JPH0420284A - 細胞培養用マイクロキャリア - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、細胞培養担体に関するものであり、動物細胞
を培養する際に使用される細胞培養用マイクロキャリア
（以下、マイクロキャリアと略す）に関するものである
。詳しくは、動物細胞を細胞培養担体に付着させ、静置
状態又は懸濁状態等で高密度培養するのに好適なマイク
ロキャリアに関するものである。

（従来の技術） 近年、動物細胞を培養するために種々の培養担体や培養
方法が開発されている。その一つに、微小球体を培養器
中、擬似浮遊状態で培養するマイクロキャリア培養法が
ある。現在市販又は報告されているマイクロキャリアの
多くは、天然多糖類系ポリマーまたは合成系ポリマーに
、正に荷電しうる化学的残基を導入したアニオン交換型
の重合体粒子である。

天然多糖類系ポリマーによるマイクロキャリアとしては
、デキストランポリマーに正に荷電し得る化学的残基を
化学結合した担体がよく知られている。例えば、サイト
デックスーｌ及びサイトデックス−２（ファルマシア社
製、特開昭５７−１９５７０１号公報参照）、スーパー
ビーズ（フロＬａｂｓ社製、特開昭５７−３５９５３号
公報参照）、特開昭５６−９５１９６号公報及び特開昭
６１−２５４８１号公報参照、ドーマセル（特開昭６０
−２３７９９１号公報参照）等のマイクロキャリアが市
販又は報告されている。これらの化学的残基の多くはＮ
、Ｎ’　−ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）型である
。

また、セルロースポリマーに正に荷電し得る化学的残基
を化学結合した担体として、ＤＢ−５２及びＤＥ−５３
（ワットマン社製）、ＭＣ−シリーズ（ワイクキ社製）
並びに特開昭６２−５００００１号公報及び特開昭６３
−１５２６０１号公報に記載されたもの等がある。

その他、キチンやキトサンに正に荷電し得る化学的残基
を化学結合した担体として、特開昭６２５１９８２号公
報に記載されたものが挙げられる。

一方、合成系ポリマーによるマイクロキャリアとして、
ポリアクリルアミドポリマーにジメチルアミノプロピル
基を化学結合した細胞培養担体であるバイオキャリア（
バイオラド社製、特開昭５５−１．０８２８６号公報参
照）が知られている。

また、特開昭６１７４５８０号公報中では、（メタ）ア
クリル酸エステルを構成単位とする水不溶性の重合体粒
子に、正に荷電し得る化学的残基を導入してなる多孔性
担体をマイクロキャリアとして用いた細胞培養担体が報
告されている。

また、特開昭６３−７１１７３号公報、特開昭６３−２
２’６２８２号公報及び特開昭６１−１０９７９号公報
等では、（メタ）アクリル酸エステルを構成単位とする
水不溶性の重合体粒子に、正に荷電し得る化学的残基を
導入してなるマイクロキャリアが報告されている。

しかし、以上の培養担体は、いずれも正に荷電し得る化
学的残基のみを有するものであり、正に荷電し得る化学
的残基と疎水性残基両方を有するものではなかった。

（発明が解決しようとする課題） 従来の細胞培養担体は、細胞播種直後の細胞の付着開始
が遅く、初期の増殖性が充分なものではなかった。また
、長期培養の場合、特に、浮遊性の強い細胞は無血清で
長期間の培養をした場合、細胞が剥離しやすいという欠
点があった。このため細胞の付着性や増殖性が良好で、
しかも長期培養においても細胞が剥離しにくいマイクロ
キャリアが求められていた。

本発明の目的は、細胞播種直後の細胞の付着開始が速く
、増殖性が良好であり、しかも長期培養においても細胞
が剥離しにくいマイクロキャリアを提供しようとするも
のである。

（課題を解決するだめの手段） 本発明者らは、」二記の問題に鑑み鋭意検討を行った結
果、細胞剥離の原因は、従来のマイクロキャリアが正電
荷のみ又は負電荷のみを有する点にあること、また、正
番、二荷電し得る化学的残基と疎水性残基両方をマイク
ロキャリア表面に導入することにより、細胞の付着性及
び増殖性が向上するばかりではなく、特に長期培養にお
いても細胞が剥離しにくくなることを見い出し、本発明
に達した。

即ち、本発明の要旨は、重合性ビニルモノマー単位を構
成単位とし、正に荷電しろる化学的残基を乾燥粒子１ｇ
あたり０．１〜３．５ミリ当量含有する水不溶性の重合
体粒子であって、炭素数５以上の疎水性残基を有する重
合性モノマー単位を１〜４０モル％含有することを特徴
とする細胞培養用マイクロキャリアに存する。

以下、本発明の詳細な説明する。

まず、本発明において、疎水性の尺度として用いるＣ　
Ｌ　ＯＧ　Ｐ値は、ボモナ大学（カリフォルニア州）、
’ｒ、Ｎ１５ｈｉｏｋａ　（京都大学）によってＦＡＣ
ＯＭ３’、３３版に編集されたプログラムを用いて、あ
る溶質の水−１−オクタツール系におけるモノマーの分
配係数の対数値を計算により求めた値である。これによ
り電荷的に中性な分子の疎水性を定量的に表現すること
ができ、その意義については後述する。

