStar7.0软件包中的Seqman对测序完成的各个片段进行拼接，经NCBI BLASTN序列比对后再使用DNAStar7.0软件中的MegAlign分析核苷酸序列同源性，最后用MEGA7.0软件对该毒株与Gene bank中登录的其他RSV基因亚型毒株的全基因组和G基因进行多序列联配，用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发生树，用Bootstrap重复抽样1000次对进化树进行验证。

核苷酸序列及其同源性分析

10个片段测序结果用DNA Star7.0生物软件通过比对、剪切和拼接后得到了B/LZ11/12毒株的全基因组序列，全长为15275nt，B/LZ11/12含有RSV的所有结构特征(表2)，基因组结构从5’端到3’端依次为5’UTR-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-3’UTR，基因组两端分别含有一段转录非翻译区(UTR)。经NCBI BLASTN序列比对后，与B亚型RSV的同源性最高，均在96.4％以上。利用DNAStar软件中的MegAlign比对全长序列(图4)，结果显示与B亚型RSV原型株9320的核苷酸同源性相对较低(96.4％)，而与其他B亚型毒株的核苷酸同源性均在99％以上，其中与中国2013年广州流行株(B/GZ/13-730株)、2012年美国(RSVB/HomoSpiens/USA/TH/10264/2012株)以及英国流行株(RSVB/England313/2012株)的同源性为最高(99.7％)，而与A亚型RSV原型株Long株的同源性仅为81％，说明兰州RSV分离株LZ11/12属于B亚型毒株。

表2 B/LZ11/12株全基因组结构组成

在NCBI BLASTN比对后，选取其中一些世界不同地区不同年份的B亚型RSV流行株以及原型株9320的全长核苷酸序列，用MEGA7.0软件中MUSCLE序列联配后再用邻接法构建系统进化树(图5)，结果显示B/LZ11/12与2013年中国广州流行株B/GZ/13-730、2016年英国流行株B/England138/2016和2016年美国流行株SC2225同属于一个分支，bootstrap值为100％，表明亲缘关系最近；相比而言，与2009年之前世界其他地方的流行株亲缘关系相对较远，其中与原型株9320的亲缘关系最远。总体来说，RSV B亚型流行毒株随着流行时间的延迟，毒株也在逐渐进化成为更多的分支，表明RSV B亚型的流行与时间密切相关，而与流行地域的相关性不大。

基因型分析

为了明确B/LZ11/12的G基因型，对B亚型现有的每种基因型，包括URU(URU1-URU2)、GB(GB1-GB4)、SAB(SAB1-SAB3)和BA(BA1-BA10)型的不同毒株与该B/LZ11/12毒株的G基因用MUSCLE序列联配后再用邻接法构建了系统发生树。结果表明B/LZ11/12与BA9基因型的3个代表株同属一个分支，bootstrap值为79％(图6)，确定B/LZ11/12的基因型为BA9型。序列联配结果表明该毒株G基因在792nt之后有60nt的插入(图7)，属于典型的BA型G基因。

主要糖蛋白基因比对分析

用MegAlign对G基因进行比对(图8A和B)，结果表明与原型株9320的核苷酸序列同源性为92.7％，而氨基酸序列同源性仅为87.6％，表明部分核苷酸变异是错义突变。与9320株相比，B/LZ11/12有30个位点彻底发生了氨基酸的置换，其中159和160位的Pro和Lys均缺失，而在255-274之间插入了20个氨基酸。B/LZ11/12与其亲缘关系最近的几个毒株的核苷酸序列同源性在98.5％-99.6％之间，氨基酸序列同源性在97.7％-99.4％之间，表明个别碱基突变属于错义突变，与其他流行毒株相比，本毒株G基因特有的变化是有一个Glu87Gly的氨基酸置换。

F基因比对结果(图8C和D)表明它与原型株9320的核苷酸序列同源性为96.6％，氨基酸同源性为98.8％，与其他毒株(都是B亚型毒株)之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均很高，均在99.3％以上。与原型株相比，B/LZ11/12有4处发生了氨基酸的置换，即Phe45Leu、Thr97Met、Leu172Gln和Ser197Asn；而与其他流行毒株相比，B/LZ11/12毒株243位有一处氨基酸置换，即Val置换为Ala。

SH基因比对结果(图8E和F)表明它与原型株9320的核苷酸和氨基酸序列同源性均为97％，本毒株在2处发生了氨基酸的置换，即Thr49Ile和Leu57Gln。与其他毒株(都是B亚型毒株)之间的核苷酸序列同源性在99.5％以上，氨基酸序列同源性在98.5％以上。

病毒电镜观察

500-1,000ml RSV B/LZ11/12病毒培养液和Long病毒培养液8,000rpm，4℃离心30分钟，分别取上清于35,000rpm 4℃超速离心4小时，弃上清并用PBS重悬沉淀，分装后冻存于-80℃冰箱用于电镜观察和蛋白分析。纯化后的病毒重悬液(即所得PBS重悬液)12,000rpm/分钟，4℃离心15分钟，分别将20μL上清和PBS重悬沉淀覆盖在铜网上，3分钟后吸去铜网上残留的液体并用20μL磷钨酸染色液染色3分钟，最后用滤纸吸去铜网上的染色液，干燥后进行电镜观察。

结果：在20,000倍放大后，B/LZ11/12株观察到了典型的病毒颗粒，大部分病毒颗粒呈球形，直径约60-100nm之间，以小球形病毒为主，并可见长约300-500nm的丝状或杆状病毒(图9A、9B、9C和9D)。据文献报道，丝杆状的病毒更具有感染性。Long株病毒几乎没有观察到丝状或杆状型的病毒，均为球形，直径约在80-150nm之间(图9E和9F)。

病毒蛋白Western Blot分析

接种B/LZ11/12的MRC-5细胞培养液和未接种B/LZ11/12的MRC-5细胞培养液超速离心纯化样品进行Western Blot分析。样品进行SDS-PAGE并电转移至硝酸纤维素膜，用脱脂奶粉封闭后，分别以鼠抗RSV F蛋白单克隆抗体(AB94968和AB43812)、N蛋白单克隆抗体(AB94806)和M2-1蛋白单克隆抗体(AB94805)作为第一抗体(均以1:2000稀释)，以HRP标记的抗鼠IgG做为第二抗体反应(以1:2000稀释)，最终通过化学发光显色。

结果：4种单克隆抗体反应后都得到了预期目标片段(图10A-D)。

RSV F蛋白的单克隆抗体AB96968检测到了一条约80kDa的特异性反应蛋白，分子量比预期的F0(70kDa)大(图10A)，另一种F蛋白单克隆抗体AB43812检测到了F1和F2蛋白，但是F1蛋白比预期大小(43kDa)略大(图10D)；两种抗体都检测到了特异目的条带，分子量大小的改变可能提示，在MRC-5细胞中RSV的F蛋白主要是以糖基化形式存在的。

N蛋白的单克隆抗体AB94806反应后检测到了一条特异性的大小为43kDa的特异性预期目的条带(图10B)。

RSV M2-1蛋白的单克隆抗体AB94805反应后检测到了3条带，其中22kDa是理论预期大小，此外，还检测到了分子略大的另外2条磷酸化修饰的M2-1蛋白(图10C)。

