CN116990508A - 一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA试剂盒及其检测方法 Download PDF

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CN116990508A CN202310790745.1A CN202310790745A CN116990508A CN 116990508 A CN116990508 A CN 116990508A CN 202310790745 A CN202310790745 A CN 202310790745A CN 116990508 A CN116990508 A CN 116990508A
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Abstract

本发明涉及一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA试剂盒及其检测方法。利用猪丹毒SpaA蛋白免疫小鼠，筛选杂交瘤细胞，制备的抗体可以特异性识别SpaA蛋白，基于该单克隆抗体经过一系列反应条件的优化建立了夹心ELISA，可用于猪丹毒SpaA蛋白的定量，检测最低浓度可达到0.1ng/ml，灵敏度高，相关系数R2为0.993，定量准确性好，可应用于猪丹毒SpaA蛋白的定量检测，该方法的建立克服了目前传统定量方法中存在的无法区分杂蛋白与目的蛋白的情况，从而保证定量数据的精确性，提高疫苗工艺的稳定性与严谨性。

Description

一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA试剂盒及其检测 方法
技术领域
本发明涉及一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA试剂盒、检测方法及其应用，属于动物疾病诊断和生物制品领域。
背景技术
猪丹毒(Swineerysipelas)是由猪丹毒丝菌(Erysipelothrixrhμsiopathiae)引起的一种急性、热性传染病，其临诊特征主要为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎。该病广泛流行于世界各地，包括我国许多地区，几十年前的三大传染病就包括猪丹毒。给养猪产业带来了相当大的经济损失。
猪丹毒丝菌在自然环境中广泛存在，最主要传染源是患病猪，通过粪便、尿液或口腔分泌物传播，在被污染饲料、饮水、土壤和圈舍等存在，并能在土壤中生存和繁殖，耐环境性强。各种日龄、品种和性别的猪均可以引起感染，主要是3-6月龄猪只最容易出现发病。温度、湿度营养、疲劳等因素都能诱发该病。猪丹毒全年多发，在夏季高温或者温度突变时易发，所有日龄猪均可感染，特别是成年猪更易感，给猪场带来严重的损失，猪丹毒的潜伏期最短1天，最长可达7日以上此外，也有哺乳动物、禽类、鱼类和两栖类等动物感染猪丹毒的报道。同时红斑丹毒丝菌也是一种重要的人畜共患菌，可导致人类感染，人感染红斑丹毒丝菌叫做类丹毒。
随着抗生素滥用问题的突出，临床上出现大量的耐药菌，因此采用疫苗免疫是预防猪丹毒等细菌病的最有效的方式。猪丹毒疫苗的研究涉及灭活苗，活疫苗，亚单位疫苗和载体疫苗等；目前市场上主要使用传统疫苗，即猪丹毒灭活菌苗和弱毒活菌苗。其主要问题在于弱毒菌株存在毒力返强，全菌灭活疫苗中存在大量无效成份，既可引起严重的副反应，又会引起过多无意义的非特异性免疫应答，浪费机体的免疫潜力问题。因此，研制新型疫苗是猪丹毒疫苗研究的主要方向，已报道的猪丹毒新型疫苗研究主要包括亚单位疫苗和乳酸菌载体疫苗等。
亚单位疫苗是通过化学分解、蛋白合成或表达等方法，获得细菌和病毒具有免疫功能的蛋白结构，从而筛选到一类不含核酸的基因工程疫苗。亚单位疫苗的抗原仅有少数几种蛋白，因此可以避免过多无关抗原对机体进行无效的免疫刺激，从而节约机体的免疫潜力，同时减少疫苗的副反应。