本発明における重合性ビニルモノマーとしては、該ビニ
ルモノマーの重合反応によって得られる水不溶性重合体
粒子が蛋白質等に対して非特異的な吸着をしにくい、親
水性のビニルモノマーを用いることが好ましい。即ち、
ＣＬＯＧＰ値が低いモノマー単位が好適であり、モノマ
ーのＣＬＯＧＰ値としては、−２，０〜＋２．０の範囲
であることが好ましい。代表的には、（メタ）アクリル
酸エステル又は（メタ）アクリルアミドが挙げられる。

具体的な（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリ
ルアミドとしては、以下の化合物が挙げられる。２−ヒ
ドロキシエチル（メタ）アクリレート、ジエチレングリ
コール（メタ）アクリレート、トリエチレングリコール
（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコール（メ
タ）アクリレート、オクタエチレングリコール（メタ）
アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリ
レート、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプ
ロパン、グリセロール（メタ）アクリレート、グリシジ
ル（メタ）アクリレート、インシアネートエチル（メタ
）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、メチル（メ
タ）アクリルアミド、及び表１、表−２に記載したモノ
マー単位等が挙げられる。以下の表中、Ｍｅはメチル基
、Ｅｔはエチル基を示す。

■ 上記重合性ビニルモノマーの重合反応によって得られた
重合体粒子が、水に対して不溶性であれば架橋剤成分は
必要ではないが、水不溶性高分子からの可溶性成分の溶
出をできる限り少なくするため、架橋剤成分を添加する
ことが好ましい。架橋剤成分としては、前述のモノマー
成分と共重合性を有する多官能性のビニルモノマーが好
適である。例えば、エチレングリコールジ（メタ）アク
リレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレー
ト、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、
テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポ
リエチレングリコールジ（メタ）アクリレート　Ｌ　　
６−ヘキサンシオールジ（メタ）アクリレート、グリシ
ジル基（メタ）アクリレート、トリメチロールエタント
リ　（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパント
リ　（メタ）アクリレート、テトラメチロールメクンテ
トラ（メタ）アクリレート、エチレンビス（メタ）アク
リルアミド、トリエチレンビス（メタ）アクリルアミド
、１，４−ジアクリロイルピペラジン等が挙げられる。

前述のように、架橋剤成分は、水不溶性高分子の可溶性
成分の漏出を最小限に抑えるために添加することが好ま
しいが、架橋剤成分の含有率が高すぎる場合、とりわけ
架橋剤成分として多官能性のビニルモノマーを用いた場
合には、水不溶性重合体粒子の膨潤度が小さくなり、更
に多孔性となる場合もあって好ましくない。以上の点を
考慮し、架橋剤成分の含有率は、全モノマーに対し０．
５〜５０重量％が好ましい。特に好ましくは、１〜２０
重量％の範囲である。

本発明の水不溶性の重合体粒子を得るためには、上記モ
ノマーに希釈剤を添加することが好ましい。

希釈剤の添加によって、マイクロキャリアとして必要な
、適度な膨潤度、比重及び屈折率等の物性を付与するこ
とができる。モノマー成分に添加する希釈剤としては、
重合性モノマーを溶解し、モノマー成分の官能基即ち、
メタクリロイル基、水酸基、グリシジル基、アミド基、
アミノ基並びにイソシアネート基及び支持体に不活性で
あればよい。それに好適な希釈剤は、使用する重合性モ
ノマ一種によって異なるが、通常、ベンゼン、トルエン
、シクロヘキサン、１．２−ジクロロエタン、ジメチル
フタレート、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール、ヘ
キサノール、シクロヘキサノール、ヘプタツール、オク
タツール、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン
、ジブチルエーテル、クロロホルム及び上記の混合溶媒
等を挙げることができる。

上記希釈剤としてモノマーに対し良溶媒（主成分モノマ
ーに対し、比較的ＣＬＯＧＰ値が近い溶媒）を使用した
場合、光学的に透明な水不溶性重合体粒子を得ることが
できる。マイクロキャリアが不透明な場合には、細胞の
生育状態は観察しにくいため、適切な懸濁状態を維持で
きる限り、マイクロキャリアは光学的に透明又は少なく
とも半透明であることが好ましい。

希釈剤の添加によりマイクロキャリアとして必要な、適
度な膨潤度を付与することができることについては前述
したが、マイクロキャリア培養に適した重合体粒子の膨
潤度は塩化ナトリウム１３７ｍＭ、塩化カリウム３ｍＭ
を含む２ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７，４）中において
１ｇあたり５．０〜２５．０　ｍ！である。重合体粒子
の膨潤度は、重合反応時の希釈剤の添加量によって大き
く異なる。

全モノマーに対する希釈剤の添加量は、０〜１０倍量（
体積比）が好適であり、更に好ましい範囲は、０．５〜
５倍量（体積比）である。モノマーに対して希釈剤を過
剰に添加した場合には、膨潤度が大きくなりすぎ、水不
溶性高分子が脆弱になるばかりではな（重合収率が低下
する等の問題が生じる。

正に荷電しうる化学的残基の含有量は、マイクロキャリ
アの乾燥粒子１ｇあたり０．１〜３．５ミリ当量となる
よう調節され、更に好ましい含有量は０．５〜２．０ミ
リ当量である。下限以下の場合には付着率及び増殖性が
低下し、一方上限を越えた場合には増殖性が低下する。

更に、細胞の付着性や増殖性を向上させるため、負に荷
電しうる化学的残基を導入することが好ましい。負に荷
電しうる化学的残基の含有量は、水不溶性高分子の乾燥
粒子１ｇあたり０．０１〜１．０ミリ当量が好ましい。

