CN101062941A - 一种重组戊型肝炎病毒蛋白、其制备方法及用途 - Google Patents

一种重组戊型肝炎病毒蛋白、其制备方法及用途 Download PDF

Info

Publication number
CN101062941A
CN101062941A CN 200710021746 CN200710021746A CN101062941A CN 101062941 A CN101062941 A CN 101062941A CN 200710021746 CN200710021746 CN 200710021746 CN 200710021746 A CN200710021746 A CN 200710021746A CN 101062941 A CN101062941 A CN 101062941A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hev
polypeptide
hepatitis
polynucleotide
serum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 200710021746
Other languages
English (en)
Inventor
孟继鸿
戴星
董晨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southeast University
Original Assignee
Southeast University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southeast University filed Critical Southeast University
Priority to CN 200710021746 priority Critical patent/CN101062941A/zh
Publication of CN101062941A publication Critical patent/CN101062941A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供一种方便易行、低成本并具有良好的抗原性和免疫原性的重组戊型肝炎病毒蛋白、其编码序列及用途。目前用于制备重组戊肝疫苗的HEV毒株均为第1基因型，而HEV p179是基于我国目前广泛流行的第4基因型HEV毒株制备，因此具有更强的针对性和实用价值；目前原核系统表达的重组HEV ORF2编码蛋白均以包涵体形式存在，而HEV p179在原核系统中不仅能够得到高效表达，且90％的目的蛋白天然可溶性；与目前真核系统、原核系统表达的HEV VLPs相比，直径约20nm的HEV p179－VLPs仅由179aa组成，肽链长度更短，是目前能够形成HEV VLPs的最小的重组HEV蛋白。

Description

一种重组戊型肝炎病毒蛋白、其制备方法及用途
一、技术领域
本发明属于分子生物学及医学领域，特别涉及一种重组戊型肝炎病毒蛋白、其制备方法及用途。
二、背景技术
现有技术：戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)是引起东南亚、中亚以及非洲等地急性传染性肝炎的主要病原体。HEV主要经过粪-口途径传播，通常是饮用受污染的水源引起，HEV引起的戊肝流行方式主要有暴发流行和散发两种。HEV的感染可以累及不同年龄的患者，但感染多见于成年人。一般来说，戊肝和甲肝的临床症状相似，目前的研究认为，在一些发展中国家HEV的感染率已经超过甲肝的感染率，而且病情也更为严重，研究显示在各类肝炎中，戊肝的病死率最高，尤其是在孕妇患者中，死亡率甚至超过20％。
作为发展中国家，我国HEV的感染情况同样值得重视。1986～1988年我国新疆南部地区曾发生HEV水型流行，共计发病119280例，死亡707例，是迄今为止世界上最大的一次戊肝流行。有学者对我国17个城市2548例急性散发型病毒性肝炎的血清学调查研究发现，戊肝占3.4～26.3％，平均为9.7％。而我们近来对全国10个省市及华东部分地区大规模人群的的调查研究发现，HEV IgG抗体的阳性率分别约为18％和17％。此外，卫生部的统计报告也表明，我国HEV的流行方式主要呈散发和小规模暴发两种形式，每年均有十数起小规模HEV的暴发流行，而且发病人数呈逐年上升趋势。其中2004年我国戊肝的发病人数几乎为2003年的两倍。由于目前尚缺乏特异性的治疗方法，因此控制HEV的传播和流行的手段主要是通过研制特异性的戊肝疫苗加以预防。
由于HEV缺乏有效的细胞培养系统，无法制备减毒疫苗或灭活疫苗，国内外研究多集中于基因工程重组戊肝疫苗的研制，因此采用合适的表达系统表达含有HEV中和抗原表位的重组HEV蛋白，对于研制有效的戊肝疫苗极为重要。尽管目前已有学者采用真核和原核表达系统成功制备了一些重组HEV蛋白，但是，由于采用真核表达系统费时费力费钱，采用原核表达系统时产物均以包涵体形式存在，需要经历变性和复性的过程，容易影响重组蛋白的天然构象，并造成产量的降低。因此，众多学者一直致力于采用原核表达系统表达天然可溶的重组HEV蛋白。然而，迄今为止仍无成功研制的报道。
三、发明内容
本发明针对上述技术问题，提供一种方便易行、低成本并具有良好的抗原性和免疫原性的重组戊型肝炎病毒蛋白、其制备方法及用途。
本发明的技术解决方案为：提供一种分离的重组戊型肝炎病毒多肽，它选自下组：a.具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；b.将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的缺失、插入或取代形成的，且具有能够诱导高滴度的、特异性的HEV中和抗体产生的由a衍生的多肽。提供一种多肽，该多肽是具有具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。提供一种分离的多核苷酸，选自下组：a.编码上述氨基酸序列多肽的多核苷酸；b.与多核苷酸a完全互补的多核苷酸。提供一种多核苷酸，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。提供上述多核苷酸的载体。一种遗传工程化的宿主细胞，其含有上述载体。一种重组戊型肝炎病毒多肽的制备方法，该方法包括：a.在适合表达重组戊型肝炎病毒多肽的条件下，培养所述的宿主细胞；b.从培养物中分离出重组戊型肝炎病毒多肽。一种诊断试剂或疫苗，它含有安全有效剂量的所述的多肽或所述的多核苷酸或所述的载体，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