对于F蛋白偏大和M2-1蛋白多带的情况，为了从理论上找到依据，发明人在网站http://www.cbs.dtu.dk/services上对B/LZ11/12株的F蛋白和M2-1蛋白进行了糖基化修饰(图11)和磷酸化修饰分析(图12)，结果表明F蛋白有5个确定的N糖基化修饰位点，即27-30位(NTTE)、70-73位(NGTD)、116-119位(NYTI)、120-123位(NTTK)和126-129位(NVSI)(图11中标记了有修饰趋势的(阈值高于0.5的)所有位点，在此基础上最终以Asn-Xaa-Ser/Thr氨基酸序列为准预测N糖基化位点)。经预测，M2-1有多个磷酸化修饰位点，蛋白在细胞内容易进行磷酸化修饰。

实施例3：病毒的生物学特性

毒株增殖水平的测定

将RSV B/LZ11/12毒株的病毒培养液(实施例1制备的纯化的RSV毒株原液)进行10倍系列稀释至10^-12，将10^-2至10^-12不同稀释度的样品(各0.5ml)分别接种在6孔板中汇合度约为80％的Vero细胞中，同时设阴性对照(不接种毒株的Vero细胞)，每个稀释度3重复，置于37℃、5％CO₂培养箱吸附1小时，期间每隔10-15分钟轻轻晃动6孔板，吸附完毕后弃吸附液，补加含0.4％-0.6％琼脂糖的MEM维持液，3ml/孔，置于37℃、5％CO₂培养箱进行培养，每日观察细胞病变。感染后5-7天，每孔加入含1％甲醛的NaCl(0.5M)溶液覆盖凝胶，室温固定2小时后弃凝胶及固定液，并用终浓度为0.15mg/ml的中性红水溶液室温染色2小时，弃染色液并对空斑进行计数，

结果：RSV B/LZ11/12可以在Vero细胞中形成清晰可见的空斑(图13)，经计算病毒滴度为3.3×10⁸PFU/ml，表明该毒株病毒滴度较高，可在体外传代细胞系中有效感染，尤其是在适于人用疫苗规模化生产和制备的Vero传代细胞系中可以有效增殖。

病毒最佳感染MOI值的确定

按1×10⁶个细胞/ml将Vero细胞(18ml/6孔板，3ml/孔)铺设至6孔板，48小时后接种不同MOI值的RSV B/LZ11/12、A2和Long株(同样用噬斑法确定A2和Long株的PFU分别为1.7×10⁸和1.5×10⁷)，按照公式

计算出不同MOI值的不同毒株的病毒接种量，每个MOI值进行三重复，每块板设阴性对照(即不接种毒株)，每日观察细胞病变待细胞病变，各样品用CPE和RT-PCR(以RSVD_F和RSVD_R为引物)两种方法综合判定结果。同时按实施例1中所述的方法分别对三个毒株的不同MOI接种样品进行间接免疫荧光(IFA)检测。最终以病毒接种量最低，且病毒培养液检测结果为阳性的MOI为最佳值。

结果：三个毒株分别从MOI值1开始摸索，B/LZ11/12从1开始至10^-5共5个值，经过3种方法一致的判定结果确定其最佳MOI值为10^-5；相比而言，A2和Long株的最佳MOI值更高，分别为10^-3和10^-2(表3)。相比2个标准株，RSV B/LZ11/12毒株能以低100倍的病毒量感染并复制子代病毒，从病毒规模化培养的角度来说可以极大地节约成本。

表3

注：对于CPE：“++++”表示≧90％的细胞有CPE，“+++”表示≧75％的细胞有CPE，“++”表示≧50％的细胞有CPE“+”表示≧25％的细胞有CPE，“—”表示阴性，即没有CPE。对于RT-PCR和IFA：“+”表示阳性，“—”表示阴性，“/”表示未进行实验

病毒的一步增殖曲线

将MOI为10^-3的B/LZ11/12同时接种至MRC-5和Vero细胞中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养，每隔24小时取样并用如上所述的噬斑法测定各样品的滴度，并绘制病毒的一步增殖曲线，同时各样品进行如上所述的RT-PCR验证。

结果：相同MOI新病毒感染细胞后不同感染时间，经病毒滴度测定和RT-PCR检测，其一步增殖曲线在两种细胞系中基本相似(图14和图15)。感染后1-2天细胞形态正常，RT-PCR检测不到病毒的基因片段，属于病毒的潜伏期。从第3天开始细胞CPE日益明显，病变范围逐步扩大，至第7天几乎所有细胞病变，在此期间病毒滴度成指数增长，RT-PCR检测到的基因片段浓度也逐步递增，是病毒的裂解期。8-10天细胞脱落逐步增多，病毒滴度和扩增到的基因片段浓度都基本维持在同一水平，属于病毒的平稳期。

实施例4：新病毒的应用

免疫原性分析

青紫兰兔和小鼠免疫

按照实施例2病毒电镜观察实验中所述的方法超速离心纯化的RSV B/LZ11/12(即病毒电镜观察实验中超速离心所得的纯化病毒)分别免疫3只2月龄青紫兰兔和6只6周龄雌性BALB/C小鼠，按照1mg/只(兔)和50μg/只(鼠)的剂量四肢皮下免疫，共免疫3次，每隔21天免疫一次，第一次免疫加等体积的弗氏完全佐剂，第二次加等体积的弗式不完全佐剂，第三次不加佐剂2mg/只(兔)和100μg/只(鼠)加强免疫；同时设对照组，青紫兰兔1只和BALB/C小鼠3只用同样的方法免疫等体积的PBS。

动物抗RSV血清IgG效价测定

三针皮下免疫后青紫兰兔和小鼠分别在颈动脉和眼底采血并收集血清，按上文所述的纯化方法超速离心纯化的B/LZ11/12和Long株病毒并分别以2.5μg/ml或5μg/ml的浓度包被，采用间接ELISA方法进行血清IgG检测，兔抗血清和鼠抗血清分别用生理盐水从1:100起进行2倍比系列稀释至1:102400，免疫PBS的兔血清和鼠血清1:20倍稀释，每个样2孔重复分别与B/LZ11/12和Long株病毒进行反应检测。最终用酶标仪测定每孔在450nm波长下的吸光值，对照动物血清反应后吸光值的3倍为Cutoff值。按照公式

分别计算6份鼠血清和3份兔血清的抗体几何平均滴度(X表示血清的反应效价或滴度，n表示血清的总份数)。

结果：注射PBS的对照兔血清和鼠血清(1:20倍稀释)的吸光值均在0.1以内，3份免疫兔血清与本型病毒的反应效价均为1:12800，与A型病毒Long株的反应效价均为6400。6份鼠血清与本型病毒的反应效价均很高，除了6#鼠为1:6400之外，其他5只鼠血清的反应效价均高于1:12800，经计算所有鼠血清与本型病毒的抗体几何平均滴度为1:28708。同样，这些抗RSV血清与A型病毒的反应除了6#鼠1:3200之外，其他均高于1:12800。与本型的反应相比，免疫血清与A型病毒的反应效价明显较低，但其抗体平均几何滴度也高达1:16106，证明B/LZ11/12毒株在鼠体内诱导产生的IgG抗体也可以与A型病毒发生很好的交叉反应，提示该病毒如果作为人用疫苗成分应用，可能会对2型病毒都产生保护作用。