負に荷電しろるモノマー単位として、例えば、メタクリ
ル酸、β−メタクリロイルオキシエチルハイドロゲンサ
クシネート、β−メタクリロイルオキシエチルハイドロ
ゲンフタレート、メタクリロキシエチルホスフェート、
スルホプロピルメタクリレート等が挙げられる。

細胞の付着性や増殖性に影響を与えるのは、化学的残基
の量ばかりではなく、水不溶性の重合体中の正に荷電し
うるモノマー単位のＣＬＯＧＰ値も重要である。水不溶
性の重合体粒子表面に細胞が付着し増殖するためには、
ポリマー中の正に荷電しうるモノマー単位のＣＬ　ＯＧ
　Ｐ値は、−１，５〜＋２．０の範囲にあることが好ま
しい。

本発明における正に荷電しうる化学的残基は、培養液中
において、その一部は解離状態にあると考えられるが、
Ｗ、Ｓ、Ｈｕ　（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　ａｎ
ｄ　　ｂｉｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｔｎｇ、２９．１１５
５−１１６３　（１９８７））らは、・ｐＨ７，２’０
における増殖速度に及ぼす正味の荷電量の影響は少ない
、もしくは全く規則性がないことを報告している。従っ
て、ポリマー中の正に荷電しうるモノマー単位の疎水性
は、中性分子のＣＬＯＧＰ値を考慮すれば良いことにな
る。

この場合、モノマー単位のＣＬＯＧＰ値が、小さ過ぎる
とマイクロキャリアに対する細胞の付着性は悪くなる。

逆にＣＬ　ＯＧ　Ｐ値が、大き過ぎる場合も細胞の付着
性や増殖性は悪くなり、しかも、場合によっては、細胞
により分泌された生理活性蛋白質が、マイクロキャリア
に吸着されることもある。更に、該モノマー単位のＣＬ
ＯＧＰ値と該モノマー単位の含有率との間には相補性が
あり、マイクロキャリア上で細胞を付着、増殖させるた
めには、ＣＬＯＧＰ値が低い場合には該モノマー単位の
含有率を高くし、逆にＣＬＯＧＰ値が高い場合には該モ
ノマー単位の含有率を低くすることが好ましい。ＣＬＯ
ＧＰ値が、−１，５〜＋２．０の範囲にあり、かつ正に
荷電しうる化学的残基を有する千ツマー単位としては、
表−１及び表−２に示したものを挙げることができる。

本発明の特徴は、細胞の伸展性や増殖性を改善すること
にあるが、リュウヘニーらはポリマー鎖に疎水性基を導
入した場合、細胞の付着率及び細胞密度が低下すること
を報告（Ｄｅｖｅｌｏｐ。

ｂ　ｉｏ　１．５ｔａｒｒｄａｒｄｔ　、Ｖｏｌ、６０
，２．１３−２５３　（１９８５））、（ＤｅＶＣｌｏ
ｐ。

ｂ　ｉ　ｏ　］、’５Ｌａｎｄａ　ｒｄ、、、；Ｖｏｌ
、５５，１］”−２３（１９８４）’）している。しか
しながら本発明者ら□は、種々検討を行った結果、疎水
性残基を導入することにより細胞の伸展性や増殖性が大
きく向上することを見い出した。

すなわちこれらの効果は、疎水性残基の側鎖部分に起因
すると考えられ、側鎖の化学的残基は、電荷的゛に中性
で、かつ、その炭素数は５以上であるものを用いる。

更に、上記疎水性残基を有するモノマー単位の最適なＣ
Ｌ　ＯＧ　Ｐ値は、１．５〜６．０の範囲にあることが
好ましい。また、゛該疎水性残基を有するモノマー単位
の含有量は、そのモル分率で１〜４０モル％、更に好ま
しくは５〜３０モル％であり、その含有率が低い場合に
は、上記伸展性、増殖性の向上といった効果が充分発揮
されにくい。

この疎水性残基を有するモノマー単位のＣＬ　ＯＧＰ値
と含有量は重要であり、ＣＬＯＧＰ値が大きい場合には
含有量が低くても効果が現われるが、含有量が４０モル
％以上の場合には疎水性残基によりかえって細胞の伸展
性、増殖性が阻害される。

また、疎水性残基を有するモノマー単位のＣＬＯＧＰ値
及び含有率が高い場合には、その疎水性残基を含有する
水不溶性重合体粒子は疎水性になり、次第に撥水性を示
すようになる。さらに、ＣＬＯＧＰ値が６．０以上の場
合には、細胞の増殖が阻害されるばかりでなく、重合体
粒子が強い撥水性を示すようになり、マイクロキャリア
としての機能を充分発揮できなくなる。このような例と
しては、オクタデシルアクリレート（ＣＬＯＧＰ値二８
．５７）及びオクタデシルメタクリレート（ＣＬＯＧＰ
値：８．９６）等の長鎖アルキル化合物が挙げられる。

ＣＬＯＧＰ値カ月、５以下の場合も、疎水性残基の効果
が充分発揮されなくなり、このような例としてはメチル
アクリレート（ＣＬＯＧＰ値二０．７５　）　、メチル
メタクリレート（ＣＬＯＧＰ値：１．０６）、エチルア
クリレート（ＣＬＯＧＰ値：１．２８）及びエチルメタ
クリレ−１−（ＣＬＯＧＰ値：１．４９）等が挙げられ
る。

本発明において水不溶性高分子の支持体表面に疎水性残
基を導入する方法としては、一般に行われる方法が挙げ
られ、重合反応の際、千ツマー中に疎水性残基を有する
重合性モノマーを添加し、水不溶性高分子を得る方法と
、水不溶性の重合体粒子を得た後、化学修飾反応により
疎水性残基を導入する方法の二通りがある。

