CN112877300A - 一种g4型欧亚类禽h1n1猪流感病毒灭活疫苗的制备 - Google Patents

一种g4型欧亚类禽h1n1猪流感病毒灭活疫苗的制备 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种重组流感病毒，重组流感病毒的负链RNA转录出与负链RNA互补的成套正链RNA，成套正链RNA包括HA‑RNA、NA‑RNA、PB2‑RNA、PB1‑RNA、PA‑RNA、NP‑RNA、M‑RNA和NS‑RNA；HA‑RNA为编码G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒HA的RNA；NA‑RNA为编码G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒NA的RNA；PB2‑RNA、PB1‑RNA、PA‑RNA、NP‑RNA、依次为编码流感病毒毒株中PB2的RNA、PB1的RNA、PA的RNA、NP的RNA；M‑RNA为编码流感病毒毒株M1和M2的RNA；NS‑RNA编码流感病毒毒株NS1和NS2的RNA。

Description

一种G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒灭活疫苗的制备
技术领域
本发明涉及疫苗研究领域，具体涉及一种G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒灭活疫苗的制备。
背景技术
流感病毒作为一种重要的人兽共患性病原，对人类公共卫生影响巨大。人类历史上一共经历了四次流感大流行，对人类社会的发展带来巨大的危害。猪可同时感染禽源、人源流感病毒，产生新型重排病毒，被认为是流感病毒的“混合器”；2009大流行流感病毒(pdm/09)的祖先病毒是猪源病毒，它的产生和流行说明猪流感病毒是可以引发重要人类公共卫生事件的病原，因此开展猪流感防控工作意义重大。已有研究表明，近年来出现的含有pdm/09病毒内部基因的G4基因型欧亚类禽H1N1猪流感病毒(以下简称G4型猪流感病毒)在我国猪群中已形成优势流行，它不仅引起猪群严重发病造成了养殖业的重大经济损失，猪场从业人员的感染阳性率也显著高于普通人群，表明G4型猪流感病毒具有形成人间流行的潜在威胁。
人H1N1流感病毒毒株A/PR/8/34(简称PR8)是一株鸡胚适应病毒株，能在鸡胚中有效地复制。PR8为单股负链、分节段的RNA，共有8个独立的 RNA片段组成，编码10种必需蛋白质和多种非必需蛋白。片段1-3编码RNA 依赖的RNA聚合酶，片段1编码聚合酶亚基PB2，片段2编码聚合酶亚基 PB1，片段3编码聚合酶亚基PA；片段4编码血凝素HA，是一种与病毒附着感染有关的表面糖蛋白；片段5编码核蛋白NP，是病毒RNA的主要结构部分；片段6编码神经氨酸酶NA，是一种包膜糖蛋白；片段7编码两种基质蛋白M1和M2，是非糖基化的结构蛋白；片段8编码两种非结构蛋白NS1 和NS2。
发明内容
因此，本发明提供一种重组流感病毒，所述重组流感病毒的基因组为单股负链、分节段的RNA，所述重组流感病毒的负链RNA转录出与所述负链 RNA互补的成套正链RNA，所述成套正链RNA包括HA-RNA、NA-RNA、 PB2-RNA、PB1-RNA、PA-RNA、NP-RNA、M-RNA和NS-RNA；
所述HA-RNA为编码G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒中HA的RNA；
所述NA-RNA为编码G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒中NA的RNA；
所述PB2-RNA为编码流感病毒毒株中PB2的RNA；
所述PB1-RNA为编码所述流感病毒毒株中PB1的RNA；
所述PA-RNA为编码所述流感病毒毒株中PA的RNA；
所述NP-RNA为编码所述流感病毒毒株中NP的RNA；
所述M-RNA为编码所述流感病毒毒株中M1和M2的RNA；
所述NS-RNA编码所述流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA。
可选的，所述编码G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒中HA的RNA为将 SEQ ID：NO：1所有T均替换为U，其它核苷酸均不变得到的序列；所述编码 G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒中NA的RNA为将SEQ ID：NO：2所有T 均替换为U，其它核苷酸均不变得到的序列；
所述流感病毒毒株为A/Puerto Rico/8/34(PR/8)。
一种制备重组病毒的方法，包括如下步骤：所述方法包括将编码HA-RNA 的DNA分子、编码NA-RNA的DNA分子、编码PB2-RNA的DNA分子、编码PB1-RNA的DNA分子、编码PA-RNA的DNA分子、编码NP-RNA的DNA 分子、编码M-RNA的DNA分子、编码NS-RNA的DNA分子共同导入宿主细胞，包装，即得到重组病毒。
