WO2020166524A1 - 増殖方法 - Google Patents

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WO2020166524A1
WO2020166524A1 PCT/JP2020/004930 JP2020004930W WO2020166524A1 WO 2020166524 A1 WO2020166524 A1 WO 2020166524A1 JP 2020004930 W JP2020004930 W JP 2020004930W WO 2020166524 A1 WO2020166524 A1 WO 2020166524A1
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leu
influenza virus
lys
pro
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慎太郎 大西
卓也 森
鈴木　隆
佑希 紅林
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花王株式会社
静岡県公立大学法人
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    • C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a method for propagating influenza virus in a host.
  • Flu is an infectious disease caused by the influenza virus, which is a respiratory infection that is infected by droplet infection, contact infection, etc., and has strong systemic symptoms such as high fever, headache, myalgia, and arthralgia.
  • Vaccination with influenza vaccine is the best way to prevent the severity of influenza.
  • the influenza vaccine is prepared by inoculating the influenza virus for vaccine production into the allantoic cavity of embryonated chicken eggs, culturing and proliferating, concentrating and purifying by centrifugation from chorioallantoic fluid, treating the viral particles with a surfactant, etc., and using formalin. It is a split vaccine or subunit vaccine in which inactivated whole particle vaccine or virus particles are crushed with ether or a surfactant and then further purified.
  • an influenza vaccine is produced by using an egg having an embryo as a host, it takes time, labor and cost, and there is a problem in terms of supply stability that rapid mass production cannot be performed.
  • Non-patent document 1 As an alternative virus production method, a method of replicating using a cultured cell as a host of influenza virus has been studied, and it has been reported that MDCK cells are suitable cells for influenza virus replication in vitro.
  • Non-patent document 1 After removing or reducing the trypsin inhibitor secreted in the culture solution of MDCK cells, the cells are inoculated with influenza virus and the influenza virus inoculated cells are cultured to increase the virus production amount. It is disclosed that this can be done.
  • Non-Patent Document 2 discloses that avian influenza virus (A/Bratislava/79(H7N7)) is transported to the outside of the nucleus by utilizing a biological defense function (apoptosis) and efficiently increases. It has been suggested that the proliferation of viruses involves apoptosis of cultured cells.
  • Patent Document 1 International Publication No. 2007/132763
  • Non-Patent Document 1 Med Microbiol Immunol (1975) 162, 9-14
  • the present invention relates to the following 1) to 5).
  • 1) A method of propagating influenza virus in a host which comprises the step of suppressing the translocation of Bax of the host cell to the inner mitochondrial membrane.
  • 2) A method for preparing influenza virus particles which comprises growing the influenza virus by the method of 1) and collecting virus particles from the host.
  • Influenza virus HA titers under various Bax inhibitor concentration conditions Time-dependent influenza virus HA titers under Bax inhibition conditions. Influenza virus growth promoting effect under Bax inhibition conditions. Influenza virus HA titer under low Bax inhibitor concentration conditions. Effect of promoting influenza virus growth under conditions of low concentration of Bax inhibitor. Influenza B virus HA titer under Bax inhibitor concentration conditions. Effect of influenza B virus growth promotion under Bax inhibitor concentration conditions. Effect of promoting influenza virus growth under Bax inhibition conditions (embryo eggs).
  • the present invention relates to providing a method for more efficiently growing an influenza virus, which is a material for a vaccine, in a host.
  • the present inventors have found that, in a host infected with influenza virus, when Bax, which is known as an apoptosis-promoting protein, is suppressed from translocating to the inner mitochondrial membrane to suppress apoptosis, unlike the previous report. It was found that the proliferation of the virus was improved and the production amount of the virus was increased.
  • the influenza virus can be efficiently propagated, and the influenza virus for vaccine preparation can be mass-produced.
  • influenza virus may be any of A type, B type, C type, and D type, and A type and B type can be preferably exemplified.
  • type of influenza virus hemagglutinin (HA: haemagglutinin) (HA type) and neuraminidase type (NA type) are not particularly limited.
  • subtypes such as H1N1 strain, H2N2 strain, H3N2 strain, H4N2 strain, H4N6 strain, H5N1 strain, H5N2 strain, H7N7 strain, H7N9 strain, and H9N2 strain, they will be isolated and identified in the future. Subtypes are also included.
  • the target virus may be any virus as long as it can infect humans, and may have the ability to infect pigs, birds, horses, and cows.
  • influenza virus of the present invention may be a strain isolated from an infected individual such as an infected animal or a patient, or may be a recombinant virus genetically engineered in a cultured cell.
  • Bax refers to an apoptosis promoting protein belonging to the Bcl-2 family. Proteins belonging to the Bcl-2 family have at least one amino acid sequence called BH (Bcl-2 homology) domain. Further, since it has a highly hydrophobic TM (transmembrane) region on the C-terminal side, it can be transferred to the mitochondrial membrane and control apoptosis.
  • BH Bcl-2 homology
  • Bcl-2 family proteins The main function of Bcl-2 family proteins is the regulation of apoptosis by regulating mitochondrial permeability.
  • the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xL are located on the outer wall of mitochondria and inhibit the release of cytochrome c.
  • the pro-apoptotic proteins Bad, Bid, Bax and Bim are cytoplasmic and translocate to the inner mitochondrial membrane by cell death signals, where they promote cytochrome c release. It is thought that extracellular cytochrome c forms a complex with Apaf-1, activates caspase 9, and further activates caspases 3, 6, and 7 to cause apoptosis (Annu Rev Genet ( 2009) 43:95-118).
  • “suppression of translocation of Bax to the inner mitochondrial membrane” refers to suppression of translocation of Bax from the cytoplasm to the inner mitochondrial membrane due to signal transduction that occurs in the cell during the process of viral infection to release.
  • the suppressing means is not particularly limited as long as it can suppress the migration of Bax existing in the host cytoplasm to the inner mitochondrial membrane.
  • a molecule that interacts with Bax to suppress mitochondrial translocation of Bax referred to as “Bax inhibitor”
  • Bax inhibitor a molecule that interacts with Bax to suppress mitochondrial translocation of Bax
  • the Bax inhibitor is an influenza virus growth promoter for growing the influenza virus by culturing the host, and can be used for growing the influenza virus by culturing the host. It can also be said that the Bax inhibitor can be used for producing an influenza virus growth promoter.
  • the Bax inhibitor is preferably a peptide or compound that inhibits the binding of Ku70 protein and Bax necessary for translocation of Bax to the inner mitochondrial membrane, and examples thereof include Biochem Biophys Res Commun (2004) 321:961-. 966) and Nat Cell Biol (2003) 5:352-357).
  • Val-Pro-Met-Leu-Lys SEQ ID NO: 1
  • Pro-Met-Leu-Lys-Glu SEQ ID NO: 2
  • Val-Thr-Leu-Lys SEQ ID NO: 3
  • Val-Pro-Ala-Leu-Arg SEQ ID NO: 4
  • Val-Pro-Ala-Leu-Lys SEQ ID NO: 5
  • Pro-Ala-Leu-Lys-Asp sequence
  • No. 6 Val-Ser-Ala-Leu-Lys (SEQ ID NO: 7), Ser-Ala-Leu-Lys-Asp (SEQ ID NO: 8) and the like.
