CN102643887A

CN102643887A - 一种重组戊型肝炎疫苗抗原p179蛋白的发酵制备方法

Info

Publication number: CN102643887A
Application number: CN2012101291842A
Authority: CN
Inventors: 时成波; 曹玉锋; 徐军
Original assignee: Changchun Institute of Biological Products
Current assignee: Changchun Institute of Biological Products
Priority date: 2012-04-28
Filing date: 2012-04-28
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2032-04-28
Also published as: CN102643887B

Abstract

本发明公开了一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，包括以下步骤：A，培养工程菌株，并制备基础培养基和补料培养基；B，灭菌处理后，接入工程菌株；C，监测所工程菌株的OD600值，当OD600的值为40～80时，加入诱导剂进行诱导；D，当所述OD600的值至少提高百分之五时，进行收菌；E，离心提纯后，即得P179蛋白；在整个过程中实时监测基础培养基中葡萄糖的含量，当葡萄糖的含量少于预定值时，增加补料培养基。本发明通过大肠杆菌HEV179/BL21(DE3)以可溶性形式表达重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白，并可自主包装成粒径为18~20nm的VLP颗粒。所述VLP颗粒具有良好的免疫原性。该发酵工艺稳定、简单、易于产业化。

Description

一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法。

背景技术

戊型肝炎在亚洲、非洲及中美洲等发展中国家是一种非常严重的传染病，是导致发病及病死的重要因素。在一些发展中国家戊型肝炎可占到急性病毒性肝炎的50％，孕妇死亡率高达20％。1986～1988年在我国新疆的爆发流行，造成二十万人发病，孕妇平均死亡率为13．46％。因此，加强对戊型肝炎的预防控制极为必要。戊型肝炎病毒（HEV）是一种经肠道传播的病原体，是一种无包膜的单股正链RNA病毒，病毒颗粒呈球形，直径27～34nm，表面粗糙，不规则，在胞浆中装配，呈晶格状排列，可形成包涵体。HEV基因组全长约7.5kb，有3个开放性读码框(ORF)，分别为ORF1、ORF2和ORF3，其中ORF2基因长约2kb，为主要的结构基因编码区，编码病毒衣壳蛋白(pORF2)，产物为分子量约76kDa的糖基化蛋白，其c末端约200个氨基酸范围内有多个重要的免疫抗原表位。目前较为普遍的分型标准将HEV分为四个主要基因型，即基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型，其代表株分别为缅甸株、墨西哥株、美国株及中国株，各基因型在全球的地理分布有明显的差异。自2000年以来，Ⅳ型HEV已经成为在中国流行的主要基因型。

由于HEV不能在体外培养，目前无法制备HEV灭活病毒疫苗和减毒活疫苗，国内外研究多为基因重组疫苗，候选抗原肽多集中于ORF2区。有学者利用杆状病毒—昆虫细胞表达系统或汉逊酵母系统等真核系统成功表达了HEV重组蛋白，但真核表达系统存在表达量低、工艺复杂、成本高等问题。厦门大学等多家研发单位采用大肠杆菌原核表达系统，表达产物为包涵体，需要变性、复性等步骤，收率低、工艺复杂。

因此，现有戊型肝炎疫苗制备工艺有待于完善和发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达率高，工艺简单，制备成本低的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，包括以下步骤：

A，培养工程菌株，并制备基础培养基和补料培养基；

B，所述基础培养基经过灭菌处理后，接入所述工程菌株；

C，监测所述工程菌株的细菌细胞密度OD600，当所述OD600的值为40～80时，在基础培养基中加入诱导剂进行诱导；

D，当所述OD600的值至少提高百分之五时，进行收菌；

E，离心提纯后，即得P179蛋白；

在所述步骤B~D过程中，实时监测基础培养基中葡萄糖的含量，当葡萄糖的含量少于预定值时，增加补料培养基，使得葡萄糖的含量等于或大于所述预定值。

所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其中，步骤A中的所述工程菌株为大肠杆菌HEV179/BL21(DE3)。

所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其中，步骤A中的所述基础培养基的配方为：葡萄糖30~50g，酵母粉90~100g，蛋白胨200~250g，NaCl 80~100g，MgSO₄ 8~15g，消泡剂2~5ml，KH₂PO₄ 35~45g，Na₂HPO₄·12H₂O 120~150g，加蒸馏水定容至20L。