可选的，所述编码HA-RNA的DNA分子，其核苷酸序列具体为SEQ ID： NO：1；所述编码NA-RNA的DNA分子其核苷酸序列具体为SEQ ID：NO： 2。
可选的，所述编码HA-RNA的DNA分子、编码NA-RNA的DNA分子、编码PB2-RNA的DNA分子、编码PB1-RNA的DNA分子、编码PA-RNA的 DNA分子、编码NP-RNA的DNA分子、编码M-RNA的DNA分子、编码NS-RNA 的DNA分子分别通过含有编码HA-RNA的DNA分子的重组载体、编码NA-RNA的DNA分子的重组载体、编码PB2-RNA的DNA分子的重组载体、编码PB1-RNA的DNA分子的重组载体、编码PA-RNA的DNA分子的重组载体、编码NP-RNA的DNA分子的重组载体、编码M-RNA的DNA分子的重组载体、编码NS-RNA的DNA分子的重组载体共同导入宿主细胞中。
可选的，所述宿主细胞为293T细胞。
一种G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒灭活疫苗，所述疫苗的活性成分为灭活重组病毒；所述重组病毒为权利要求1所述的重组病毒或权利要求 3-6任一所述的方法制备得到的重组病毒。
与权利要求上述的重组流感病毒相关的生物材料，为下述E1)至E2)中的任一种：
E1)编码权利要求1所述重组流感病毒的所述成套正链RNA的成套DNA分子；
E2)权利要求1所述的重组流感病毒的基因组；
E3)成套载体，由下述E3a)、E3b)、E3c)、E3d)、E3e)、E3f)、E3g) 和E3h)组成：
E3a)含有上述PB1-RNA的DNA分子的重组载体；
E3b)含有上述PB2-RNA的DNA分子的重组载体；
E3c)含有编码上述PA-RNA的DNA分子的重组载体；
E3d)含有编码上述NP-RNA的DNA分子的重组载体；
E3e)含有编码上述M-RNA的DNA分子的重组载体；
E3f)含有编码上述HA-RNA的DNA分子的重组载体；
E3g)含有编码上述NA-RNA的DNA分子的重组载体；
E3h)含有编码上述NS-RNA的DNA分子的重组载体；
E3)含有编码E1)所述成套DNA分子的重组微生物；
E4)含有E3)所述成套载体的重组微生物；
上述的重组病毒在制备流感疫苗中的应用；
可选的，所述流感疫苗具体为季节性H1N1、H3N2、pdm/09 H1N1或 H7N9禽流感病毒疫苗；
所述疫苗为单价疫苗、双价疫苗或三价疫苗；单价疫苗为G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒疫苗单价疫苗；双价疫苗或三价疫苗包含G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒疫苗。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供一种重组流感病毒，该病毒的构建以PR8病毒为骨架包含G4型猪流感病毒毒株的HA和NA基因，利用该重组病毒制备流感灭活疫苗，本发明同时对疫苗的安全性和免疫保护效果进行评价，来作为人的储备疫苗以应对G4型猪流感病毒可能引起的人类公共卫生事件。
2、本发明通过鸡胚传代制备疫苗主代种子批和工作种子批，按照《中国药典》的相关标准对种子批进行检定。对检定合格的工作种子批进行鸡胚大量繁毒，用终浓度为0.2％(v/v)的甲醛进行灭活，再进行超滤浓缩、纯化等程序制备灭活疫苗。将检定合格的灭活病毒原液与GEL 01佐剂混合后分别在第0d和第14d免疫6周龄Balb/c雌性小鼠，通过测定血清抗体水平和攻毒后体重变化、死亡情况、组织病理学变化、脏器病毒滴度等对其免疫保护作用进行评价。结果表明，成功拯救了以PR8为骨架包含G4型猪流感病毒毒株HA和NA基因重组病毒(rPR8-SW1204)，将重组病毒在鸡胚上连续传代15代，通过对不同代次HA、NA基因的序列比对显示重组病毒rPR8-SW1204在鸡胚中连续传代15代未发生突变，表明其遗传稳定性好；
通过对种子批进行检定病毒滴度、无菌检测、禽外源性病毒因子检测，病毒滴度为109.25EID50/mL，血凝效价为1:512，无菌检测和禽外源性病毒因子检测等各项指标均符合标准；
3、本发明提供一种G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒灭活疫苗，疫苗的活性成分为灭活重组病毒；重组病毒为上述的重组病毒或上述的方法制备得到的重组病毒。将疫苗免疫小鼠，将重组病毒灭活后添加水溶性佐剂 GEL 01制备成G4型病毒单价灭活疫苗，在小鼠体内进行免疫保护效力的评价。小鼠体内抗体检测结果显示，结果如图2所示：与PBS组相比，疫苗免疫组均产生较高的抗体水平，且差异显著，其中免疫SW1204/PR8+GEL 01组小鼠所产生的抗体水平高于SW1204/PR8+PBS组。
攻毒后体重变化和死亡情况如图3所示：在感染SW1204病毒后，PBS 组小鼠自第三天开始体重迅速下降，同时出现背毛颤栗，精神萎靡、发抖、虚弱无力临床症状，并在第7d出现死亡，而两组疫苗免疫组小鼠精神状态良好，行为活动均无明显异常，体重无明显下降，小鼠百分之百存活。
攻毒后肺脏组织病毒含量检测和病理学观察结果显示，免疫灭活疫苗能够有效抑制SW1204病毒在肺脏中的复制，减轻肺脏病理变化。