本发明所述的一种新型重组HEV蛋白，含有179个氨基酸(HEVp179)。其氨基末端位于开放阅读框架2编码衣壳蛋白的380位至480位氨基酸之间，羧基末端位于580位至650位氨基酸之间或由此蛋白片段产生的衍生物，优选片段是戊型肝炎病毒第4基因型毒株开放读码框架2中编码中和抗原表位的位于第453位至631位氨基酸序列的基因片段。该重组HEV蛋白的特征在于含有戊型肝炎病毒的中和抗原表位，其编码的基因片段能够在原核表达系统中高效、可溶性表达，经过纯化后可以形成戊型肝炎病毒样颗粒(Hepatitis E viruslike paticles，HEV p179-VLPs)。
本发明所述重组HEV蛋白的制备方法方法：将编码HEV中和抗原表位的优选基因片段与质粒pET-28a(+)或经改造的质粒pET-28a(+)进行重组，再将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，在IPTG的诱导下进行表达。上述优选基因片段的核苷酸序列为：
GTTATCCAGGACTATGATAATCAACATGAGCAAGACCGCCCTACCCCCTCCC
CTGCTCCTTCTCGCCCTTTTTCTGTGCTTCGTGCTAATGATGTGCTTTGGCTC
TCTCTCACCGCCGCCGAGTATGATCAGACTACCTACGGCTCTTCTACTAACC
CTATGTATGTTTCTGATACTGTAACGTTTGTCAATGTGGCCACTGGCGCCCA
GGGGGTTTCGCGCTCTCTGGACTGGTCTAAGGTTACCCTTGATGGGCGTCCA
CTAACTACTATCCAGCAGTATTCCAAGACTTTCTATGTTCTGCCTCTTCGTGG
TAAGCTTTCTTTTTGGGAGGCTGGTACTACTAAAGCCGGCTACCCATACAAT
TATAATACTACTGCTAGTGATCAGATCCTGATTGAGAATGCAGCTGGCCATC
GGGTTTGTATTTCTACTTATACTACTAATTTGGGCTCCGGGCCTGTTTCTATC
TCTGCTGTCGGTGTCCTCGCACCCCATTCTGCATTGGCCGTTTTGGAGGACA
CTGTTGATTACCCT
本发明所述重组HEV蛋白HEV p179具有良好的抗原性和免疫原性。体外研究表明，在20～80ng剂量范围内，HEV p179-VLPs可以作为抗原用来检测HEV的特异性IgM和IgG抗体，上述检测方法中HEV p179-VLPs优选的剂量是50ng。动物实验结果表明，在2.5～80μg的剂量范围内，HEV p179-VLPs均能够诱导高滴度的、特异性的HEV中和抗体的产生，上述用于HEV疫苗研究的HEV p179-VLPs优选的剂量是20μg。因此HEV p179可以用于新型诊断试剂和疫苗的研制。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
(1)目前用于制备重组戊肝疫苗的HEV毒株均为第1基因型，而HEV p179是基于我国目前广泛流行的第4基因型HEV毒株制备，因此具有更强的针对性和实用价值；
(2)目前原核系统表达的重组HEV ORF2编码蛋白均以包涵体形式存在，而HEV p179在原核系统中不仅能够得到高效表达，且90％的目的蛋白天然可溶；
(3)与目前真核系统、原核系统表达的HEV VLPs相比，直径约20nm的HEVp179-VLPs仅由179aa(HEV ORF2编码的439～617aa)组成，肽链长度更短，是目前能够形成HEV VLPs的最小的重组HEV蛋白。
(4)众所周知，与一般的重组蛋白相比，VLPs具有更好的抗原性和免疫原性，此外，HEV p179-VLPs是由天然可溶的重组蛋白HEV p179形成，因此最大限度地保存了HEV中和抗原表位的天然构象，具有更高的研究价值。
四、附图说明
图1为重组质粒pET-28a(+)-179 PCR扩增及酶切鉴定图：1.DNA marker；2.HEV p179 PCR产物；3.pET-28a(+)/p179双酶切产物；
图2为克隆测序报告图(上游测序)；
图3为重组蛋白HEV p179表达产物裂解的SDS-PAGE分析图谱：1.重组菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-p179 IPTG诱导前菌体裂解液；2.重组菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-p179 IPTG诱导后菌体裂解液；3.重组菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-p179 IPTG诱导后菌体裂解液上清；4和5.重组菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-p179IPTG诱导前菌体裂解液沉淀；6.蛋白分子量Marker；
图4为p179蛋白与4种不同基因型抗HEV单克隆抗体的Western-blot分析结果：1.阴性对照；2.3G1(第I基因型)；3.E5E12(第II基因型)；4.4D3(第III基因型)；5.1G10(第IV基因型)；
图5为重组p179蛋白与戊肝病人血清标本的Western-blot分析结果；
图6为重组蛋白HEV p179表达产物纯化后SDS-PAGE分析图谱：1.重组菌BL21(DE3)/pET28a(+)/p179 IPTG诱导前菌体裂解液；2.重组菌BL21(DE3)/pET28a(+)/p179 IPTG诱导后菌体裂解液上清；3.重组蛋白HEVp179高效液相纯化产物；4.蛋白分子量Marker；
图7为HEV p179-VLPs与戊肝病人血清标本的Western-blot分析结果；
图8为HEV p179重组蛋白形成病毒样颗粒的电镜照片(箭头所示)(×20000)；
图9为HEV攻击猕猴系列血清抗-HEVIgM抗体和IgG抗体检测结果；
图10为HEV攻击猕猴系列血清抗-HEVIgM抗体和IgG抗体检测结果；
图11为13份门诊血清标本RT-nPCR产物部分电泳图谱：1.阴性对照；2.阳性对照；3.154号门诊血清标本；4.131号门诊血清标本；5.Markers；6.10号门诊血清标本；
图12为铝佐剂、HEV p179-VLPs免疫小鼠血清中HEV抗体水平随时间的变化：
图释：各剂量组随着免疫次数的增加，血清HEV IgG抗体抗体反应逐渐增强；而且在2.5～80mg/L大范围剂量内，所诱导的血清HEV IgG抗体水平确无明显差异。统计学分析结果见(d)中。
五、具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Joe Sambrook、David Russell等人，《Molecular Cloning：ALaboratory Manual》3rd ed(Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中，“重组戊型肝炎病毒多肽”、“重组戊型肝炎病毒蛋白”可互换使用，都指具有能够诱导高滴度的、特异性的HEV中和抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。
“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其它物质中分开，则为分离纯化的。
