CN104093416A

CN104093416A - 发酵方法

Info

Publication number: CN104093416A
Application number: CN201380007654.0A
Authority: CN
Inventors: P.M.H.德霍泰; P.戈芬
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2012-02-01
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2033-01-30
Also published as: BR112014017898B1; EP2809343A1; HUE037681T2; JP2018007676A; WO2013113729A1; JP2015506691A; JP6582020B2; CA2862560A1; CY1119902T1; ES2653261T3; BR112014017898A8; LT2809343T; DK2809343T3; HRP20171826T1; CN104093416B; JP6181082B2; US9475848B2; PL2809343T3; BR112014017898A2; SI2809343T1

Abstract

本发明涉及用于发酵博德特氏菌的方法，其包括a)提供博德特氏菌属物种细菌的样品；b)在第一环境中在至少一种bvg(博德特氏菌毒力基因)调节条件下将所述博德特氏菌属物种细菌的样品孵育至少5代，从而产生成熟培养物；c)在第二环境中在至少一种bvg调节条件不存在的情况下孵育所述成熟培养物；其中步骤c)在步骤b)之后发生。

Description

发酵方法

背景

细菌百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)是百日咳(在婴儿和年幼儿童中可严重的呼吸系统疾病)的致病因子。该疾病病程的特征在于快速咳嗽的发作，和随后的吸气努力，经常与特征性的“喘息”声音相关。在严重的情况下，缺氧可导致脑损伤；然而，最常见的并发症是继发性肺炎。

百日咳通常认为由百日咳博德特氏菌引起，但偶尔副百日咳博德特氏菌(B. parapertussis)从具有百日咳的典型体征和症状的患者分离到。副百日咳博德特氏菌感染比百日咳博德特氏菌的频率更低，其中5-10％的百日咳与副百日咳博德特氏菌相关(Mertsola (1985) Eur J Clin Microbiol 4; 123; Lautrop (1971) Lancet 1(7711) 1195-1198)。副百日咳博德特氏菌与轻度的临床症状相关，其组合它与百日咳博德特氏菌的血清学交叉反应性，使得副百日咳博德特氏菌难以诊断。

针对百日咳博德特氏菌的第一代疫苗是全细胞疫苗，由杀灭的全细菌构成。这些在20世纪50年代和60年代在许多国家被引入，并且成功降低百日咳的发病率。用全细胞百日咳博德特氏菌疫苗的问题在于与它们相关的高水平的反应原性。含有纯化的百日咳博德特氏菌蛋白的无细胞疫苗反应原性较低，并且已经被用于许多国家的接种疫苗计划。通常含有百日咳毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)和相当经常的百日咳杆菌粘附素(PRN)的无细胞疫苗被广泛使用并提供有效保护免于百日咳的严重性。

概述

介绍

在第一个方面，提供了发酵方法，其包括以下步骤：

a) 提供博德特氏菌属物种细菌的样品；

b) 在第一环境中在至少一种bvg(博德特氏菌毒力基因)调节条件下将所述博德特氏菌属物种细菌的样品孵育至少5代，从而产生成熟培养物；

c) 在第二环境中在至少一种bvg调节条件不存在的情况下孵育所述成熟培养物；

其中步骤c)在步骤b)之后发生。

在第二个方面，提供了发酵方法，其包括以下步骤：

a) 在包含至少一种bvg调节剂的第一培养基中提供博德特氏菌属物种细菌的样品；

b) 在包含至少一种bvg调节剂的第一培养基中将所述样品孵育至少5代，从而产生成熟培养物；

c) 在第二培养基中在至少一种bvg调节剂不存在的情况下孵育所述成熟培养物；

其中步骤c)在步骤b)之后发生。

在第三个方面，提供了发酵方法，其包括以下步骤：

a) 在第一培养基中提供博德特氏菌属物种细菌的样品；

其中步骤c)在步骤b)之后发生。

在第四个方面，提供了通过所述方法可获得的毒力因子。

在第五个方面，提供了通过所述方法获得的毒力因子。

在第六个方面，提供了包含毒力因子和药学上可接受的赋形剂的免疫原性组合物。

在第七个方面，提供了包含免疫原性组合物的疫苗。

在第八个方面，提供了免疫原性组合物或疫苗在预防或治疗疾病中的用途。

在第九个方面，提供了免疫原性组合物或疫苗在制备用于治疗或预防细菌性疾病的药物中的用途。

在第十个方面，提供了预防或治疗疾病的方法，其包括向患者施用免疫原性组合物或疫苗。

附图简述

图1. 描绘bvg^-基因型和bvg⁺基因型百日咳博德特氏菌细胞针对发酵时间的生长的图。bvg^-细胞的生长通过连接菱形点的线描绘；bvg⁺细胞的生长通过连接正方形点的线描绘。

图2. 描绘在不同水平的bvg调节剂烟酸存在的情况下作为bvg^-基因型的百日咳博德特氏菌细胞针对代数的比例的图。当使用0.004g/L烟酸时，连接正方形点的线描绘bvg^-细胞的比例，当使用0.021g/L烟酸时，连接圆形点的线描绘bvg^-基因型细胞的比例，当使用0.113g/L烟酸时，连接菱形点的线描绘bvg^-细胞的比例，当使用0.604g/L烟酸时，连接三角形点的线描绘bvg^-细胞的比例。

图3 描绘对于实施例6中描述的两次发酵的溶解氧概况的图。顶部线描绘当发酵是氧充足时的溶解氧概况，且底部线描绘当发酵是氧受限时的溶解氧概况。

图4 描绘在0.004g/L烟酸存在的情况下发酵的4次培养物中bvg-基因型细胞针对代数的比例的图。正方形点代表发酵开始时具有95% bvg-基因型细胞的起始比例的培养物。圆形点代表发酵开始时具有75% bvg-基因型细胞的起始比例的培养物。三角形点代表发酵开始时具有25% bvg-基因型细胞的起始比例的培养物。菱形点代表发酵开始时具有5% bvg-基因型细胞的起始比例的培养物。

图5 描绘在0.6g/L烟酸存在的情况下发酵的4次培养物中bvg-基因型细胞针对代数的比例的图。正方形点代表发酵开始时具有95% bvg-基因型细胞的起始比例的培养物。圆形点代表发酵开始时具有75% bvg-基因型细胞的起始比例的培养物。三角形点代表发酵开始时具有25% bvg-基因型细胞的起始比例的培养物。菱形点代表发酵开始时具有5% bvg-基因型细胞的起始比例的培养物。

详述

总体

本发明人已经令人惊讶地发现，百日咳毒力因子的更高产量可以通过在至少一种bvg调节条件存在的情况下培养本文所述的百日咳物种来获得，尽管bvg调节条件通常被认为抑制百日咳物种的毒力因子的表达。

百日咳博德特氏菌可以在毒力方面显示不同的表型。这些表型被命名为Bvg+和Bvg- (Bvg表明博德特氏菌毒力基因的表达或其缺乏)。Bvg+表型是特征在于毒力因子诸如百日咳毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)和百日咳杆菌粘附素(PRN)，而且还有其它毒素和粘附素的高表达的毒力表型。Bvg-表型是不表达毒力因子诸如PT或其它毒素/粘附素的无毒表型。

表型状态之间的转换是在双组分调控系统BvgAS的控制之下，其直接或间接检测环境条件，诸如温度、硫酸盐、烟酸，并调节在其控制下的基因表达。在某些条件下，传感蛋白BvgS自磷酸化，并且经由磷酸化级联，磷酰基最终被转移到应答调节因子BvgA。活性BvgA~P(磷酸化的)结合毒力因子基因的启动子区域，并调节其转录水平。此类调节系统在一种单一中央转录调节因子BvgAS的水平上导致环境信号(environmental cues)的整合。作为输出，百日咳博德特氏菌响应于环境条件在转录水平调节毒力因子的表达。

基因在BvgAS系统的转录控制下形成Bvg调节子。

抑制百日咳菌产生毒力因子的化合物经常通过调节bvg遗传基因座发挥作用，因此可以被命名为bvg调节剂。类似地，有利于Bvg+表型的条件可以被命名为bvg调节条件。

通常，博德特氏菌细胞能够在Bvg+和Bvg-基因型之间突变。具体而言，在培养过程中，博德特氏菌细胞可以经由自发突变突变为Bvg-基因型。Bvg-基因型细胞具有Bvg-表型，这意味着它们产生较少量的毒力因子(并且因此在旨在产生高水平毒力因子的发酵方法中是不希望的)。Bvg-基因型细胞产生较低水平的毒力因子这一事实相比于Bvg+基因型细胞为Bvg-基因型细胞提供了优势，即在产生毒力因子中消耗其能量较少，使它们生长更快。出于这个原因，当培养博德特氏菌细胞时，具有Bvg-基因型的细胞比例趋向于随着时间增加(称为Bvg-接管(Bvg- takeover))。本发明人已经表明，可以通过添加Bvg调节条件在Bvg+基因型中维持较高比例的细胞。这些条件，如上所解释，有利于Bvg-表型状态，并且此类条件的存在使得博德特氏菌表达Bvg-表型(同时保持它们的Bvg+基因型)。这去除了Bvg-基因型细胞的竞争优势，意味着Bvg-基因型细胞在最终培养物中的比例较低。在发酵的生长阶段过程中，博德特氏菌可以在这些bvg调节条件下生长，直到达到所需质量的Bvg+基因型细胞。一旦博德特氏菌细胞的质量足够高，则可以去除bvg调节条件，使得Bvg+基因型细胞回复至Bvg+表型并表达高水平的毒力因子。