  • the Bax inhibitory effect of such a Bax inhibitor can be evaluated, for example, by measuring the binding inhibitory activity between Bax and Ku70 protein. In addition, it can be evaluated by inducing apoptosis in the cells under the condition that the Bax inhibitor is added and evaluating the ratio of the apoptotic cells.
  • the Bax inhibitor has a concentration of 1 ⁇ M or more, preferably 5 ⁇ M or more, more preferably 10 ⁇ M or more and 1000 ⁇ M or less, with respect to a host for growing influenza virus (A type, B type, C type, D type). It is preferably used at 500 ⁇ M or less, more preferably 200 ⁇ M or less, and 1 to 1000 ⁇ M, preferably 5 to 500 ⁇ M, more preferably 10 to 200 ⁇ M.
  • the growth of influenza virus is specifically carried out by the steps of infecting a host with influenza virus and culturing the infected host under conditions in which the virus can replicate.
  • the Bax mitochondria are used.
  • the step of suppressing transfer to the inner membrane is performed, for example, before virus infection, after virus infection, or simultaneously with virus infection.
  • the Bax inhibitor is added to the host before, after, or simultaneously with the viral infection.
  • the host used for the growth of influenza virus may be either cultured cells or embryonated chicken eggs, but it is preferable to use cultured cells from the viewpoint of supply stability.
  • the cultured cells any cells can be used as long as they are susceptible to influenza virus. Examples of such cells include MDCK cells (cell lines derived from dog kidney), Vero cells (cell lines derived from African green monkey kidney), PER. Examples include C6 (human retinal cell-derived cell line), SK-NEP-1 cell (human kidney-derived cell line), A549 (human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cell), and Duck embryo cell (duck embryo cell).
  • CEF cells Chicken embryonic fibroblast cells
  • the CEF cells include cells present in embryonated chicken eggs in addition to the isolated cells.
  • a cell line developed to efficiently grow the influenza virus can also be used for the growth of the influenza virus. Examples of such cell lines include, but are not limited to, EB66 (registered trademark), DuckCelt-T17 (registered trademark), and EBx (registered trademark).
  • the medium for culturing the cell is a medium usually used for cell culture, for example, fetal bovine serum (FBS)-containing MEM medium (Wako), serum-free medium (Serum-Free). Medium) (manufactured by ThermoFisher) and the like can be mentioned, but any of them may be used.
  • FBS fetal bovine serum
  • Wako serum-free medium
  • ThermoFisher manufactured by ThermoFisher
  • non-essential amino acids and L-glutamine can be added to the medium.
  • a protease such as trypsin or acetylated trypsin can be added for the purpose of promoting the cleavage of hemagglutinin.
  • antibiotics generally used for cell culture such as penicillin, streptomycin, and gentamicin may be added to avoid contamination of microorganisms.
  • the pH of the medium is adjusted to 6.5 to 8, preferably 6.8 to 7.3, which is suitable for the growth of animal cells, with an appropriate buffer (eg, sodium hydrogen carbonate, HEPES).
  • Cell culture methods include static culture in which cells are attached to the bottom of the incubator, and floating culture in which cells are suspended and cultured in a medium, but suspension culture is preferable when performed at an industrial production level.
  • Examples of the method of suspension culture include a method of attaching cells to a carrier such as a microcarrier and suspending and culturing the cells, or a method of suspending and culturing the cells without using a carrier. You may use.
  • the cell culture (mixture of cultured cells and medium) can be used as it is for inoculation of influenza virus.
  • fresh medium or an appropriate buffer such as PBS or Tris buffer is used. It is preferred that the cells be washed. Specifically, cells grown in culture in a spinner flask or the like are subjected to low-speed centrifugation or membrane filtration to separate the cells and culture supernatant, and a fresh medium is added to the cells of the centrifugal sediment or membrane filtration concentrate to suspend the cells. By doing so, the medium is exchanged.
  • the influenza virus solution is added to the cell culture thus obtained, and the culture is performed under constant conditions.
  • the initial cell density at the start of virus culture may be 0.001 to 100 ⁇ 10 6 cells/mL, preferably 0.01 to 10 ⁇ 10 6 cells/mL, more preferably 0.1 to 10 ⁇ . 10 6 cells/mL.
  • the cell density may be measured according to a general method using a hemocytometer or the like.
  • the influenza virus solution added to the cell culture can be added so that the infectious titer MOI (Multiplicity of infection) is 0.00001 to 10, and preferably 0.0001 to 0.1, more preferably 0.0001. It can be added in an amount of up to 0.01.
  • MOI Multiplicity of infection
  • embryonated chicken eggs When embryonated chicken eggs are used as the host, they are incubated at 33°C to 38°C, preferably 35 to 37°C, and humidity conditions of 40 to 60%, preferably 45 to 55%, and incubated 1 to 24 times a day. It is possible to use a chicken egg which has been grown by preferably performing egg turning 4 to 12 times. Eggs on the 8th to 13th day of development can be infected with influenza virus, and preferably eggs on the 10th to 12th day of development can be infected. The amount of virus to infect is 1 to 1 ⁇ 10 6 EID 50 /Egg at a 50% hen egg infectious dose (50% Egg Infection Dose; EID 50 ), but preferably 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 5.
  • EID 50 /Egg more preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 4 EID 50 /Egg can be infected.
  • the infection site is preferably in the chorioallantoic membrane of the egg (in the allantoic fluid), but may be in the amniotic membrane (amniotic fluid) and is not limited as long as the influenza virus grows in the egg.
  • the culture condition may be any condition as long as the influenza virus can grow in the host. It is appropriately adjusted depending on the combination of cell type, virus inoculum, culture scale, method and the like.
  • the culture temperature is 33°C to 39°C, preferably 34 to 38°C
  • the culture period is 1 to 10 days, preferably 3 to 7 days
  • the carbon dioxide concentration is 3 to 8 days. %, preferably 4 to 5%
  • the oxygen concentration is 17 to 25%, preferably 20 to 22%.
  • the temperature is 33°C to 38°C, preferably 34 to 36°C
  • the culture period is 1 to 5 days, preferably 2 to 4 days
  • the humidity condition is 40 to 60%, preferably Is cultivated under the conditions of 45 to 55%, but the conditions in which the proliferative property is maximized differ depending on the virus strain, so the culturing period, culturing temperature, humidity, etc. can be appropriately combined.
  • influenza virus can be efficiently propagated.
  • the virus content in the host can be determined by the hemagglutination method using erythrocytes such as guinea pig (dilution factor), the ELISA method using an antibody against hemagglutinin ( ⁇ g/mL), the plaque assay for measuring virus infectious titer, the TCID 50 , The amount of viral RNA can be measured by real-time PCR or the like.
  • Influenza virus is contained in allantoic fluid (chorioallantoic fluid) or amniotic fluid when the host is embryonated chicken eggs, and in the culture supernatant when the host is cultured cells. After completion of the culture, virus particles are recovered from the virus suspension in the host, concentrated, purified and inactivated to prepare virus particles for inactivated whole grain vaccine or inactivated split vaccine. When used as a live vaccine or a live attenuated vaccine, it can be prepared as virus particles for influenza vaccine after concentration and purification.