“分离的重组戊型肝炎病毒蛋白或多肽”是指重组戊型肝炎病毒多肽基本上不含有天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域技术人员能用标准的蛋白纯化技术纯化重组戊型肝炎病毒蛋白。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核表达系统中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或是非糖基化的。
本发明还包括重组戊型肝炎病毒蛋白的片断、衍生物和类似物。上述“片断”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然戊型肝炎病毒蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。根据本文的教导，这些片断、衍生物和类似物属于本领域技术人员公知的范围。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ NO：1所示的编码区序列相同或是简并的变异体。如上述“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQNO：2的蛋白质，但与SEQ NO：2所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列+各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)+非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和、或非编码序列的多核苷酸。
本发明的重组戊型肝炎病毒蛋白核苷酸全长序列或其片断通常采用PCR扩增法、重组法或人工合成法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，通常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接再一起。一旦获得了有关序列，就可以用重组法来大批量的获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明选用编码HEV第4基因型毒株ORF2中的编码HEV中和抗原表位的基因片段，位于453至631位共179个氨基酸，简称p179。通过分子克隆的方法，将其插入质粒pET-28a(+)中，构建重组质粒pET-28a(+)-179，经过PCR、双酶切和测序鉴定准确无误后，转化大肠杆菌BL21(DE3)，重组菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-179在IPTG的诱导下表达。应用SDS-PAGE和Western-blot对重组菌所表达的重组蛋白进行分析，其结果显示该重组菌能够高效、可溶性的表达目的蛋白，并且目的蛋白可以与戊肝病人血清和不同基因型HEV单克隆抗体发生免疫反应。此外，体外研究表明，HEV p179-VLPs可以作为抗原用来检测HEV的特异性抗体；动物实验结果表明，在2.5～80μg的剂量范围内，HEV p179-VLPs均能够诱导高滴度的、特异性的HEV中和抗体的产生。因此HEV p179可以用于新型诊断试剂和疫苗的研制。
实施例1
本实施描述了重组菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-179的构建方法：
(a)目的基因的获得：以HEV第4基因型中国株序列为模板，用引物1(5’-CCCCCCATGGTTATCCAGGACTATGATAATC-3’)和引物2(5’-CCCCTCGAGTCAAGGGTAATCAACAGTGTCCTCCA-3’)扩增ORF2编码多肽453-631(p179)的基因片段。PCR条件为：94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，35个循环。其中引物1和引物2分别含有NcoI和XhoI的酶切位点。PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化。
上述第453位至631位氨基酸序列(p179)，其所述的氨基酸序列如下：
VIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPM
YVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLS
FWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVL
APHSALAVLEDTVDYP。
上述第453位至631位氨基酸序列(p179)，其所述的核苷酸序列如下：
GTTATCCAGGACTATGATAATCAACATGAGCAAGACCGCCCTACCCCCTCCC
CTGCTCCTTCTCGCCCTTTTTCTGTGCTTCGTGCTAATGATGTGCTTTGGCTC
TCTCTCACCGCCGCCGAGTATGATCAGACTACCTACGGCTCTTCTACTAACC
CTATGTATGTTTCTGATACTGTAACGTTTGTCAATGTGGCCACTGGCGCCCA
GGGGGTTTCGCGCTCTCTGGACTGGTCTAAGGTTACCCTTGATGGGCGTCCA
CTAACTACTATCCAGCAGTATTCCAAGACTTTCTATGTTCTGCCTCTTCGTGG
TAAGCTTTCTTTTTGGGAGGCTGGTACTACTAAAGCCGGCTACCCATACAAT
TATAATACTACTGCTAGTGATCAGATCCTGATTGAGAATGCAGCTGGCCATC
GGGTTTGTATTTCTACTTATACTACTAATTTGGGCTCCGGGCCTGTTTCTATC
TCTGCTGTCGGTGTCCTCGCACCCCATTCTGCATTGGCCGTTTTGGAGGACA
CTGTTGATTACCCT。
(b)重组质粒和重组菌的构建：本实施例中，琼脂糖凝胶回收纯化均是使用上海申能博彩生物科技有限公司的“3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit”产品，按照说明书操作即可。PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化，用NcoI和XhoI双酶切后再经琼脂糖凝胶回收纯化。同时质粒pET-28a(+)用NcoI和XhoI双酶切后进行琼脂糖凝胶回收纯化。然后，将酶切纯化过的PCR片段和质粒pET-28a(+)按摩尔比3∶1混匀，在T4DNA连接酶作用下进行连接，最后转化E.coliBL21(DE3)，pET-28a(+)含有卡那霉素的抗药基因，因此在卡那霉素的固体培养基中筛选阳性克隆。