为了避免疑问，任何提及“Bvg+细胞”或“bvg+细胞”是指具有Bvg+基因型的细胞，类似地，任何提及“Bvg-细胞”或“bvg-细胞”是指具有Bvg-基因型的细胞。

因此，本发明人已经发现，发酵博德特氏菌属物种的方法可以通过增加在至少一种bvg调节条件中培养博德特氏菌属物种的步骤得到改进，这确保了博德特氏菌可以生长至高质量，同时保持高比例的Bvg+基因型的博德特氏菌细胞，并且当达到足够细胞量时，可以去除bvg调节条件，留下培养物，所述培养物含有高比例的以高水平表达毒力因子的Bvg+基因型细胞。这导致从博德特氏菌属物种产生的毒力因子的产量增加。尽管事实是，通常，如本文定义的bvg调节条件导致毒力因子表达的减少。

因此，在第一个实施方案中，提供了发酵方法，其包括以下步骤：

a) 提供博德特氏菌属物种细菌的样品；

其中步骤c)在步骤b)之后发生。

步骤b)描述了以下步骤，其中存在bvg调节条件，并且博德特氏菌培养物生长以提供足够细胞量用于高表达，同时保留了Bvg+基因型(降低Bvg-细胞的接管)。然后应该将博德特氏菌属物种转移至不存在bvg调节条件的条件中以允许毒力因子的表达(步骤c)。可以在发酵方法的早期将博德特氏菌属物种暴露于bvg调节条件，例如可以在细胞建库步骤的过程中使用bvg调节条件。或者，可以在随后阶段，诸如预培养过程中添加bvg调节条件。

术语“发酵方法”是指用于培养细胞和/或从那些细胞表达蛋白的工业规模(例如20升或更多升)的方法。在这种情况下，本公开的方法可以用于从博德特氏菌属物种表达高浓度的毒力因子。或者，可以设想其它应用，例如该方法可用于培养博德特氏菌属物种，以用于制备全细胞博德特氏菌疫苗。任选地，发酵方法是用于从博德特氏菌属物种产生一种或多种毒素的方法。在一个实施方案中，该方法是用于在工业培养物中保存bvg+基因型的博德特氏菌属物种的方法。在一个实施方案中，该方法是用于在工业培养物中在生长中防止毒力因子的表达损失的方法。在一个实施方案中，该方法是用于增强博德特氏菌属物种产生毒力因子的方法。

术语“博德特氏菌属物种”是指博德特氏菌属的物种，包括但不限于百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)、和支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)，优选百日咳博德特氏菌。

除非另有解释，本文所使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域普通技术人员的通常理解具有相同含义。分子生物学中的常见术语的定义可以参见Benjamin Lewin, Genes V, 由Oxford University Press出版, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew 等人(编辑), The Encyclopedia of Molecular Biology, 由Blackwell Science Ltd.出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 和Robert A. Meyers (编辑), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 由VCH Publishers, Inc.出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)。

除非上下文另有明确指明，单数术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述(the)”包括所有复数所指物。类似地，除非上下文另有明确指明，词语“或”意图包括“和”。术语“多个/种”指两个/种或更多个/种。应当进一步理解的是，对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，和所有分子量或分子质量值是近似的，并且为了描述而提供。另外，关于物质诸如抗原的浓度或水平给出的数值限制意图为近似的。因此，当指明浓度是至少(例如)200 pg时，则意图该浓度被理解为至少约(或“大约”或“~”) 200 pg。

尽管与本文所述的方法或材料相同或等效的方法或材料可以用于本公开的实施或测试中，但下文描述合适的方法和材料。术语“包含”意味着“包括”。因此，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprises)”和变体诸如“包含(comprise)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包括所述化合物或组合物(例如，核酸，多肽，抗原)或步骤，或化合物或步骤的组，但不排除任何其它化合物、组合物、步骤或其组。在每种情况下，本发明人旨在本文中的术语“包含(comprising)”、“包含(comprise)”和“包含(comprises)” 任选可分别被术语“由......组成(consisting of)”、“由......组成(consist of)”和“由......组成(consists of)”所取代。

缩写“例如(e.g.)”衍生自拉丁语例如(exempli gratia)，并且在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”是同义的。

步骤a)

步骤a)描述了将博德特氏菌属物种暴露于bvg调节条件之前发酵方法的阶段；这通常是指提供一定量的活博德特氏菌细菌样品的步骤。接种的培养基可以是固体或液体培养基。在一个实施方案中，该方法进一步包括选择博德特氏菌属物种的细菌样品的步骤i)，其中所述细菌样品主要是Bvg+基因型，并且其中步骤i)在步骤a)之前发生。任选地，细菌样品的多于50％、多于60％、多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、多于98％、85％至100％、90％至100％、95％至100％或98％至100％在步骤a)中是Bvg+基因型。

本公开的方法降低了Bvg-基因型细胞的接管，所以它对于使用主要为Bvg+基因型的博德特氏菌属物种样品开始该方法是有利的。

步骤a)中使用的样品可以从任何来源获得，例如，样品可以从实验室内持有的细胞系进行选择，或者可以从机构诸如ATCC(美国典型培养物保藏中心)获得。

步骤b)

步骤b)描述了将步骤a)的样品暴露于至少一种bvg调节条件，此类条件可以是降低Bvg-基因型细胞的接管或保留Bvg+基因型的任何条件。不被理论所束缚，当博德特氏菌在培养物中(例如在实验室或生产设施中)孵育时，Bvg-基因型的细胞的比例趋向于随着时间(几代)增加。这可能是由于不表达毒力因子导致的选择性优势，这对于培养中的博德特氏菌没有益处。出于这个原因，在降低毒力因子表达的条件存在的情况下孵育博德特氏菌降低了来自转换为Bvg-基因型的选择性优势，从而降低了培养中的Bvg-基因型细胞的接管。从而保持了样品中的Bvg+基因型群体。

出于这个原因，bvg调节条件包括降低毒力因子表达的条件。任选地，“bvg调节条件”是在培养物中生长5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多代之后防止Bvg-基因型细胞的比例增加超过25倍、15倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍、1.5倍的条件。代是指培养物中的细菌数加倍花费的时间，其对于百日咳博德特氏菌大约为4小时，然而，这根据培养百日咳博德特氏菌的条件而不同。可以确定潜在bvg调节条件事实上是否是在潜在bvg调节条件下培养细胞至少8代且将细胞铺板在Bordet-Gengou培养基(其含有5％血液)(Bordet J和Gengou O, Le Microbe de la coqueluche, Annales de l’Institut Pasteur 1906; 20:731-41)上以获得单一菌落的bvg调节条件。在BG培养基上，Bvg+基因型细胞呈现为半球形(domed)、紧凑的、溶血菌落，而Bvg-基因型细胞呈现为平的、未溶血菌落。应当将这种测试的结果与在相同条件下但不使用潜在bvg调节条件生长的细胞比较。如果Bvg-基因型细胞的比例显著低于参考样品中Bvg-基因型细胞的比例，则该条件是bvg调节条件。

在本公开的上下文中可以使用任何bvg调节条件；具体实例包括高或低pH条件、低氧条件、低温条件或bvg调节剂的存在。

短语“bvg调节剂”是指降低Bvg-基因型细胞的接管的合适浓度(调节浓度)的化合物。bvg调节剂的浓度在整个步骤b)中不一定是恒定的，但在整个步骤b)中保持在调节浓度内。例如，各种浓度(包括0.604g/L)的烟酸是bvg调节剂。通常，抑制来自百日咳博德特氏菌的毒素诸如百日咳毒素表达的化合物是bvg调节剂。

步骤b)是指其中存在至少一种bvg调节条件的发酵方法的任何阶段，例如该步骤可以包括细胞建库和/或预培养和/或大规模发酵。术语“细胞建库”对于本领域技术人员是清楚的。通常，细胞建库涉及制备用于贮存的细菌菌株，并且可以涉及利用细菌克隆(其可以是上面提到的接种物)，并且孵育细菌克隆，直到获得小体积的细菌。可以将这种体积的细菌的样品制备、快速冷冻和保存在冰箱中。预培养通常涉及采用起始培养物并允许细胞繁殖以达到浓度足以用于方法中的下一个步骤(例如毒力因子表达)的浓度。这可以涉及几种小孵育，例如博德特氏菌的小样品可以在小摇瓶中生长，并且可以将该小摇瓶的内容物转移至较大摇瓶。这甚至可以涉及其中细胞在小发酵罐中生长的步骤。