综上所述，本发明成功构建了以PR8为骨架包含G4型猪流感病毒毒株的HA和NA基因的重组病毒，并且制备出符合《国家药典》标准的流感灭活疫苗原液，与GEL 01佐剂混合后免疫小鼠，具有较好的免疫保护作用，有潜力作为候选疫苗应对G4型猪流感病毒可能引起的人类公共卫生安全事件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A为实施例3中不同代次rPR8-SW1204病毒基因突变频率；
图1B为实施例3中P1-P5、P10、P15代HA编码氨基酸序列比对示意图；
图1C为实施例3中P1-P5、P10、P15代NA编码氨基酸序列比对示意图；
图2是实施例4中的免疫后小鼠血清特异性抗体水平；**p<0.01, *p<0.05；
图3是实施例4攻毒后小鼠体重及存活率变化；A：攻毒后体重变化曲线；B：存活率曲线；在攻毒后14天内每天观察小鼠的临床症状，测量小鼠的体重变化情况，小鼠体重下降至原始体重的20％时，则将该小鼠判定为死亡，小鼠体重变化曲线为每组4只小鼠体重变化的平均值±SD；
图4是实施例4中攻毒后小鼠肺脏表面病理变化；
图5是实施例4中攻毒后5d肺脏HE染色图像；
图6是实施例4中攻毒后5d肺脏免疫组化图像；
图7是实施例4中组织脏器病毒滴度测定结果。
具体实施方式
下列实施例表1中的毒株，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
SW/HN/08/11(G1 EA H1N1)、SW/HB/T37/13(G1 EA H1N1)、SW/BJ/731/12 (G1 EAH1N1)、SW/LN/458/12(G1 EA H1N1)、SW/SD/1207/16(G4 EA H1N1) 、SW/JL/23/16(G4 EAH1N1)、SW/HLJ/1214/16(G4 EA H1N1)、SW/SD/0334/17 (G4 EA H1N1)、SW/HLJ/0140/17(G4EA H1N1)、A/Michigan/45/2015在Sun, H.；Xiao,Y.；Liu,J.；Wang,D.；Li,F.；Wang,C.；Li,C.；Zhu,J.；Song, J.；Sun,H.；et al.Prevalent Eurasian avian-like H1N1 swineinfluenza virus with 2009pandemic viral genes facilitating humaninfection.Proc. Natl.Acad.Sci.USA 2020,117,17204–17210.中公开过。
实施例1G4型猪流感病毒抗原性分析
通过以4株G1型欧亚类禽H1N1猪流感病毒即G1 EA H1N1病毒、6 株G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒即G4 EA H1N1病毒以及一株Pdm/09 病毒(A/Michigan/45/2015)作为抗原，分别与G1 EA H1N1、G4 EA H1N1 和pdm/09 H1N1病毒制备的抗血清进行了血凝抑制试验(HI)，见表1。抗血清均按照常规实验方法制备。结果显示，G4 EA H1N1病毒与G1 EA H1N1及pdm/09 H1N1的血凝抑制滴度均较低，形成相对独立的抗原群，这提示G4 EA H1N1的抗原性已经发生了显著的变化，针对G1 EA H1N1 和pdm/09 H1N1的中和抗体很可能已经无法提供对G4 EA H1N1病毒的保护。基于抗原性结果，选择病毒SW/IM/1204/20作为疫苗候选毒株，进行重组病毒的构建。
表1甲型H1N1 SIV病毒的HI抗原分群
Figure RE-GDA0002990340170000081
实施例2重组流感病毒的拯救
SEQ ID NO：1所示的DNA分子为SW/IM/1204/20毒株的HA基因；
SEQ ID NO：2所示的DNA分子为SW/IM/1204/20毒株NA基因。
1、重组载体的构建
在载体pHW2000的StuⅠ识别序列间插入SW1204-HA(SEQ ID NO： 1所示的DNA分子)，得到的重组质粒命名为：pHW2000-SW1204-HA；
在载体pHW2000的StuⅠ识别序列间插入SW1204-NA(SEQ ID NO： 2所示的DNA分子)，得到的重组质粒命名为：pHW2000-SW1204-NA。
在载体pHW2000的StuⅠ识别序列间插入A/Puerto Rico/8-1/1934的PB2基因(genbank编号：NC_002023.1)的CDS区，得到的重组质粒命名为：pHW2000-PB2。
在载体pHW2000的StuⅠ识别序列间插入A/Puerto Rico/8-1/1934的 PB1基因(genbank编号：NC_002021.1)的CDS区，得到的重组质粒命名为：pHW2000-PB1。
在载体pHW2000的StuⅠ识别序列间插入A/Puerto Rico/8-1/1934的 PA基因(genbank编号：NC_002022.1)的CDS区，得到的重组质粒命名为： pHW2000-PA。
在载体pHW2000的StuⅠ识别序列间插入A/Puerto Rico/8-1/1934的 NP基因(genbank编号：NC_002019.1)的CDS区，得到的重组质粒命名为： pHW2000-NP。