转化过程如下：将连接反应液5μl和50μl E.coli BL21(DE3)新鲜感受态细菌混匀，冰浴30min；42℃水浴100s，立即冰浴2min；加600μl LB，37℃1h后，取100μl涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜。筛选过程如下：首先挑取平皿上若干个单克隆，首先用引物1和引物2进行PCR筛选，PCR条件为94℃预变性3min，然后94℃变性1.5min，52℃退火2min，72℃延伸3min，30个循环，最后72℃延伸7min。然后，筛出的PCR阳性的克隆，抽取质粒，并用NcoI和XhoI双酶切鉴定(见图1)。最后，双酶切鉴定阳性的克隆进行测序(见图2)。测序完全正确的克隆即为含有重组质粒pET-28a(+)-179的E.coli BL21(DE3)。
(c)重组菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-179蛋白表达分析(如图3-图5所示)：重组菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-179和含空质粒菌BL21(DE3)-pET-28a(+)在37℃，IPTG诱导下表达目的蛋白，4℃5000g离心15分钟收集菌体并将菌体重悬于bufier A(20mM Tris-HCl，pH 7.4)，采用超声方法裂解菌体，提取全菌体蛋白后进行SDS-PAGE电泳，转膜并进行Western-blot分析，结果显示重组菌在20KD左右有一条新生的蛋白条带，位置与p179预期分子量大小一致，而对照空载体菌在相对应的位置无该条蛋白带；结果还显示重组菌所表达的重组p179蛋白能与I、II、III、IV型HEV单抗发生免疫印迹反应，呈单一清晰条带；同时重组菌表达的重组p179蛋白也可与戊型肝炎病人血清发生反应；而含空质粒菌BL21(DE3)-pET-28a(+)免疫印迹分析无阳性免疫条带出现。说明重组菌所表达重组p179蛋白与各型抗HEV的单抗和病人血清标本均有较好的免疫反应性。
实施例2
本实施描述了重组p179蛋白的纯化方法及其电镜分析结果(图6-图8)：
重组p179蛋白的纯化采用下述方法进行：重组菌BL21(DE3)-pET-28a(+)-179在37℃，IPTG诱导下表达目的蛋白。4℃5000g离心15分钟收集菌体并将菌体重悬于buffer A(20mM Tris-HCl，pH 7.4)，采用超声方法裂解菌体。然后，4℃20000g离心30分钟去除沉淀，需要说明的是HEV p179为非融合蛋白且大多以可溶性形式存在于裂解液的上清中。HEV p179的纯化采用Biologic LP System(Bio-Red，England)。首先，将裂解所获的上清加入已预先用buffer A平衡的阴离子交换层析柱(SOURCE 30Q，10ml bed volume)，然后用含有0-1mol/L NaClbuffer A进行线性梯度洗脱，流速1ml/min。收集目的蛋白组分，并进一步用已预先用buffer A平衡的凝胶层析柱(Sephadex G75，100ml bed volum)纯化，用buffer A作为洗脱液，流速0.5ml/min，收集含有HEV p179的组分并用SDS-PAGE和Western blot方法进行鉴定和分析，并进行超滤浓缩。浓缩后的HEV p179重组蛋白的浓度用BCA方法确定。
将经过高效液相纯化的重组蛋白HEV p179经5～50％蔗糖密度梯度离心，进一步进行纯化，并将纯化后的重组蛋白HEV p179经10g/L磷钨酸(pH 7.0)负染，透射电镜观察发现，重组蛋白HEV p179可以形成球形空壳样颗粒，直径约20nm，为经过纯化后重组蛋白HEV p179自身装配而形成的HEV VLPs(HEVp179-VLPs)。
实施例3
本实施描述了重组p179蛋白作为抗原用于检测HEV IgG抗体的间接法ELISA的评价，其中重组p179蛋白的包被剂量范围是20～80ng/孔，优选浓度是50ng/孔。
(a)检测步骤：
预先将重组p179蛋白作为抗原包被聚苯乙烯微孔条(50ng/孔)，4℃过夜；次日1×PBST洗液洗板3次，扣干；用封闭液封闭预包被微孔板，37℃1h；PBST洗涤2次，扣干；密封，4℃储存备用。
加样：每孔加95μl样本稀释液，依次加入5μl血清标本，设立空白对照孔、阴性对照血清、阳性对照血清和待检样本，轻拍混匀；
温育：置37℃温育30min；
洗涤：弃去孔中液体，PBST洗涤5次，扣干；
加酶：除空白对照孔外，每孔加入工作浓度的HRP标记羊抗人IgG，每孔100μl；
温育：置37℃温育30min；
洗涤：弃去孔中液体，PBST洗涤5次，扣干；
显色：包括空白对照孔，每孔加入底物A液、B液各50μl，轻拍混匀，置37℃避光显色10min；
终止：每孔加入终止液50μl终止反应，轻拍混匀；
测定：20min内用Bio-Rad 550酶标仪测A450。酶标仪以空白对照孔调零，在波长450nm处测定各孔OD值，打印检测结果；
结果判定：待检标本的OD值如低于临界值，则判定为阴性结果；如果标本的OD值大于或等于临界值则判定为阳性结果。
cut-off值的确定：检测2000份南京高校入学新生血清标本，阴性平均OD值为0.058，标准误差s为0.020，标准cut-off值＝阴性均值+3×s＝0.118，检测180份阳性血清标本确定矫正cut-off值为0.13×阳性对照均值+阴性平均值＝0.13×1.06+0.058＝0.196。
(b)敏感性和特异性评价：
(1)本方法检测19份HEV RT-nPCR阳性的戊型肝炎病人血清，结果全部抗-HEV IgG抗体阳性，检出率100％。这些病人均经临床确诊为HEV感染的病人，没有一例漏诊。
(2)检测52份收集自美国、巴西、墨西哥、印度、越南、俄罗斯、索马里及中国等世界不同国家血清标本，于美国CDC用多种方法检测阳性48份，阴性4份；本方法也检测出48份阳性，4份阴性，总检出符合率为100％(表1)，说明本方法能检测出来源于世界不同国家的HEV血清标本，具有较广泛的血清反应性。
表1：采集自不同国家的52份血清标本抗-HEV IgG抗体检测结果
标本来源     美国CDC检测结果   IgG HEV ELISA间接法检测结果 合计
  阳性   阴性   阳性   阴性
  美国印度巴西墨西哥俄罗斯索马里越南中国   1151121522   10001002   1151121522   10001002   1251131511
  合计   48   4   48   4   52
(3)采用本方法检测5份HAV阳性、8份HBV阳性和12份HCV阳性血清标本，结果全部阴性，说明本方法与甲型、乙型和丙型肝炎病人血清无交叉反应，具有较好的特异性。
(4)检测180份中国健康人血清标本和30份美国健康献血者血清标本，结果均为阴性，与CDC检测结果完全一致，符合率为100％。
(c)重复性评价
将3份阳性血清标本在同一时间段测定10次，计算批内变异系数；将同样的3份阳性血清连续测定5次，每天一次，计算批间变异系数；结果变异系数均小于10％，显示本方法的重复性较好(如表2所示)。
                        表2  重复性试验结果(CV)