疎水性の化学的残基を有する好適な重合性モノマーの具
体的な例としては、スチレン（２，８７）、４−ｔ−７
’チルスチレン（４，７４）、ジビニルベンゼン（３，
２５）等の芳香族モノマー頻１フェニル（メタ）アクリ
レート（２，０６，２，３７）　、ベンジル（メタ）ア
クリレート（２，５２，２，８３）、フェネチル（メタ
）アクリレート（２，８４，３，１５）、フェノキシエ
チル（メタ）アクリレート（２，５０，２，８１Ｌ２−
ヒドロキシ−３−フェニルオキシプロピル（メタ）アク
リレート（１，６７，１，９８）　、フェノキシジエチ
レングリコール（メタ）アクリレート（２，５６，２，
８７）　、フェノキシポリエチレングリコール（メタ）
アクリレート等の芳香族含有（メタ）アクリレートモノ
マー類；ブチル（メタ）アクリレ−）（２，３３，２゜
６４）、ヘキシル（メタ）アクリレート（３，３９，３
、７０＞　、オクチル（メタ）アクリレート（４，４５
，４，７６）等のアルキル（メタ）アクリレート類；シ
クロヘキシル（メタ）アクリレート等の脂環式アルキル
（メタ）アクリレート類；オクチル（メタ）アクリルア
ミド（３，０６，３，３７）等のアクリルアミド類等が
挙げられる。ただし、ここに記載されていない重合性モ
ノマーであっても、本発明の特許請求の範囲を越えない
限り好適に使用される。ここで、上記（）内の数値はＣ
ＬＯＧＰ値であり、２つの値が記載されている場合、前
者はアクリレート又はアクリルアミド、後者はメタクリ
レート又はメタアクリルアミドのＣＬＯＣＰ値である。

得られた水不溶性の重合体粒子が上記の疎水性の化学的
残基量に満たない場合、又は重合反応の際、千ツマー中
に疎水性残基を有する重合性モノマーを添加していない
場合、更に疎水性残基を有する化合物を化学修飾によっ
て導入することもできる。即ち、重合体粒子がグリシジ
ル基を含有する場合は、アミンとの反応により導入する
ことができる。水酸基、２，３−ジヒドロキシプロピル
基等の場合には、臭化シアンとの反応によりイミドカル
ボネートを得た後、ジアミンとの反応により、導入する
ことができる。これらの導入方法に関しては、メソンズ
・イン・エンザイモロジー、モスバッハ著（１３４巻、
１３５巻、１３６巻）等に詳細に記述されている。

水不溶性の重合体粒子の製造方法については、特開昭６
３−７１１７３号公報、特開昭６３−２２６２８２号公
報及び特開昭６４−１０９７９号公報の中で詳細に記述
されているように、通常懸濁重合法により製造すること
ができる。重合体粒子の粒径は、１μｍ〜１０００μｍ
が好ましく、更に好ましくは５０μｍ〜５００μｍの範
囲である。

水不溶性の重合体粒子を製造する際に使用する重合開始
剤としては、過酸化ヘンジイル、過酸化ラウロイル、過
酸化アセチル等の過酸化物系重合開始剤、２，２′−ア
ゾビス−２−シクロプロピルプロビオニトリル等のアゾ
系重合開始剤、過酸化水素水−Ｆｅ”塩等のレドックス
系重合開始剤等が好ましい。ここで重合開始剤の選択は
、モノマー、架橋剤、希釈剤等によって適宜選択される
。

例えば、モノマー溶液が水溶性である場合には、レドッ
クス系重合開始剤、水溶性アゾ系重合開始剤及び過酸化
アンモニウム、過酸化カリウム−Ｎ。

Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラアゾエチレンジアミン等が好
ましく用いられる。

重合温度は、レドックス系重合開始剤、過酸化物系重合
開始剤及びアゾ系重合開始剤のいずれを用いる場合も、
３０°Ｃ〜１００°Ｃで行うことが好ましい。

本発明マイクロキャリアを用いて細胞を培養する方法は
、培養規模、培養の目的等によって異なるが、例えば以
下の方法が挙げられる。即ち、シャーレ、Ｔ−フラスコ
を用いた場合には、懸濁培養法が、固定床を用いた場合
には、固定床培養法が、その他エアーリフトを用いた場
合には、還流培養法等が挙げられる。

また、培養方法によりマイクロキャリアの投入量は大き
く異なるが、一般に培養液に対して５％〜４０％の範囲
が好ましい。

（実施例） 以下、実施例により本発明の詳細な説明するが、本発明
はその要旨を越えない限り以下の実施例により限定され
るものではない。

（実施例−１） マイクロキャリアを、以下に述べる方法により製造した
。

３００ｍｌの四ツ目フラスコに温度計、冷却管、窒素導
入管、攪拌羽根を取り付け、この中へ塩化カルシウム・
２水塩２５ｇ、３％ポリビニルアルコール水溶液３０ｒ
ｒ＋４２．イオン交換水８５ｍ！！、を入れ攪拌した。