所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其中，步骤A中的所述基础培养基的配方还包括微量元素 30~50 ml，所述微量元素的配方为：FeSO₄·7H₂O 0.1~0.2g，CaC1₂·2H₂O 0.025~0.05g，ZnSO₄·7H₂O 0.0225~0.05g，MnSO₄·H₂O 0.001~0.005g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.001~0.005g，Na₂B₄O₇·12H₂O 0.0002~0.0005g，CuS0₄·5H₂O 0.01~0.04g，CoCl₂·6H₂O 0.001~0.005g，加蒸馏水定容至1L。

所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其中，在所述步骤B~D过程中，保持温度在35～38℃之间，溶解氧的浓度不低于30%，所述基础培养基的pH值为 6.0~8.0。

所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其中，所述预定值为0.1%。

所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其中，步骤A中，所述补料培养基的配方为A配方或B配方；

所述A配方为：葡萄糖230~250g，MgSO₄3~5g，加蒸馏水定容至1L；

所述B配方为：葡萄糖230~250g，酵母粉40~50g，MgSO₄ 3~5g，加蒸馏水定容至1L。

所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其中，所述诱导剂为IPTG，IPTG的浓度为0.2~1.0mmol/L，诱导时间为4~7小时。

所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其中，步骤C中，当采用空气为气源时，在所述OD600的值为40～50时，用诱导剂IPTG进行诱导；

所述OD600的值为55～65时，进行收菌。

所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其中，步骤C中采用纯氧为气源时，所述OD600的值为60～75时，加入诱导剂IPTG进行诱导；

所述OD600的值为80～100时，进行收菌。

本发明提供一种利用高密度发酵技术中试规模生产重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的方法。利用该工艺在较短时间内即可实现高密度发酵，目的蛋白表达量不低于15%，主要以可溶形式表达，表达产物在发酵过程中自主形成粒径为18~20nm的VLP颗粒，所述VLP颗粒具有良好的免疫原性。该发酵工艺稳定、简单、易于产业化。本发明所采用工程菌株为大肠杆菌HEV179/BL21(DE3)，该工程菌株由PET28A-P179重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经克隆筛选获得。所述大肠杆菌HEV179/BL21(DE3)以可溶性形式表达重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白，并可自主包装成粒径为18~20nm的VLP颗粒。所述重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白是基于Ⅳ型戊型肝炎病毒（HEV）中国株的蛋白片段，该蛋白片段为HEV ORF2编码的453~631位氨基酸，具体氨基酸序列见说明书核苷酸和氨基酸序列表。

附图说明

图1为本发明一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法中发酵罐内大肠杆菌的生长曲线图。

图2为本发明一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法中VLP颗粒的电镜观察图。

图3为本发明一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法中发酵菌的可溶性分析。

具体实施方式

本发明提供了一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明公开了一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，包括以下步骤：

步骤A，培养工程菌株，并制备基础培养基和补料培养基。所述工程菌株为大肠杆菌，具体为大肠杆菌HEV179/BL21(DE3)，所述大肠杆菌HEV179/BL21(DE3)能实现高密度发酵，菌密度OD600可达50~100，湿菌重达80~150g/L，发酵周期短，工艺稳定；且发酵过程中表达产物自主形成粒径为18~20nm的VLP颗粒，所述VLP颗粒与铝佐剂配制的疫苗具有很好的免疫原性，预防肝炎的保护率达100%。具体可从工作种子库里取出大肠杆菌的菌种1支，按1%比例复苏后，于37℃，200rpm过夜培养，作为种子液用于发酵，培养出来的种子液应在4h内使用，否则菌种活力会下降。

所述发酵基础培养基具体的配方为：葡萄糖30~50g，酵母粉90~100g，蛋白胨200~250g，NaCl 80~100g，MgSO₄ 8~15g，消泡剂2~5ml，KH₂PO₄ 35~45g，Na₂HPO₄ ·12H₂O 120~150g，加蒸馏水定容至20L，原位灭菌后使用。

酵母粉、蛋白胨作为菌体生长的氮源，主要构成菌体细胞物质、维持菌体正常生理活动并合成目的产物。氮源浓度过高，菌体则生长过快、对数期维持时间较短、菌体老化严重；浓度过低则菌体生长缓慢，不利于高密度发酵。葡萄糖成本低廉，容易被微生物利用，而成为首选优质碳源。葡萄糖一方面提供微生物生长代谢能量及菌体合成的碳骨架，但过快的生长速度可导致乙酸生成过量，对菌体生长及生理代谢构成不利影响；另一方面葡萄糖代谢产物可降低cAMP含量，通过代谢物阻遏效应发挥对受控于乳糖操纵子的T7启动子的负调控作用，进而降低目的蛋白表达量。本研究以[OD600值×目的蛋白表达量]为判断指标，在单因素分析的基础上进行正交试验，确定出所述基础培养基的具体配方，[OD600值×目的蛋白表达量]数值较高，表明工程菌收率、目的蛋白表达量较为可观。试验表明，酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、MgSO₄及微量元素含量对菌体生长及目的蛋白的表达量影响尤其明显。基于以上研究，发明上述发酵的基础培养基配方。