表4 B/LZ11/12免疫反应效价

动物抗RSV血清中和抗体效价测定

微量中和法测定上面实验所述的抗RSV血清。按1×10⁶个细胞/ml将Vero细胞铺设至96孔板，48小时后上述兔抗和鼠抗RSV血清于56℃灭活30分钟，将100CCID₅₀/0.1mL的B/LZ11/12分别与2⁶、2⁷、2⁸、2⁹、2¹⁰、2¹¹、2¹²、2¹³、2¹⁴和2¹⁵倍稀释(PBS稀释)的上述动物的灭活抗RSV血清0.1mL混合并在37℃中和1小时，之后按40μl/孔接种至已长满单层Vero细胞的96孔板中，每个稀释度4孔重复，同时在同一板中设PBS注射的相应动物对照血清(2³倍稀释)与病毒(100CCID₅₀/0.1mL)中和的阴性对照孔(2孔重复，40μl/孔)，以及没有接种病毒与血清的混合物的正常对照细胞孔(2孔重复)。此外，在同一板中做病毒回滴试验(各稀释度2孔重复)：病毒(100CCID₅₀)分别作0.1、1、10和100CCID₅₀稀释，每个稀释度2孔重复，按照20μl/孔接种于Vero细胞中。判定结果以0.1CCID₅₀不病变，100CCID₅₀全病变为准。最后，病毒和血清混合孔、病毒回滴孔和正常细胞对照孔分别再补加100μl、120μl和140μl的MEM细胞维持液进行培养。感染后6-8天，当病毒回滴试验，阴性血清对照和正常细胞对照全部成立时，进行结果判定，被检血清孔出现100％CPE判为阴性，50％以上细胞出现保护者为阳性；用Karber法计算半数保护量PD₅₀＝L+d(S-0.5)计算每份血清的中和抗体效价，其中L为50％以上细胞保护的血清稀释度的对数，d为距离比例，即稀释系数，S为保护比值之和。固定病毒稀释血清中和试验的结果计算，是计算出能保护50％细胞孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。最终用公式

分别计算6份鼠血清和3份兔血清的中和抗体几何平均滴度(X表示血清抗体滴度或效价，n表示血清的总数量)。

结果：1:2³倍稀释的对照阴性兔血清和鼠血清均完全没有抑制RSV融合病变，6份鼠血清和3份兔血清与本型病毒均具有较高的中和活性，其中3只鼠血清的中和RSV的活性最高，为1:2¹⁴，最低的为1:2¹²，经计算6只鼠血清中和本型病毒的抗体几何平均滴度为1:2¹³。由于鼠血清数量有限，与A型两个毒株的中和效价无法测定。3份兔血清与本型病毒中和的抗体几何平均滴度为1:4096(2¹²)，与A型病毒反应的抗体平均几何滴度为1:512(2⁹)，证明该毒株在兔体内诱导产生的IgG抗体也可以与A型病毒发生交叉中和反应，提示该病毒如果作为人用疫苗成分应用，可能会对2型病毒都产生保护作用。

表5 B/LZ11/12的中和效价

新病毒传代稳定性

RSV的最佳敏感细胞应该是来源于呼吸道黏膜组织的上皮细胞，即人胚肺上皮成纤维细胞。人胚肺上皮成纤维细胞为二倍体细胞，与Vero细胞相比有如下不足：1)在体外传代的寿命相对较短；2)在体外扩传时不易放大，通常只能以1:4的比例扩传；3)细胞体积相对较大，铺满单层的细胞密度相对较低；4)细胞生长速度较慢。因此，就RSV基于细胞培养的相关疫苗的规模化生产和制备而言，Vero细胞更有优势。为了确定RSV B/LZ11/12在Vero细胞中的传代稳定性，将其在Vero细胞中连续传代20次，培养过程中每日观察细胞病变，每隔5代取样分别测定病毒滴度，每隔10代扩增并克隆病毒的主要保护性抗原F和G基因，并进行序列测定和分析。

结果：RSV B/LZ11/12在连续20次传代过程中，Vero细胞中的CPE典型，病毒滴度在3.3×10⁸～7.8×10¹⁰PFU/ml之间(表6)，第10代(P10)和第20代(P20)病毒原液扩增G和F基因并测序后，结果表明G基因核苷酸序列同源性(图16A)99.9％以上，氨基酸序列(图16B)同源性100％；F基因核苷酸序列(图16C)和氨基酸序列(图16D)同源性均为100％。上述结果表明RSV B/LZ11/12的遗传稳定性好，适用于疫苗生产时病毒原液样品的制备或者蛋白组分提纯，从而制备性能稳定且均一的免疫原。

表6不同代次的病毒滴度测定结果

实施例5：RSV B/LZ11/12感染动物模型的确定

5只18～20g的BALB/C鼠用5％的水合氯醛(100～120μl/只)腹腔注射进行麻醉，待小鼠彻底麻醉后通过滴鼻的方法将3.3×10⁶PFU/ml的RSV B/LZ11/12病毒原液顺着呼吸滴入小鼠鼻腔内15μl/孔，共30μl，同时设滴鼻Vero细胞培养液(MEM)的对照组小鼠5只，对照组和感染组分房喂养。接种后7天对照组和感染组小鼠全部处死，在无菌环境下解剖小鼠并观察和采集肺脏，与正常小鼠肺脏眼观有差异的用福尔马林固定后做病理切片，剩余的肺脏研磨后立即取上清液用上述噬斑法测定病毒滴度。

结果：接种病毒的感染组和只接种了培养液的对照组小鼠在感染后7天过程中没有死亡病例发生。

眼观病变：7天后解剖小鼠，发现病毒感染组所有小鼠相比对照组有明显的眼观病变，主要表现为肺脏充血和局部出血，大部分呈暗红色，个别鼠肺呈灰白色；对照组2只小鼠的肺脏正常，3只的呈现轻微充血。

病理切片结果：如图17所示，感染组有明显的肺部炎症，主要表现为肺泡膈毛细血管扩张、充血，支气管黏膜上皮坏死脱落，局灶支气管腔和肺泡腔内有巨噬细胞和渗出物，间质有中性粒细胞、淋巴细胞浸润；外观有轻微充血的对照组小鼠主要的病理变化为肺泡膈毛细血管扩张。

病毒滴度测定结果：5只病毒感染组小鼠均有活性RSV的增殖，病毒滴度均在3.4×10³～1.1×10⁴PFU/ml之间(如表7所示)，说明LZ11/12在小鼠体内可以进行增殖，该病毒可以作为RSV动物感染模型的建立。相比而言，对照组5只小鼠的肺脏中均没有测到RSV病毒。RSV的最佳动物感染模型为非人灵长类动物，但由于伦理和经济方面的原因其研究受到许多限制。研究者们常以容易操作和实现的啮齿类动物作为感染模型，LZ11/12在小鼠中的感染模型结果表明其可以感染小鼠下呼吸道并在其中增殖。正如许多研究报道的结果一样，感染较高滴度的LZ11/12后小鼠肺脏中其RSV增殖水平并没有达到体外细胞系中的增殖水平，这是因为鼠类不是RSV的最佳感染动物模型，这或许也是感染后肺脏有明显的感染发生，但仍没有小鼠死亡病例的主要原因之一。

表7：小鼠感染后7天肺病毒载量

综上所述，可以得到以下结论：

1.基本描述：

1)在RSV流行季节，从兰州大学第一附属医院的肺炎感染患者的呼吸道临床样本中自行分离培养RSV，获得了一株野生型RSV强毒株。

2)分离培养采用了HRSV感染最适宜的呼吸道黏膜上皮细胞—人胚肺成纤维上皮细胞MRC-5作为细胞基质。

3)初步分离新病毒时，同时用CPE、RT-PCR和间接免疫荧光反应三种方法同时进行鉴定；结果CPE出现了RSV典型的细胞融合病变，融合巨细胞中可见许多嗜酸性颗粒；RT-PCR的检测引物均为自行设计，测序结果为RSV预期目标片段，证明检测引物特异且有效；间接免疫荧光反应可观察到与RSV特异性抗体结合反应的荧光区域均在胞浆中，与RSV的复制定位一致。