  • the virus particles are collected by clarifying the virus suspension, specifically by centrifugation or filtration, and then ultrafiltration for concentration.
  • the virus can be purified by means of ultracentrifugation such as sucrose density gradient centrifugation or liquid chromatography.
  • the purified virus liquid is inactivated by formalin treatment, ultraviolet irradiation, beta-propiolactone, binary ethyleneimine and the like.
  • the purified virus liquid is prepared as virus particles for influenza vaccine.
  • a pharmaceutically acceptable carrier buffer, emulsifier, preservative (eg, thimerosal), tonicity agent, pH adjuster, adjuvant (eg, aluminum hydroxide gel), etc. is appropriately added. It is possible to prepare vaccines of various dosage forms.
  • a method for growing an influenza virus in a host which comprises the step of suppressing the migration of Bax of the host cell to the inner mitochondrial membrane.
  • the step of suppressing the transfer of Bax to the inner mitochondrial membrane is a step of adding a Bax inhibitor to the cells.
  • Bax inhibitors are Val-Pro-Met-Leu-Lys (SEQ ID NO: 1), Pro-Met-Leu-Lys-Glu (SEQ ID NO: 2), Val-Pro-Thr-Leu-Lys (SEQ ID NO: 3), and Val-Pro-Ala-Leu-Arg (SEQ ID NO:4), Val-Pro-Ala-Leu-Lys (SEQ ID NO:5), Pro-Ala-Leu-Lys-Asp (SEQ ID NO:6), Val.
  • ⁇ 2> which is a peptide selected from -Ser-Ala-Leu-Lys (SEQ ID NO: 7) and Ser-Ala-Leu-Lys-Asp (SEQ ID NO: 8).
  • ⁇ 4> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the host is cultured cells or embryonated chicken eggs.
  • cells are MDCK cells (cell line derived from dog kidney), Vero cells (cell line derived from African green monkey kidney), PER.
  • C6 human retinal cell-derived cell line
  • SK-NEP-1 cell human kidney-derived cell line
  • A549 human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cell
  • Duck embryo cell duck embryo cell
  • the method of ⁇ 4> which is a chicken embryo-derived fibroblast.
  • the Bax inhibitor is used at a concentration of 1 ⁇ M or more, preferably 5 ⁇ M or more, more preferably 10 ⁇ M or more with respect to a host for growing influenza virus (A type, B type, C type, D type), and The method according to any one of ⁇ 2> to ⁇ 5>, which is used at 1000 ⁇ M or less, preferably 500 ⁇ M or less, more preferably 200 ⁇ M or less, and 1 to 1000 ⁇ M, preferably 5 to 500 ⁇ M, more preferably 10 to 200 ⁇ M.
  • a method for preparing influenza virus particles which comprises growing the influenza virus by any of the methods ⁇ 1> to ⁇ 5> and collecting the virus particles from the host.
  • ⁇ 8> The method according to ⁇ 7>, wherein the virus particles are used for preparing an influenza vaccine.
  • Bax inhibitors are Val-Pro-Met-Leu-Lys (SEQ ID NO: 1), Pro-Met-Leu-Lys-Glu (SEQ ID NO: 2), Val-Pro-Thr-Leu-Lys (SEQ ID NO:).
  • Val-Pro-Ala-Leu-Arg SEQ ID NO:4
  • Val-Pro-Ala-Leu-Lys SEQ ID NO:5
  • Pro-Ala-Leu-Lys-Asp SEQ ID NO:6
  • Val. -Ser-Ala-Leu-Lys SEQ ID NO: 7
  • Ser-Ala-Leu-Lys-Asp SEQ ID NO: 8
  • MDCK cell canine renal tubular epithelial cell-derived cell line (MDCK cell)
  • MDCK cells canine renal tubular epithelial cell-derived cell line, obtained from DS Pharma Biochemical
  • the cells were cultured in MEM medium (Wako) containing 5% fetal bovine serum (FBS) at 37° C. in the presence of 5% CO 2 .
  • the MDCK cells were seeded in a 24-well plate and used in the test in a confluent state. After washing the MDCK cells seeded in the 24-well plate described above with PBS, Serum free medium (SFM; manufactured by Gibco) was added at 400 ⁇ L/well and acclimated for 1 hour.
  • SFM Serum free medium
  • Infectious titer MOI Multiplicity of infection
  • the cells were infected at 0.001 and incubated for 1 hour. After that, a washing operation with SFM was performed, and a Bax inhibitor (Bax inhibitor peptide (V5) (Val-Pro-Met-Leu-Lys (SEQ ID NO: 1); TOCRIS bioscience)) was added at a concentration of 0 to 200 ⁇ M.
  • a Bax inhibitor Bax inhibitor peptide (V5) (Val-Pro-Met-Leu-Lys (SEQ ID NO: 1); TOCRIS bioscience)
  • An SFM culture medium containing 0.0 ⁇ g/mL-acetylated trypsin manufactured by Sigma was added at 500 ⁇ L/well, and the mixture was cultured for 23 hours.
  • the culture supernatant was collected 24 hours after the infection, and the HA titer of influenza virus was measured by the HA assay described below (Fig. 1).
  • 2.0 ⁇ g/mL-acetylated trypsin-containing SFM culture medium was used for culturing influenza virus.
  • HA Assay Using a U-bottom 96-well plate, 50 ⁇ L of influenza virus culture supernatant was diluted 2-fold by 2-fold to prepare a dilution series. 50 ⁇ L of PBS containing 0.7% guinea pig red blood cells was added thereto, and the mixture was allowed to stand at 4° C. for 2 hours. After that, the agglutination of red blood cells was confirmed, and the dilution concentration at which agglutination was not observed was defined as HA value.
  • Example 2 Examination of Influenza Virus Growth-Promoting Effect at Various Time Points by Addition of Bax Inhibitor (1)
  • the amount of influenza virus in the culture broth was quantified by the focus assay described below using the culture supernatant 21 or 24 hours after infection (FIG. 3).
  • 1) Focus Assay MDCK cells were cultured in a 12-well plate so as to be confluent, washed with PBS, and then acclimated to SFM for 1 hour.
  • the influenza virus culture supernatant collected 21 or 24 hours after infection was diluted 100 to 100000 times, added to MDCK cells cultured in the 12-well plate at 1 mL/well, and incubated for 1 hour to obtain influenza. Infected with the virus. This test was performed by triple measurement.
  • the immobilized cells were the primary antibody: Anti-NP antibody (mouse hybridoma (4E6) cell culture supernatant: Journal of Virology (2008) 82:5940-5950) and secondary antibody: HRP linked goat Anti-mouse IgG+IgM antibody (Jackson Immuno). Reaction Laboratories) and reacted with HRP using DEPDA reaction, and the number of stained foci was counted. Focus assays were performed in triplicate independently, and statistical analysis was performed using Student's t-test (FIGS. 3 and 5) or one-way analysis of variance (subsequent test by Tukey, FIG. 7), and a risk factor of 5 was used. % Was taken as the significance level (*; p ⁇ 0.05, **; p ⁇ 0.01, ***; p ⁇ 0.001).