目前关于猪丹毒的抗原蛋白定量方法停留在BCA、bradford等方法，这些定量方法都局限于不能区分杂蛋白与抗原蛋白，导致其最终的定量数据差异极大，从而影响抗原半定量的结果。最终影响疫苗的效力，因此急需建立一种可靠的和可重复的定量分析方法用于疫苗生产过程中的抗原定量及疫苗抗原有效成分的定量分析。为了保证分析的可靠性，必须充分验证定量方法。主要考虑一下几点：特异性，保证样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物；灵敏度，标准曲线和定量范围，应提供标准曲线的线性方程和相关系数；精密度，用质控样品的批内和批间变异系数(CV)来考察方法的精确度；准确度，在确定的分析条件下，测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度。
发明内容
本发明的目的在于：将猪丹毒SpaA作为免疫原采用多次免疫方式制备单克隆抗体，该单抗在WesternBlot中能识别目的蛋白，在建立的双抗夹心ELISA体系中，该试剂盒特异性好、灵敏度高、稳定性好，能够快速、简便、高效的定量检测猪丹毒SpaA蛋白，最低检测下限为0.1ng/mL，为后续疫苗的准确定量及质量控制提供基础。
本发明首先提供了一种猪丹毒SpaA双抗体夹心定量ELISA试剂盒，所述试剂盒包括包被有抗猪丹毒SpaA蛋白单克隆抗体的酶标板、稀释液、封闭液、酶标抗体、浓缩洗涤液、显色液、终止液、标准品、阳性对照、阴性对照，所述包被有抗猪丹毒SpaA蛋白单克隆抗体的酶标板使用的是单抗16H7，所述单抗16H7由小鼠杂交瘤细胞(Ery)-16H7株获得，所述小鼠杂交瘤细胞(Ery)-16H7株于2023年5月17日送交至中国科学院微生物研所菌种保藏中心保藏，保藏号为45611。
进一步的，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的抗猪丹毒SpaA单克隆抗体，所述抗猪丹毒SpaA单克隆抗体为单抗24G12，所述单抗24G12由小鼠杂交瘤细胞24G12株获得，所述小鼠杂交瘤细胞(Ery)-24G12株于2023年5月17日送交至中国科学院微生物研所菌种保藏中心保藏，保藏号为45612。
进一步的，所述稀释液为0.05M碳酸盐缓冲液，PH值为9.6，含有1.59g的Na2CO3、2.93g的NaHCO3。
进一步的，所述封闭液为含5％脱脂乳的PBS溶液。
同发明同时还提供了一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用包被液稀释纯化后的单抗16H7，按照100μl/孔包被酶标板，37℃包被2h或者4℃作用过夜；
(2)甩去板中的液体，用洗涤液洗板5次，每次5min，最后一次拍干，加入封闭液，100μl/孔，置37℃孵育1.5h；
(3)用洗涤液洗板5次，加入一定稀释度的待检抗原样品及对照样品，100μl/孔，置37℃孵育，同时设不加抗原对照(用脱脂乳代替)；
(4)用洗涤液洗板5次，加入稀释的酶标抗体24G12-HRP，100μl/孔，置37℃孵育1h；(5)用洗涤液洗板5次，加入TMB，50μl/孔，室温显色15min；
(6)加终止液，50μl/孔，混匀后10min内测定OD450nm值。
进一步的，所述步骤(1)中包被液按照1:1000稀释单抗16H7，所述步骤(4)中酶标抗体按照1:2000稀释。
相对于现有技术，本发明提供的一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA试剂盒及其检测方法的进步之处在于，利用猪丹毒SpaA抗原蛋白免疫小鼠，筛选杂交瘤细胞，制备的抗体可以特异性识别猪丹毒SpaA蛋白，可用于WB、IFA等猪丹毒相关检测；进行抗体配对筛选后，经过一系列反应条件的优化建立了夹心ELISA，该试剂盒特异性好、灵敏度高、稳定性好，能够快速、简便、高效的定量检测猪丹毒SpaA蛋白，最低检测下限为0.1ng/mL，为后续疫苗的准确定量及质量控制提供基础。
附图说明
图1为猪丹毒SpaAWB检测图，图中标记1：maker；2：BSA-2mg/ml；3：BSA-1mg/ml；4：BSA-0.5mg/ml；5：BSA-0.25mg/ml；6：BSA-0.125mg/ml。
图2为猪丹毒SpaASDS定量图，图中标记1：maker；2：BSA-2mg/ml；3：BSA-1mg/ml；4：BSA-0.5mg/ml；5：BSA-0.25mg/ml；6：BSA-0.125mg/ml。
图3为三次免疫后小鼠血清ELISA检测的OD450读数。
图4为细胞融合后杂交瘤上清ELISA复检的OD450读数。
图5是第二次亚克隆后杂交瘤上清ELISA检测的OD450读数。