4)通过连续3次噬斑克隆纯化方法筛选并纯化出了新病毒株，并命名为B/LZ11/12，其生物保藏编号为：CCTCC NO:V201821。

5)自行设计了10对特异性引物并扩增到了新病毒株的全基因组，测序结果表明新病毒基因组全长为15275nt，含有RSV的所有结构特征，基因组结构从5’端到3’端依次为5’UTR-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-3’UTR。

2.新病毒的基因特性：

1)经全基因序列比对后，B/LZ11/12与B亚型RSV的同源性最高，均在96.8％以上，而与A亚型RSV原型株Long株的同源性仅为81％，确定该毒株为B亚型野生毒株。

2)经全基因序列比对，B/LZ11/12与B亚型RSV原型株9320的核苷酸同源性相对较低(96.8％)，而与其他B亚型毒株的核苷酸同源性均在99％以上，其中与中国2013年广州流行株(B/GZ/13-730)、2012年美国(RSVB/Homo Spiens/USA/TH/10264/2012)以及英国流行株(B/England313/2012株)的同源性为最高(99.7％)。

3)将不同B亚型基因型的代表毒株与该毒株的G基因用MUSCLE序列联配后再用邻接法构建了系统发生树。结果表明B/LZ11/12与BA9基因型的3个代表株同属一个分支，确定B/LZ11/12的基因型为BA9型。序列联配结果表明该毒株G基因在792nt之后有60nt的插入，属于典型的BA型G基因。

4)新毒株G基因与原型株9320的核苷酸序列同源性92.7％，氨基酸序列同源性仅为87.6％，表明部分核苷酸变异为错义突变。与9320株相比，B/LZ11/12有30个位点彻底发生了氨基酸的置换，其中159和160位的Pro和Lys均缺失，而在255-274之间插入了20个氨基酸。B/LZ11/12与其亲缘关系最近的几个毒株的核苷酸序列同源性在98.5％-99.6％之间，氨基酸序列同源性在98.1％-99.4％之间，本毒株G基因特有的变化是有一个Glu87Gly的氨基酸替换。

5)F基因与原型株9320的核苷酸序列同源性为96.6％，氨基酸同源性为98.8％，与其他毒株(都是B亚型毒株)之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均很高，均在99.3％以上。与原型株相比，B/LZ11/12有4处发生了氨基酸的替换，即Phe45Leu、Thr97Met、Leu172Gln和Ser197Asn；而与其他流行毒株相比，B/LZ11/12毒株243位有一处氨基酸替换，即Val替换为Ala。

6)SH基因与原型株9320的核苷酸和氨基酸序列同源性均97％，新病毒在2处发生了氨基酸的替换，即Thr49Ile和Leu57Gln。与其他毒株(都是B亚型毒株)之间的核苷酸序列同源性在99.5％以上，氨基酸序列同源性在98.5％以上。

3.新病毒主要结构蛋白WB分析：

1)RSV F蛋白的2种单克隆抗体AB96968和AB43812均可以检测到特异性的目标条带，两种抗体可以检测到F0、F1和F2蛋白，并且是以糖基化形式存在的F0和F1。

2)N蛋白的单克隆抗体AB94806反应后检测到了一条特异性的大小为43kDa的特异性预期目的条带。

3)RSV M2-1蛋白的单克隆抗体AB94805反应后检测到了3条带，除了22kDa的条带之外，还检测到了分子量略大的另外2条磷酸化修饰的M2-1蛋白。

4.新病毒形态学特征：

透射电镜观察结果表明，大部分病毒颗粒呈球形，直径约60-100nm之间，以小球形病毒为主，并可见长约300-500nm的丝状或杆状病毒。据文献报道，丝杆状的病毒更具有感染性。相比而言，RSV标准毒株Long株在镜下几乎没有观察到丝状或杆状型的病毒，均为球形，直径约在80-150nm之间。

5.新病毒的增殖特性：

1)病毒增殖能力B/LZ11/12除了在MRC-5细胞中增殖之外，还可以在适宜用于人用疫苗规模化生产和制备的Vero传代细胞中有效增殖，并形成清晰可见的空斑，病毒滴度可达3.3×10⁸PFU/ml。.

2)最佳感染MOI用CPE、RT-PCR和免疫荧光3种判定方法确定了B/LZ11/12在Vero细胞中的最佳MOI值为10^-5；相比而言，A2和Long株的最佳MOI值更高，分别为10^-3和10^-2。相比2个标准株，该新毒株能以低100倍的病毒量感染并复制子代病毒。如果病毒应用于疫苗制备，从病毒规模化培养的角度来说可以极大地节约成本。

3)病毒一步增殖曲线在最佳MOI条件下经病毒滴度测定和RT-PCR检测，绘制了B/LZ11/12在MRC-5细胞和Vero细胞中的一步增殖曲线，确定其在两种细胞系中的感染高峰在3-7天，且在两种细胞系中的增殖水平基本一致。提示病毒用于疫苗应用，可以选用其中任一细胞系。

6.新病毒的应用:

1)免疫原性评价新病毒经培养制备和超速离心纯化后分别皮下分3剂免疫青紫兰幼兔和BalB/C幼鼠，经间接ELISA检测后，兔血清与本型病毒的反应抗体几何平均滴度(GMT)为1:12800，与A亚型Long株交叉反应的GMT为1:6400；3份兔血清中和本型病毒的抗体GMT为1:4096(2¹²)，中和A亚型Long株的抗体GMT为1:512(2⁹)。6份鼠血清与本型病毒反应的抗体几何平均滴度(GMT)为1:28708，中和本型病毒的抗体GMT为1:8192(2¹³)；鼠血清与A亚型Long株交叉反应的GMT为1:16101。确定RSV B/LZ11/12株免疫实验动物后产生了很强的体液免疫反应，其诱导产生的抗体同时可以与B亚型和A亚型RSV发生很强和较强的交叉反应，更佳的是兔血清对本型病毒和A亚型病毒具有较强中和活性，提示该毒株有希望用于相关组分疫苗或减毒活疫苗的开发以同时保护两个亚型的RSV。

2)遗传稳定性B/LZ11/12在Vero细胞中连续20次传代过程中，CPE典型，病毒滴度在3.3×10⁸～7.8×10¹⁰PFU/ml之间，P10和P20病毒原液扩增G和F基因并测序后，G基因核苷酸序列同源性在99.9％以上，氨基酸序列同源性为100％；F基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为100％。确定RSV B/LZ11/12的遗传稳定性好，适用于疫苗生产时病毒原液样品规模化的制备。

3)动物感染模型的建立B/LZ11/12经过鼻腔滴鼻途径可以在BALB/C小鼠中引起下呼吸道肺部的感染，感染后7天小鼠肺部有明显的眼观病变发生，主要表现为肺脏充血和局部出血，大部分呈暗红色，个别呈灰白色；病理变化主要表现为肺泡膈毛细血管扩张、充血，支气管黏膜上皮坏死脱落，局灶支气管腔和肺泡腔内有巨噬细胞和渗出物，间质有中性粒细胞、淋巴细胞浸润；经噬斑法测定感染组小鼠肺脏病毒的平均载量为4×10⁴PFU/ml，证明该毒株可以在小鼠体内进行复制。确定B/LZ11/12可以作为人RSV感染动物模型的毒株和疫苗保护率效果评价的攻击毒株使用，因此为抗病毒药物的筛选、RSV病毒感染机制的研究和人呼吸道合胞病毒疫苗的研制提供了基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 兰州生物制品研究所有限责任公司