  • Example 3 Examination of Influenza Virus Growth-Promoting Effect under Low Concentration Conditions of Bax Inhibitors (2 Types)
  • H1N1 Example 1
  • Bax inhibitor peptide V5
  • P5 Pro-Met-Leu-Lys-Glu
  • the culture supernatant was collected 24 hours after infection, and HA titer of influenza virus was measured by HA assay (FIG. 4).
  • HA titer of influenza virus was measured by HA assay (FIG. 4).
  • the addition of the Bax inhibitor increased the HA titer of H3N2, H1N1pdm, and H1N1 (experimental strain) influenza virus strains even under low concentration conditions as compared with Example 2.
  • the HA titer of influenza virus was also increased in SEQ ID NO:2.
  • Example 2(2) Further, the amount of influenza virus was quantified by the focus assay in the same manner as in Example 2(2) using the culture supernatant added with SEQ ID NO: 2 for 24 hours after infection (FIG. 5). As a result of this study, it was revealed that the addition of the Bax inhibitor of SEQ ID NO: 2 enhances the virus growth of H3N2, H1N1pdm, and H1N1 (experimental strain) influenza virus strains.
  • Bax inhibitor Bax inhibitor peptide (V5) (Val-Pro-Met-Leu-Lys-Lys) was used.
  • SEQ ID NO: 1 and (P5) Pro-Met-Leu-Lys-Glu (SEQ ID NO: 2); TOCRIS bio
  • the amount of influenza virus in the culture broth was quantified by the plaque assay described below using the culture supernatant 48 hours after infection (FIG. 7).
  • Plaque assay MDCK cells were cultured in a 12-well plate so as to be confluent, washed with PBS, and then acclimated to SFM for 1 hour.
  • the influenza B virus culture supernatant collected 48 hours after infection was diluted 100 to 100000 times, added to MDCK cells cultivated in the 12-well plate at 1 mL/well, and incubated for 1 hour. Infected with influenza virus. This test was performed by triple measurement. After infection, washing with SFM was performed to obtain 2.0 mL of SFM containing 0.8%-agarose (Lonza Japan Co., Ltd.
  • Example 5 Examination of growth promotion effect of influenza virus in growing chicken eggs of Bax inhibitor (1) Using the growing chicken eggs on the 11th day of development, the growth of H1N1 influenza virus strain (A/Puerto Rico/8/1934) was evaluated. .. The control group was infected with H1N1 influenza virus at a 50% hen egg infectious dose (50% Egg Infection Dose; EID 50 ) of 5 ⁇ 10 2 EID 50 /chicken, and the control-10 times dose group was 5 ⁇ 10 5. 3 EID 50 /chicken egg was infected.
  • EID 50 50% hen egg infectious dose
  • the Bax inhibitor group (the group to which Val-Ser-Ala-Leu-Lys (SEQ ID NO: 7) was added) was adjusted so that the final concentration of the Bax inhibitor was 10 ⁇ M when the chorioallantoic fluid volume of the chicken egg was 5 mL.
  • the above peptide was added to the virus solution for infection.
  • the amount of infectious solution was 200 ⁇ L/chicken egg in each group.
  • Chorioallantoic fluid was collected from the embryonated chicken eggs 48 hours after infection, and the amount of influenza virus was quantified by the focus assay as in Example 2(2) (FIG. 8). Error bars indicate standard error.

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Abstract

ワクチンの材料となるインフルエンザウイルスを、宿主中で効率よく増殖させる方法を提供する。　宿主においてインフルエンザウイルスを増殖する方法であって、宿主細胞のＢａｘのミトコンドリア内膜への移行を抑制する工程を含む、方法。

Description

増殖方法
　本発明は宿主におけるインフルエンザウイルスの増殖方法に関する。
　インフルエンザは、インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症であり、飛沫感染や接触感染等により感染し、高熱、頭痛、筋肉痛、関節痛等の強い全身症状を伴う呼吸器感染症である。インフルエンザワクチンの接種はインフルエンザの重症化の防御に最良の手段となっている。
　インフルエンザワクチンは、ワクチン製造用のインフルエンザウイルスを発育鶏卵の尿膜腔内に接種して培養増殖させ、漿尿液から遠心にて濃縮精製し、ウイルス粒子を界面活性剤等で処理し、ホルマリンで不活化した全粒子ワクチン又はウイルス粒子をエーテルや界面活性剤で破砕後更に精製を行ったスプリットワクチン又はサブユニットワクチンである。しかしながらインフルエンザワクチンを、宿主として胚を有する鶏卵を用いて製造する場合、時間、労働及び費用を要し、急な大量生産ができないという供給安定性の面で問題がある。
　これに替わるウイルス生産方法として、インフルエンザウイルスの宿主として培養細胞を用いて複製する手法が研究され、ＭＤＣＫ細胞がインフルエンザウイルスのｉｎ　ｖｉｔｒｏでの複製のための適切な細胞であることが報告されている（非特許文献１）。また、特許文献１には、ＭＤＣＫ細胞の培養液中に分泌されるトリプシンインヒビターを除去又は低減した後に、細胞にインフルエンザウイルスを接種して、インフルエンザウイルス接種細胞を培養することによりウイルス生産量を増加できることが開示されている。
　また、非特許文献２には、トリインフルエンザウイルス（Ａ／Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ／７９（Ｈ７Ｎ７））が、生体防御機能（アポトーシス）を利用して核外へ輸送され、効率的に増えることが開示され、インフルエンザウイルスの増殖には、培養細胞のアポトーシスが関与することが示唆されている。
　　（特許文献１）国際公開第２００７／１３２７６３号
　　（非特許文献１）Med Microbiol Immunol (1975)162,9-14