在载体pHW2000的StuⅠ识别序列间插入A/Puerto Rico/8-1/1934的 M基因(genbank编号：NC_002016.1)，得到的重组质粒命名为：pHW2000-M。
在载体pHW2000的StuⅠ识别序列间插入A/Puerto Rico/8-1/1934的 NS基因(genbank编号：NC_002020.1)，得到的重组质粒命名为：pHW2000-NS。
2、重组流感病毒的拯救
向无菌EP管中加入200μL jetPRIME buffer，然后按顺序加入待拯救的重组病毒的八种质粒(步骤1的pHW2000-SW1204-HA、 pHW2000-SW1204-NA、pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、 pHW2000-NP、pHW2000-M和pHW2000-NS)，每种500ng，震荡混合后瞬离；然后再加入8μL的jetPRIME转染试剂(购买自Polyplus)，震荡混匀后瞬离；在室温下反应15min；共转染到293T细胞中，于37℃，5％CO2 培养箱中培养4-6h，吸弃细胞上清，用PBS清洗细胞1-2次。于每孔中加入1mL含有TPCK-胰酶的OPTI-MEM，TPCK-胰酶的终浓度在2.0 μg/mL；将此六孔板于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。将每孔中的液体用注射器混匀数次，待细胞全部悬浮后将细胞悬液接种9日龄SPF鸡胚， 0.5mL细胞悬液/胚，将接种后的鸡胚在35℃培养72h，收获尿囊液，测定其红细胞活性，有血凝活性的尿囊液含有拯救成功的重组流感病毒(命名为rPR8-SW1204)，病毒滴度为109.5EID50/mL；通过测序验证与原病毒株对比，重组病毒(rPR8-SW1204)的HA基因和NA基因未发生突变。
实施例3 G4型猪流感疫苗株的传代研究与种子批的建立
1、主代种子批和工作种子批制备
(1)主代种子批制备
将稀释倍数为10-3的重组病毒液(实施例2中的有血凝活性的鸡胚尿囊液)接种9日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml；将接种后的鸡胚在35℃培养72h 后，筛选活鸡胚在4℃冻胚4h以上，收获尿囊液作为为主代种子批。
(2)工作种子批制备
将稀释倍数为10-3的主代种子批病毒液接种9日龄SPF鸡胚，每胚 0.1ml；将接种后的鸡胚在35℃培养72h后，筛选活鸡胚在4℃冻胚4h以上，收获尿囊液作为为工作种子批。
2、传代病毒遗传稳定性的测定
将主代种子批病毒在鸡胚上连续传十五代，并对主代种子批病毒，第 1～5、10、15代病毒进行全基因组测序。利用MEGA软件进行不同代次之间HA和NA的序列比对，经过分析在第1-15代重组病毒HA和NA基因未发生任何核苷酸、氨基酸位点的变异，稳定性好，具体见图1。
3、主代种子批和工作种子批纯净性检定
以检定合格的重组病毒rPR8-SW1204为基础，通过在SPF鸡胚上传代获得主代种子批和工作种子批，至成品疫苗病毒总传代不超过五代。按照《中国药典》2015年版的规定对种子批毒株进行检定，其中主代种子批病毒的检定指标包括：鉴别实验、病毒滴度、血凝效价、无菌检测、支原体检测、外源性禽白血病病毒因子检测、外源性禽腺病病毒因子检测；工作种子批病毒的检定指标包括：鉴别实验、病毒滴度、血凝效价、无菌检测、支原体检测，检测结果如表2、3所示。
表2主代种子批检定结果
Figure RE-GDA0002990340170000111
表3工作种子批检定结果
Figure RE-GDA0002990340170000112
经检定，主代种子批和工作种子批在病毒滴度、血凝效价、纯净性均符合《中国药典》2015年版所规定的的标准，可以应用于灭活疫苗的生产。
实施例4灭活疫苗的制备和免疫保护效果评价
4.1灭活疫苗的制备
(1)重组流感病毒(rPR8-SW1204)的接种与培养
将稀释倍数为10-3的重组流感病毒液(即为实施例2中的有血凝活性鸡胚尿囊液)接种9日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml；将接种后的鸡胚在35℃培养72h后，筛选活鸡胚在4℃冻胚4h以上，收获尿囊液；再进行病毒滴度、血凝滴度以及纯净性检定，检测合格的病毒液进行下一步操作。
(2)病毒收获液的过滤与浓缩
将收获后的病毒液首先用10μm的滤膜粗滤后，再用0.45μm的滤膜过滤两次，然后用截留分子质量为1000kD的超滤膜进行过滤和浓缩，最后用 0.01mol/L的PBS溶液进行浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/L的磷酸盐缓冲液回收病毒。
(3)病毒纯化
使用蔗糖速率区带离心的方法进行病毒纯化。分别用30％(质量分数) 和55％(质量分数)的蔗糖作为蔗糖密度梯度，以30000r/min的速度在蔗糖溶液中区带离心3h。
(4)病毒灭活
将纯化后的鸡胚尿囊液用终浓度0.2％(v/v)的甲醛在4℃下灭活48h (每12h混匀一次)，并进行病毒灭活检测。
(8)抗原与佐剂的混合
根据所配制的半成品的量计算原液用量，使用前加入5％(v/v)的佐剂混匀后所得即为半成品。所使用的疫苗佐剂是赛彼科公司生产的GEL 01。