この中へ１−へキサノール２７ｇ、シクロヘキサノール
３５ｇ１ポリエチレングリコールメタクリレート（商品
名プレンマーＰＥ−３５０、日本油脂製）１２．４ｇ、
グリシジルメタクリレート（キシダ化学製）７．０ｇ、
フェノキシエチルアクリレート（商品名ＡＭＰＩＯＧ、
新中村化学製）５．０ｇ、ポリエチレングリコールジメ
タクリレート（商品名４Ｇ、新中村化学製）１．５ｇの
溶液に重合開始剤として２．２′−アゾビス（２，４−
ジメチルバレロニトリル）（商品名Ｖ−６５、和光純薬
製）３０ｍｇを溶解したモノマー溶液を調製した。この
溶液を四ツ目フラスコに滴下した。窒素雰囲気下で重合
反応を行うため、窒素を通気し溶存酸素を除去した。室
温から徐々に昇温し７０°Ｃで５時間、重合反応を行っ
た。重合終了後、該ポリマーをグツフナ−漏斗上にあけ
、水洗後、５０％メタノール水溶液でポリマーを洗浄し
た。ポリマーを再度フラスコに戻し、この操作を繰り返
し、１−ヘキサノール及びシクロヘキザノール臭がしな
くなるまでポリマーを洗浄した。

得られたポリマーは、撥水性を示す無色透明球状体で、
重合収率は７７％であった。

該ポリマーを用いて更に以下のアミノ化反応を行った。

ポリ？−３０ｍＩ！、（水中）を８０％１゜４−ジオキ
サン水溶液で充分に洗浄し置換した。

これを３００ｍｆｆのフラスコ内に入れ、更にジオキサ
ンを３０ｍ！追加した。この中へエタノールアミン（東
京化成製）１０ｇのジオキサン溶液３０ｍｐ、を滴下し
、７５°Ｃで４時間アミノ化反応を行った。反応終了後
、アミン臭がしなくなるまで充分にポリマーを水洗した
。得られたポリマーを標準篩を用い、２１０μｍ〜２５
０μｍの範囲で分級した。

元素分析より、アミンの官能基量は１．５４ミリ当量／
ｇであった。リン酸緩衝溶液（日永製薬製、以下ＰＢＳ
と略す）中における該ポリマーの膨潤度は１７．９ｍρ
／ｇ、平均粒径は２００μｍ、比重は１．０３ｇ／ｍｆ
ｆ１であった。本実施例の場合、正に荷電するモノマー
単位は、メタクリル酸ヒト０キシエチルアミノ−２−ヒ
ドロキシプロピルでありそのＣＬＯＧＰ値は−０，６７
である。また疎水性残基を有するモノマー単位は、フェ
ノキシエチルアクリレートであり、そのＣＬＯＧＰ値は
２．８１である。

（実施例−２） ３００ｍｊ２の四ツ目フラスコに温度計、冷却管、窒素
導入管、攪拌羽根を取り付け、この中へ塩化カルシウム
・２水塩２５ｇ、３％ポリビニルアルコール水溶液３０
ｍ１、イオン交換水８５ｍｆｆ１を入れ攪拌した。一方
、１−へキサノール４０ｇ１シクロヘキサノール２５ｇ
、１−オクタツール３０ｇ、ポリエチレングリコールメ
タクリレート（商品名ブレンマーＰＥ−２００，日本油
脂製）７．７ｇ、グリシジルメタクリレート５．４ｇ、
ベンジルメタクリレート５．０ｇ、β−アクリロイルオ
キシエチルハイトロゲンサクシネート（商品名ＮＫエス
テルＡ−３Ａ、新中村化学製）１．１ｇ、２ヒドロキシ
−１，３−ジメタクリロキシプロパン（商品名ＮＫエス
テル７０１、新中村化学製）０．６ｇの溶液に■−６５
を１００ｍｇ溶解したモノマー溶液を調製した。この溶
液を四ツ目フラスコに滴下した。窒素雰囲気下で重合反
応を行うため、窒素を通気し溶存酸素を除去した。室温
から徐々に昇温し６５°Ｃで５時間、重合反応を行った
。

重合終了後の後処理は、実施例−１と同様に行った。得
られたポリマーは、無色透明球状体で撥水性を示し、重
合収率は７４％であった。アミノ化反応におｉ′Ｊるア
ミンは、エタノールアミンの代わりに１．３−プロパン
ジアミンを使用した以外は、実施例−１と同様に行った
。

元素分析より、アミンの官能基量は１．２３ミリ当量／
ｇであった。ＰＢＳ中における該ポリマーの膨潤度は１
６．８　ｍ　Ｅ　／　ｇ、平均粒径は２１０μｍ、比重
は］、、　０３　ｇ　／　ｍ　１２であった。本実施例
の場合、相当する正に荷電するモノマー単位は、メタク
リル酸アミノプロピルアミノ−２−ヒドロキシプロピル
であり、そのＣＬ　ＯＧ　Ｐ　（ｉは−１，０３である
。また相当する疎水性残基を有するモノマー単位は、フ
ェネチルメタクリレートでありそのＣＬＯＧＰ値は３．
１５である。

（実施例−３） ３００ｍｆの四ツ目フラスコに温度計、冷却管、窒素導
入管、攪拌羽根を取り付け、この中へ塩化カルシウム・
２水塩２５ｇ、３％ポリビニルアルコール水溶液３０ｍ
ｊ、イオン交換水８５ｍＩＶ、を入れ攪拌した。一方、
■−ヘキサノール３５ｇ２１−オクタツール３５ｇ５ポ
リエチレングリコールメタクリレート（ブレンマーＰＥ
−３５０，前述）１２．７ｇ、ジエチルアミノエチルメ
タクリレート４．４ｇ、２−ヒドロキシ−３−フェニル
オキシプロピルアクリレート３．５ｇ、ポリエチレング
リコールジメタクリレート（商品名ＮＫエステル９Ｇ、
新中村化学製）０．８ｇの溶液にＶ−６５（前述）８０
ｍｇを溶解したモノマー溶液を調製した。この溶液を四
ツ目フラスコ内へ滴下した。