图6是腹水ELISA检测的OD450读数。
图7是腹水纯化后抗体ELISA检测的OD450读数。
图8是抗体配对检测的OD450读数。
图9是配对抗体灵敏度检测结果。
图10是配对抗体的WB验证结果。
图11是猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA的标准曲线。
图12是为猪丹毒SpaA蛋白SDS定量检测图，图中标记1：maker；2：BSA-2mg/ml；3：BSA-1mg/ml；4：BSA-0.5mg/ml；5：BSA-0.25mg/ml；6：BSA-0.125mg/ml。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
本实施例中使用的pET28a载体购自于赛默飞公司
本发明所用感受态细胞BL21购自于北京擎科生物科技有限公司
本发明所用TB培养基购自于北京索莱宝科技有限公司
本发明所用LB液体培养基北京索莱宝科技有限公司
本发明所用96孔酶标板购自康宁公司
本发明所用BCA试剂盒购自于赛默飞公司
超净工作台品牌为沪净净化
二氧化碳培养箱为Thermo
水平低速离心机为常州鸿科
生物倒置显微镜为上海启步
酶标仪为MDCMaxPlus
电泳仪为天能
垂直电泳槽为六一
湿转转膜槽为六一
水平脱色摇床为其林贝尔
核酸蛋白检测仪为杭州奥盛
电融合仪为NEPAGENE
实施例1
一、SpaA-DC1序列合成及重组质粒构建
根据NCBI报道的猪丹毒血清1a型菌株LA150627(GenBank:Kμ214211.1)抗原丹毒SpaA序列，合成具有血清1a型抗原特征的SpaA；SpaA-DC1大小为1239个碱基；序列合成并连接至pET28a载体BamHI和EcoRI酶切位点之间，构建原核表达载体pET28a-SpaA-DC1，具体操作方法参照《分子克隆试验操作手册》。
二、表达菌株构建及蛋白诱导表达和纯化
1、SpaA-DC1蛋白制备
(1)BL21感受态转化和蛋白诱导表达
将阳性质粒转化BL21感受态，转化后挑取单菌落于含有含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养，8000r/min离心5min，收集菌体后，用沸水浴煮5min，12000r/min离心3min，取上清进行PCR鉴定，鉴定正确后扩大培养。
(2)阳性菌株培养和蛋白诱导表达
将PCR检测阳性的菌株分别接种150mLTB培养基中，37℃摇床培养至OD600＝0.8，加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导4h，培养物离心后用1/10体积的PBS重悬，进行超声破碎，离心收获上清和沉淀进行蛋白鉴定，检测阳性样品用于后续纯化，检测结果如附图1所示。
(3)包涵体纯化
将沉淀按1:10(w：v)加入冷的洗涤液(20mMTris，2mMEDTA，1％Trixon100，1％Tween20，0.5Murea，pH8.2)中，搅拌20分钟。2～8℃，12000r/min离心25分钟，弃上清，取沉淀。重复一次(洗涤2～4小时去除膜碎片和膜蛋白)。所得沉淀再用50mmol/LTris-HCl洗1次，相同离心条件，离心弃去上清，所得的沉淀即为洗涤后的包涵体。将洗涤后的包涵体沉淀按1:10(w：v)加入包涵体变性溶解液(50mMTris，8Murea，5mMGSH，pH8.2)重悬，于室温搅拌30～60分钟以充分溶解，2～8℃，12000r/min离心15分钟，弃沉淀取上清，将上清缓慢匀速加入7倍体积的PBS溶液，2～8℃过夜复性，离心将上清过0.22μm滤膜除菌，即为复性的蛋白抗原液。将洗涤后的包涵体沉淀按1:10(w：v)加入包涵体变性溶解液重悬，于室温搅拌30～60分钟以充分溶解，2～8℃，12000r/min离心15分钟，弃沉淀取上清，将上清缓慢匀速加入7倍体积的PBS溶液，2～8℃过夜复性，离心将上清过0.22μm滤膜除菌，即为复性的蛋白抗原液。
三、抗原蛋白的灭活与定量
灭活：取复性的蛋白抗原液加入1mol/L的BEI溶液，使其终浓度为0.005mol/L，边加边搅拌，混合均匀，37℃灭活24小时。灭活结束后，加入过滤除菌的2mol/L硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液，使其终浓度为0.005mol/L，充分搅拌均匀，37℃反应1小时终止灭活。置2～8℃保存。