任选地，预培养阶段可以包括产生约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18代的百日咳菌。任选地，预培养阶段为1小时至200小时，2小时至150小时，5小时至125小时，10小时至100小时，20小时至50小时，大于或等于1小时，大于或等于2小时，大于或等于5小时，大于或等于10小时，大于或等于20小时，大于或等于50小时，小于或等于200小时，小于或等于150小时，小于或等于125小时，小于或等于100小时，或小于或等于50小时。任选地，预培养阶段在小于10升、小于8升、小于5升、1至10升、1至8升、1至5升、1至3升、2至8升、2至5升或2至3升的容器中进行。

在步骤b)过程中，将博德特氏菌在“第一环境”(其是指包含bvg调节条件的环境)中培养。例如，这种环境可以指缺氧环境或高pH环境。术语“环境”也可以指包含至少一种bvg调节剂的培养基。因此，第一环境可以指包含至少一种bvg调节剂的第一培养基，且第二环境可以指不包含至少一种bvg调节剂的第二培养基。任选地，至少一种bvg调节条件包含第一培养基中的至少一种bvg调节剂的存在。任选地，第一和第二培养基是相同的。任选地，第一和第二培养基是不同的。任选地，第二培养基包含Stainer Scholte培养基。或者，第二培养基包含改良的Stainer Scholte培养基。Stainer Scholte培养基的组成描述于Cohen和Wheeler, American Journal of Public Health (1946) 36:371-376。如果培养基含有基本上相同浓度的基本相同的培养基组分，然而，含有培养基组分中1至5种的浓度的改良，缺乏培养基组分中的1至3种，或含有1至20种额外培养基组分，则所述培养基是改良的Stainer Scholte培养基。

步骤b)导致产生可用于步骤c)中的成熟培养物。短语“成熟培养物”是指已经在至少一种bvg调节条件存在的情况下生长至少5代的接种物。

任选地，步骤b)的至少部分在体积为50 ml至25升、50ml至20升、50ml至15升、50 ml至10升、50ml至5升、小于或等于25升、小于或等于20升、小于或等于15升、小于或等于10升、小于或等于5升、大于或等于25 ml、大于或等于50 ml、大于或等于100ml、大于或等于250ml、大于或等于500ml、大于或等于1升或大于或等于2升的容器中进行。

任选地，步骤c)在发酵罐中进行。发酵罐工作体积可以是5至10000升、10至5000升、20至2000升、50升至1000升、大于或等于5升、大于或等于10升、大于或等于15升、大于或等于20升、大于或等于25升、大于或等于50升、大于或等于100升、小于或等于10000升、小于或等于5000升或小于或等于2500升。

任选地，步骤b)包括细胞建库阶段。或者，细胞建库发生在步骤a)和步骤b之间。

在一个实施方案中，步骤b)包含至少5、6、7、8、9、10、12、14、16、或17代。任选地，步骤b)包含小于40、小于35、小于30、小于25、小于20或小于18代。任选地，步骤b)是小于或等于200小时、小于或等于150小时、小于或等于100小时、小于或等于80小时、小于或等于70小时、小于或等于60小时、小于或等于55小时、大于或等于10小时、大于或等于15小时、大于或等于20小时、大于或等于25小时、大于或等于30小时、大于或等于35小时、大于或等于40小时、10小时至200小时、15小时至150小时、20小时至100小时、25小时至80小时、或30小时至70之间。

在一个实施方案中，步骤b)在20℃至45℃、22℃至43℃、24℃至42℃、28℃至42℃、30℃至42℃或32℃至40℃的温度进行。

在一个实施方案中，步骤b)在6.5至7.8、6.7至7.5、6.9至7.3或7.0至7.2的pH进行。

在一个实施方案中，步骤b)在10％至50％、15％至45％、20％至35％的溶解氧存在的情况下进行。

步骤c)

步骤c)是指其中博德特氏菌在步骤b)的至少一种bvg调节条件不存在的情况下生长的步骤。通常，去除步骤b)的bvg调节条件的存在，例如，如果bvg调节条件是低于28℃的温度，则在至少一种bvg调节条件不存在的情况下孵育成熟培养物涉及在大于28℃的温度下孵育成熟培养物。类似地，如果至少一种bvg调节条件是bvg调节剂的存在，则在至少一种bvg调节条件不存在的情况下孵育成熟培养物涉及在bvg调节剂不存在的情况下孵育成熟培养物。例如，如果烟酸是bvg调节剂，则可以将其添加至用于步骤b)的第一培养基，并降低在用于步骤c)的第二培养基中的浓度(从而使得其低于调节浓度)。

通常，步骤c)不需要在步骤b)之后直接发生，可以有数天或数周的间隔，例如在发酵中实际使用细胞之前数周或数个月进行细胞建库的情况下。任选地，步骤c)在步骤b)之后直接发生。

步骤b)可以在多于一种bvg调节条件存在的情况下发生。在这种情况下，这些bvg调节条件中的至少一种，优选所有，应当在步骤c)过程中去除。

博德特氏菌属物种在步骤c)中通常表达较高水平的毒力因子，可以将其纯化用于免疫原性组合物或疫苗中。步骤c)的至少部分通常在发酵罐中进行，尽管步骤c)可以在任何适当容器中进行。在一个实施方案中，发酵罐工作体积是5至10000升、10至5000升、20至2000升、50升至1000升、大于或等于5升、大于或等于10升、大于或等于15升、大于或等于20升、大于或等于25升、大于或等于50升、大于或等于100升、小于或等于10000升、小于或等于5000升或小于或等于2500升。

步骤c)可以是分批补料方法。在分批补料方法中，将新培养基连续添加至发酵罐。在一个实施方案中，步骤c)小于或等于100小时、小于或等于80小时、小于或等于60小时、小于或等于40小时、大于或等于5小时、大于或等于10小时、大于或等于15小时、大于或等于25小时、5小时至100小时、10小时至80小时、15小时至60小时、25小时至40小时。

任选地，在步骤c)开始时或步骤b)结束时，成熟培养物的小于或等于20％、小于或等于18％、小于或等于15％、小于或等于12％、小于或等于10％、小于或等于8％、小于或等于6％、小于或等于5％、小于或等于4％、小于或等于3％、大于或等于1％、大于或等于2％、大于或等于3％、2％至10％、2％至8％、2％至12％、2％至10％、2％至6％或2％至5％是bvg-。

步骤c)可以在大于或等于32℃、大于或等于33℃、大于或等于34℃、大于或等于35℃、小于或等于45℃、小于或等于42℃、小于或等于40℃、小于或等于38℃、32℃至45℃、33℃至42℃、34℃至40℃或35℃至38℃的温度进行。

任选地，在步骤c)中使用机械消泡器。

在一个实施方案中，步骤c)为小于或等于200小时、小于或等于150小时100小时、小于或等于80小时、小于或等于60小时、小于或等于40小时、大于或等于5小时、大于或等于10小时、大于或等于15小时、大于或等于25小时、5小时至200小时、10小时至150小时、15小时至100小时或25小时至80小时。在一个实施方案中，步骤c)包括在第二环境/第二培养基中将成熟培养物孵育至少5、6、7、8、9、10、12、15、18、20代或小于200、175、150 或125代。

在一个实施方案中，步骤c)在6.5至7.8、6.8至7.5、6.9至7.3或7.0至7.2的pH进行。

在一个实施方案中，步骤c)在10％至50％、15％至45％、20％至35％的溶解氧存在的情况下进行。

BVG调节条件

在本发明的上下文中可以使用任何bvg调节条件。下面提供了一些实例。

在一个实施方案中，至少一种bvg调节条件包括在低于或等于28℃、低于或等于27℃、低于或等于26℃、低于或等于25℃、高于或等于18℃、高于或等于20℃、高于或等于22℃、高于或等于24℃、0℃至28℃、0℃至27℃、0℃至26℃或0℃至25℃的温度孵育样品。

在一个实施方案中，至少一种bvg调节条件包括在低于或等于0.100、低于或等于0.090、低于或等于0.080、低于或等于0.070、高于或等于0.001、高于或等于0.050、高于或等于0.010、高于或等于0.015、高于或等于0.020、高于或等于0.025、0.010至0.100、0.010至0.090、0.010至0.080或0.010至0.070 mmol溶解O₂/每升的氧浓度下孵育样品。

在一个实施方案中，至少一种bvg调节条件包括在碱性pH孵育样品。任选地，pH是大于或等于7.2、大于或等于7.3、大于或等于7.4、小于或等于9.5、小于或等于9.0、小于或等于8.5、小于或等于8.0、7.2至8.0、7.3至8.0或7.4至8.0的pH。