4.2病毒灭活验证
将灭活后的病毒液作10倍倍比稀释，取原液、10-1、10-2倍稀释的病毒液接种9日龄鸡胚尿囊腔，每组接种10枚鸡胚，每胚接种0.2ml，在35℃培养72h。每组鸡胚的存活率均在80％以上，自存活的鸡胚中取0.5ml鸡胚尿囊液，按组混合后，再盲传一代，每组接种10枚鸡胚，每胚接种0.2ml，在35℃培养72h，取尿囊液进行血凝试验，结果如下表所示：
表4病毒灭活验证结果
Figure RE-GDA0002990340170000131
4.3灭活病毒原液检定
按照人用流感疫苗的一般制备流程和获得上市许可人用流感疫苗的标准制备重组病毒灭活疫苗。按照《中国药典》2015版相关规定对灭活病毒原液进行型别鉴定、血凝素含量、蛋白质含量、无菌检测(分为胰酪大豆胨液体培养基和硫乙醇酸盐流体培养基)相关指标的检测，检测结果如表5 所示。
表5灭活原液检定结果
Figure RE-GDA0002990340170000132
经检定，灭活病毒原液无菌检测、型别鉴定、血凝素含量和蛋白质含量各项指标均符合《中国药典》2015版相关规定，可用于后续免疫保护性试验实验动物的免疫。
4.4小鼠试验验证疫苗免疫保护效果
选取6周龄健康的雌性BALB/c小鼠30只，随机分为3组，每组10 只，按照表6的分组均按常规颈部皮下注射免疫相应成分(100μl/只)。两周后进行二次免疫，初次免疫后第7d、14d、21d、28d采血分离血清检测抗原特异性IgG抗体水平，第28天攻106TCID50 SW/IM/1204/20病毒/只，观察感染后14天小鼠的精神状态、体重变化、存活情况，分别在感染后第 3d和第5d剖检取肺脏进行病毒滴度测定、病理组织变化的观察。
表6小鼠试验分组情况
Figure RE-GDA0002990340170000141
注：SW1204/PR8指的是经检定合格的灭活重组病毒液。
4.4.1小鼠血清特异性IgG抗体水平的检测
(1)在初次免疫前收集小鼠的空白血清作为对照，在初次免疫后的第 7天、14天，二次免疫后的第7天、14天分别采血。
(2)将采集的免疫4周后每组的小鼠血液于室温静置2h，再将血液放入4℃静置过夜后，在4℃离心机中3000rpm离心15min，收集离心后的上清液即为小鼠血清样品。
(3)利用建立的标准ELISA方法检测小鼠血清特异性IgG抗体水平。
(4)使用SPSS软件进行数据分析，P<0.05差异有统计学意义。
标准ELISA方法：按照以下操作步骤进行间接ELISA实验：
1)包被抗原：用0.05M碳酸盐溶液(pH9.6)稀释SW/IM/1204/20病毒为106TCID50/100μL，每孔加100μl稀释病毒液，4℃包被过夜。
2)洗涤：弃去孔内液体，每孔加入300μL的PBST，室温洗涤3次，每次3min，弃去液体。
3)封闭：每孔加入300μl封闭液，37℃温箱内封闭1h。
4)洗涤：弃去孔内液体，每孔加入300μl的PBST，室温洗涤3次，每次3min，弃去液体。
5)孵育一抗：将待检血清1:100倍稀释后每孔100μl加入，37℃温箱孵育1h。
6)洗涤：弃去孔内液体，每孔加入300μl的PBST，室温洗涤3次，每次3min，弃去液体。
7)孵育二抗：将HRP标记的羊抗鼠IgG(碧云天)按1:8000倍稀释后每孔100μl加入，37℃温箱孵育1h。
8)洗涤：弃去孔内液体，每孔加入300μl的PBST，室温洗涤3次，每次3min，弃去液体。
9)TMB显色：每孔100μl加入TMB显色液(索莱宝)，室温避光显色15min。
10)终止：每孔加入50μl的2M硫酸溶液终止显色，5min内用酶标仪读数。
11)读数：用酶标仪在450nm波长检测OD值。
12)数据处理：阴阳性临界值＝阴性血清OD平均值+3SD(标准差，最终概率为99％)，若样品的OD450nm值≥阴阳性临界值，判定为阳性，否则为阴性。
检测小鼠血清特异性IgG抗体水平，结果如图2所示：与PBS组相比，疫苗免疫组均产生较高的抗体水平，且差异显著，其中免疫SW1204/PR8+GEL 01组小鼠所产生的抗体水平高于SW1204/PR8+PBS组。
4.4.2攻毒保护试验
(1)小鼠死亡率和体重变化
在感染病毒后的14天内，每日称量小鼠体重，观察临床症状，当小鼠体重下降程度超过原体重20％时，判定其死亡。攻毒后体重变化和死亡情况如图3所示：在感染SW1204病毒后，PBS组小鼠自第三天开始体重迅速下降，同时出现背毛颤栗，精神萎靡、发抖、虚弱无力临床症状，并在第7d出现死亡，而两组疫苗免疫组小鼠精神状态良好，行为活动均无明显异常，体重无明显下降，小鼠百分之百存活。
(2)肺脏病变观察
在攻毒后第3d、5d每组分别取三只小鼠剖检，在剖检时观察肺脏的大体病变并拍照记录；将所采集小鼠的部分肺脏样品，固定于4％多聚甲醛组织固定液(碧云天)中，进行HE染色与免疫组织化学染色。
根据图4的结果可以观察到在感染后第3天(即图中3d)各组小鼠肺脏表面均无明显病变，在感染后第5天(即图4中5d)SW1204/PR8+GEL 01 组小鼠和SW1204/PR8+PBS组肺脏表面无明显病变，PBS组小鼠肺脏出现部分区域淤血实变(图中箭头所指部分)。