蛋白含量测定：按SDS法检测蛋白含量，结果为1.32mg/ml，检测结果如图2所示。
四、单克隆细胞系的建立
1、小鼠免疫及抗血清检测
选择5只6周龄雌性BalB/C小鼠，对小鼠进行标记并编号，尾静脉采血30～50μl，凝血离心收集免疫前血清；
首免：按每只小鼠免疫量200μg计算所需抗原体积，使用等体积弗氏完全佐剂进行抗原乳化，皮下多点注射进行免疫；
二免：两周后进行第二次免疫，按每只小鼠免疫量100μg计算所需抗原体积，使用等体积弗氏不完全佐剂进行抗原乳化，皮下多点注射进行免疫；
三免：两周后进行第三次免疫，按每只小鼠免疫量100μg计算所需抗原体积，使用等体积弗氏不完全佐剂进行抗原乳化，皮下多点注射进行免疫；
血清采集：三免后一周，尾静脉采血30～50μl，凝血后离心收集血清；
ELISA检测血清效价：CBS包被P300396蛋白，终浓度为1μg/ml，100μl/孔，4℃过夜后用0.1％酪蛋白-PBS进行封闭，37℃封闭1h后洗板；小鼠血清起始稀释度为1:1000，倍比稀释，PBS为阴性对照，ELISA检测血清效价，酶标仪测定OD450读数，结果如图3所示。结果显示经过三刺免疫后5只小鼠血清效价相近，均可达到1:243000，选取最高值的小鼠进行细胞融合。
2、细胞融合
(1)至少融合前一周准备小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，调整细胞状态至对数生长期，选择ELISA效价最高的小鼠，融合前3天对小鼠进行加强免疫，100μg/只，腹腔注射；
(2)融合：取小鼠脾脏，机械破碎后收集脾细胞，200目筛网过滤，PBS洗涤3次；收集SP2/0细胞，PBS洗涤3次；细胞计数后按SP2/0:脾细胞＝1:2.5的比例进行混合，离心后弃去PBS，使用细胞融合仪进行细胞融合，融合结束，细胞离心后加入含HAT的完全培养基，重悬混匀细胞后铺板于96孔板中；
(3)换液：融合后5天进行一次半换液。
3、杂交瘤筛选
ELISA检测：包被抗原P300396，浓度为1μg/ml，融合后7天吸取细胞培养上清进行ELISA检测，记录读数大于1.0的孔，做好标记并进行半换液；ELISA复检：次日对进行补液的阳性孔进行复检，记录效价稳定的克隆号，检测结果如图4所示。
4、稳定细胞株建立
(1)首次亚克隆：从上步中选择复检阳性细胞孔24G12、12F2、13H2、15H6、10B2、(Ery)-16H7株、13E3、18A4、19E12进行亚克隆筛选，有限稀释法，完全培养基，按每孔1个细胞的数量铺板于96孔板中；
(2)7天后镜下观察，标记出单克隆孔，次日进行ELISA检测，舍弃转为阴性的克隆号，对于阳性克隆，挑选生长旺盛的孔进行一次补液；
(3)二次亚克隆：从上步中选择阳性细胞孔进行亚克隆筛选，有限稀释法，完全培养基，按每孔1个细胞的数量铺板于96孔板中；
(4)7天后镜下观察，标记出单克隆孔，次日进行ELISA检测，检测结果如图5所示；亚克隆至ELISA检测阳性率为100％时，挑选生长旺盛的孔进行扩大培养，冻存保种。
5、腹水制备
注射稳定杂交瘤细胞至小鼠腹腔，1*106个细胞/只小鼠，10天后小鼠腹腔明显膨胀后处死小鼠，采集腹水。进行ELISA检测，结果图6所示。
6、腹水纯化及检测
(1)纯化柱的平衡：使用10倍柱床体积的去离子水洗去ProteinG纯化柱中的乙醇保护液，再用10倍柱床体积的0.01MPBS(pH7.4)冲洗平衡纯化柱；
(2)腹水离心后0.45μm孔径滤膜过滤，进行过柱纯化；
(3)使用0.1M甘氨酸(pH2.5)进行洗脱，收集纯化产物，并立即用1MpH9.0Tris-HCl中和；
(4)纯化的抗体用0.01MPBS(pH7.4)透析，浓缩后，-20℃保存备用；
(5)浓度测定：使用Nano-500测定抗体浓度；
(6)抗体纯度检测：SDS-PAGE检测抗体纯度；
(7)抗体效价检测：CBS包被P300396蛋白，终浓度为1μg/ml，100μl/孔，4℃过夜后用0.1％酪蛋白-PBS进行封闭，室温封闭1h后洗板，抗体起始稀释度为1:2000，倍比稀释，PBS为阴性对照，ELISA检测抗体效价，酶标仪测定OD450读数，如图7所示。
五、纯化抗体HRP标记
抗体标记：利用经典过碘酸钠法将纯化的抗体标记辣根过氧化物酶。