在一个实施方案中，至少一种bvg调节条件包括在酸性pH孵育样品。任选地，酸性pH是小于或等于7.0、小于或等于6.8、小于或等于6.6、小于或等于6.4、小于或等于6.2、高于或等于4.5、高于或等于5.0、高于或等于5.5、高于或等于6.0、高于或等于6.5、5.0至7.0、5.0至6.9或5.0至6.8的pH。

在一个实施方案中，至少一种bvg调节剂包含烟酸。任选地，bvg调节剂包含浓度为大于或等于0.004g/l、大于或等于0.01g/l、大于或等于0.1g/l、大于或等于0.2g/l、大于或等于0.3g/l、大于或等于0.004g/l、小于或等于400g/l、小于或等于300 g/l、小于或等于200g/l、小于或等于100g/l、小于或等于50g/l、小于或等于5g/l、0.004g/l至500g/l、0.01g/l至400g/l、0.1g/l至300g/l、0.4g/l至200g/l或0.2g/l至100g/l的烟酸。

在一个实施方案中，至少一种bvg调节剂包含选自镁盐、硫酸盐、磷酸盐和碳酸盐的无机盐。任选地，无机盐是硫酸盐。硫酸盐可以是以大于或等于0.04mM、大于或等于0.08mM、大于或等于1mM、大于或等于4mM、大于或等于8mM、大于或等于10mM、小于或等于50mM、小于或等于40mM、小于或等于35mM、小于或等于30mM、小于或等于25mM、小于或等于20mM、小于15mM、0.04mM 至40mM、0.08mM至1mM、4mM至40mM、8mM至10mM、15mM 至40mM、或17mM至40mM的浓度。

任选地，无机盐是磷酸盐。磷酸盐可以是以大于或等于0.4g/l、大于或等于0.5g/l、大于或等于0.6g/l、大于或等于0.7g/L、小于或等于20g/l、小于或等于18g/l、小于或等于16g/l、小于或等于10g/l、小于或等于5g/l、小于或等于2g/l、0.4g/L至20g/L、0.5g/L至20g/L、0.6g/L至20g/L 或0.7g/L至20g/L的浓度。

在一个实施方案中，至少一种bvg调节剂包含蔗糖。蔗糖可以是以大于或等于10mM、大于或等于15mM、大于或等于20mM、大于或等于25mM、大于或等于30mM、大于或等于35mM、大于或等于40mM、小于或等于100mM、小于或等于90mM、小于或等于85mM、小于或等于80mM、小于或等于75mM、小于或等于70mM、小于或等于50mM、 10mM至100mM、15mM至95mM、20mM至90mM、25mM至85mM 或30mM至80mM的浓度。

任选地，至少一种bvg调节剂包含选自酵母提取物、胰蛋白酶大豆琼脂、磷酸胰蛋白 (tryptose phosphate)、蛋白胨和脑心组织浸出物和蛋白胨的复合培养基组分。复合培养基组分可以是以大于或等于1g/L、大于或等于3g/L、大于或等于5g/L、大于或等于10g/L、小于或等于40g/L、小于或等于35g/L、小于或等于30g/l、小于或等于25g/l、小于或等于20g/L、1g/L至40g/l、3g/l至40g/l、5g/l至40g/L、或10g/L至40g/L的浓度。

任选地，至少一种bvg调节剂包含脯氨酸。脯氨酸可以是以大于或等于0.25g/l、大于或等于0.4g/l、大于或等于0.5g/l、大于或等于0.6g/L、大于或等于1g/L、大于或等于2g/L、大于或等于3g/L 大于或等于4g/l、小于或等于50g/L、小于或等于30g/L、小于或等于25g/L、小于或等于20g/L、小于或等于15g/L、0.25g/L至50g/L、0.4g/L至50g/L、0.5g/L至50g/L、0.6g/L至50g/L、1g/L至50g/L、2g/L至50g/L、3g/L至50g/L、或4g/L至50g/L的浓度。

在一个实施方案中，至少一种bvg调节剂包含浓度为大于100mM、大于120mM、大于150mM、大于175mM、大于200mM、大于250mM、小于2000mM、小于1000mM、小于800mM、100mM至2000mM、120mM至2000mM、150mM至2000mM、175mM至2000mM、或200mM至2000mM的钠离子。

在一个实施方案中，bvg调节剂包含消泡剂。任选地，消泡剂是聚二甲基硅氧烷。聚二甲基硅氧烷可以是大于或等于5g/l、大于或等于10g/l、大于或等于15g/l、大于或等于20g/l、大于或等于25g/l、大于或等于30g/l、大于或等于40g/l、小于或等于250g/l、小于或等于230g/l、小于或等于200g/l、小于或等于180g/l、小于或等于150g/l、5g/l至250g/l、10g/l至230g/l、15g/l至200g/l、20g/l至180g/l、25g/l至150g/l 或25g/l至150g/l的浓度。

在一个实施方案中，至少一种bvg调节剂包含谷胱甘肽。谷胱甘肽可以是大于或等于0.15g/L、大于或等于0.20g/L、大于或等于0.25g/L、大于或等于0.30g/L、大于或等于0.35g/L、大于或等于0.40g/L、小于或等于20g/L、小于或等于15g/l、小于或等于12g/L、小于或等于10g/L、 0.15g/L至20g/L、0.20g/L至20g/L、0.25g/L至20g/L、0.30g/L至20g/L、0.35g/L至20g/L、 0.35g/L至20g/L 或0.40g/L至20g/L的浓度。

在一个实施方案中，至少一种bvg调节剂包含含硫氨基酸，这些氨基酸包括半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸，而且还包括含有硫原子的任何其它氨基酸(天然的和非天然氨基酸)。这些氨基酸可以衍生自蛋白或肽来源，或者可以作为个别氨基酸来源。在进一步的实施方案中，至少一种bvg调节剂包含浓度大于或等于0.25mM、大于或等于0.5mM、大于或等于0.8mM、小于或等于1000mM、小于或等于500mM、小于或等于250mM、小于或等于100mM、小于或等于50mM、小于或等于25mM、小于或等于10mM、0.25mM至1000mM、 0.5mM至500mM、0.8mM至250mM、或0.5mM至100mM的含硫氨基酸。

进一步的步骤

在一个实施方案中，博德特氏菌属物种表达至少一种选自百日咳毒素、丝状血细胞凝集素、菌毛凝集原(fimbrial aggultinogen)和百日咳杆菌粘附素(Pertactin)的毒力因子。任选地，百日咳毒素在步骤b)中以小于

的百日咳毒素比生产速率产生。任选地，百日咳毒素在步骤c)过程中以大于的百日咳毒素比生产速率产生。

本公开的方法可以包括进一步的纯化毒力因子以产生纯化的毒力因子的步骤d)。纯化的毒力因子可以是纯化的百日咳毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)、百日咳杆菌粘附素(PRN)、凝集原2或凝集原3。纯化的毒力因子可以在纯化后进行改变，例如百日咳毒素可以在纯化后进行化学去毒。对于百日咳抗原的制备，也参见EP 427462和WO 91/12020。在一个实施方案中，步骤d)涉及使用层析的细胞纯化。在一个实施方案中，所述层析技术是亲和层析、凝胶过滤、高压液相层析(HPLC)或离子交换层析。任选地，亲和层析使用亲和标签纯化柱、抗体纯化柱、凝集素亲和柱、前列腺素纯化柱或链霉亲和素柱。任选地，HPLC使用离子交换柱、反相柱或大小排阻柱。任选地，离子交换柱是阴离子交换柱或阳离子交换柱。

该方法可以进一步包括配制包含纯化的毒力因子的免疫原性组合物的步骤e)。

该方法可以进一步包括将至少一种进一步的抗原添加至免疫原性组合物的步骤f)。在一个实施方案中，至少一种进一步的抗原选自百日咳毒素、丝状血细胞凝集素、百日咳杆菌粘附素、菌毛凝集原、白喉类毒素、破伤风类毒素、至少一种缀合的来自脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的糖抗原、乙型肝炎表面抗原、灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)和缀合的来自b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae b)的糖抗原。至少一种缀合的来自脑膜炎奈瑟氏球菌的糖抗原可以是MenC、MenY、MenA 和MenW (例如A+C、A+Y、A+W、C+Y、C+W、Y+W、A+C+Y、A+C+W、A+Y+W、C+Y+W、A+C+Y+W)；任选地，包括MenC和/或MenY，任选包括所有四种。