肺脏组织病理学观察HE染色结果显示SW1204/PR8+GEL 01免疫组肺脏未出现明显病变；SW1204/PR8+PBS组肺脏表现出支气管上皮细胞脱落， PBS对照组表现出严重的支气管肺炎，肺泡壁增厚，浸润大量炎性细胞，并伴有局部出血，见图5。
免疫组化结果显示SW1204/PR8+GEL 01免疫组肺脏未检测到流感病毒阳性信号；SW1204/PR8+PBS组肺脏在支气管上皮细胞检测到少量流感病毒阳性信号，PBS对照组小鼠肺脏支气管上皮细胞内有大量病毒抗原阳性信号，见图6。
(3)组织脏器病毒滴度测定
将采集的鼻甲和肺脏组织样品称重后加入3倍重量的无菌PBS溶液研磨，研磨后在4℃条件下8000rpm离心10min，离心后，每份吸取上清液进行EID50定量试验，测定病毒滴度。在感染后第3d和第5d，PBS组小鼠肺脏和鼻甲组织均分离到较高滴度的流感病毒，SW1204/PR8+PBS组小鼠在感染后第3d从鼻甲和肺脏组织中分离到病毒，在第5d未分离出病毒，而SW1204/PR8+GEL 01组小鼠在感染后第3d、5d鼻甲和肺脏组织中均未分离出病毒(见图7)，表明疫苗免疫对抵抗G4型流感病毒的感染和复制有良好的保护作用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<120> 一种G4型欧亚类H1N1禽猪流感病毒灭活疫苗的制备
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1701
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggaagcaa gattatttgt attattctgt gcattcacta cactaaaagc tgacaccatt 60
tgtgtaggct accatgccaa caattccaca gacactgtcg acacaatatt ggagaagaat 120
gtgactgtta cccattcagt taatttactg gaaaacagcc ataatggaaa actctgcagc 180
ctgaatggac agattccatt acaactggga aactgcaacg tagcaggatg gatccttggc 240
aacccagaat gtgacttgct actcacagcg aattcgtggt cttacataat agagacttca 300
aattcaaaaa atggagcatg ctaccccgga gaatttgctg attatgaaga gttaaaggag 360
cagctgagtg cagtttcttc atttgaaaga tttgaaattt tcccaaaggc atcctcatgg 420
ccaaaccatg ataccaccag aggtaccacg gttgcatgct cccactctgg agccaacagc 480
ttttatcgga atttactatg gatagtaaag aaaggaaacg cctatcctaa gctaagcaag 540
tcatacacaa acaataaggg aaggaaagtg cttgtaatct ggggagtgca ccaccctccg 600
accgacagtg accaacaaac cctctaccag aataatcata catatatttc agttggatca 660
tcaaaatact acaaaaggtt cacaccagaa atagtagcaa gacctaaagt cagagaacaa 720
gcaggcagaa tgaattatta ctggacactg ttagatcaag gggacaccat aacgtttgaa 780
gccactggga atttaatagc accatggcat gcatttgcat tgaaaaaagg ctctagctct 840
ggaattatga ggtcggatgt ccaggttcac aattgcacta caaagtgcca aactccccat 900
ggggccttaa agggcaatct tccttttcag aatgtacatc ccgtcactat tggaaattgc 960
cccaaatatg ttaaaagcac ccaactgagg ctggcgacag gactaaggaa catcccctct 1020
attcaatcta gaggactttt cggggcaatt gccggattca ttgaaggagg atggacagga 1080
atggtagatg gatggtatgg atatcaccat cgaaatgagc aaggatccgg ttacgcagca 1140
gatcagaaaa gcacacagac tgcaattgat gggataagca acaaagtgaa ctcagtgatt 1200
gaaaaaatga acattcaatt tgcttcagtg ggcaaggagt tcaatagtct agagaaaagg 1260
atggaaaatt tgaataagaa ggttgatgat gggtttttgg atgtatggac atataacgct 1320
gagttgctca ttttacttga gaatgaaaag actctagact tccatgacct taacgtaaaa 1380