所述补料培养基的配方包括A配方或B配方；

所述A配方为：葡萄糖230~250g，MgSO₄ 3~5g，加蒸馏水定容至1L；

所述B配方为：葡萄糖230~250g，酵母粉40~50g，MgSO₄ 3~5g，加蒸馏水定容至1L。高压湿热灭菌后使用。

Mg^2＋是菌体多菌体多种酶的活性中心，Mg^2＋不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的生物合成，而且高密度时发酵菌体密度较大，碳源消耗较快，因此发酵过程中流加一定浓度的葡萄糖和MgSO₄。试验中A、B配方完全满足高密度发酵的需要。对菌体生长及表达量的影响无明显差异，从节约成本角度考虑选择A配方。

更优选的配方在所述基础培养基里还包括微量元素 30~50 ml，所述微量元素的配方为：FeSO₄·7H₂O 0.1~0.2g，CaC1₂·2H₂O 0.025~0.05g，ZnSO₄·7H₂O 0.0225~0.05g，MnSO₄·H₂O 0.001~0.005g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.001~0.005g，Na₂B₄O₇·12H₂O 0.0002~0.0005g，CuS0₄·5H₂O 0.01~0.04g，CoCl₂·6H₂O 0.001~0.005g，加蒸馏水定容至1L。过滤除菌。

微量元素是微生物生理活性物质的重要组成，并调节其生理活性，在低浓度时对微生物生长和产物的合成有促进作用，在高浓度是常表现出明显的抑制作用。经过长期微生物培养经验及试验，研制出上述微量元素的具体配方。

步骤B，所述基础培养基灭菌处理后，接入所述工程菌株。优先是将所述基础培养基注入发酵罐，具体地，将20L基础培养基注入发酵罐，然后116℃，30min进行原位灭菌，待基础培养基冷至室温后，按3~5%比例接入工程菌株。经摇瓶发酵多次试验得出，当所述发酵罐内的温度设为35～38℃，所述基础培养基的pH值为 6.0~8.0，起始转速为200rpm，起始罐压为0.5bar时，最适合用于培养，研究发现，当采用空气或纯氧为气源时，控制溶解氧为不低于30%，优选是不高于60%，发酵收菌量均可达到预期效果。

自接入工程菌株后，直到收菌完成，都需要实时监测基础培养基中葡萄糖的含量，当葡萄糖的含量少于预定值时，增加补料培养基，使得葡萄糖的含量等于或大于所述预定值；所述预定值为0.1%。优选保持葡萄糖的含量保持在0.1%～0.2%之间，通过基础培养基葡萄糖含量、pH值、溶解氧及菌浓变化确定补料时机和补料速率。

步骤C，监测所述工程菌株中大肠杆菌的菌浓度（OD600值），如图1所示，为本发明重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法中发酵罐内大肠杆菌的生长曲线图，采用空气为气源时随培养时间延长，菌浓度的增加，而当OD600达到40~50时，菌体达对数生长末期，比生长速率明显变低，此时开始诱导。采用纯氧为气源时，OD600达到60~75时，最高OD600可达到80，菌体达对数生长末期，此时开始诱导。即当所述菌浓度在OD600的值为40~80时，用诱导剂IPTG进行诱导；所述诱导剂IPTG的浓度为0.2~1.0mmol/L，诱导时间为4~7小时。选择菌体生长的对数末期进行诱导，既保证了工程菌良好的生长状态和表达活力，又保证了较高的菌体密度。诱导时菌体密度过低不利于高密度发酵，菌体密度过高过则表达活性下降。

步骤D，诱导后，菌浓度在OD600的值会有所提高，优选地，当所述菌浓度在OD600的值至少提高百分之五时，进行收菌。

具体地，采用空气为气源时，当所述菌浓度在OD600的值为40～50时，用诱导剂IPTG进行诱导；当所述菌浓度在OD600的值为55～65时，进行收菌，此时，湿菌重达80~100g/L。

又或者是，采用纯氧为气源时，当所述菌浓度在OD600的值为60～75时，用诱导剂IPTG进行诱导；当所述菌浓度在OD600的值为80～100时，进行收菌，此时湿菌重达150~180g/L。