或者或除了上述脑膜炎球菌抗原以外，免疫原性组合物可以包含一种或多种肺炎球菌荚膜寡糖或多糖 - 载体蛋白缀合物。

通常，本发明的组合物中代表的肺炎球菌荚膜寡糖或多糖(优选后者)包含衍生自肺炎球菌的至少四种血清型的抗原。优选地，四种血清型包含6B、14、19F 和23F。更优选地，组合物中包含至少7种血清型，例如衍生自血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的那些。仍然更优选地，组合物中包含至少11种血清型(11价)，例如衍生自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F 和23F的那些。仍然更优选地，组合物中包含至少10种血清型(10价)，例如衍生自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F 和23F的那些。在本发明的一个优选的实施方案中，包含至少13种此类缀合的肺炎球菌抗原，尽管本发明还考虑进一步的抗原，例如23价(诸如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和33F)。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含药学上可接受的赋形剂。在一个实施方案中，发酵方法包括将药学上可接受的赋形剂添加至免疫原性组合物的步骤g)。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含佐剂，诸如磷酸铝或氢氧化铝。在一个实施方案中，发酵方法包括将佐剂添加至免疫原性组合物的步骤f)。将DTPa和DTPw抗原吸附至铝佐剂的方法是本领域中已知的。参见例如WO 93/24148和WO 97/00697。通常，将抗原在本发明的组合免疫原性组合物中混合在一起之前，吸附至佐剂的组分在室温在适当pH放置至少10分钟期间，用于吸附大部分且优选所有抗原。

与其它组分混合之前，其它组分是优选未吸附的(诸如IPV)或特异性吸附至其它佐剂上-乙型肝炎表面抗原(HBsAg)优选吸附至磷酸铝(如WO 93/24148中描述)上。

在一个进一步的实施方案中，提供了通过所述方法可获得的毒力因子。在一个进一步的实施方案中，提供了通过所述方法获得的毒力因子。

在一个进一步的实施方案中，提供了包含毒力因子和药学上可接受的赋形剂的免疫原性组合物。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含至少一种进一步的抗原。在一个实施方案中，至少一种进一步的抗原选自百日咳毒素、丝状血细胞凝集素、百日咳杆菌粘附素、菌毛凝集原、白喉类毒素、破伤风类毒素、至少一种缀合的来自脑膜炎奈瑟氏球菌的糖抗原、乙型肝炎表面抗原、灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)和缀合的来自b型流感嗜血杆菌的糖抗原(任选缀合至破伤风类毒素)。至少一种缀合的来自脑膜炎奈瑟氏球菌的糖抗原可以是MenC、MenY、MenA 和MenW (例如A+C、A+Y、A+W、C+Y、C+W、Y+W、A+C+Y、A+C+W、A+Y+W、C+Y+W、A+C+Y+W)；任选地，包括MenC和/或MenY，任选包括所有四种。在一个实施方案中，疫苗包含白喉类毒素、破伤风类毒素和PT、FHA 和PRN中的至少一种(DTPa疫苗)。

在一个实施方案中，免疫原性组合物进一步包含佐剂。在一个实施方案中，免疫原性组合物包含磷酸铝或氢氧化铝。将DTPa抗原吸附至铝佐剂的方法是本领域中已知的。参见例如WO 93/24148和WO 97/00697。通常，将抗原在本发明的组合免疫原性组合物中混合在一起之前，吸附至佐剂的组分在室温在适当pH放置至少10分钟期间，用于吸附大部分且优选所有抗原。

在一个实施方案中，提供了包含免疫原性组合物的疫苗。

疫苗制备通常描述于Vaccine Design - The Subunit and adjuvant approach Ed Powell and Newman; Pellum Press。有利地，根据本发明的组合疫苗是儿科疫苗。

选择每个疫苗剂量中多糖或寡糖缀合物抗原的量作为诱导免疫保护应答、而在典型接种疫苗者中没有明显不利副作用的量。此类量将根据采用何种具体免疫原而不同。通常，预期每个剂量将包含1-1000 μg、优选2-100 μg、更优选4-40、2-15或3-10 μg、最优选约或恰好5 μg缀合的多糖或寡糖(以糖的量表示)。

疫苗中蛋白抗原的含量将通常在1-100μg的范围内，优选5-50μg，最通常5 - 25μg 的范围内。

可以通过涉及观察受试者中的抗体效价和其它应答的标准研究来确定用于特定疫苗的抗原的最佳量。在最初接种疫苗之后，受试者可以以约4周或更长时间间隔接受一次或两次加强注射。

本发明的疫苗制剂可用于借助经由全身或粘膜途径施用所述疫苗保护或治疗易受传染的哺乳动物(优选人)。这些施用可包括经由肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射。

在一个进一步方面，提供了如前所述的免疫原性组合物或疫苗，其用于预防或治疗疾病。

在一个进一步方面，提供了如前所述的免疫原性组合物或疫苗，其用于预防或治疗百日咳博德特氏菌疾病。

在一个进一步方面，提供了如前所述的免疫原性组合物或疫苗用于预防或治疗疾病的用途。

在一个进一步方面，提供了如前所述的免疫原性组合物或疫苗在制备用于治疗或预防细菌性疾病的药物中的用途。

在一个进一步方面，提供了预防或治疗疾病的方法，其包括向患者施用如前所述的免疫原性组合物或疫苗。

在一个实施方案中，所述疾病是百日咳博德特氏菌疾病。

实施例

实施例1 - 20L规模发酵中百日咳博德特氏菌bvg ⁺ 和bvg ^- 突变体的生长和毒力因子产生

将百日咳博德特氏菌的摇瓶培养物铺板在Bordet-Gengou培养基(含有5％绵羊血液)，以便能够检测溶血(bvg ⁺)和非溶血(bvg ^-)菌落。从这些板分离一个单一bvg ⁺菌落和一个单一bvg ^-菌落，并用于进行20L规模发酵。

用10⁹百日咳博德特氏菌CFU接种含有7.5 ml新鲜培养基(通过添加二甲基--环糊精1 g/L和酸酪蛋白水解物10 g/L、用L-半胱氨酸40 mg/L替代L-胱氨酸40 mg/L并使用较高浓度的L-谷氨酸钠(11.84 g/L)、还原型谷胱甘肽(150 mg/L)和抗坏血酸(400 mg/L)而改变自Stainer和Scholte (J. Gen. Microbiol. 63:211-220 (1971)))的第一摇瓶预培养物，并在35℃(+/- 1℃)和150 rpm孵育24h (+/- 1h)以产生第一预培养物。使用第一预培养物接种含有100ml新鲜培养基的第二摇瓶预培养物。将第二预培养物在35℃(+/- 1℃)和150 rpm孵育24h (+/- 1h)，并用于接种两个各含1L新鲜培养基的摇瓶。在35℃(+/- 1℃)和150 rpm生长24h (+/- 4h)之后，将来自第三次预培养的两个摇瓶合并。第三次预培养一停止，马上将合并的预培养物用来接种发酵罐。平行地，通过将适当的稀释物铺板在BG (Bordet Gengou)培养基(含有5％血液)上测量第三次预培养结束时bvg ⁺和bvg ^-细胞的比例。该比例代表20L发酵中bvg ^-细胞的初始比例(表1)。

使用20L发酵罐(Biolafitte^TM)。将10L培养基无菌转移至发酵罐中。使用以下条件来校准100％溶解氧(DO)水平：温度(35℃)、排出压力(head pressure)(0.4巴(bar))、空气流速(4.6L鼓泡空气/分钟)和搅拌速度(50 rpm或每分钟转动)。

通过添加1.5L合并的预培养物实现接种。

在发酵过程中，使温度(35℃)和排出压力(0.4巴)保持在恒定水平。使用机械消泡器来控制发酵过程中的泡沫。根据预先定义的曲线，空气流速在发酵过程中渐进地增加。将溶解氧的水平设定在25％，并通过当DO下降至25％以下时增加搅拌进行调节。将最低搅拌速度设定在50 rpm；将最大搅拌速度设定在550 rpm。将pH通过添加乙酸50％(w/v或重量/体积)调节在7.2。

在发酵过程中，bvg-和bvg+培养物的生长作为650 nm处的光密度(OD_650nm；图1)进行监测。在发酵结束时(定义为氧消耗降低- 作为谷氨酸盐耗竭的结果-，导致搅拌速度降低的时间)，培养上清液中百日咳毒素(PT)的产生通过标准ELISA测定，并且bvg ⁺和bvg ^-细胞的比例通过将发酵液的适当稀释物铺板在含有5％血液的BG培养基上进行测量(表1)。该比例代表20L发酵中bvg ^-细胞的最终比例(表1)。

与用bvg ⁺分离株发酵相比，用bvg ^-分离株发酵导致更快生长，但非常低的PT产生。然而，两种分离株之间的最大生物量浓度没有不同。　

*总发酵时间被定义为氧消耗降低(作为谷氨酸盐耗竭的结果)，导致搅拌速度降低的时间。

实施例2 -百日咳博德特氏菌的20L规模发酵中bvg^-细胞的积累

如实施例1中所述进行百日咳博德特氏菌的20L发酵，除了用10⁹百日咳博德特氏菌CFU接种第一预培养物，其代表bvg ⁺与bvg ^-细胞的99:1比率。

通过将发酵液的适当稀释物铺板在含有5％血液的BG培养基上测量20L发酵开始和结束时bvg ⁺和bvg ^-细胞的比例(表2)。bvg-细胞的比例随着代数增加而增加。　