aatttatatg aaaaagtcaa atcacaacta aggaacaatg ccagggaaat tggaaatggc 1440
tgctttgagt tctatcacaa atgtgacaat gagtgcatgg agagcgtaaa gaatggcaca 1500
tacaattatc ccaaatattc agaagaatcc aagttgaata gggaagaaat agatggtgtg 1560
aagctagaat caatgggaat tcaccagatt ttggcgatct actccacagt cgccagttcc 1620
ctagtcttat tagtctccct gggggcagtc agcttctgga tgtgttctaa tgggtcattg 1680
cagtgcagaa tatgcattta a 1701
<210> 2
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaatccaa atcagaagat aataaccatt ggttcgatct gtgtgacaat tggaatagcc 60
agcttgatac tacaaattgg aaacataata tcgatatgga ttagccactc aattcaaatt 120
gagaataaaa atcagtctga aatatgcaat caaaacatca ttacttacga aaacaacact 180
tgggtcaacc agacatatgt taacgtcagc aacaccaatt ttgttgctga acaggcaata 240
gcttcagtga aattagcggg caattcccct ctctgtcctg ttagtggatg ggctatatac 300
agtaaagata atagtgtacg aataggttcc aggggggatg tttttgtcat aagggagcca 360
ttcatttcat gctcccactt ggaatgcaga actttcttct taactcaagg ggcccttctg 420
aacgacaagc attctaacgg aacaattaaa gacaggagcc cttatcgaac attgatgagc 480
tgtcctattg gtgaggttcc ttctccatat aactcaaggt ttgaatcagt cgcttggtca 540
gcaagtgcct gccatgatgg cacaagttgg ctaacaattg gaatttctgg cccagataat 600
ggggcagtgg cagtgctgaa atacaatggc ataataatag acactatcaa gagttggaga 660
aagaacatat taagaacaca agagtctgaa tgtgcatgca ttaatggttc ttgttttaca 720
gtaatgactg atggaccaag taatgggcag gcctcgtaca agatttttaa gatagaaaag 780
gggaaagtag tcaaatcagt tgagttagat gcccctaatt atcactatga ggaatgctcc 840
tgttatcctg aatctagtga aatcatgtgt gtgtgtagag ataattggca tgggtcaaat 900
cggccatggg tgtcatttaa tcagaatctg gaatatcaaa taggatacat atgtagtggg 960
attttcggag ataatccacg gcctaatgat aaaacaggca gttgtggtcc agtatcactg 1020
aatggggcaa atggagtaaa aggattttca tttaaatacg gcaatggtat ttggataggg 1080
agaactaaaa gcactagttc aaggatgggt tttgagatga tttgggatcc ggatggatgg 1140
accagaacaa atgataaatt ctcagtaaag caagatatca taggaatagc tgattggtca 1200
ggctacagtg gaagttttgt tcaacacccg gaactgaccg gactggactg tatgagacct 1260
tgtttttggg ttgaactaat cagagggcga cccaaagaga acacaatctg gactagcggg 1320
agtagcatat ccttttgtgg tgtaaatggt gacacagtgg gttggtcttg gccagacggt 1380
gctgagctgc ccttcaccat tgacaagtaa 1410

Claims (10)

1.重组流感病毒，其特征在于，所述重组流感病毒的基因组为单股负链、分节段的RNA，所述重组流感病毒的负链RNA转录出与所述负链RNA互补的成套正链RNA，所述成套正链RNA包括HA-RNA、NA-RNA、PB2-RNA、PB1-RNA、PA-RNA、NP-RNA、M-RNA和NS-RNA；