  样本                批内变异                批间变异
ξ s CV(％) ξ s CV(％)
  强阳性中阳性弱阳性   1.8290.9470.462   0.0620.0310.034   3.43.37.4   1.7930.8970.453   0.0840.0680.041   4.77.69.1
(d)稳定性评价
将试剂盒(包括预包被微孔板标本稀释液、酶结合物底物液A和B、终止液)于37℃温箱放置4天，与放置在4℃冰箱的试剂盒平行检测3份阳性和1份阴性血清标本，进行热稳定性试验(如表3所示)。经配对T检验分析，P值＝0.12，显示两种状态下OD值的差异不具有统计学意义。按37℃放置1天相当于4℃放置1.6个月计算，该试剂至少可以稳定6个月。
     表3：37℃和4℃放置结果比较(OD值)
  检测样品   放置于4℃   放置于37℃
  强阳性中阳性弱阳性阴性   1.6340.9320.3280.026   1.4590.8470.3090.028
实施例4
本实施描述了重组p179蛋白作为抗原用于检测HEV IgM抗体的捕获法ELISA的评价。其中酶标抗原(重组p179蛋白)的剂量范围是20～100ng/孔，优选浓度是50ng/孔。
首先制备了抗人IgM单克隆抗体作包被抗体，专一地捕获血清中的IgM，再表达重组p179蛋白，并用辣根过氧化物酶标记制备酶标抗原，建立HEV IgM抗体捕获法。
(a)特异性捕获HEV IgM抗体的证据
(1)5份HEV IgG阳性但IgM阴性的血清标本检测结果为阴性，5份HEVIgG阴性但IgM阳性的血清标本检测结果为阳性，说明所选择的包被抗体只能特异性捕获血清中的IgM抗体，不与IgG抗体结合。
(2)中国株HEV攻击2只猕猴前和攻击后第1、3、5、6、7、8、10、11、14周收集血清，本方法检测HEV IgM抗体，ELISA一步法检测HEV IgG抗体。一只猕猴病毒攻击后5周检测到IgM和IgG抗体均阳转，6周时IgM抗体滴度达高峰，之后滴度逐渐下降，11周转阴，而IgG抗体阳转后滴度逐渐升高，11周时仍维持较高滴度(图9)。另一只猕猴病毒攻击后8周IgM抗体阳转，10周达高峰，之后抗体滴度逐渐降低，14周转阴，IgG抗体于病毒攻击后10周阳转，抗体滴度不断升高，14周时仍维持在较高水平(图10)。说明本检测方法能与中国株HEV实验感染的猕猴血清反应，并具有较高的灵敏度。病毒攻击后第14周本方法检测结果为阴性，而此时IgG抗体滴度较高，提示本方法选择的包被抗体M3只能特异性地捕获血清中的IgM抗体，不与IgG抗体结合。
(3)检测墨西哥株HEV攻击黑猩猩系列血清，病毒攻击后4周IgM抗体阳转，之后滴度逐渐降低，10周时转阴；IgG抗体也于病毒攻击后4周阳转，之后滴度逐渐升高，并持续到3个月，仍维持较高滴度(表4)。
                   表4  墨西哥株HEV攻击黑猩猩系列血清抗体检测结果
  检测方法                         血清收集时间
  0周   4周   6周   8周   10周   3月
  ELISAIgG一步法IgM抗体捕获法   0.0580.042   0.3271.783   0.4191.416   0.4160.729   0.9430.025   1.760.034
(4)DTT破坏试验：10份抗HEV-IgM阳性血清与0.2mol/L DTT混合，37℃作用1小时，检测结果全部阴性，DTT破坏试验阳性；同一10份阳性血清不经DTT处理，检测结果仍为阳性。说明包被抗体捕获血清中的免疫球蛋白能被DTT完全破坏，故均为IgM类。
(b)敏感性和特异性
(1)本方法检测37份HEV RT-nPCR阳性的肝炎病人血清，结果全部抗-HEVIgM抗体阳性，检出率100％。这些病人均为确诊的中国戊型肝炎病人，没有一例漏诊。
(2)采集自美国、印度、墨西哥、俄罗斯、索马里、越南、中国的52份血清标本，美国CDC用多种方法检测，阳性48份，阴性4份，本方法也检测出48份阳性，4份阴性，总检出符合率为100％(表5)，说明本方法能检测出来源于不同国家的HEV血清标本，具有较为广泛的血清反应性。
表5  采集自不同国家的47份血清标本抗-HEV IgM抗体检测结果
标本来源   美国CDC检测结果(份)   IgM抗体捕获法检测结果(份)   合计
  阳性   阴性   阳性   阴性
  美国印度墨西哥俄罗斯索马里越南中国   115221522   1001002   115221522   1001002   125231511
  合计   48   4   48   4   52
(3)48份血清标本用ELISA IgM抗体捕获法与IgM抗体一步法都检测出24份阳性标本和24份阴性标本，检出率相同，其中有22份阳性血清捕获法测OD450值明显高于一步法，20份阴性血清捕获法测OD450值低于一步法(表6)，说明两种方法相比，IgM抗体捕获法具有阴性本底低、阳性标本OD值高的特点，便于结果判断，大大避免了ELISA一步法中常遇到的本底较高，结果判断模糊的情况。
表6  本方法与ELISA一步法检测48份血清标本OD值比较
标本号         阳性血清        阴性血清
  IgM抗体捕获法   ELISA一步法   IgM抗体捕获法   ELISA一步法
  1234567891011131415161718192021222324   1.6981.6131.7041.7411.8681.4841.5300.7950.6661.5630.2750.7440.9021.9511.7391.6571.3470.9730.6790.7340.5260.8810.936   1.0651.1380.9860.9720.9590.8510.9580.6800.6731.0180.2570.6160.7351.6671.4231.2090.9840.6340.8240.6410.4980.8650.892   0.0580.0500.0460.0530.0590.0700.0610.0640.0910.0680.0680.0660.044-0.0060.0020.0380.0620.0250.0540.0630.0330.0720.069   0.0520.0790.0780.0630.0850.0720.0700.0700.0790.0740.0870.0720.0590.0660.0680.0720.0690.0570.0610.0470.0570.0580.061
(4)HEV抗原中和实验：10份HEV阳性血清分别加入重组HEV p179抗原，37℃温育1小时，检测结果全部阴性，中和实验阳性；对照组此10份血清未加入重组抗原，37℃温育1小时，检测结果全部阳性。
(5)检测5份HAV阳性、8份HBV阳性和12份HCV阳性血清标本，结果全部阴性，说明本方法与甲型、乙型、丙型肝炎病人血清无交叉反应，具有较好的特异性。
(6)186份健康人血清标本检测结果全部阴性。
(c)与Genelabs试剂盒比较