实施例3. 调节化合物对系列摇瓶培养过程中bvg ^- 细胞的接管的影响

用实施例1中描述的改良从Stainer和Scholte (J. Gen. Microbiol. 63:211-220 (1971))改良的培养基中平行进行四个系列的培养，每个系列含有MgSO₄ (10 mM)和/或烟酸(0g/L或0.604 g/L)，如表3中描述。对于每个系列，用10⁹百日咳博德特氏菌CFU接种含有7.5 ml新鲜培养基的第一摇瓶，其代表bvg ⁺与bvg ^-细胞的99:1比率。所有随后的摇瓶培养物含有100 ml新鲜培养基。将所有培养物在35℃(+/- 1℃)孵育24h (+/- 1h)。在第三代和第四代结束时，bvg ⁺和bvg ^-细胞的比例通过将培养物的适当稀释物铺板在含有5％血液的BG培养基上进行测量(表3)。

在调节浓度的MgSO₄或烟酸不存在的情况下(系列A)，bvg ^-细胞迅速积累。添加MgSO₄ (20 mM; 系列C)或烟酸(0.604 g/L; 系列B)或两者导致bvg ^-细胞显著较低的积累。

实施例4 - 调节化合物烟酸对系列摇瓶培养过程中 bvg ^- 细胞的接管的剂量影响

在百日咳博德特氏菌的系列摇瓶培养过程中评价烟酸对bvg ^-细胞的接管的剂量影响。用实施例1中描述的改良从Stainer和Scholte (J. Gen. Microbiol. 63:211-220 (1971))改良的培养基中平行进行四个系列的培养。培养基也含有以下改良：以与用10 g/L酪蛋白水解物获得的浓度等效的浓度用12种氨基酸(L-天冬氨酸、甘氨酸、L-缬氨酸，L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸、L -丝氨酸和L-赖氨酸)的混合物替换酸酪蛋白水解物，增加的L-谷氨酸钠(20 g/L)和L-脯氨酸(1.04 g/L)浓度，且不存在NaCl。每个系列含有不同浓度的烟酸，如表4中所述。对于每个系列，用约4x10⁹百日咳博德特氏菌CFU接种含有100 ml新鲜培养基的第一摇瓶，其代表bvg ⁺与bvg ^-细胞的94:6比率。所有随后的摇瓶含有100 ml新鲜培养基，并以约4x10⁸ CFU/ml的初始细胞浓度用前述培养物接种。将所有培养物在35℃(+/- 1℃)以150 rpm孵育24h (+/- 1h)。在每次传代结束时，bvg ⁺和bvg ^-细胞的比例通过将培养物的适当稀释物铺板在含有5％血液的BG培养基上进行测量(表4)。基于光密度测量值(OD_650nm)，计算每次传代的代数。作为代数的函数的bvg ^-细胞接管描述在图2中。

低烟酸浓度在控制bvg ^-细胞的接管时没有那么有效。然而，当以高浓度(0.604 g/L)添加烟酸时，没有观察到bvg ^-接管，最多达15代。

实施例5 - 20L规模发酵中使用调节化合物烟酸以控制 bvg ^- 细胞的接管

平行进行百日咳博德特氏菌的两次20L发酵。两次发酵是相同的，除了发酵COQ255的前两次预培养物中存在高烟酸浓度(0.604 g/L)，以控制bvg ^-接管，而发酵COQ255接下来的两次预培养物含有低烟酸浓度(0.004 g/L)。在发酵COQ254中，在0.004 g/L烟酸存在的情况下进行所有四次预培养。该方法的每个步骤的烟酸浓度在表5中注明。由于各预培养步骤的培养基稀释，20L发酵罐中初始烟酸浓度为0.004 g/L，即低于调节浓度，以使得产生PT。　

*代表新鲜培养基中的烟酸浓度。　

**代表计算的烟酸浓度，考虑新鲜培养基中的烟酸浓度、由于添加接种物的新鲜培养基的稀释和连同前一步骤的接种物带来的烟酸(假设在生长过程中没有烟酸利用或降解)。

使用相同的冷冻细胞库用约1x10⁹百日咳博德特氏菌CFU(代表bvg ⁺与bvg ^-细胞的99:1比率)接种两次发酵的第一预培养物，其由含有30 ml新鲜培养基(用实施例1中描述的改良从Stainer和Scholte (J. Gen. Microbiol. 63:211-220 (1971))改良)的摇瓶组成。将第一预培养物在35℃(+/- 1℃)和150 rpm孵育24h (+/- 1h)，并用于接种含有1L新鲜培养基的第二摇瓶预培养物。将第二预培养物在35℃(+/- 1℃)和150 rpm孵育24h (+/- 2h)，并用于接种含有1L新鲜培养基的第三摇瓶。在35℃(+/- 1℃)和150 rpm孵育24h (+/- 1h)之后，第三预培养物用于接种两个各含1L新鲜培养基的摇瓶。在35℃(+/- 1℃)和150 rpm生长13h (+/- 1h)之后，将来自第四次预培养的两个摇瓶合并。第四次预培养一停止，马上将合并的预培养物用来接种发酵罐。平行地，通过将适当的稀释物铺板在含有5％血液的BG培养基上测量第四次预培养结束时bvg ⁺和bvg ^-细胞的比例。该比例代表20L发酵中bvg ^-细胞的初始比例(表6)。预培养系列的代数(18代，如从OD_650nm测量计算)代表可以用来以商业规模(约2,000L发酵液)进行发酵的代数。

使用20L发酵罐(Biolafitte)。将10L培养基无菌转移至发酵罐中。使用以下条件来校准100％溶解氧(DO)水平：温度(35℃)、排出压力(0.4巴)、空气流速(4.6L鼓泡空气/分钟)和搅拌速度(50 rpm)。

通过添加1.5L合并的预培养物实现接种。

在发酵过程中，使温度(35℃)和排出压力(0.4巴)维持恒定。使用机械消泡器来控制发酵过程中的泡沫。根据预先定义的曲线，空气流速在发酵过程中渐进地增加。将溶解氧的水平设定在25％，并通过当DO下降至25％以下时增加搅拌进行调节。将最低搅拌速度设定在50 rpm；将最大搅拌速度设定在550 rpm。将pH通过添加乙酸50％(w/v)调节在7.2。

在发酵过程中，生长作为650 nm处的光密度(OD_650nm)进行监测。在发酵结束时(定义为氧消耗降低- 作为谷氨酸盐耗竭的结果-，导致搅拌速度降低的时间)，培养上清液中百日咳毒素(PT)的产生通过ELISA测定，并且bvg ⁺和bvg ^-细胞的比例通过将发酵液的适当稀释物铺板在含有5％血液的BG培养基上进行测量(表6)。该比例代表20L发酵中bvg ^-细胞的最终比例(表6)。

在前两个预培养步骤过程中添加高烟酸浓度导致20L发酵开始时bvg ^-细胞的比例较低。尽管在发酵本身过程中没有对bvg ^-接管施加控制(0.004 g/L烟酸，使得PT表达)，但bvg ^-细胞的较低初始比例反映在发酵结束时，并且导致发酵液中PT滴度的显著增加。发酵COQ255稍微更慢，这与bvg ^-细胞比bvg ⁺细胞生长更快的观察结果一致。最终生物量浓度在两次发酵之间类似：只有细菌群体在bvg ⁺:bvg ^-比率方面的组成受到影响。这通过比PT产生(specific PT production)的增加说明(表6)。　

实施例6 –作为抑制PT产生的条件的低溶解氧

平行进行百日咳博德特氏菌的两次20L发酵。如实施例2中所述进行预培养步骤。相同的预培养系列用于接种两个20L发酵罐。如实施例1所述进行20L发酵，除了在第一次发酵中最大搅拌速度设定为550 rpm(COQ238；氧充足条件下)，且在第二次发酵中最大搅拌速度设定为280 rpm (COQ239；氧受限条件)。当碳源完全耗竭时(如氧消耗的突然停止所证明)，停止发酵。

两次发酵的溶解氧概况在图3中比较(使用亨利定律从温度、排出压力和相对溶解氧的在线测量计算绝对溶解氧)。生物量和PT产率显示于表7中。受限氧供给(COQ239)对最终生物量和PT浓度具有负面影响。在氧受限制条件下，培养物的生长速率也受负面影响。　