1、抗体配对
(1)CBS包被各个纯化后单克隆抗体，终浓度为1μg/ml，100μl/孔，4℃过夜后用0.1％酪蛋白-PBS进行封闭，37℃封闭1h后洗板；
(2)加入50μl夹心抗原，即P300396蛋白(终浓度100ng/ml)，再加入50μl标记后抗体(终浓度为1/10000稀释)，37℃孵育1h；
(3)洗板5次，每孔加入100μl的TMB工作液，显色5min后，每孔加入50μl终止液，酶标仪测定OD450处吸光值，检测结果如图8所示。
2、灵敏度测定
CBS包被捕获抗体，终浓度为1μg/ml，100μl/孔，4℃过夜后用0.1％酪蛋白-PBS进行封闭，37℃封闭1h后洗板；加入夹心抗原P300396蛋白，终浓度3000ng/ml起始，3倍梯度稀释，再加HRP标记抗体，终浓度0.1μg/ml，37℃孵育1h，洗板，酶标仪测定OD450读数。检测结果如图9所示，根据检测结果，选择单抗16H7及单抗24G12-HRP进行双夹心定量Elisa检测方法的建立。并将分泌单抗16H7的小鼠杂交瘤细胞16H7株株和分泌单抗24G12的小鼠杂交瘤细胞24G12株送保藏中心进行保藏。
3、抗体WB验证
跑胶，抗原Ery-DC1-SpaA加样200ng，阳性对照Ery-DC1/DC2全菌加样5μl；转膜；封闭，将转好的膜加入PBST+5％脱脂牛奶，摇床上室温孵育1h；孵育一抗，PBST+5％脱脂牛奶稀释一抗，摇床上室温孵育1h；PBST洗膜3次，每次5min；PBST+5％脱脂牛奶稀释二抗(稀释比例1：10000)，摇床上室温孵育1h；PBST洗膜3次，每次5min；加显色液，转入发光设备拍照，结果如图10所示。
实施例2
定量夹心ELISA检测法的建立
1、夹心ELISA具体操作步骤
(1)使用包被液0.05M碳酸盐缓冲液(PH9.6，Na2CO31.59g、NaHCO32.93g)1:1000稀释单抗16H7，按每孔100μL加入96孔板中，4℃过夜包被，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；
(2)分别加入100μl含％脱脂奶粉的PBS封闭3h，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；
(3)猪丹毒SpaA抗原按100ng/孔加入后，于37℃反应60min，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；
(4)将24G12-HRP按1:2000进行稀释后，分别加入孔中于37℃反应60min，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；
(5)加入50μlTMB室温显色5min；
(6)加入50μl2M的H2SO4终止反应，OD450读数。
2、建立标准曲线
将经过纯化得到的纯度为90％的猪丹毒SpaA抗原作为标准样本，进行BCA定量后，将猪丹毒SpaA浓度调整至1μg/mL，随后进行2倍梯度稀释，得到不同浓度的猪丹毒SpaA标准品，将梯度稀释的猪丹毒SpaA标准品依次加入100μL，即得到100ng/孔，50ng/孔，25ng/孔，12.5ng/孔，6.25ng/孔，3.125ng/孔，0ng/孔，用于建立猪丹毒的标准曲线进行后续定量。将不同浓度与其对应的OD值输入Excel中进行曲线拟合，得到对应的浓度与OD值换算公式。如图11所示。
结果为：将猪丹毒SpaA作为标准样本，依次梯度稀释后作为标准品建立标准曲线，并将去除本底的OD值与对应的浓度进行统计学分析，计算后得到相应的公式，发现VLPs的浓度在0-1μg/ml时具有良好的线性关系，得到的计算公式为y＝1.3558x+0.0632，相关系数R2为0.993。
3、不同定量方法比对试验
将纯化后不同浓度的猪丹毒SpaA抗原，用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测试后，再用夹心ELISA进行检测，以BCA定量后浓度35μg/mL、60μg/mL、90μg/mL三个样本为例，根据得到的样本OD值与浓度对应的标准曲线计算SpaA-DC1的浓度，分析统计两种浓度定量方法的差异。结果为：夹心ELISA检测的样本浓度与BCA法测定蛋白浓度上下浮动范围均小于5％。
实施例3
猪丹毒SpaA双抗体夹心定量ELISA检测方法评价