(1)291份门诊血清标本中，14份标本Genelabs公司试剂盒和本方法都能检测出IgM抗体阳性，261份标本均检测为阴性，符合率为94.5％(14/30)，另外有3份标本Genelabs公司试剂盒检测IgM抗体阳性，本方法检侧为阴性，13份标本本方法检测为IgM抗体阳性，Genelabs公司试剂盒检测为阴性(表7)，对这13份标本进行HEV RT-nPCR检测，得到2份阳性(图11)，说明至少此2份血清标本确实曾感染HEV，完全排除假阳性的可能，这13份标本HEV抗原中和实验均为阳性，也可以排除这13份标本假阳性的可能。说明本方法具有更好的血清反应性，灵敏度较高。
表7  门诊血清标本本方法和Genelabs试剂盒检测结果比较
  Genelabs公司HEVIgM抗体试剂盒   HEV IgM抗体捕获法 合计
  阴性   阳性
  阴性阳性合计   2613   1314   27417
  264   27   291
(2)Genelabs公司试剂盒检测2只中国株HEV攻击猕猴系列血清，结果都没有检出抗体阳转，而本方法检测2只猕猴系列血清均阳转，两种方法检测结果有较大差异，为了进一步验证检测结果，我们用国产万泰抗-HEV IgM抗体诊断试剂盒进行检测，一只猕猴系列血清检测到3份阳性，另一只检测到一份弱阳性。说明中国株HEV攻击猕猴，产生抗-HEV IgM抗体，但Genelabs公司试剂盒漏检。
(d)稳定性
将试剂盒(预包被酶标板标本稀释液、酶结合物显色液A和B终止液)于37℃温箱放置4天，与放置4℃的试剂盒平行检测4份血清标本，进行热稳定性试验(表8)。经配对设计T检验分析，P＝0.12，表明两者OD值的差异不具有统计学意义。按37℃放置1天相当于4℃放置1.6个月计算[0]，该试剂在4℃至少稳定6个月。
      表8  37℃放置4天稳定性试验结果
样品   放置于4℃(OD值)   放置于37℃(OD值)
  强阳性中阳性弱阳性阴性   1.6340.9320.3280.026   1.4590.8470.3990.028
(e)重复性
3份阳性标本同时测定10次，计算批内变异系数，连续测定5天，每天测定一次，计算批间变异系数(表9)，均小于10％，重复性较好。
                            表9  重复性实验结果
  样本               批内变异               批间变异
ξ s CV(％) ξ s CV(％)
  强阳性中强阳性弱阳性   1.8290.9470.462   0.0620.0310.034   3.43.37.4   1.7930.8970.453   0.0840.0680.041   4.77.69.1
实施例5
本实施描述了重组p179蛋白作为候选HEV疫苗的免疫原性研究。
(a)候选HEV疫苗的制备
将纯化后的HEV重组蛋白HEV p179-VLPs以生理盐水稀释至5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L和160mg/L，然后加入等体积铝佐剂(1g/L)吸附过夜，即为制备的候选HEV疫苗。其中HEV p179的浓度分别位2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L和80mg/L。
(b)动物分组及免疫方案
将70只BALB/c小鼠随机分为7组，每组10只，包括6个实验组、1个铝佐剂对照组，6个实验组分别命名为E2.5、E5、E10、E20、E40和E80，并分别予以0.1mL/只皮下多点注射小鼠候选HEV疫苗2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L和80mg/L，然后于首次免疫后4、6周以0.05mL/只腹腔注射相同浓度的抗原加强免疫。铝佐剂对照组组则在相同时间注射相同剂量的铝佐剂(1g/L)作为对照。
(c)实验动物的血清采集
所有实验动物均于免疫前和免疫后2、4、6、8、10、12、14周经眼眶静脉取血，离心后收集血清，将所有血清均贮存于-20℃。待实验结束后检测HEV特异性抗体的产生情况。
(d)免疫动物血清HEV IgG抗体的检测
动物免疫实验结果表明(图12)，HEV p179-VLPs 2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L和80mg/L组动物血清中HEV抗体的A450值于初次免疫2周后开始逐渐增高，显示实验组小鼠HEV IgG抗体阳转；第3次免疫后，全部免疫动物出现HEV IgG抗体阳转，其HEV IgG抗体滴度提高，并至少持续至免疫后3个月。与Al(OH)3对照组相比，第4周后实验组A450值明显高于对照组，差异具有显著性意义(P＜0.01)。比较不同时间点的各实验组吸光度A450值发现，HEV p179-VLPs各实验组动物HEV IgG抗体反应A450值在第12周达到最高水平。进一步比较发现，与第4周相比，第6、8、10、12、14周HEV IgG抗体反应A450值水平明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)，同第6周相比，第8、10、12、14周HEV IgG抗体反应A450值水平明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。提示随着免疫次数的增加，抗体反应逐渐增强。铝佐剂对照组未检测出抗体应答。此外，研究结果同样显示，该新型HEVp179-VLPs在2.5～80mg/L大范围剂量内，所诱导的血清HEV IgG抗体水平确无明显差异，提示HEV p179-VLPs具有良好的免疫原性。
实施例6
中和抗体在一定程度上反映了疫苗的保护性效果，由于缺乏合适的细胞培养体系，本研究中我们采用基于RT-nPCR的体外中和试验检测HEV p179-VLPs诱导小鼠产生HEV中和抗体的能力。为进一步病毒攻击保护试验提供依据。
将Al(OH)3、E2.5、E5、E10、E20、E40和E80实验组免疫小鼠14周采集的、每组10只动物血清分别进行等量混合，1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀释后与定量HEV混合，按材料与方法中所述方法检测HEV中和抗体。结果如表10所示，1∶10、1∶20和1∶40稀释的不同剂量组的免疫动物血清均可有效中和HEV。提示基于新型HEV p179-VLPs制备的候选HEV疫苗能够诱导动物产生特异性的、具有中和作用的HEV抗体。
表10  Al(OH)3、HEV p179-VLPs免疫小鼠第14周血清体外中和试验结果
Group
  Negative   Positive   Al(OH)3   E2.5   E5   E10   E20   E40   E80
  1∶101∶201∶401∶80   ----   +++-   ----   +++-   +++-   +++-   +++-   +++-   +++-
Negative：HEV IgG抗体阴性病人血清；Positive：HEV IgG抗体阳性病人血清；
+：中和试验结果表明能够中和HEV；-：中和试验结果表明不能中和HEV.