由于高密度发酵时，菌体浓度较大、菌液粘稠，优选通过提高转速、加大通气量、培养后期通入纯氧等方式维持溶氧在30~60%之间。实验证实，溶氧过低菌体生长状态不好，目的蛋白表达量下降；氧浓度过高可发生氧中毒，并导致大肠杆菌自溶。

步骤E，离心提纯后，即得P179蛋白。具体地，发酵后的菌体经离心、破碎、粗提及精纯后，即可获得纯度不低于95%的P179蛋白。采用本发明的制备方法，重复发酵5批，收菌量稳定，表达量均不低于15%。所述P179蛋白能在大肠杆菌中自动包装成18~20nm的病毒样颗粒（VLP）。病毒样颗粒(VLP)是含有某种病毒一个或多个结构蛋白的病毒样颗粒，形态结构上类似完整病毒，具有与完整病毒相似的免疫原性，并通过激活抗原提呈细胞，诱导免疫应答。VLP不含有病毒核酸，不能自主复制，因此无致病性，安全性良好，在疫苗研发中具有广泛的应用前景。

以下是本发明一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法最优选的具体实施例：

1-1，培养工程菌株：取工作种子库大肠杆菌的菌种1支，按1%比例复苏后于37℃，200rpm过夜培养，作为种子液用于发酵，制备好的种子液应在4h内使用。

2-1，配制基础培养基：

葡萄糖45g，酵母粉95g，蛋白胨200g，NaCl 80g，MgSO₄ 10g，微量元素 50 ml，消泡剂5ml，KH₂PO₄ 35g, Na₂HPO₄·12H₂O 120g，加蒸馏水定容至20L，高压原位灭菌后使用。

2-2，配制补料培养基：A配方：葡萄糖250g，MgSO₄ 5g，加水定容至1L，高压原位灭菌后使用。

2-3，配制微量元素：FeSO₄·7H₂O 0.2g，CaC1₂·2H₂O 0.03g，ZnSO₄·7H₂O 0.05g，MnSO₄·H₂O 0.002g，Na₂MoO₄·2H₂O，0.002g，Na₂B₄O₇·12H₂O 0.0005g，CuS0₄·5H₂O 0.03g，CoCl₂·6H₂O 0.005g，加蒸馏水定容至1L，过滤除菌。

3-1，以空气为气源时的罐发酵：

将基础培养基20L注入发酵罐，116℃，30min进行原位灭菌，待基础培养基冷至室温后，按3~5%比例接入种子液。起始转速为200rpm，起始pH为7.0，起始罐压为0.5 bar。发酵过程中通过调节转速、通气量及补料速率控制溶解氧不低于30%，且不高于60%；实时监控基础培养基葡萄糖含量，当葡萄糖含量低于0.1%时，按100ml/h的起始速率流加25%葡萄糖与0.5% MgSO₄，维持葡萄糖浓度在0.1%~0.2%之间；发酵过程根据溶解氧及菌浓变化调整补料速率。菌浓在OD600约为40时，加入0.5mmol/L的IPTG进行诱导，诱导时间为4h，收菌浓度OD600达55。经SDS-PAGE分析显示，目的蛋白表达量不低于15%，可溶性蛋白占总目的蛋白的90%以上，表达产物自主形成粒径为18~20nm的VLP颗粒。

3-2，以纯氧为气源时的罐发酵：

将基础培养基20L注入发酵罐，116℃，30min进行原位灭菌，待基础培养基冷至室温后，按3~5%比例接入种子液。起始转速为200rpm，起始pH为7.0，起始罐压为0.5 bar。发酵过程中通过调节转速、通气量及补料速率控制溶解氧不低于40%；实时监控基础培养基葡萄糖含量，当葡萄糖含量低于0.1%时，按100ml/h的起始速率流加25%葡萄糖与0.5% MgSO₄；发酵过程根据溶解氧及菌浓变化调整补料速率。菌浓在OD600约为70时，加入0.5mmol/L的IPTG进行诱导，诱导阶段调整罐压至0.7 bar，增大通氧量及转速，控制溶氧不低于50%，诱导时间为5h，收菌浓度OD600达96。经SDS-PAGE分析显示，目的蛋白表达量不低于15%，可溶性蛋白占总目的蛋白的90%以上，表达产物自主形成粒径为18~20nm的VLP颗粒。