窒素雰囲気下で重合反応を行うため、窒素を通気し溶存
酸素を除去した。室温から徐々に昇温し、５５°Ｃで７
時間、重合反応を行った。重合終了後の後処理は、実施
例−１と同様に行った。得られ３ま たポリマーは、無色透明球状体で撥水性を示し、重合収
率は７５％であった。このポリマーを標準篩を用い、１
８０μｍ〜２１０μｍの範囲で分級した。分級ポリマー
を用いてアミノ化反応を行った。アミンは、エタノール
アミンの代わりにＮ。

Ｎ−ジエチルエチレンジアミン（東京化成製）を使用し
た以外は、実施例−１と同様に行った。

元素分析より、アミンの官能基量は１．４４ミリ当量／
ｇであった。ＰＢＳ中におけるポリマーの膨潤度は１６
．３　ｍ　ＩＬ　／　ｇ、平均粒径は２４０μｍ、比重
は１．０３　ｇ　／　ｍ　Ｅであった。本実施例の場合
、正に荷電する千ツマー単位は、メタクリル酸−Ｎ。

Ｎ−ジエチルアミノエチルアミノ−２−ヒドロキシプロ
ピルであり、そのＣＬＯＧＰ値は１．１０である。また
疎水性残基を有するモノマー単位は、ベンジルメタクリ
レートであり、そのＣＬＯＧＰ値は２．８２である。

（実施例−４） ３００ｍｎの四ツ目フラスコに温度計、冷却管、窒素導
入管、攪拌羽根を取り付け、この中へ塩化カルシウム・
２水塩２５ｇ、３％ポリビニルアルコール水溶液３０ｍ
ｊ２、イオン交換水８５ｍｊ２を入れ攪拌した。一方、
シクロヘキサノール４０ｇ、トルエン３０ｇ１ジエチレ
ングリコールメタクリレート（商品名ブレンマーＰＥ−
９０，日本油脂製）７．４ｇ、エチルアクリルアミド５
．４ｇ、グリシジルメタクリレート４．４ｇ、スチレン
５．６ｇ。

１．６−ヘキサンジオールジアクリレート（商品名ＡＥ
−２１０６、国産化学製）０．５ｇの溶液に重合開始剤
として２．２−アゾビス−（４−メトキシ−２，４−バ
レロニトリル）（Ｖ−７０、和光純薬）５Ｑｍｇを溶解
した千ツマー溶液を調製した。この溶液を四ツ目フラス
コ内へ滴下した。

窒素雰囲気下で重合反応を行うため、窒素を通気し溶存
酸素を除去した。室温から徐々に昇温し、４５°Ｃで５
時間重合反応を行った。重合終了後の後処理は、実施例
−１と同様に行った。得られたポリマーは、実施例−１
〜実施例−３で得られた水不溶性高分子担体以上に強い
撥水性を示し、重合収率は７８％であった。このポリマ
ーを標準篩を用い、１８０μｍ〜２１０μｍの範囲で分
級した。この分級ポリマーを用いて、アミノ化反応を行
った。アミノ化反応は、エタノールアミンの代わりにジ
エチルアミンを使用した以外は、実施例１と同様に行っ
た。

元素分析より、アミンの官能基量は１．０９ミリ当１／
ｇであった。比重は］、０３ｇ／ｒｎｆｆｉであった。

ＰＢＳ中における該ポリマーの膨潤度は１４゜６　ｍ　
１　／　ｇ、平均粒径は２３０μｍ、比重は１．０４ｇ
／ｍ！であった。本実施例の場合、正に荷電するモノマ
ー単位は、メタクリル酸ジエチルアミノ−２−ヒドロキ
シプロピルであり、そのＣＬＯＧＰ値は１．１２である
。また疎水性残基を有する千ツマー単位はスチレンであ
り、そのＣｌ−０ＧＰ値は２．８２である。

（実施例−５） ３００ｒｒ＋ｊ！の四ツ目フラスコに温度計、冷却管、
窒素導入管、攪拌羽根を取り付け、この中へ塩化カルシ
ウム・２水塩２５ｇ、３％ポリビニルアルコール水溶液
３０ｍ１．、イオン交換水８５ｍβを入れ攪拌した。一
方、１−ヘキサノール２０ｇ、シクロヘキサノール１５
ｇ、、１−オクタツール２５ｇ、グリセロールメタクリ
レート（商品名ブレンマーＧＬＭ、日本油脂製）８．８
ｇ、グリシジルメタクリレート５．４ｇ、フェノキシジ
エチレングリコールアクリレート（商品名ＡＭＰ−２０
Ｇ、新中村化学製）５．０ｇ、トリメチロールプロパン
トリ　（メタ）アクリレート０．６ｇの溶液にＶ−６５
（前述）を１００ｍｇを溶解したモノマー溶液を調製し
た。この溶液を四ツロフラスコ中に滴下した。窒素雰囲
気下で重合反応を行うため、窒素を通気し溶存酸素を除
去した。室温から徐々に昇温し、６５゛Ｃで５時間、重
合反応を行った。重合終了後の後処理は、実施例−１と
同様に行った。

得られたポリマーは、撥水性を示す無色透明球状体で、
重合収率は６９％であった。アミノ化反応におけるアミ
ンは、エタノールアミンの代わりに１．３−プロパンジ
アミンを使用した以外は、実施例−１と同様に行った。