实施例7
本实施例描述了HEV p179-VLPs免疫恒河猴后免疫效果的评价。
本实验中，我们选用剂量为20μg的HEV p179-VLPs制备的候选戊肝疫苗免疫恒河猴，以Al(OH)3佐剂为对照，每组5只。采用ELISA法检测HEV IgG抗体的产生水平，并计算其几何平均滴度(GMTs)。结果发现，首次接种后4周候选戊肝疫苗组动物HEV IgG抗体全部转阳，并维持至实验结束。
表3-8 不同剂量的实验性HepE疫苗诱导小鼠产生HEV IgG抗体的水平比较(GMTs)
Group                        Titers of anti-HEV(week of post immunization)
  0   2   4   6   8   10   14   18
  Group Al(OH)3Group E20   --   --   -107   -8444   -63034   -67758   -63034   -67758
“-”：1∶100的免疫血清检测结果为阴性。
进一步的病毒攻击试验结果表明，候选戊肝疫苗组动物在病毒攻击后均无戊肝症状的出现，未出现粪便排毒和病毒血症；而对照组动物均出现不同程度的戊肝症状，并伴有粪便排毒和病毒血症。
                         序列表
<110>东南大学
<120>一种重组戊型肝炎病毒蛋白、其制备方法及用途
<160>4
<210>1
<211>537
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)…(537)
<400>1
1    GTTATCCAGGACTATGATAATCAACATGAGCAAGACCGCCCTACCCCCTCCCCTGCTCCT
1    ValIleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaPro
61   TCTCGCCCTTTTTCTGTGCTTCGTGCTAATGATGTGCTTTGGCTCTCTCTCACCGCCGCC
21   SerArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAla
121  GAGTATGATCAGACTACCTACGGCTCTTCTACTAACCCTATGTATGTTTCTGATACTGTA
41   GluTyrAspGlnThrThrTyrGlySerSerThrAsnProMETTyrValSerAspThrVal
181  ACGTTTGTCAATGTGGCCACTGGCGCCCAGGGGGTTTCGCGCTCTCTGGACTGGTCTAAG
61   ThrPheValAsnValAlaThrGlyAlaGlnGlyValSerArgSerLeuAspTrpSerLys
241  GTTACCCTTGATGGGCGTCCACTAACTACTATCCAGCAGTATTCCAAGACTTTCTATGTT
81   ValThrLeuAspGlyArgProLeuThrThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPheTyrVal
301  CTGCCTCTTCGTGGTAAGCTTTCTTTTTGGGAGGCTGGTACTACTAAAGCCGGCTACCCA
101  LeuProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrPro
361  TACAATTATAATACTACTGCTAGTGATCAGATCCTGATTGAGAATGCAGCTGGCCATCGG
121  TyrAsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnIleLeuIleGluAsnAlaAlaGlyHisArg
421  GTTTGTATTTCTACTTATACTACTAATTTGGGCTCCGGGCCTGTTTCTATCTCTGCTGTC
141  ValCysIleSerThrTyrThrThrAsnLeuGlySerGlyProValSerIleSerAlaVal
481  GGTGTCCTCGCACCCCATTCTGCATTGGCCGTTTTGGAGGACACTGTTGATTACCCT
161  GlyValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaValLeuGluAspThrValAspTyrPro
<210>2
<211>179
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
ValIleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaPro
SerArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAla
GluTyrAspGlnThrThrTyrGlySerSerThrAsnProMETTyrValSerAspThrVal
ThrPheValAsnValAlaThrGlyAlaGlnGlyValSerArgSerLeuAspTrpSerLys
ValThrLeuAspGlyArgProLeuThrThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPheTyrVal
LeuProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrPro
TyrAsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnIleLeuIleGluAsnAlaAlaGlyHisArg
ValCysIleSerThrTyrThrThrAsnLeuGlySerGlyProValSerIleSerAlaVal
GlyValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaValLeuGluAspThrValAspTyrPro
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>合成引物
<400>3
CCCCCCATGG TTATCCAGGA CTATGATAAT C
<210>4
<211>35
<212>DNA
<213>合成引物
<400>4
CCCCTCGAGT CAAGGGTAAT CAACAGTGTC CTCCA

Claims (8)

1.一种分离的重组戊型肝炎病毒多肽，其特征在于，它选自下组：
a.具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；
b.将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的缺失、插入或取代形成的，且具有能够诱导产生高滴度、特异性的HEV中和抗体的由a衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有具有SEQ IDNO：2氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，选自下组：
a.编码权利要求1或2所述多肽的多核苷酸；
b.与多核苷酸a完全互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQID NO：2所示氨基酸序列的多肽。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求5所述的载体。
7.一种权利要求1所述的重组戊型肝炎病毒多肽的制备方法，其特征在于，该方法包括：
a.将编码重组戊型肝炎病毒蛋白的基因片段与原核系统表达载体进行重组，再将该重组质粒转化宿主菌，进行诱导表达，上述优选的原核系统表达载体为质粒pET-28a(+)或经改造的质粒pET-28a(+)；优选宿主菌是大肠杆菌BL21(DE3)。
b.从培养物中分离出重组戊型肝炎病毒多肽。
8.一种诊断试剂或疫苗，其特征在于，它含有安全有效剂量的权利要求1所述的多肽或权利要求3所述的多核苷酸或权利要求5所述的载体，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
CN 200710021746 2007-04-27 2007-04-27 一种重组戊型肝炎病毒蛋白、其制备方法及用途 Pending CN101062941A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200710021746 CN101062941A (zh) 2007-04-27 2007-04-27 一种重组戊型肝炎病毒蛋白、其制备方法及用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200710021746 CN101062941A (zh) 2007-04-27 2007-04-27 一种重组戊型肝炎病毒蛋白、其制备方法及用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101062941A true CN101062941A (zh) 2007-10-31

Family

ID=38964248

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200710021746 Pending CN101062941A (zh) 2007-04-27 2007-04-27 一种重组戊型肝炎病毒蛋白、其制备方法及用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101062941A (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101564533B (zh) * 2009-06-12 2012-01-04 东南大学 戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗及其制备方法
CN102643887A (zh) * 2012-04-28 2012-08-22 长春生物制品研究所有限责任公司 一种重组戊型肝炎疫苗抗原p179蛋白的发酵制备方法
CN103267846A (zh) * 2013-06-09 2013-08-28 湖南农业大学 一种检测2型猪圆环病毒IgM抗体的ELISA试剂盒