实施例7 - 使用酵母提取物以抑制PT产生

平行进行百日咳博德特氏菌的两次20L发酵。如实施例2中所述进行预培养步骤，除了L-谷氨酸钠浓度(20 g/L)。如实施例1中所述进行20L发酵，除了对培养基组成进行以下改良：在发酵COQ199中，以20 g/L的浓度将酵母提取物添加至培养基，而在发酵COQ182中，以10 g/L的浓度添加酪蛋白水解物。在两次发酵中，经由泡沫控制器通过自动添加聚二甲基硅氧烷乳剂控制发泡。当碳源完全耗竭时(如氧消耗的突然停止所证明)，停止发酵。

生物量和PT产率显示于表8中。酵母提取物(COQ199)而不是酪蛋白水解物(COQ182)的使用对生物量浓度具有正面影响，且对PT产生具有负面影响(与参考条件相比降低43％)。

实施例8 - 使用高脯氨酸浓度和低钠浓度以抑制PT产生

平行进行百日咳博德特氏菌的三次20L发酵。如实施例2中所述进行预培养步骤，除了培养基组成如实施例4中所述。如实施例1中所述进行20L发酵，除了培养基组成：在发酵COQ280中，添加脯氨酸以获得1 g/L的最终浓度，而在发酵COQ278中，脯氨酸浓度为12 g/L。为了保持两种条件之间相似量的碳源，将谷氨酸盐(作为谷氨酸钠提供)浓度从发酵COQ280中的20 g/L降低到发酵COQ278中的7 g/L。在发酵COQ281中，脯氨酸和谷氨酸盐浓度与COQ278相同，但以4 g/L的浓度添加NaCl，以补偿相比COQ280的谷氨酸钠的降低。当碳源完全耗竭时(如氧消耗的突然停止所证明)，停止发酵。

生物量和PT产率显示于表9中。当脯氨酸以高浓度存在(COQ278)时，观察到PT产生的显著降低(与COQ280相比降低58％)。当添加NaCl以补偿降低的谷氨酸钠浓度时，这种影响部分减轻(COQ281；与COQ280相比降低37％)。这些观察结果表明，高脯氨酸浓度和低钠浓度两者都对PT产生具有负面影响，且这些影响是累加的(即非冗余的)。

实施例9 - 使用高磷酸盐浓度以抑制PT产生

平行进行百日咳博德特氏菌的两次20L发酵。如实施例8中所述进行预培养步骤。如实施例1中所述进行20L发酵，除了对培养基组成进行以下改良：在发酵COQ280中，以0.5 g/L的浓度添加KH₂PO₄，而在发酵COQ279中，KH₂PO₄浓度为0.8 g/L。当碳源完全耗竭时(如氧消耗的突然停止所证明)，停止发酵。

生物量和PT产率显示于表10中。当磷酸盐以高浓度存在时，观察到PT产生的显著降低(与COQ280相比降低32％)。

实施例10 –组合高磷酸盐浓度、高脯氨酸浓度和低钠浓度以抑制PT产生

平行进行百日咳博德特氏菌的两次20L发酵。如实施例8中所述进行预培养步骤。如实施例1中所述进行20L发酵，除了对培养基组成进行以下改良(表11中详述)：在发酵COQ269中，培养基含有高磷酸盐(KH₂PO₄ 0.8 g/L)、低钠(谷氨酸钠7 g/L且无NaCl)和高脯氨酸(12 g/L)浓度的组合。当碳源完全耗竭时(如氧消耗的突然停止所证明)，停止发酵。

生物量和PT产率显示于表11中。在高磷酸盐、低钠和高脯氨酸浓度存在的情况下(COQ269)，观察到对生物量产率没有负面影响。然而，PT产生严重降低(与COQ280相比降低84％)。

实施例11 - 使用半胱氨酸浓度以抑制PT产生

平行进行百日咳博德特氏菌的两次20L发酵。如实施例2中所述进行预培养步骤。如实施例1中所述进行20L发酵，除了培养基组成的以下改良：在发酵COQ280中，以0.04 g/L的浓度添加L-半胱氨酸，而在发酵COQ396中，L-半胱氨酸的浓度为0.2 g/L。当碳源完全耗竭时(当存在氧消耗的突然停止)，停止发酵。

生物量和PT产率显示于表12中。当L-半胱氨酸以高浓度存在时，观察到PT产生的显著降低(与COQ280相比降低32％)。

实施例12 –用烟酸长期控制bvg ^- 接管

实施例3和4表明，0.6 g/L的烟酸可用于控制有限数目的代内bvg ^-细胞的接管，甚至从相对低比例的bvg-细胞(最多达6％)开始。为了将这种观察延伸到bvg ^-细胞的更高代数和更宽范围的初始比例，如下所述进行两组四次系列摇瓶培养。

首先，将一个bvg ⁺分离株和一个bvg ^-分离株分别接种在100ml改良自Stainer和Scholte(如实施例4中所述)(J. Gen. Microbiol. 63:211-220 (1971))且含有0.004 g/L烟酸的新鲜培养基。将两个摇瓶在35℃(+/- 1℃)以150 rpm孵育24h (+/- 1h)。将细胞通过离心收获，用新鲜培养基洗涤两次，并在新鲜培养基中再悬浮。然后制备两种细胞悬浮液的不同混合物，以获得含有93.8%、72.1%、4.2%或4% bvg ^-细胞的悬浮液。使用这四种混合细胞悬浮液中的每一种以接种两个分开的含有具有0.004 g/L烟酸或0.6 g/L烟酸的100 ml新鲜培养基的摇瓶。在35℃(+/- 1℃)和150 rpm孵育24h (+/- 1h)之后，每种培养物用于接种含有包含相同烟酸浓度的100 ml新鲜培养基的摇瓶。对于8种摇瓶培养物中的每一种，该程序总共重复17次，以达到约90至100的总代数。在每次传代(约5代)结束时，bvg ⁺和bvg ^-细胞的比例通过将培养物的适当稀释物铺板在BG培养基上进行测量。对于具有烟酸0.004 g/L的四次系列培养的结果表示在图4中，且对于具有烟酸0.6 g/L的四次系列培养的结果表示在图5中。

这些结果表明，使用0.6 g/L而不是0.004 g/L的烟酸，可以有效控制bvg ^-细胞的接管，这独立于这些细胞的初始比例。它们还显示，这种控制对于最多达100代是有效的，这通常对应于从新分离的百日咳博德特氏菌菌株开始产生用于接种工业规模发酵的工作细胞库和足够生物量(预培养系列)所需的代数。

Claims

1.发酵方法，其包括以下步骤：

a) 提供博德特氏菌属物种细菌的样品；

其中步骤c)在步骤b)之后发生。

2.权利要求1的发酵方法，其中所述bvg调节条件包括在以下温度下孵育所述样品

(i) 低于或等于28℃、低于或等于27℃、低于或等于26℃、或低于或等于25℃；

(ii) 高于或等于18℃、高于或等于20℃、高于或等于22℃、或高于或等于24℃；或

(iii) 0℃至28℃、0℃至27℃、0℃至26℃或0℃至25℃。

3.权利要求1-2中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节条件包括在以下氧浓度下孵育所述样品

(i) 低于或等于0.100、低于或等于0.090、低于或等于0.080、或低于或等于0.070 mmol溶解O₂ /升；

(ii) 高于或等于0.001、高于或等于0.050、高于或等于0.010、高于或等于0.015、高于或等于0.020、或高于或等于0.025 mmol溶解O₂ /升；或

(iii) 0.010至0.100、0.010至0.090、0.010至0.080或0.010至0.070 mmol溶解O₂ /升。

4.权利要求1-3中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节条件包括在碱性pH孵育所述样品。

5.权利要求4的发酵方法，其中所述碱性pH是以下pH

(i) 大于或等于7.2、大于或等于7.3、大于或等于7.4；

(ii)小于或等于9.5、小于或等于9.0、小于或等于8.5或小于或等于8.0；或

(iii) 7.2至8.0、7.3至8.0或7.4至8.0。

6.权利要求1-5中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节条件包括在酸性pH孵育所述样品。

7.权利要求6的发酵方法，其中所述酸性pH是以下pH

(i) 小于或等于7.0、小于或等于6.8、小于或等于6.6、小于或等于6.4或小于或等于6.2；

(ii) 高于或等于4.5、高于或等于5.0、高于或等于5.5、高于或等于6.0或高于或等于6.5；或

(iii) 5.0至7.0、5.0至6.9或5.0至6.8。

8.任何前述权利要求的发酵方法，其中所述第一环境是第一培养基。

9.任何前述权利要求的发酵方法，其中所述第二环境是第二培养基。

10.权利要求8的发酵方法，其中所述至少一种bvg调节条件包括在所述第一培养基中的至少一种bvg调节剂的存在。

11.发酵方法，其包括以下步骤：

b) 在所述包含至少一种bvg调节剂的第一培养基中将所述样品孵育至少5代，从而产生成熟培养物；

其中步骤c)在步骤b)之后发生。

12.发酵方法，其包括以下步骤：

a) 在第一培养基中提供博德特氏菌属物种细菌的样品；

其中步骤c)在步骤b)之后发生。

13.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述博德特氏菌属物种是选自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)和支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)的物种。