所述HA-RNA为编码G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒中HA的RNA；
所述NA-RNA为编码G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒中NA的RNA；
所述PB2-RNA为编码流感病毒毒株中PB2的RNA；
所述PB1-RNA为编码所述流感病毒毒株中PB1的RNA；
所述PA-RNA为编码所述流感病毒毒株中PA的RNA；
所述NP-RNA为编码所述流感病毒毒株中NP的RNA；
所述M-RNA为编码所述流感病毒毒株中M1和M2的RNA；
所述NS-RNA编码所述流感病毒毒株中NS1和NS2的RNA。
2.根据权利要求1所述的重组流感病毒，其特征在于，所述编码G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒中HA的RNA为将SEQ ID：NO：1所有T均替换为U，其它核苷酸均不变得到的序列；所述编码G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒中NA的RNA为将SEQ ID：NO：2所有T均替换为U，其它核苷酸均不变得到的序列；
所述流感病毒毒株为A/Puerto Rico/8/34(PR/8)。
3.一种制备重组病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：所述方法包括将编码HA-RNA的DNA分子、编码NA-RNA的DNA分子、编码PB2-RNA的DNA分子、编码PB1-RNA的DNA分子、编码PA-RNA的DNA分子、编码NP-RNA的DNA分子、编码M-RNA的DNA分子、编码NS-RNA的DNA分子共同导入宿主细胞，包装，即得到重组病毒；所述编码HA-RNA的DNA分子，其核苷酸序列具体为SEQ ID：NO：1；所述编码NA-RNA的DNA分子其核苷酸序列具体为SEQ ID：NO：2。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
所述编码HA-RNA的DNA分子、编码NA-RNA的DNA分子、编码PB2-RNA的DNA分子、编码PB1-RNA的DNA分子、编码PA-RNA的DNA分子、编码NP-RNA的DNA分子、编码M-RNA的DNA分子、编码NS-RNA的DNA分子分别通过含有编码HA-RNA的DNA分子的重组载体、编码NA-RNA的DNA分子的重组载体、编码PB2-RNA的DNA分子的重组载体、编码PB1-RNA的DNA分子的重组载体、编码PA-RNA的DNA分子的重组载体、编码NP-RNA的DNA分子的重组载体、编码M-RNA的DNA分子的重组载体、编码NS-RNA的DNA分子的重组载体共同导入宿主细胞中。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特性在于，所述宿主细胞为293T细胞。
6.一种G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗的活性成分为灭活重组病毒；所述重组病毒为权利要求1所述的重组病毒或权利要求3-5任一所述的方法制备得到的重组病毒。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括佐剂；可选的，所述佐剂为水溶性佐剂；
或，所述疫苗的剂型为注射剂。
8.与权利要求1所述的重组流感病毒相关的生物材料，为下述E1)至E2)中的任一种：
E1)编码权利要求1所述重组流感病毒的所述成套正链RNA的成套DNA分子；
E2)权利要求1所述的重组流感病毒的基因组；
E3)成套载体，由下述E3a)、E3b)、E3c)、E3d)、E3e)、E3f)、E3g)和E3h)组成：
E3a)含有编码权利要求1所述PB1-RNA的DNA分子的重组载体；
E3b)含有编码权利要求1所述PB2-RNA的DNA分子的重组载体；
E3c)含有编码权利要求1所述PA-RNA的DNA分子的重组载体；
E3d)含有编码权利要求1所述NP-RNA的DNA分子的重组载体；
E3e)含有编码权利要求1所述M-RNA的DNA分子的重组载体；
E3f)含有编码权利要求1所述HA-RNA的DNA分子的重组载体；
E3g)含有编码权利要求1所述NA-RNA的DNA分子的重组载体；
E3h)含有编码权利要求1所述的NS-RNA的DNA分子的重组载体；
E3)含有编码E1)所述成套DNA分子的重组微生物；
E4)含有E3)所述成套载体的重组微生物。
9.权利要求1中所述的重组病毒或在制备流感疫苗中的应用。
10.根据权利要求6所述疫苗或权利要求9所述应用，其特征在于，
所述流感疫苗具体为季节性H1N1、H3N2、pdm/09H1N1或H7N9禽流感病毒疫苗；
所述疫苗为单价疫苗、双价疫苗或三价疫苗；单价疫苗为G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒疫苗单价疫苗；双价疫苗或三价疫苗包含G4型欧亚类禽H1N1猪流感病毒疫苗。
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