　　（非特許文献２）THE EMBO Journal(2003)22,2717-2728
　本発明は、以下の１）～５）に係るものである。
　１）宿主においてインフルエンザウイルスを増殖する方法であって、宿主細胞のＢａｘのミトコンドリア内膜への移行を抑制する工程を含む、方法。
　２）１）の方法によってインフルエンザウイルスを増殖させ、宿主からウイルス粒子を回収する、インフルエンザウイルス粒子の調製方法。
　３）Ｂａｘ阻害剤を有効成分とするインフルエンザウイルス増殖促進剤。
　４）インフルエンザウイルスの増殖を促進するための、Ｂａｘ阻害剤の使用。
　５）インフルエンザウイルス増殖促進剤を製造するための、Ｂａｘ阻害剤の使用。
様々なＢａｘ阻害剤濃度条件におけるインフルエンザウイルスＨＡ価。 Ｂａｘ阻害条件における時間依存的なインフルエンザウイルスＨＡ価。 Ｂａｘ阻害条件におけるインフルエンザウイルス増殖性亢進効果。 Ｂａｘ阻害剤低濃度条件におけるインフルエンザウイルスＨＡ価。 Ｂａｘ阻害剤低濃度条件におけるインフルエンザウイルス増殖促進効果。 Ｂａｘ阻害剤濃度条件におけるＢ型インフルエンザウイルスＨＡ価。 Ｂａｘ阻害剤濃度条件におけるＢ型インフルエンザウイルス増殖促進効果。 Ｂａｘ阻害条件におけるインフルエンザウイルスの増殖促進効果（発育鶏卵）。
発明の詳細な説明
　本発明はワクチンの材料となるインフルエンザウイルスを、宿主中でより効率よく増殖させる方法を提供することに関する。
　本発明者等は、鋭意研究を重ねた結果、インフルエンザウイルスを感染させる宿主において、アポトーシス促進タンパク質として知られるＢａｘのミトコンドリア内膜への移行を抑制してアポトーシスを抑制した場合に、既報とは異なり、ウイルスの増殖性が向上し、ウイルスの産生量が増加することを見出した。
　本発明の方法によれば、インフルエンザウイルスを効率よく増殖でき、ワクチン調製のためのインフルエンザウイルスを大量生産することができる。
　本発明において、インフルエンザウイルスとしては、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、及びＤ型のいずれでも良いが、Ａ型及びＢ型を好適に例示することができる。
　また、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（赤血球凝集素　ＨＡ：ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）の型（ＨＡ型）とノイラミニダーゼの型（ＮＡ型）も特に制限されない。例えば、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ２Ｎ２株、Ｈ３Ｎ２株、Ｈ４Ｎ２株、Ｈ４Ｎ６株、Ｈ５Ｎ１株、Ｈ５Ｎ２株、Ｈ７Ｎ７株、Ｈ７Ｎ９株、Ｈ９Ｎ２株等の現在知られている亜型の他、将来単離・同定される亜型も包含される。
　また対象となるウイルスは、ヒトに感染できるものであればよく、他にブタやトリ、ウマ、ウシへの感染能力を有するウイルスでもよい。
　また、本発明のインフルエンザウイルスは、感染動物や患者等の感染個体から単離された株であってもよく、遺伝子工学的に培養細胞で樹立された組換えウイルスであってもよい。
　本発明において、「Ｂａｘ」とは、Ｂｃｌ－２ファミリーに属するアポトーシス促進タンパク質を指す。Ｂｃｌ－２ファミリーに属するタンパク質はＢＨ（Ｂｃｌ－２　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメインと呼ばれるアミノ酸配列を１つ以上有している。また、Ｃ末端側に疎水性の高いＴＭ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）領域を有しているため、ミトコンドリア膜上に移行し、アポトーシスを制御することが可能となる。
　Ｂｃｌ－２ファミリータンパク質の主要機能は、ミトコンドリアの透過性を調節することによるアポトーシスの制御である。抗アポトーシスタンパク質であるＢｃｌ－２とＢｃｌ－ｘＬはミトコンドリアの外壁に存在し、シトクロムｃの放出を阻害する。アポトーシス促進性のタンパク質であるＢａｄ、Ｂｉｄ、Ｂａｘ及びＢｉｍは細胞質に存在し、細胞死のシグナルによりミトコンドリア内膜へと移動し、そこでシトクロムｃの放出を促進する。細胞外へ流出したシトクロムｃはＡｐａｆ－１と複合体を形成し、カスパーゼ９を活性化、更にカスパーゼ３、６、７を活性化することでアポトーシスが起こると考えられている（Annu Rev Genet (2009)43:95-118）。
　本発明において、「Ｂａｘのミトコンドリア内膜への移行の抑制」とは、ウイルス感染から放出の過程で細胞内に生じるシグナル伝達に起因する、Ｂａｘの細胞質からミトコンドリア内膜への移行を抑制することを意味する。
　抑制手段としては、宿主の細胞質に存在するＢａｘのミトコンドリア内膜への移行を抑制可能であれば、特に限定されない。例えばＢａｘと相互作用してＢａｘのミトコンドリア移行を抑制する分子（「Ｂａｘ阻害剤」と称する）を当該細胞に適用すること、細胞質内に存在するＢａｘを遺伝子工学的に低減すること等が挙げられるが、好適には、Ｂａｘ阻害剤の使用である。すなわち、本発明において、Ｂａｘ阻害剤は、宿主の培養によってインフルエンザウイルスを増殖させるためのインフルエンザウイルス増殖促進剤であると云え、宿主の培養によってインフルエンザウイルスを増殖させるために使用できる。また、Ｂａｘ阻害剤はインフルエンザウイルス増殖促進剤を製造するために使用することができるとも云える。
　Ｂａｘ阻害剤としては、好適には、Ｂａｘのミトコンドリア内膜への移行に必要なＫｕ７０タンパク質とＢａｘとの結合を阻害するペプチドや化合物が挙げられ、例えばBiochem Biophys Res Commun (2004)321:961-966）やNat Cell Biol (2003)5:352-357）に記載のペプチドが挙げられる。
　具体的には、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号１）、Ｐｒｏ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ（配列番号２）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号３）、及びＶａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（配列番号４）が挙げられるが、この他にもＶａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号５）、Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号６）、Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号７）、及びＳｅｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号８）等が挙げられる。
　斯かるＢａｘ阻害剤におけるＢａｘ阻害効果は、例えば、ＢａｘとＫｕ７０タンパク質との結合阻害活性を測定することにより評価できる。また、Ｂａｘ阻害剤を添加した条件において、当該細胞へアポトーシスを誘導し、そのアポトーシス細胞の割合を評価することにより評価できる。
　Ｂａｘ阻害剤は、インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型）を増殖させるための宿主に対して、濃度１μＭ以上、好ましくは５μＭ以上、より好ましくは１０μＭ以上で、且つ１０００μＭ以下、好ましくは５００μＭ以下、より好ましくは２００μＭ以下、また、１～１０００μＭ、好ましくは５～５００μＭ、より好ましくは１０～２００μＭで使用される。
　インフルエンザウイルスの増殖は、具体的には、宿主中にインフルエンザウイルスを感染させる工程、及び当該感染宿主をウイルスが複製可能な条件下で培養する工程により行われるが、本発明においては、Ｂａｘのミトコンドリア内膜への移行を抑制する工程が、例えばウイルス感染前、ウイルス感染後、又はウイルス感染と同時に行われる。好適には、Ｂａｘ阻害剤をウイルス感染前、ウイルス感染後、又はウイルス感染と同時に宿主に添加することが挙げられる。
　インフルエンザウイルスの増殖に用いられる宿主としては、培養細胞又は発育鶏卵の何れでもよいが、供給安定性の面から培養細胞を用いるのが好ましい。
　培養細胞としては、インフルエンザウイルスに感受性であれば如何なる細胞も使用できる。このような細胞として、例えば、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓由来の株化細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓由来の株化細胞）、ＰＥＲ．Ｃ６（ヒト網膜細胞由来の株化細胞）、ＳＫ－ＮＥＰ－１細胞（ヒト腎臓由来の株化細胞）、Ａ５４９（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞）、Ｄｕｃｋ　ｅｍｂｒｙｏ細胞（アヒル胚細胞）が挙げられる。これらの細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に、それぞれＣＣＬ－３４、ＣＣＬ－８１、ＣＣＬ－１０７、ＨＴＢ－４８、ＣＣＬ－１８５、ＣＣＬ－１４１等として登録されており、また、市販で購入することができる。また、インフルエンザウイルスに感受性を示すニワトリ由来の細胞として、ＣＥＦ細胞（Ｃｈｉｃｋｅｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｃｅｌｌ：ニワトリ胚由来線維芽細胞）が使用できる。なお、ＣＥＦ細胞には単離された細胞以外に発育鶏卵中に存在する細胞も含まれる。この他、インフルエンザウイルスの増殖には、インフルエンザウイルスを効率的に増殖させるために開発された細胞株を用いることもできる。斯かる細胞株としては、例えばＥＢ６６（登録商標）、ＤｕｃｋＣｅｌｔ－Ｔ１７（登録商標）、ＥＢｘ（登録商標）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　宿主として培養細胞を用いる場合、細胞を培養するための培地としては、通常細胞培養に用いられる培地、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ社製）、無血清培地（Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）等が挙げられるが何れを使用しても良い。