<120> 人呼吸道合胞病毒毒株、应用、抗体或杂交瘤细胞或抗血清

<130> FI-183564-59:52/C

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15275

<212> DNA

<213> 人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus)

<400> 1

acgcgaaaaa atgcgtacta caaacttgca cactcgaaaa aaatggggca aataagaatt 60

tgataagtgc tatttaagtc taaccttttt aatcagaaat ggggtgcaat tcactgagca 120

tgataaaggt tagattacaa aatttgtttg ataatgacga agtagcattg ttaaaaataa 180

catgttatac tgacaaatta attcttctga ctaatgcatt agccaaagca acaatacata 240

caattaaatt aaacggcata gtttttatac atgttataac aagcagtgaa gtgtgccctg 300

ataacaatat tgtagtgaaa tctaacttta caacaatgcc aatattacaa aatggaggat 360

acatatggga attgattgaa ttgacacact gctctcaatt aaatggtcta atagatgata 420

atcgtgaaat caaattttct aaaagactaa gtgactcagt aatgactgat tatatgaatc 480

aaatatctga tttacttggg cttgatctcc attcatgaat tatgtttagt ctaattcaat 540

agacatgtgt ttattaccat tttagttaat ataaaacctc atcaaaggga aatggggcaa 600

ataaactcac ccaatcaatc aaaccatgag cactacagac gacaacacca ccatgcaaag 660

attgatgatc acagacatga gacccctgtc gatggattca ataataacat ctctcaccaa 720

agaaatcatc acacacaaat tcatatactt gataaacaat gaatgtattg taagaaaact 780

cgatgaaaga caagctacat ttacattcct agtcaattat gagatgaagc tattgcacaa 840

agtagggagt accaaataca agaaatacac cgaatataat acaaaatatg gcacattccc 900

tatgcctata tttatcaatc atggcgggtt tctagaatgt attggcatta agcctacaaa 960

acatactcct ataatatacg aatatgacct caacccgtaa cttccaacaa aaaaaccaac 1020

tcatccaaac caagctattc tctaaacaac aatgctcaac agttaagaag gagctaatcc 1080

attttagtaa ttaaaaataa gggtgaaacc agtaacataa attggggcaa atacaaagat 1140

ggctcttagc aaagtcaagt tgaatgatac attaaataag gatcagctgc tgtcatccag 1200

caaatacact attcaacgta gtacaggaga taatattgac actcccaatt atgatgtgca 1260

aaaacaccta aacaaactat gtggtatgct attaatcact gaagatgcaa atcataaatt 1320

cacaggatta ataggtatgc tatatgctat gtccagatta ggaagggaag acactataaa 1380

gatacttaaa gatgctggat atcatgttaa agctaatgga gtagatataa caacatatcg 1440

tcaagatata aatggaaagg aaatgaaatt cgaagtatta acattatcaa gcttgacatc 1500

agaaatacaa gtcaatattg agatagaatc tagaaagtcc tacaaaaaaa tgctaaaaga 1560

gatgggagaa gtggctccag aatataggca tgattctcca gactgtggga tgataatact 1620

gtgtatagct gcccttgtaa taaccaaatt agcagcagga gatagatcag gtcttacagc 1680

agtaattagg agggcaaaca atgtcttaaa aaacgaaata aaacgctaca agggcctaat 1740

accaaaagac atagccaaca gtttttatga agtgtttgaa aaataccctc atcttataga 1800

tgtttttgtg cactttggca tagcacaatc atccacaaga gggggcagta gagttgaagg 1860

aatctttgca ggattgttta tgaatgccta tgrttcagga caagtaatgc taagatgggg 1920

agttttagcc aaatctgtaa aaaatatcat gctaggacat gctagtgtcc aagcagaaat 1980

ggagcaagtt gtggaagtct atgagtatgc acagaagttg ggaggagaag ctggtttcta 2040

ccatatattg aacaatccaa aagcatcatt gctgtcatta actcaatttc ctaacttctc 2100

aagtgtggtc ctaggcaatg cagcaggtct aggcataatg ggagagtata gaggtacacc 2160

aagaaaccaa gatctctatg atgcagccaa agcatatgca gagcaactca aagaaaatgg 2220

agtaataaac tacagtgtat tagacttaac aacagaagaa ttggaagcca taaagcatca 2280

actcaacccc aaagaagatg acgtagagct ttaagttaac aaaaaatacg gggcaaataa 2340

gtcaacatgg agaagtttgc acctgaattt catggagaag atgcaaataa caaagctacc 2400

aaattcctag aatcaataaa aggcaagttt gcatcatcca aagatcctaa gaagaaagat 2460

agcataatat ctgtcaactc aatagacata gaagtcacta aagagagccc gataacatct 2520

ggcaccaaca ttatcaatcc aacaagtgaa gccgacagta ccccagaaac caaagccaac 2580

tacccaagaa aacccctagt aagcttcaaa gaagatctca ccccaagtga taaccctttc 2640

tctaagttgt acaaagaaac catagaaaca tttgataaca atgaagaaga atctagctac 2700

tcatatgagg agatcaatga tcaaacaaat gacaacatta cagcaagact agatagaatt 2760

gatgaaaaat taagtgaaat attaggaatg ctccatacat tagtagttgc aagtgcagga 2820

cctacttcgg ctcgtgacgg aataagagat gctatggttg gtctaagaga agaaatgata 2880

gaaaaaataa gagcagaagc attaatgacc aatgataggt tagaggctat ggcaagactt 2940

aggaatgagg aaagcgaaaa aatggcaaaa gacacctcag atgaagtgtc tctcaatcca 3000

acctccaaaa aattgagtga cttgttggaa gacaacgata gcgacaatga tctatcactt 3060

gatgattttt gatcagtgat caactcactc agcaatcaac aacatcaata aaacagacac 3120

caatccattg aatcaattgc cagactgaaa aaacaaacat ccatcagcag aaccaccaac 3180

caatcaatca accaattgat caatcagcac cctgacaaaa ttaacaatat agtaacaaaa 3240

aaagaaacag atggggcaaa tatggaaaca tacgtgaaca agcttcacga aggctccaca 3300

tacacagcag ctgttcagta caatgttcta gaaaaagatg atgatcccgc atcactaaca 3360

atatgggtgc ctatgttcca gtcatctgtg ccagcagact tgctcataaa agaacttgca 3420

agcatcaaca tactagtaaa gcagatctct acgcccaaag gaccttcact acgagtcacg 3480

atcaactcaa gaagtgctgt gctggctcaa atgcctagta atttcaccat aagtgcaaat 3540

gtatcattag atgaaagaag caaattagca tatgatgtaa ctacaccttg tgaaatcaaa 3600

gcatgcagtc taacatgctt aaaagtaaaa agtatgttaa ctacagtcaa agatctaacc 3660

atgaagacat tcaaccccac tcatgagatc attgctctat gtgaatttga aaatattatg 3720

acatcaaaaa gagtaataat accaacctat ctaagatcaa ttagtgtcaa aaacaaggac 3780

ctgaactcac tggaaaatat agcaaccacc gaattcaaaa atgctatcac caatgctaaa 3840

attattccct atgcaggatt agtgttagtt atcacggtta ctgataataa aggagcattc 3900

aagtatatca agccacagag tcaatttata gtggatcttg gtgcctacct agaaaaagag 3960

agcatatatt atgtgactac taattggaag catacagcta cacgtttttc aatcaaacca 4020

ctagaggatt aaactcaatt atcaacattg aatgacaggt tcacatatat cctcaactgc 4080

acactatatc taaacatcat aaacatctac actacacact tcatcacaca aaccaatccc 4140

actcaaaatc taaaatcact tccagccatt gtctgccaga cctagagtgc gaataggtaa 4200