如图2所示，为本发明一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法中VLP颗粒的电镜观察图；可见生成的VLP颗粒的直径为18~20 nm，与铝佐剂配制的疫苗有很好的免疫原性。实验结果显示，所述P179蛋白与AL(OH)3佐剂配制的戊型肝炎疫苗（20μg/剂/0.5ml），免疫4-5周龄未孕雌性NIH小鼠10只，皮下注射0.5μg/只，4周后采血，用酶联免疫法测定抗-HEV IgG，发现小鼠抗体阳转率为100%，表明P179蛋白免疫原性良好。

本发明利用高密度发酵技术生产重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白。其优点在于：（1）在短时间内（不超过24h），即可实现高密度发酵，菌密度(OD600)达55~65，湿菌重达80~100g/L；在优选的发酵条件下，菌密度(OD600)达80~100，湿菌重达150~180g/L；（2）发酵过程中表达产物自主形成粒径为18~20nm的VLP颗粒。（3）目的蛋白表达量不低于15%，如图3所示，为本发明一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法中发酵菌的可溶性分析，其可溶性蛋白占总目的蛋白的90%以上，不需要变性和复性处理，简化了纯化工艺，降低了生产成本，易于产业化。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

<110> 长春生物制品研究所有限责任公司

<120> 一种重组戊型肝炎疫苗P179蛋白的制备方法

<130> 20080502

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 179

<212> PRT

<213> Ⅳ型戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus）

<220>

<400> 1

Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro

1 5 10 15

Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val

20 25 30

Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Thr Thr Tyr Gly

35 40 45

Ser Ser Thr Asn Pro Met Tyr Val Ser Asp Thr Val Thr Phe Val Asn

50 55 60

Val Ala Thr Gly Ala Gln Gly Val Ser Arg Ser Leu Asp Trp Ser Lys

65 70 75 80

Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Thr Thr Ile Gln Gln Tyr Ser Lys

85 90 95

Thr Phe Tyr Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala

100 105 110

Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser

115 120 125

Asp Gln Ile Leu Ile Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Cys Ile Ser

130 135 140

Thr Tyr Thr Thr Asn Leu Gly Ser Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val

145 150 155 160

Gly Val Leu Ala Pro His Ser Ala Leu Ala Val Leu Glu Asp Thr Val

165 170 175

Asp Tyr Pro

Claims

1.一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，包括以下步骤：

A，培养工程菌株，并制备基础培养基和补料培养基；

B，所述基础培养基经过灭菌处理后，接入所述工程菌株；

D，当所述OD600的值至少提高百分之五时，进行收菌；

E，离心提纯后，即得P179蛋白；

2.如权利要求1所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其特征在于，步骤A中的所述工程菌株为大肠杆菌HEV179/BL21(DE3)。

3.如权利要求1所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其特征在于，步骤A中的所述基础培养基的配方为：葡萄糖30~50g，酵母粉90~100g，蛋白胨200~250g，NaCl 80~100g，MgSO₄ 8~15g，消泡剂2~5ml，KH₂PO₄ 35~45g，Na₂HPO₄·12H₂O 120~150g，加蒸馏水定容至20L。

4.如权利要求3所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其特征在于，步骤A中的所述基础培养基的配方还包括微量元素 30~50ml，所述微量元素的配方为：FeSO₄·7H₂O 0.1~0.2g，CaC1₂·2H₂O 0.025~0.05g，ZnSO₄·7H₂O 0.0225~0.05g，MnSO₄·H₂O 0.001~0.005g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.001~0.005g，Na₂B₄O₇·12H₂O 0.0002~0.0005g，CuS0₄·5H₂O 0.01~0.04g，CoCl₂·6H₂O 0.001~0.005g，加蒸馏水定容至1L。

5.如权利要求1所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其特征在于，在所述步骤B~D过程中，保持温度在35～38℃之间，溶解氧的浓度不低于30%，所述基础培养基的pH值为 6.0~8.0。

6.如权利要求1所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其特征在于，所述预定值为0.1%。

7.如权利要求1所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其特征在于，步骤A中，所述补料培养基的配方为A配方或B配方；

所述A配方为：葡萄糖230~250g，MgSO₄3~5g，加蒸馏水定容至1L；

8.如权利要求1所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其特征在于，所述诱导剂为IPTG，IPTG的浓度为0.2~1.0mmol/L，诱导时间为4~7小时。

9.如权利要求1所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其特征在于，步骤C中，当采用空气为气源时，在所述OD600的值为40～50时，加入诱导剂IPTG进行诱导；

所述OD600的值为55～65时，进行收菌。

10.如权利要求1所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法，其特征在于，步骤C中采用纯氧为气源时，所述OD600的值为60～75时，加入诱导剂IPTG进行诱导；

所述OD600的值为80～100时，进行收菌。