　当該培地には、細胞の増殖効率を上げるために、非必須アミノ酸やL-グルタミンを添加することができる。また、インフルエンザウイルスの培養においては、ヘマグルチニンの開裂を促す目的でトリプシンやアセチル化トリプシン等のプロテアーゼを添加することができる。また、微生物のコンタミネーションを避けるために、ペニシリンやストレプトマイシン、ゲンタマイシン等の細胞培養に一般的に使用される抗生物質を添加してもよい。培地のｐＨは、適当な緩衝液（例えば、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ）で動物細胞の増殖に適した６．５～８、好ましくは、６．８～７．３に調整される。
　細胞培養の方法としては、培養器の底に細胞を付着させた静止培養、細胞を培地中に浮遊させて培養する浮遊培養が挙げられるが、工業生産レベルで行なうときは、浮遊培養が好ましい。浮遊培養の方法としては、マイクロキャリアなどの担体に細胞を付着させてこれを浮遊させて培養する方法又は担体を用いずに細胞を浮遊させて培養する方法等が挙げられるが、何れの方法を用いても良い。
　細胞培養物（培養した細胞と培地の混液）は、そのままインフルエンザウイルスの接種に使用することできるが、インフルエンザウイルスの接種に際しては、新鮮な培地又は適当な緩衝液、例えば、ＰＢＳ、トリス緩衝液により細胞の洗浄が行なわれることが好ましい。
　具体的には、スピナ－フラスコ等で培養増殖した細胞を低速遠心又は膜ろ過し、細胞と培養上清に分離し、遠心沈渣又は膜ろ過濃縮液の細胞に新鮮培地を加え、細胞を懸濁することにより培地交換が行われる。
　斯くして得られる細胞培養物に、インフルエンザウイルス液が添加され、一定条件下で培養が行なわれる。ウイルス培養開始時の初期細胞密度は０．００１～１００×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬを用いることができるが、好ましくは０．０１～１０×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは０．１～１０×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。なお、細胞密度の測定は、血球計算盤等による一般的な方法に従って行えばよい。細胞培養物に添加されるインフルエンザウイルス液は、感染価ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が０．００００１～１０となるように添加できるが、好ましくは０．０００１～０．１、より好ましくは０．０００１～０．０１で添加することができる。
　また、宿主として発育鶏卵を用いる場合、３３℃～３８℃、好ましくは３５～３７℃、湿度条件は４０～６０％、好ましくは４５～５５％の条件で孵卵し、１日に１～２４回、好ましくは４～１２回の転卵を行うことで発育させた鶏卵を用いることができる。発育８－１３日目の鶏卵を用いインフルエンザウイルスを感染させることができるが、好ましくは１０－１２日目の鶏卵に感染させることができる。感染させるウイルス量は、５０％鶏卵感染用量（５０％Ｅｇｇ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｄｏｓｅ; ＥＩＤ５０）で１～１×１０６ ＥＩＤ５０／Ｅｇｇを感染させることができるが、好ましくは１×１０２～１×１０５ＥＩＤ５０／Ｅｇｇ、より好ましくは１×１０３～１×１０４ ＥＩＤ５０／Ｅｇｇを感染させることができる。感染部位は鶏卵の漿尿膜内（尿膜腔液中）が望まれるが、羊膜内（羊水中）であっても良く、鶏卵中でインフルエンザウイルスが増殖する部位であれば限定されない。
　培養条件は、宿主内でインフルエンザウイルスが増殖可能な条件であればいかなる条件であってもよい。細胞の種類、ウイルス接種量及び培養スケール・方法等の組み合わせにより適切に調節される。例えば、宿主として培養細胞を用いる場合、培養温度は、３３℃～３９℃、好ましくは３４～３８℃、培養期間は、１～１０日間、好ましくは３～７日間、炭酸ガス濃度は３～８％、好ましくは４～５％、酸素濃度は、１７～２５％、好ましくは２０～２２％が使用される。
　また、宿主として発育鶏卵を用いる場合、感染後は３３℃～３８℃、好ましくは３４～３６℃、培養期間は１～５日間、好ましくは２～４日間、湿度条件は４０～６０％、好ましくは４５～５５％の条件で培養されるが、ウイルス株によって増殖性が最も高まる条件は異なるため、培養期間、培養温度、湿度等は適切に組み合わせることができる。
　本発明の方法によれば、インフルエンザウイルスを効率的に増殖させることができる。なお、宿主中のウイルス含量は、モルモット等の赤血球を用いた赤血球凝集法（希釈倍数）やヘマグルチニンに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（μｇ／ｍＬ）、ウイルス感染価を測定するプラークアッセイやＴＣＩＤ５０、ウイルスＲＮＡ量を測定できるリアルタイムＰＣＲ等により測定することができる。
　インフルエンザウイルスは、宿主が発育鶏卵の場合は尿膜腔液（漿尿液）または羊水中に含まれており、宿主が培養細胞の場合は培養上清に含まれる。培養終了後、宿主中のウイルス浮遊液からウイルス粒子が回収され、濃縮、精製及び不活化することにより、不活化全粒ワクチンや不活化スプリットワクチン用のウイルス粒子を調製することができる。生ワクチンや弱毒化生ワクチンとして用いる場合は、濃縮及び精製後にインフルエンザワクチン用のウイルス粒子として調製することができる。
　ウイルス粒子の回収は、ウイルス浮遊液を清澄化すること、具体的には遠心分離又は濾過することにより行われ、次いで、濃縮のために、限外濾過が行われる。ウイルスの精製は、ショ糖密度勾配遠心分離等の超遠心分離や液体クロマトグラフィー等の手段を用いて行うことができる。精製ウイルス液は、不活化全粒ワクチンや不活化スプリットワクチンの場合、ホルマリン処理、紫外線照射、ベータプロピオラクトン、バイナリーエチレンイミン等により、不活化処理される。生ワクチンや弱毒化生ワクチンとして用いる場合は、上記精製ウイルス液をインフルエンザワクチン用のウイルス粒子として調製される。
　斯かるインフルエンザウイルス粒子に、適宜医薬として許容され得る担体（緩衝剤、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウムゲル）等を添加し、各種剤型のワクチンを調製することができる。
　上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞宿主においてインフルエンザウイルスを増殖する方法であって、宿主細胞のＢａｘのミトコンドリア内膜への移行を抑制する工程を含む、方法。
＜２＞Ｂａｘのミトコンドリア内膜への移行を抑制する工程が、Ｂａｘ阻害剤を前記細胞に添加する工程である、＜１＞の方法。
＜３＞Ｂａｘ阻害剤が、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号１）、Ｐｒｏ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ（配列番号２）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号３）、及びＶａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（配列番号４）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号５）、Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号６）、Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号７）、及びＳｅｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号８）から選ばれるペプチドである、＜２＞の方法。
＜４＞宿主が培養細胞又は発育鶏卵である、＜１＞～＜３＞のいずれかの方法。
＜５＞細胞がＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓由来の株化細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓由来の株化細胞）、ＰＥＲ．Ｃ６（ヒト網膜細胞由来の株化細胞）、ＳＫ－ＮＥＰ－１細胞（ヒト腎臓由来の株化細胞）、Ａ５４９（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞）、Ｄｕｃｋ　ｅｍｂｒｙｏ細胞（アヒル胚細胞）、又はニワトリ胚由来線維芽細胞である、＜４＞の方法。