ataaaacaag aatatggggt aaatagatat cagttagagt tcaaccaatc tcaacaacca 4260

tctataccgc ccatccaata catacattgc aaatcttaaa atgggaaaca catccatcac 4320

aatagaattc acaagcaaat tttggcccta ttttacacta atacatatga tcttaactct 4380

aatctcttta ctaattataa tcactattat gattgcaata ctaaataagc taagtgaaca 4440

taaaatattc tgcaacaaaa ctcttgaaca aggacagatg tatcaaatca acacatagtg 4500

ttctcccatt atgctgtatc aaattataat cttgtgtata taaataaaca aatccaatct 4560

tctcacagag tcatggcatc acaaaaccat gccaaccatc atggtagcat agagtagtta 4620

tttaaaaatt aacataatga tgaattatta gtatgggatc aaaaacaaca ttggggcaaa 4680

tgcaacaatg tccaaaaaca agaatcaacg cactgccagg actctagaaa agacctggga 4740

tactcttaat catctaattg taatatcctc ttgtttatac aaattaaatt taaaatctat 4800

agcacaaata gcactatcag ttttggcaat gataatctca acctctctya taattgcagc 4860

cataatattc atcatctctg ccaatcacaa agttacacta acaactgtca cagttcaaac 4920

aataaaaaac cacactggga aaaacataac cacttacctt actcaagtct caccagagag 4980

ggttagccca tccaaacaac ccacagccac accaccaatc cacacaaact cagccacaat 5040

atcacccaat acaaaatcag aaacacacca tacaacagca caaaccaaag gcacaacctc 5100

tactccaaca cagaacaaca agccaagcac aaaaccacgt ccaaaaaatc caccaaaaaa 5160

agatgattac cattttgaag tgttcaactt tgttccctgt agtatatgtg gcaacaatca 5220

actctgcaaa tccatttgca aaacaatacc aagcaataaa ccaaagaaaa aaccaactac 5280

aaaacccaca aacaaaccac ctaccaaaac cacaaacaaa agagacccca aaacactagc 5340

caaaacaccg aaaaaagaaa ccaccattaa cccaacaaaa aaaccaaccc ccaagactac 5400

agaaagagac accagcaccc cacaatccac tgtgctcgac ataaccacat caaaacacac 5460

agaaagagac accagcacct cacaatccat tgcgcttgac acaaccacat caaaacacac 5520

aacccaacag caatctctct actcaaccac ccccgaaaac acacccaact ccacacaaac 5580

acccacagca tccgagccct ccacatcaaa ttctacctaa aaactccagt catatgctta 5640

gttatttaaa aactacatct tagcagagaa ccgtgatccc tcaagcaaga acgaaattaa 5700

atctggggca aataaccatg gagttgctga tccatagatc aagtgcaatt ttcctaactc 5760

ttgctattaa tgcattgtac ctcacctcaa gtcagaacat aactgaggag ttttaccaat 5820

caacatgtag tgcagttagc agaggttact tgagtgcttt aagaacaggt tggtatacca 5880

gtgtcataac aatagaatta agtaatataa aagaaaccaa atgcaatgga actgacacta 5940

aagtaaaact tataaaacaa gaattagata agtataagaa tgcagtaaca gaattacagt 6000

tacttatgca aaacacacca gctgtcaaca accgggccag aagagaagca ccacagtata 6060

tgaactacac aatcaatacc actaaaaacc taaatgtatc aataagcaag aagaggaaac 6120

gaagatttct gggcttcttg ttaggtgtag gatctgcaat agcaagtggt atagctgtat 6180

ccaaagttct acaccttgaa ggagaagtga acaagatcaa aaatgctttg cagtctacaa 6240

acaaagctgt agtcagtcta tcaaatgggg tcagtgtttt aaccagcaaa gtgttagatc 6300

tcaagaatta tataaacaac caattattac ctatagtaaa tcaacagagt tgtcgcatat 6360

ccaacattga aacagttata gaattccagc agaagaacag cagattgttg gaaatcacca 6420

gagaatttag tgtcaatgca ggtgcaacga cacctttaag cacttacatg ttaacaaaca 6480

gtgagttact atcattaatc aatgatatgc ctataacaaa tgatcagaaa aaattaatgt 6540

caagcaatgt tcagatagta aggcaacaaa gttattctat catgtctata ataaaggaag 6600

aagtccttgc atatgttgta cagctaccta tctatggtgt aattgataca ccttgctgga 6660

aattacacac atcacctctg tgcaccacca acatcaaaga aggatcaaat atttgtttaa 6720

caaggactga tagaggatgg tactgtgata atgcaggatc agtatccttc tttccacaag 6780

ctgacacctg taaagtacag tccaatcgag tattttgtga cactatgaac agtttgacat 6840

taccaagtga agtcagcctt tgtaacactg acatattcaa ttccaagtat gactgcaaaa 6900

ttatgacatc aaaaacagac ataagcagct cagtaattac ttctctagga gctatagtgt 6960

catgctatgg taagactaaa tgtactgcat ccaacaaaaa tcgtggaatt ataaagacat 7020

tttctaatgg ttgtgattat gtgtcaaaca aaggagtaga tactgtatca gtgggcaaca 7080

ctttatatta tgtcaacaag ctggaaggca aaaaccttta tgtaaaaggg gaacctataa 7140

taaattacta tgaccctcta gtgtttcctt ctgatgagtt tgatgcatca atatctcaag 7200

tcaatgaaaa aattaatcaa agtttagctt ttattcgtag atccgatgaa ttattacata 7260

atgtaaatac tggaaaatct actacaaata ttatgataac tgcaattatt atagtaatca 7320

ttgtagtatt gttatcatta atagctattg gtttactgtt gtattgcaaa gccaaaaaca 7380

caccagttac attaagcaaa gaccaactaa gtggaatcaa taatattgca ttcagcaaat 7440

agacaaaaaa ccacctgatc atgtttcaac aacaatctgc tgaccaycaa tcccaaatca 7500

acttacaaca gatacttcaa catcacagca caggctgaat catttcctcg catcatgcta 7560

cccacacaac taagctagat ccttaactca tagttacata aaagcctcaa atatcgcaat 7620

caacactaaa tcaacacatc attcacaaaa ctaacagctg gggcaaatat gtcgcgaaga 7680

aatccctgca aatttgagat tagaggtcat tgcttgaatg gtagaagatg ccactacagt 7740

cataattact ttgaatggcc tcctcatgca ttgctagtga ggcaaaactt catgttaaac 7800

aagatactca agtcaatgga caagagcata gacactttgt ctgaaataag tggagctgct 7860

gaacttgata gaacagaaga atatgctctt ggtatagttg gagtgctaga gagttacata 7920

ggatctataa acaacataac aaaacaatca gcatgtgttg ctatgagtaa acttcttatt 7980

gagatcaata gtgatgacat taaaaagctg agagacaatg aagaacccaa ttcacctaag 8040

ataagagtgt acaatactgt tatatcatac atcgagagca atagaaaaaa cagcaagcaa 8100

accatccatc tgctcaaacg attaccagca gacgtgctga agaagacaat aaagaacaca 8160

ttagatatcc acaaaagcat aaccataagc aacccaaaag agtcaaccat aagtgatcaa 8220

aatgaccaaa ccaaaaataa tgatattacc ggataaatat ccttgtagta tatcatccat 8280

attgatctca agtgaaagca tgattgctac attcaatcat aaagacatat tacaatttaa 8340

ccacaaccat ttggataacc accagtgttt attaaatcat atatttgatg aaattcattg 8400

gacacctaaa aacttattag atgccactca acaatttctc caacatctta acatccctga 8460

agatatatat acagtatata tattagtgtc ataatgcttg atcataacga ttctatatca 8520

tccaaccata aaactgtctt aataaagtta tgggacaaaa tggatcccat tattaatgga 8580