元素分析より、アミンの官能基量は１．５５ミリ当１／
ｇであった。ＰＢＳ中における該ポリマーの膨潤度は１
６．８　ｍ　１　／　ｇ、平均粒径は２１０μｍ、比重
は１．０３ｇ／ｍｎであった。本実施例の場合、正に荷
電するモノマー単位は、メタクリル酸アミノプロピルア
ミノ−２−ヒドロキシプロピルであり、そのＣＬＯＧＰ
値は−１，０３である。

また疎水性残基を有するモノマー単位はフェネチルメタ
クリレートであり、そのＣＬＯＧＰ値は３゜１５である
。

（比較例−１） ３００ｍｆｆの四ツ目フラスコに温度計、冷却管、窒素
導入管、攪拌羽根を取り付け、この中へ塩化カルシウム
・２水塩２５ｇ、３％ポリビニルアルコール水溶液３０
ｍｉ！、イオン交換水８５ｍ！を入れ攪拌した。重合反
応は窒素雰囲気下で行った。

この中へ　１−へキサノール３０ｇ、シクロヘキサノー
ル３０ｇ、ポリエチレングリコールメタクリレート（ブ
レンマーＰＥ−３５０：前述）】３゜２ｇ１グリシジル
メタクリレート６、Ｏｇ、ポリエチレングリコールジメ
タクリレート（４Ｇ）０．８ｇの溶液にｌ−６５（前述
）を２０ｍｇを溶解したモノマー溶液を加えた。窒素雰
囲気下で重合反応を行うため、窒素を通気し溶存酸素を
除去した。

室温から徐々に昇温し、６５℃で５時間、重合反応を行
った。反応終了後、ポリマーをグツフナ−漏斗上にあけ
、３０％メタノール水溶液で洗浄した後、ポリマーを再
度フラスコ内へ戻した。この操作を繰り返し、１−ヘキ
サノール及びシクロヘキサノール臭がしなくなるまで洗
浄した。得られたポリマーは無色透明球状体で、重合収
率は６９％であった。このポリマーを標準篩を用い、１
８０μｍ〜２１０μｍの範囲で分級した。該ポリマーを
用いて更に以下のアミノ化反応を行った。３０ｒｒ＋ｊ
２　（水中）のポリマーを８０％の１．４−ジオキサン
水溶液で充分に洗浄した。これを３００ｍｊ２のフラス
コ内に入れ、更にジオキサン水溶液を３０ｍＩ！、追加
した。この中へエタノールアミン１０、０　ｇのジオキ
サン水溶液３０ｍｎを滴下し、７５°Ｃで４時間アミノ
化反応を行った。反応終了後、アミン臭がしな（なるま
で充分にポリマーを洗浄した。元素分析より、アミンの
官能基量は１゜４２ミリ当ｆｆｌ／ｇであった。ＰＢＳ
中におけるＪ亥ポリマーの膨潤度は１７．３ｍｐ、／ｇ
、平均粒径は２３０μｍ１比重は１．０３ｇ／ｍｐ、で
あった。本比較例の場合、正に荷電する千ツマー単位は
、メタクリル酸ヒドロキシエチルアミノ−２−ヒドロ４
−ジプロピル ６９である。しかし本比較例では、疎水性残基を有する
モノマー単位を含有していない。

（比較例−２） ３　０　０　ｒｎ　ｐ．の四ツロフラスコに温度計、冷
却管、窒素導入管、攪拌羽根を取りイ」け、この中へ塩
化カルシウム・２水塩２５ｇ、３％ポリビニルアルコー
ル水溶液３０ｍ！、イオン交換水８５ｍｌを入れ攪拌し
た。重合反応は窒素雰囲気下で行った。

この中へ　１−へキサノール３０ｇ１シクロ−・キサノ
ール３０ｇ、グリセロールメタクリレ−１・７。

８ｇ、メチルメタクリレ−）　５．　０　ｇ、グリシジ
ルメタクリレ−１−６．４ｇ，２−ヒドロキシ−１、３
シメタクリロオキシブロパン０．　８　ｇの？容液に■
６５（前述）を２０ｍｇを溶解したモノマー溶液を加え
た。窒素雰囲気下で重合反応を行うため、窒素を通気し
溶存酸素を除去した。室温から徐々に昇温し、６５°Ｃ
で５時間、重合反応を行った。

反応終了後、該ポリマーをグツフナ−漏斗上にあげ、３
０％メタノール水溶液で洗浄した。ポリマーを再度フラ
スコ内へ戻した。この操作を繰り返し、１−ヘキサノー
ル及びシクロヘキザノール臭がしなくなるまでポリマー
を洗浄した。得られたポリマーは無色透明球状体で、重
合収率ば６７％であった。該ポリマーを用いて以下のア
ミノ化反応を行った。３０ｒｒ＋＋２　　（水中）のポ
リマーを８０％の１、４−ジオキザン水溶液で充分に洗
浄し置換した。これを３　０　０ｍｆｆのフラスコ内に
入れ、更にジオキサンを３　０ｍｆ！．追加した。この
中へ１３−プロパンジアミン１　０．　０　ｇのジオキ
ザン水溶液３０ｍ！を滴下し、７０°Ｃで４時間アミノ
化反応を行った。反応終了後、ポリマーを充分に洗浄し
た。その後、アミノ化ポリマーを標準篩を用い、２１０
μｍ〜２　５　０　ｕｍの範囲で分級した。