RU2493249C1 (ru) * 2012-04-27 2013-09-20 Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" Рекомбинантный штамм дрожжей hansenula polymorpha - продуцент капсидного белка вируса гепатита е
RU2501568C1 (ru) * 2012-04-27 2013-12-20 Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" Рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита е у животных
RU2501809C1 (ru) * 2012-04-27 2013-12-20 Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" Способ получения рекомбинантного капсидного белка вируса гепатита е и рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита е
CN108473540A (zh) * 2015-11-30 2018-08-31 生物梅里埃公司 突变的hev多肽及其用于测定抗hev抗体的用途
CN108912213A (zh) * 2015-11-27 2018-11-30 山东大学 肠道病毒71型vp1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用
CN112724205A (zh) * 2021-02-01 2021-04-30 山西省中医药研究院（山西省中医院） C种戊型肝炎病毒239蛋白制备病毒样颗粒的方法和应用
WO2023282243A1 (ja) * 2021-07-06 2023-01-12 株式会社先端生命科学研究所 Ｅ型肝炎ウイルス感染の検出方法、ｅ型肝炎ウイルス感染検出用抗原ポリペプチド及びキット

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101564533B (zh) * 2009-06-12 2012-01-04 东南大学 戊型肝炎蛋白-核酸复合疫苗及其制备方法
RU2501568C1 (ru) * 2012-04-27 2013-12-20 Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" Рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита е у животных
RU2501809C1 (ru) * 2012-04-27 2013-12-20 Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" Способ получения рекомбинантного капсидного белка вируса гепатита е и рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита е
RU2493249C1 (ru) * 2012-04-27 2013-09-20 Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" Рекомбинантный штамм дрожжей hansenula polymorpha - продуцент капсидного белка вируса гепатита е
CN102643887B (zh) * 2012-04-28 2014-11-26 长春生物制品研究所有限责任公司 一种重组戊型肝炎疫苗抗原p179蛋白的发酵制备方法
CN102643887A (zh) * 2012-04-28 2012-08-22 长春生物制品研究所有限责任公司 一种重组戊型肝炎疫苗抗原p179蛋白的发酵制备方法
CN103267846A (zh) * 2013-06-09 2013-08-28 湖南农业大学 一种检测2型猪圆环病毒IgM抗体的ELISA试剂盒
CN108912213A (zh) * 2015-11-27 2018-11-30 山东大学 肠道病毒71型vp1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用
CN108912213B (zh) * 2015-11-27 2021-08-03 山东大学 肠道病毒71型vp1抗原的免疫原性多肽及其制备方法与应用
CN108473540A (zh) * 2015-11-30 2018-08-31 生物梅里埃公司 突变的hev多肽及其用于测定抗hev抗体的用途
CN108473540B (zh) * 2015-11-30 2022-07-29 生物梅里埃公司 突变的hev多肽及其用于测定抗hev抗体的用途
CN112724205A (zh) * 2021-02-01 2021-04-30 山西省中医药研究院（山西省中医院） C种戊型肝炎病毒239蛋白制备病毒样颗粒的方法和应用
CN112724205B (zh) * 2021-02-01 2023-05-02 山西省中医药研究院（山西省中医院） C种戊型肝炎病毒239蛋白制备病毒样颗粒的方法和应用
WO2023282243A1 (ja) * 2021-07-06 2023-01-12 株式会社先端生命科学研究所 Ｅ型肝炎ウイルス感染の検出方法、ｅ型肝炎ウイルス感染検出用抗原ポリペプチド及びキット

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101062941A (zh) 一种重组戊型肝炎病毒蛋白、其制备方法及用途
Ye et al. Chimeric virus-like particle vaccines displaying conserved enterovirus 71 epitopes elicit protective neutralizing antibodies in mice through divergent mechanisms
Shao et al. Promising multiple-epitope recombinant vaccine against foot-and-mouth disease virus type O in swine
Sanford et al. Assessment of the cross-protective capability of recombinant capsid proteins derived from pig, rat, and avian hepatitis E viruses (HEV) against challenge with a genotype 3 HEV in pigs
CN110759973B (zh) 一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用
CN107432930B (zh) 一种i群4型禽腺病毒dna疫苗及其制备方法和应用
Guo et al. Self-assembly of virus-like particles of rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein expressed in Escherichia coli and their immunogenicity in rabbits
CN1903363A (zh) 一种嵌合型病毒样颗粒dna疫苗
CN102221618B (zh) 猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建及疫苗的制备方法
CN109535233A (zh) 猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒、制备方法及其应用和疫苗
Pérez-Filgueira et al. Preserved antigenicity of HIV-1 p24 produced and purified in high yields from plants inoculated with a tobacco mosaic virus (TMV)-derived vector
Guo et al. Protection of chickens against avian hepatitis E virus (avian HEV) infection by immunization with recombinant avian HEV capsid protein
CN1858062A (zh) 猪、牛口蹄疫病毒非结构蛋白酶联免疫吸附试验检测试剂盒
Lim et al. Immunogenicity and performance of an enterovirus 71 virus-like-particle vaccine in nonhuman primates
CN101074442A (zh) 百日咳疫苗保护性抗原的重组表达及其应用
CN101036784A (zh) 一种乙型肝炎治疗性细胞毒性t细胞表位疫苗及其制备方法
CN112812193A (zh) 诺如病毒gii.4型和肠道病毒71型的重组蛋白疫苗
CN107287268A (zh) 一种增强hiv‑1核酸疫苗免疫原性的佐剂
EP1000168B1 (en) A swine hepatitis e virus and uses thereof
CN106148568B (zh) 一种免疫磁珠试剂盒及其在检测小反刍兽疫病毒抗原中的用途
CN105259347B (zh) 一种肠道病毒71的检测方法及其试剂盒
CN110698542B (zh) 人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白、ELISA检测试剂盒及其应用
CN113512098A (zh) 鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接elisa方法及其应用
WO2015134480A1 (en) A live attenuated antigenically marked classical swine fever vaccine
Tian et al. A promising multiple-epitope recombinant vaccine against classical swine fever virus

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Open date: 20071031