agctctgcta atgtatatct aactgatagt tatctaaaag gtgttatctc tttttcagaa 8640

tgtaatgctt tagggagtta cctttttaay ggcccttatc ttaaaaatga ttataccaac 8700

ttaattagta gacaaagccc actaatagag catatgaatc taaaaaaact aactataaca 8760

cagtcattaa tatctagata ccataaaggt gaactgaaat tagaagaacc aacttatttc 8820

cagtcattac ttatgacata taaaagcatg tcctcgtctg aacaaattgc tacaactaac 8880

ttacttaaaa aaataatacg aagagctata gaaataagtg atgtaaaggt gtacgccatc 8940

ttgaataaac taggactaaa ggaaaaggac agagttaagc ccaacagcaa ttcaggtgat 9000

gaaaactcag tacttacaac cataattaaa gatgatatac tctcagctgt ggaaaacaat 9060

caatcatata caaattcaga taaaaattac tcagtaaatc aaaatatcaa tatcaaaaca 9120

acactcttaa aaaagttgat gtgttcaatg caacatcctc catcatggtt aatacactgg 9180

ttcaatttat atacaaaatt aaataacata ttaacacaat atcgatcaaa tgaggtaaaa 9240

agtcatgggt ttatattaat agataatcaa actttgagtg gttttcagtt tattttaaat 9300

caatatggtt gcattgttta tcataaaggg ctcaaaaaat tacaactact acatacaatc 9360

aatttttgac atggaaagac atcagcctca gcagattaaa tgtttgctta attacttgga 9420

taagtaattg tttaaataca ttaaataaaa gcttagggtt gagatgcgga ttcaataatg 9480

ttgtgctatc acaattattc ctttacggag attgtatact gaaattattt cataatgaag 9540

gcttttacat aataaaagaa gtagaaggat ttattatgtc tttaattcta aacataacag 9600

aagaagatca atttaggaaa cgattttata atagcatgct aaataacatc acagatgcag 9660

ctattaaggc tcaaaaggat ctactatcaa gagtatgtca cactttatta gacaagacag 9720

tgtctgataa tatcataaat ggtaaatgga taattctatt aagtaaattt cttaaattga 9780

ttaagcttgc aggtgataat aatctcaata acttgagtga gctatatttt ctcttcagaa 9840

tctttggaca tccaatggtt gatgaaagac aagcaatgga tgctgtaaga attaactgca 9900

atgaaactaa gttctattta ttaagtagcc taagtacgtt gagaggtgct ttcatttata 9960

gaatcataaa agggtttgta aatacctaca acagatggcc cactttaagg aatgctattg 10020

tcctacctct aagatggtta aactattata aacttaatac ttatccatct ctacttgaaa 10080

tcacagaaaa tgatttgatt attttatcag gattgcggtt ctatcgtgag tttcatctgc 10140

ctaaaaaagt ggatcttgaa atgataataa atgacaaagc tatttctcct ccaaaagatc 10200

taatatggac tagttttcct agaaattaca tgccatcaca tatacaaaat tatatagaac 10260

atgaaaagtt gaagttctct gaaagcgaca gatcaagaag agtactagag tattacttga 10320

gagataataa attcaatgaa tgtgatctat acaattgtgt agttaatcaa agctatctca 10380

acaactctaa tcatgtggta tcactaactg gtaaagaaag agagctcagt gtgggtagaa 10440

tgtttgctat gcaaccaggt atgtttaggc aaatccaaat cttagcagaa aaaatgatag 10500

ccgaaaatat tttacaattc ttccctgaga gtttgacaag atatggtgat ctagagcttc 10560

aaaagatatt agaattaaaa gcaggaataa gcaacaagtc aaatcgttat aatgataact 10620

acaacaatta tatcagtaaa tgttctataa taacagatct tagcaaattt aatcaagcat 10680

ttagatatga aacatcatgt gtctgcagtg atgtattaga tgaactgcat ggggtacaat 10740

ctctattctc ttggttgcat ttaacaatac ctcttgttac aataatatgt acatatagac 10800

atgcacctcc ttttataaag gatcatgttg tcaatcttaa tgaagttgat gaacaaagtg 10860

ggttatacag atatcatatg ggtggtattg agggctggtg tcaaaaactg tggaccattg 10920

aagccatatc attattagat ctaatatctc ttaaaggtaa attctccatc acagctctga 10980

taaatggtga taatcagtca attgatataa gtaaaccagt tagacttata gagggtcaga 11040

cccatgctca agcagattat ttgttagcat taaatagcct taaattgcta tataaagagt 11100

atgcaggcat aggccataag cttaagggaa ctgagaccta tatatctcga gatatgcagt 11160

tcatgagcaa aacaatccag cacaatggag tgtactatcc agccagtatc aaaaaagtcc 11220

tgagagtagg tccatggata aatacaatac ttgatgattt taaagttagt ttagaatcta 11280

taggtagctt aacacaggag ttagaataca gaggagaaag cttattatgc agtttaatat 11340

ttaggaatat ttggttatac aatcaaattg ctctgcaact ccgaaatcat gctttatgta 11400

ataataagct atatttagat atattgaaag tattaaaaca cttaaaaacc ttttttaatc 11460

ttgatagtat cgatacggcg ttatcattgt atatgaactt gcctatgctg tttggtggtg 11520

gtgatcctaa tttgttatat cgaagctttt ataggagaac tccagacttc cttacagaag 11580

ctatagtaca ttcagtgttc gtgttgagct attatactgg tcacgatcta caagataagc 11640

tccaggatct tccagatgat agactgaaca aattcttgac ttgtgtcatc acatttgata 11700

aaaatccaaa tgccgagttt gtaacattga tgagggatcc acaggcttta gggtctgaaa 11760

ggcaagctaa aattactagt gagattaata gattagcagt aacagaagtc ttaagtatag 11820

ctccaaacaa aatattttct aaaagtgcgc aacactatac taccactgag attgatctaa 11880

atgacattat gcaaaatata gaaccaactt accctcatgg attaagagtt gtttatgaaa 11940

gtttaccttt ttataaagca gaaaaaatag ttaatcttat atcaggaaca aaatccataa 12000

ctaatatact tgaaaaaaca tcagcgatag atacaactga tattaatagg gctactgata 12060

tgatgaggaa aaatataacc ttacttataa ggatacttcc actagattgt aacaaagaca 12120

aaagagagtt attaagttta gaaaatctta gcataactga attaagcaag tatgtaagag 12180

aaagatcttg gtcattatcc aatatagtag gagtaacatc gccaagtatt atgttcacaa 12240

tggacattaa atatacaact agcactatag ccagtggtat aattatagaa aaatataatg 12300

ttaatggttt aactcgtggt gaaagaggac ctactaagcc atgggtaggt tcatctacac 12360

aggagaaaaa aacaatgcca gtgtacaata gacaagtttt aaccaaaaag caaagagacc 12420

aaatagattt attagcaaaa ttagactggg tatatgcatc catagacaac aaagatgaat 12480

tcatggaaga actgagtact ggaacacttg gactgtcata tgaaaaggcc aaaaagttgt 12540

ttccacaata tctaagtgtc aattatttac accggttaac agtcagtagt agaccatgcg 12600

aattccctgc ctcaatacca gcttatagaa caacaaatta tcattttgat actagtccta 12660

tcaatcatgt attaacagaa aagtatggag atgaagatat cgacattgtg tttcaaaatt 12720

gcataagttt tggtcttagc ttgatgtcag ttgtggaaca attcacaaac atatgtccta 12780

atagaattat tctcataccg aagctgaatg agatacattt gatgaaacct cctatattta 12840

caggagatgt tgatatcatc aagttgaagc aagtgataca aaaacagcat atgttcctac 12900

cagataaaat aagtttaacc caatatgtag aattattctt aagtaacaaa gcacttaaat 12960