(1)检测准确度评价：选择3种不同来源的蛋白进行定量检测，包括上述所述纯化后及未纯化的猪丹毒SpaA-DC1，以及实验室配制的圆支二联亚单位疫苗，同时使用BCA及SDS方法对三种样品进行分析与比较；ELISA、BCA及SDS定量检测整理数据结果如下表1所示，SDS胶图如图12所示。
表1：
结果显示，纯化样品：三种检测方法所得结果基本一致，与理论相符(定量数据为1.32mg/ml)；未纯化样品，经SDS及BCA检测数据对比，BCA数据检测了总蛋白的含量，不能区分目标蛋白与杂蛋白，因此BCA检测结果明显高于SDS，即BCA不能区分目标蛋白与杂蛋白；圆支疫苗产品的结果发现，由于疫苗产品抗原含量相对较低(25-30μg/ml)因此SDS灰度分析相对困难，不能真实反应最终结果；BCA检测数据中则包含了两种抗原成分，因此不能真实反应猪丹毒抗原的准确含量。
(2)灵敏度分析：用零浓度标准品或者样本稀释液作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的吸光度值A，据此可计算其平均值M及标准差SD。将M+2SD所对应的吸光度值代入标准曲线方程求出对应的浓度值，该浓度值即为检测灵敏度。该方法最低检测下限为0.1ng/mL，灵敏性非常高。

Claims (7)

1.一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括包被有抗猪丹毒SpaA蛋白单克隆抗体的酶标板、稀释液、封闭液、酶标抗体、浓缩洗涤液、显色液、终止液、标准品、阳性对照、阴性对照，所述包被有抗猪丹毒SpaA蛋白单克隆抗体的酶标板使用的是单抗16H7，所述单抗16H7由小鼠杂交瘤细胞(Ery)-16H7株获得，所述小鼠杂交瘤细胞(Ery)-16H7株于2023年5月17日送交至中国科学院微生物研所菌种保藏中心保藏，保藏号为45611。
2.根据权利要求1所述的一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的抗猪丹毒SpaA单克隆抗体，所述抗猪丹毒SpaA单克隆抗体为单抗24G12，所述单抗24G12由小鼠杂交瘤细胞(Ery)-24G12株获得，所述小鼠杂交瘤细胞(Ery)-24G12株于2023年5月17日送交至中国科学院微生物研所菌种保藏中心保藏，保藏号为45612。
3.根据权利要求1所述的一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于：所述稀释液为0.05M碳酸盐缓冲液，PH值为9.6，含有1.59g的Na2CO3、2.93g的NaHCO3。
4.根据权利要求1所述的一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA试剂盒，其特征在于：所述封闭液为含5％脱脂乳的PBS溶液。
5.一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用包被液稀释纯化后的单抗16H7，按照100μl/孔包被酶标板，37℃包被2h或者4℃作用过夜；
(2)甩去板中的液体，用洗涤液洗板5次，每次5min，最后一次拍干，加入封闭液，100μl/孔，置37℃孵育1.5h；
(3)用洗涤液洗板5次，加入稀释后的待检抗原样品及对照样品，100μl/孔，置37℃孵育，同时设置用脱脂乳代替的不加抗原对照；
(4)用洗涤液洗板5次，加入稀释的酶标抗体24G12-HRP，100μl/孔，置37℃孵育1h；
(5)用洗涤液洗板5次，加入TMB显色液，50μl/孔，室温显色15min；
(6)加终止液，50μl/孔，混匀后10min内测定OD450nm值。
6.根据权利要求5所述的一种猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心定量ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中包被液按照1:1000稀释单抗16H7，所述步骤(4)中酶标抗体按照1:2000稀释。
7.一种如权利要求1所述的猪丹毒SpaA蛋白双抗体夹心ELISA试剂盒在猪丹毒SpaA抗原的抗原检测中的应用。
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