元素分析より、アミンの官能基量は１．５１ミリ当璽／
ｇであった。ＰＢＳ中における該ポリマーの膨潤度は１
　７．　９　ｍ　ｌ　／　ｇ、平均粒径は２１０μｍ、
比重は１．０３ｇ／ｍ！であった。本比較例の場合、正
に荷電するモノマー単位は、メタクリル酸アミノプロピ
ルアミノ−２−ヒドロキシプロピルでありそのＣ　Ｌ　
Ｏ　Ｇ　Ｐ値は−１．０３である。比較例２においては
、疎水性残基を有するモノマー単位はメチルメタクリレ
ートであり、そのＣＬＯＣ；Ｐイ直は１．０６である。

（細胞培養実験−１） 細胞の伸展性や増殖性を評価するため、実施例及び比較
例で製造されたマイクロキャリアを用いて、以下の方法
により培養評価した。

まず実施例１〜６及び比較例１、２で製造された各マイ
クロキャリアを、蒸留水で充分洗浄した後、ＰＢＳで洗
浄した。更に高圧蒸気滅菌可能ｅＲＤＦ培地（極東製薬
製）で２回洗浄した。細胞培養には、１０％牛脂児血清
（三菱化成製）（以下、ｌ”　Ｂ　Ｓと略す）を添加し
たｃ−Ｒ　Ｄ　Ｆ培地を用いた。培養に供した細胞はＶ
ｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞）、ＭＤＣＫ細
胞（コツ力スパニエル腎細胞）、ＥＣ，−５６Ｄ細胞（
肺小細胞株由来ハイブリドーマ細胞及びＣＩ］０−３２
２細胞（ＣＨＯ−Ｋｌ細胞（チャイニーズハムスター卵
巣細胞）］を宿主とした組換えヒトアポリボ蛋白質Ｅ（
以下、ＡｐｏＥと略す）（３６ｋｄ）生産細胞であり、
いずれの細胞も大日本製薬社から購入した。

マイクロキャリア培養は以下のように行った。

ｅ−ＲＤＦ培地で置換したマイクロキャリア１５。

０ｒｒ＋４２をｌＬのスピンナーフラスコ（ヘルコ社）
内に入れ、１２１°Ｃで３０分間オートクレーブ滅菌し
た。フラスコにＦＢＳを２　０ｍｊ！及びｅ　＝ＲＤＦ
培地を加え２　９　５ｍｆｆとした。更に、培養に使用
する以下の各細胞（ＣＨＯ−３２２細胞、Ｖｅｒｏ細胞
、ＭＤＣＫ細胞及びＥＣ−５６Ｄ細胞）を４．５Ｘ１０
７ｃｅ　Ｉ　ｌ　ｓ加え、５％炭酸インキュヘーター内
で、３６．５°Ｃ、２５ｒｐｍで連続撹拌し培養を開始
した。３日日より必要に応して培地交換し、細胞数の増
加とともに血清濃度を下げ８日前後よりｅ−ＲＤＦ培地
のみで無血清培養をを開始した。この培養の間、定期的
にマイクロキャリアを一部抜き出し細胞の状態を観察し
た。

その結果を表−３に示した。細胞の伸展性は播種後５〜
１０時間、増殖性は播種後２日後に評価した。

なお、表−３中の記号士、＋」、＋手中は、マイクロキ
ャリアに付着した細胞の伸展及び増殖の状態を示したも
のである６＋士士は非常に良好、士士は良好、＋は不良
を示すものである。

（細胞培養実験−２） 長期間マイクロキャリア培養した場合の細胞の剥離性を
評価するため、実施例−１、実施例−２及び比較例−１
で製造されたマイクロキャリアを用いて、以下の実験に
より培養評価した。

前述の細胞培養実験−１でマイクロキャリア培養したＣ
ＨＯ−３２２細胞を、飽和状態に達した後、引き続きｅ
−ＲＤＦ培地のみで無血清培養を行なった。培養期間中
マイクロキャリアを抜き出し、マイクロキャリアに付着
した細胞を観察した。

更に、組換え体ＣＨＯ−３２２細胞が分泌するＡｐｏＥ
を５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲル（１２，５
％ゲル）により１ｍした。これにより、比較例−１のマ
イクロキャリアで培養した細胞よりも、実施例−１及び
実施例−２のマイクロキャリアで培養した細胞の方が、
ＡｐｏＥの分泌量が多いことがわかった。

以上の結果からも、正に荷電し得る化学的残基と疎水性
残基両方を有するマイクロキャリアは、長期間の培養に
も優れ、しかも該マイクロキャリアで培養した細胞が分
泌する有用蛋白質の量も多いことがわかる。

（発明の効果） 本発明のマイクロキャリアによれば、正に荷電し得る化
学的残基と疎水性残基両方を有するモノマー単位が存在
するために、細胞の伸展性や増殖性が改善できる。しか
も長期間培養した場合には、マイクロキャリア上から細
胞が剥離しにくくなる。

この特徴は細胞をできる限り速く増殖させる場合や、逆
にマイクロキャリア上で細胞を長期間培養し、細胞から
分泌される有用蛋白質を回収する場合の両方に対し有用
である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）重合性ビニルモノマー単位を構成単位とし、正に
   荷電しうる化学的残基を乾燥粒子１ｇあたり０．１〜３
   ．５ミリ当量含有する水不溶性の重合体粒子であって、
   炭素数５以上の疎水性残基を有する重合性モノマー単位
   を１〜４０モル％含有することを特徴とする細胞培養用
   マイクロキャリア。