＜６＞Ｂａｘ阻害剤を、インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型）を増殖させるための宿主に対して、濃度１μＭ以上、好ましくは５μＭ以上、より好ましくは１０μＭ以上で、且つ１０００μＭ以下、好ましくは５００μＭ以下、より好ましくは２００μＭ以下、また、１～１０００μＭ、好ましくは５～５００μＭ、より好ましくは１０～２００μＭで使用する、＜２＞～＜５＞のいずれかの方法。
＜７＞＜１＞～＜５＞のいずれかの方法によってインフルエンザウイルスを増殖させ、宿主からウイルス粒子を回収する、インフルエンザウイルス粒子の調製方法。
＜８＞前記ウイルス粒子が、インフルエンザワクチン調製に用いられるものである、＜７＞の方法。
＜９＞Ｂａｘ阻害剤を有効成分とするインフルエンザウイルス増殖促進剤。
＜１０＞インフルエンザウイルスの増殖を促進するための、Ｂａｘ阻害剤の使用。
＜１１＞インフルエンザウイルス増殖促進剤を製造するための、Ｂａｘ阻害剤の使用。
＜１２＞Ｂａｘ阻害剤が、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号１）、Ｐｒｏ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ（配列番号２）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号３）、及びＶａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（配列番号４）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号５）、Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号６）、Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号７）、及びＳｅｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号８）から選ばれるペプチドである、＜９＞の剤又は＜１０＞若しくは＜１１＞の使用。
実施例１　イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来細胞株（ＭＤＣＫ細胞）を用いたウイルスの増殖性評価試験
（１）ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来細胞株、ＤＳファーマバイオケミカル社より入手）を５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ社製）にて３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。上記ＭＤＣＫ細胞を２４ウェルプレートに播種し、コンフルエントの状態で試験に用いた。上述の２４ウェルプレートに播種したＭＤＣＫ細胞をＰＢＳで洗浄後、Ｓｅｒｕｍ　ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ；Ｇｉｂｃｏ社製）を４００μＬ／ウェルで添加し、１時間馴化させた。
（２）上記細胞にＡ型インフルエンザウイルスであるＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１）、及びＨ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザウイルス株（Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／８３０／２００９）を感染価ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．００１となるように感染させ、１時間インキュベートした。その後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、Ｂａｘ阻害剤（Ｂａｘ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｖ５）（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号１）；ＴＯＣＲＩＳ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））を０－２００μＭ濃度で添加した２．０μｇ／ｍＬ－アセチル化トリプシン（Ｓｉｇｍａ社製）含有ＳＦＭ培養培地を５００μＬ／ウェル量加え、２３時間培養した。感染２４時間後に培養上清を回収し、後述のＨＡアッセイにより、インフルエンザウイルスのＨＡ価を測定した（図１）。なお、以降の実験においてインフルエンザウイルスの増殖性を評価する試験では、２．０μｇ／ｍＬ－アセチル化トリプシン含有ＳＦＭ培養培地をインフルエンザウイルスの培養に用いた。
（３）ＨＡアッセイ
　Ｕ底９６ウェルプレートを用い、インフルエンザウイルス培養上清５０μＬを２－１０２４倍まで２倍ずつ、希釈系列を作製した。そこへ、０．７％モルモット赤血球含有ＰＢＳ　５０μＬを加え、４℃で２時間静置した。その後、赤血球の凝集を確認し、凝集が認められない希釈濃度をＨＡ価とした。
（４）本検討の結果、Ｂａｘ阻害剤の添加は、Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株のＨＡ価を増加させることが明らかとなった。
実施例２　Ｂａｘ阻害剤添加による様々なタイムポイントにおけるインフルエンザウイルスの増殖促進効果の検討
（１）実施例1と同様に、ＭＤＣＫ細胞をＳＦＭで１時間馴化させた後、Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザウイルス株を感染価ＭＯＩ＝０．００１となるように感染させ、１時間インキュベートした後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、Ｂａｘ阻害剤（Ｂａｘ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｖ５））を１００μＭ濃度で添加し、２０－４７時間培養した。感染後２１時間、２４時間、４８時間に培養上清を回収し、ＨＡアッセイにより、インフルエンザウイルスのＨＡ価を測定した（図２）。
　本検討の結果、Ｂａｘ阻害剤の添加は培養の早い段階から、インフルエンザウイルス株のＨＡ価を増加させることが明らかとなった。
（２）また、感染後２１又は２４時間の培養上清を用い、培養液中のインフルエンザウイルス量を、後述するフォーカスアッセイにより定量した（図３）。
　１）フォーカスアッセイ
　１２ウェルプレートにＭＤＣＫ細胞をコンフルエントとなるように培養し、ＰＢＳで洗浄後、ＳＦＭに１時間馴化させた。感染後２１又は２４時間で回収したインフルエンザウイルス培養上清を１００－１０００００倍に希釈し、上記１２ウェルプレートにて培養しているＭＤＣＫ細胞に１ｍＬ／ウェルで添加し１時間インキュベートすることで、インフルエンザウイルスを感染させた。本試験は三重測定にて行った。感染後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、１．２％－セオラス（旭化成ケミカルズ，ＲＣ５９１）及び２．０μｇ／ｍＬ－アセチル化トリプシン（Ｓｉｇｍａ社製）含有ＳＦＭを２．０ｍＬ／ウェルとなるように加え、３０時間培養した。培養後、ウェルを４℃に冷やしたＰＢＳで３回洗浄後、－２０℃に冷やした１００％メタノール（Ｗａｋｏ社製）を加え、細胞を固定化した。固定化細胞は一次抗体：Ａｎｔｉ－ＮＰ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（マウスハイブリドーマ（4E6）細胞培養上清：Journal of Virology (2008) 82:5940-5950）及び二次抗体：ＨＲＰ　ｌｉｎｋｅｄ　ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ社製）にて反応させ、ＤＥＰＤＡ反応を用いＨＲＰと反応させ、染色されたフォーカス数をカウントした。フォーカスアッセイは独立した三重測定で行い、統計学的な解析はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ（図３及び図５）又は一元配置分散分析（Ｔｕｋｅｙによるその後の検定、図７）を用い、危険率５％を有意水準（＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１、＊＊＊；ｐ＜０．００１）とした。
　２）本検討の結果、Ｂａｘ阻害剤の添加は、Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株のウイルス増殖性亢進効果を示すことが明らかとなった。
実施例３　Ｂａｘ阻害剤（２種類）の低濃度条件におけるインフルエンザウイルスの増殖促進効果の検討
（１）実施例1と同様に、ＭＤＣＫ細胞をＳＦＭで１時間馴化させた後、Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１ｐｄｍ、Ｈ１Ｎ１（実験株）インフルエンザウイルス株を感染価Ｍｏｉ＝０．００１となるように感染させ、１時間インキュベートした後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、Ｂａｘ阻害剤（Ｂａｘ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｖ５）（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号１）及び（Ｐ５）（Ｐｒｏ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ（配列番号２）；ＴＯＣＲＩＳ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））を１．０ μＭ濃度で添加し、２３時間培養した。感染後２４時間に培養上清を回収し、ＨＡアッセイにより、インフルエンザウイルスのＨＡ価を測定した（図４）。