ctggatctca catcaactct aatttaatat tagtacataa aatgtctgat tattttcata 13020

atgcgtatat tttaagtact aatttagctg gacattggat tctgattatt caacttatga 13080

aagattcaaa aggtattttt gaaaaagatt ggggagaggg gtatataact gatcatatgt 13140

tcattaattt gaatgttttc tttaatgctt ataagactta tttgctatgt tttcatagag 13200

gttatggtaa agcaaaatta gaatgtgata tgaacacttc agatcttctt tgtgttttgg 13260

agttaataga cagtagctac tggaaatcta tgtctaaagt tttcctagaa caaaaagtca 13320

taaaatacat agtcaatcaa gacacaagtt tgcatagaat aaaaggttgt cacagtttta 13380

agttgtggtt tttaaaacgc cttaataatg ctaaatttac cgtatgccct tgggttgtta 13440

acatagatta tcacccaaca cacatgaaag ctatattatc ttacatagat ttagttagaa 13500

tggggttaat aaatgtagat aaattaacca ttaaaaataa aaacaaattc aatgatgaat 13560

tttacacatc aaatctcttt tacattagtt acaacttttc agacaacact catctgctaa 13620

caaaacaaat aaggattgct aattcagaat tagaagataa ttataacaaa ctatatcacc 13680

caaccccaga agctttagaa aatatatcat taatccctgt taaaagtaat aatagaaaca 13740

aacctaaatt ttgtataagt ggaagtactg aatctatgat gacgtcaaca ttctctaata 13800

aaatgcatat taaatcttcc actgttacca caagattcaa ttatagtaga caagacttgt 13860

acaatttatt tccaattgtt gtgatagaca ggattataga tcattcaggt aatacagaaa 13920

aatctaacca actttacacc accacttcac atcagacatc tttagtaagg aatagtgcat 13980

cactttattg catgcttcct tggcatcatg tcaatagatt taactttgta tttagttcca 14040

caggatgcaa gatcagtata gagtatattt taaaagatct taagattaaa gatcccagtt 14100

gtatagcatt cataggtgaa ggagctggta acttattatt acgtacggta gtagaacttc 14160

atcctgacat aagatatatt tacagaagtt taaaagattg caatgatcat agtttaccta 14220

ttgaatttct aaggttatac aacgggcata taaacataga ttatggtgag aatttaacca 14280

ttcctgctac agatgcaact aacaacatac attggtctta tttacatata aaatttgcag 14340

aacctattag tatctttgtc tgcgatgctg aattacctgt cacagccaat tggagtaaaa 14400

ttataattga atggagtaag catgtaagaa agtgcaaata ctgttcttct gtaaatagat 14460

gcattttaat tgcaaaatac catgctcaag atgatattga tttcaaatta gataacatta 14520

ctatattaaa aacttatgtg tgcctaggta gcaagttaaa aggatctgaa gtttacttag 14580

tccttacaat aggccctgca aatatacttc ctgtttttga tgttgtgcaa aatgctaaat 14640

tgattctttc aagaactaaa aatttcatta tgcctaaaaa gattgacaag gaatctatcg 14700

atgcaaatat taaaagctta atacctttcc tttgttaccc tataacaaaa aatggaatta 14760

agacttcatt gtcaaaattg aagagtgtag ttaatggaga tatattatca tattctatag 14820

ctggacgtaa tgaagtattc agcaacaagc ttataaacca caagcatatg aatatcttaa 14880

aatggctgga tcatgtttta aactttagat cagctgaact taattacaat catttataca 14940

tgatagagtc cacatatcct tacttgagtg aattattaaa tagtttaaca accaatgagc 15000

tcaagaagct gattaaaata acaggtagtg tactatacaa ccttcctaat gaacagtaac 15060

ttaaaatatc attaacaagt ttggtcaaat ttagatgcta acacattatt atattatagt 15120

tattaaaaaa tatgcaaact tttcaataat ttagcatatt gattccaaaa ttatcatttt 15180

agtcttaagg gattaaataa aagtctaaaa ctaacaatca cacatgtgca tttacaacac 15240

aacgagacat tagtttttga cacttttttt ctcgt 15275

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ggattctacc atatattgaa caatcc 26

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

tcttcttcat tgttatcaaa tgtttc 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

acgcgaaaaa atgcgtacta caaac 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cataggcatt cataaacaat cctgc 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

gtagagttga aggaatcttt gcagg 25

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

tttcacaagg tgtagttaca tcatatgc 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

gcaaattagc atatgatgta actacacc 28

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

attatggctg caattatgag agag 24

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

aaagacctgg gatactctta atcatcta 28

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

attgcacttg atctatggat cagc 24

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

tggagttgct gatccataga tcaag 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

ttgttgtaag ttgatttggg attgg 25

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

tactatgacc ctctagtgtt tccttctg 28

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

acgaggacat gcttttatat gtcataag 28

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

ggagttacct ttttaatggc ccttatc 27

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

ttgtcaaact ctcagggaag aattg 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

ccgaaaatat tttacaattc ttccc 25

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

tcagacccta aagcctgtgg atc 23

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

cattcagtgt tcgtgttgag ctatt 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

gaataatcag aatccaatgt ccagc 25

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

gacattggat tctgattatt caacttatga 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

acgagaaaaa aagtgtcaaa aactaatgtc 30

Claims

1.一种人呼吸道合胞病毒毒株，其中所述毒株为B亚型毒株，并且其保藏编号为CCTCCNO:V201821。

2.根据权利要求1所述的人呼吸道合胞病毒毒株，其中所述毒株的全基因序列为SEQID No.:1所示的序列。

3.根据权利要求1或2所述的人呼吸道合胞病毒毒株用于制备人呼吸道合胞病毒减毒株的应用。

4.根据权利要求1或2所述的人呼吸道合胞病毒毒株在制备用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其中所述药物为疫苗。

6.根据权利要求5所述的应用，其中所述药物为减毒活疫苗或蛋白组分疫苗。

7.一种抗体或杂交瘤细胞或抗血清，其中所述抗体或杂交瘤细胞或抗血清是以根据权利要求1或2所述的人呼吸道合胞病毒毒株作为免疫原对动物进行免疫而制备得到的。

8.根据权利要求7所述的抗体或杂交瘤细胞或抗血清，其中所述动物为小鼠或兔。

9.根据权利要求1或2所述的人呼吸道合胞病毒毒株在建立呼吸道合胞病毒感染的动物模型中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中所述人呼吸道合胞病毒毒株用作攻击毒株。