　本検討の結果、Ｂａｘ阻害剤の添加は実施例２と比較して低濃度条件においてもＨ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１ｐｄｍ、Ｈ１Ｎ１（実験株）インフルエンザウイルス株のＨＡ価を増加させることが明らかとなった。加えて、配列番号２においてもインフルエンザウイルスのＨＡ価の増加が認められた。
（２）また、配列番号２を添加した感染後２４時間の培養上清を用い、実施例２（２）と同様にインフルエンザウイルス量をフォーカスアッセイにより定量した（図５）。
　本検討の結果、配列番号２のＢａｘ阻害剤を添加することで、Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１ｐｄｍ、Ｈ１Ｎ１（実験株）インフルエンザウイルス株のウイルス増殖性が亢進することが明らかとなった。
実施例４　Ｂａｘ阻害剤（２種類）のＢ型インフルエンザウイルスの増殖促進効果の検討
（１）実施例３と同様に、使用するウイルス株をＢ型インフルエンザウイルス株（Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０）に変更しウイルスの増殖性を評価した。Ｍｏｉ＝０．０１となるようにＢ型インフルエンザウイルスを感染させ、１時間インキュベートした後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、Ｂａｘ阻害剤（Ｂａｘ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｖ５）（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号１）及び（Ｐ５）（Ｐｒｏ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ（配列番号２）；ＴＯＣＲＩＳ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））を０～１００μＭ濃度で添加し、４７時間培養した。感染後４８時間に培養上清を回収し、ＨＡアッセイにより、インフルエンザウイルスのＨＡ価を測定した（図６）。
　本検討の結果、Ｂａｘ阻害剤の添加はＢ型インフルエンザウイルス株のＨＡ価を増加させることが明らかとなった。
（２）また、感染後４８時間の培養上清を用い、培養液中のインフルエンザウイルス量を後述するプラークアッセイにより定量した（図７）。
　１）プラークアッセイ
　１２ウェルプレートにＭＤＣＫ細胞をコンフルエントとなるように培養し、ＰＢＳで洗浄後、ＳＦＭに１時間馴化させた。感染後４８時間で回収したＢ型インフルエンザウイルス培養上清を１００－１０００００倍に希釈し、上記１２ウェルプレートにて培養しているＭＤＣＫ細胞に１ｍＬ／ウェルで添加し１時間インキュベートすることで、Ｂ型インフルエンザウイルスを感染させた。本試験は三重測定にて行った。感染後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、０．８％－アガロース（ロンザジャパン株式会社　ＳｅａＫｅｍ（登録商標）Ｇｏｌｄ　Ａｇａｌｏｓｅ）及び２．０μｇ／ｍＬ－アセチル化トリプシン（Ｓｉｇｍａ社製）含有ＳＦＭを２．０ｍＬ／ウェルとなるように加え、４７時間培養した。培養後、エタノール：酢酸＝５：１で混合した溶液を各ウェルに１ｍＬ添加し、４℃で一晩以上静置することで細胞を固定化した。固定化細胞を１％（ｗ／ｖ）濃度のクリスタルバイオレッド溶液で染色し、ＰＢＳで洗浄後に、ウイルス感染に伴い細胞が脱落している部分（プラーク）の数をカウントした。
　２）本検討の結果、配列番号１及び配列番号２のＢａｘ阻害剤は、Ｂ型インフルエンザウイルス株に対してもウイルス増殖性亢進効果を示すことが明らかとなった。
実施例５　Ｂａｘ阻害剤の発育鶏卵におけるインフルエンザウイルスの増殖促進効果の検討
（１）発生１１日目の発育鶏卵を用いＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株（Ａ/Ｐｕｅｒｔｏ　Ｒｉｃｏ/８/１９３４）の増殖性を評価した。対照群にはＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスを５０％鶏卵感染用量（５０％Ｅｇｇ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｄｏｓｅ; ＥＩＤ５０）が５×１０２ ＥＩＤ５０/鶏卵となるように感染させ、対照－１０倍量群には５×１０３ＥＩＤ５０/鶏卵となるように感染させた。Ｂａｘ阻害剤群（Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号７）を添加する群）には鶏卵の漿尿液量を５ｍＬとしたときにＢａｘ阻害剤の終濃度が１０μＭとなるように上記ペプチドをウイルス溶液に添加し感染操作を行った。感染液量はいずれの群も２００μＬ/鶏卵とした。感染後４８時間に発育鶏卵より漿尿液を回収し、実施例２（２）と同様にインフルエンザウイルス量をフォーカスアッセイにより定量した（図８）。エラーバーは標準誤差を示した。
（２）本検討の結果、Ｂａｘ阻害剤の添加はＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株のウイルス価を１．２７倍に増加させることが明らかとなった。加えて、Ｂａｘ阻害剤の添加により１０倍量のウイルスを感染させた発育鶏卵よりも得られるウイルス価が高まることが明らかとなった。

Claims (10)

  1. 　宿主においてインフルエンザウイルスを増殖する方法であって、宿主細胞のＢａｘのミトコンドリア内膜への移行を抑制する工程を含む、方法。
  2. 　Ｂａｘのミトコンドリア内膜への移行を抑制する工程が、Ｂａｘ阻害剤を前記宿主に添加する工程である、請求項１記載の方法。
  3. 　Ｂａｘ阻害剤がＶａｌ－Ｐｒｏ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号１）、Ｐｒｏ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ（配列番号２）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号３）、及びＶａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（配列番号４）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号５）、Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号６）、Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号７）、及びＳｅｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号８）から選ばれるペプチドである、請求項２記載の方法。
  4. 　宿主が培養細胞又は発育鶏卵である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項記載の方法によってインフルエンザウイルスを増殖させ、宿主からウイルス粒子を回収する、インフルエンザウイルス粒子の調製方法。
  6. 　前記ウイルス粒子がインフルエンザワクチン調製に用いられるものである、請求項５記載の方法。
  7. 　Ｂａｘ阻害剤を有効成分とするインフルエンザウイルス増殖促進剤。
  8. 　インフルエンザウイルス増殖促進剤を製造するための、Ｂａｘ阻害剤の使用。
  9. 　インフルエンザウイルスを増殖促進するための、Ｂａｘ阻害剤の使用。
  10. 　Ｂａｘ阻害剤がＶａｌ－Ｐｒｏ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号１）、Ｐｒｏ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ（配列番号２）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号３）、及びＶａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ（配列番号４）、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号５）、Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号６）、Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号７）、及びＳｅｒ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ（配列番号８）から選ばれるペプチドである、請求項７記載の剤又は請求項８若しくは９の使用。
     
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