14.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述发酵方法是用于从博德特氏菌属物种生产一种或多种毒素的方法。

15.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中步骤b)包括小于40、小于35、小于30、小于25、小于20或小于18代。

16.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述方法是用于在工业培养物中保存bvg+基因型的博德特氏菌属物种的方法。

17.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述方法是用于在工业培养物中在生长中将毒力因子的表达损失降到最低的方法。

18.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述方法是用于增强产生博德特氏菌属物种毒力因子的方法。

19.权利要求10-18中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含烟酸。

20.权利要求19的发酵方法，其中所述烟酸是以以下的浓度

(i) 大于或等于0.004g/l、大于或等于0.01g/l、大于或等于0.1g/l、大于或等于0.2g/l、大于或等于0.3g/l、或大于或等于0.004g/l；

(ii)小于或等于400g/l、小于或等于300 g/l、小于或等于200g/l、小于或等于100g/l、小于或等于50g/l、或小于或等于5g/l；或

(iii) 0.004g/l至500g/l、0.01g/l至400g/l、0.1g/l至300g/l、0.4g/l至200g/l或0.2g/l至100g/l。

21.权利要求10-20中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含选自镁盐、硫酸盐、磷酸盐和碳酸盐的无机盐。

22.权利要求21的发酵方法，其中所述无机盐是硫酸盐。

23.权利要求22的发酵方法，其中所述硫酸盐是以以下的浓度

(i) 大于或等于0.04mM、大于或等于0.08mM、大于或等于1mM、大于或等于4mM、大于或等于8mM或大于或等于10mM；

(ii) 小于或等于50mM、小于或等于40mM、小于或等于35mM、小于或等于30mM、小于或等于25mM、小于或等于20mM或小于或等于15mM；或

(iii) 0.04mM至40mM、0.08mM至1mM、4mM至40mM、8mM至10mM、15mM至40mM、或17mM至40mM。

24.权利要求21的发酵方法，其中所述无机盐是磷酸盐。

25.权利要求24的发酵方法，其中所述磷酸盐是以以下的浓度

(i) 大于或等于0.4g/l、大于或等于0.5g/l、大于或等于0.6g/l、或大于或等于0.7g/L；

(ii) 小于或等于20g/l、小于或等于18g/l、小于或等于16g/l、小于或等于10g/l、小于或等于5g/l、或小于或等于2g/l；或

(iii) 0.4g/L至20g/L、0.5g/L至20g/L、0.6g/L至20g/L或0.7g/L至20g/L。

26.权利要求10-25中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含蔗糖。

27.权利要求26的发酵方法，其中所述蔗糖是以以下的浓度

(i) 大于或等于10mM、大于或等于15mM、大于或等于20mM、大于或等于25mM、大于或等于30mM、大于或等于35mM或大于或等于40mM；

(ii) 小于或等于100mM、小于或等于90mM、小于或等于85mM、小于或等于80mM、小于或等于75mM、小于或等于70mM或小于或等于50mM；或

(iii) 10mM至100mM、15mM至95mM、20mM至90mM、25mM至85mM或30mM至80mM。

28.权利要求10-27中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含选自酵母提取物、胰蛋白酶大豆琼脂、磷酸胰蛋白、脑心组织浸出物和蛋白胨的复合培养基组分。

29.权利要求28的发酵方法，其中所述复合培养基组分是以以下的浓度

(i) 大于或等于1g/L、大于或等于3g/L、大于或等于5g/L、或大于或等于10g/L；

(ii) 小于或等于40g/L、小于或等于35g/L、小于或等于30g/l、小于或等于25g/l、或小于或等于20g/L；或

(iii) 1g/L至40g/l、3g/l至40g/l、5g/l至40g/L、或10g/L至40g/L。

30.权利要求10-29中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含脯氨酸。

31.权利要求30的发酵方法，其中所述脯氨酸是以以下的浓度

(i) 大于或等于0.25g/l、大于或等于0.4g/l、大于或等于0.5g/l、大于或等于0.6g/L、大于或等于1g/L、大于或等于2g/L、大于或等于3g/L、或大于或等于4g/l；

(ii)小于或等于50g/L、小于或等于30g/L、小于或等于25g/L、小于或等于20g/L、或小于或等于15g/L；或

(iii) 0.25g/L至50g/L、0.4g/L至50g/L、0.5g/L至50g/L、0.6g/L至50g/L、1g/L至50g/L、2g/L至50g/L、3g/L至50g/L、或4g/L至50g/L。

32.权利要求10-31中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含以以下浓度的钠离子

(i) 大于100mM、大于120mM、大于150mM、大于175mM、大于200mM、或大于250mM；

(ii) 小于2000mM、小于1000mM、或小于800mM；或

(iii) 100mM至2000mM、120mM至2000mM、150mM至2000mM、175mM至2000mM、或200mM至2000mM。

33.权利要求10-32中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含消泡剂。

34.权利要求33的发酵方法，其中所述消泡剂是聚二甲基硅氧烷。

35.权利要求33或34的发酵方法，其中所述聚二甲基硅氧烷是以以下的浓度

(i) 大于或等于5g/l、大于或等于10g/l、大于或等于15g/l、大于或等于20g/l、大于或等于25g/l、大于或等于30g/l、或大于或等于40g/l；

(ii)小于或等于250g/l、小于或等于230g/l、小于或等于200g/l、小于或等于180g/l、或小于或等于150g/l；或

(iii) 5g/l至250g/l、10g/l至230g/l、15g/l至200g/l、20g/l至180g/l、25g/l至150g/l或25g/l至150g/l。

36.权利要求10-35中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含谷胱甘肽。

37.权利要求36的发酵方法，其中所述谷胱甘肽是以以下的浓度

(i) 大于或等于0.15g/L、大于或等于0.20g/L、大于或等于0.25g/L、大于或等于0.30g/L、大于或等于0.35g/L、或大于或等于0.40g/L；

(ii)小于或等于20g/L、小于或等于15g/l、小于或等于12g/L、或小于或等于10g/L、或

(iii) 0.15g/L至20g/L、0.20g/L至20g/L、0.25g/L至20g/L、0.30g/L至20g/L、0.35g/L至20g/L、0.35g/L至20g/L或0.40g/L至20g/L。

38.权利要求10-37中任一项的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含至少一种含硫氨基酸。

39.权利要求38的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含半胱氨酸。

40.权利要求39的发酵方法，其中所述bvg调节剂包含甲硫氨酸。

41.权利要求38-40中任一项的发酵方法，其中所述含硫氨基酸是以以下的浓度

(i) 大于或等于0.25mM、大于或等于0.5mM、或大于或等于0.8mM；

(ii) 小于或等于1000mM、小于或等于500mM、小于或等于250mM、小于或等于100mM、小于或等于50mM、小于或等于25mM、或小于或等于10mM；或

(iii) 0.25mM至1000mM、 0.5mM至500mM、0.8mM至250mM、或0.5mM至100mM。

42.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中

在步骤c)开始时，所述成熟培养物的

(i) 小于或等于20%、小于或等于18%、小于或等于15%、小于或等于12%、小于或等于10%、小于或等于8%、小于或等于6%、小于或等于5%、小于或等于4%、或小于或等于3%；

(ii) 大于或等于1%、大于或等于2%、或大于或等于3%；或

(iii) 2%至10%、2%至8%、2%至12%、2%至10%、2%至6%或2%至5%

是bvg-基因型。

43.权利要求9-42中任一项的发酵方法，其中所述第二培养基包含Stainer Scholte培养基。

44.权利要求9-42中任一项的发酵方法，其中所述第二培养基包含改良的Stainer Scholte培养基。

45.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中步骤b)的至少部分在体积为

(i) 50ml至25升、50ml至20升、50ml至15升、50ml至10升、或50ml至5升；

(ii)小于或等于25升、小于或等于20升、小于或等于15升、小于或等于10升、或小于或等于5升；或

(iii)大于或等于25 ml、大于或等于50ml、大于或等于100ml、大于或等于250ml、大于或等于500ml、大于或等于1升、或大于或等于2升

的容器中进行。

46.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中步骤c)在发酵罐中进行。

47.权利要求46的发酵方法，其中所述发酵罐工作体积为

(i) 5至10000升、10至5000升、20至2000升、或50升至1000升；

(ii) 大于或等于5升、大于或等于10升、大于或等于15升、大于或等于20升、大于或等于25升、大于或等于50升、或大于或等于100升；或

(iii) 小于或等于10000升、小于或等于5000升、或小于或等于2500升。

48.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤c)在以下温度下进行

(i) 大于或等于32℃、大于或等于33℃、大于或等于34℃、或大于或等于35℃；

(ii) 小于或等于45℃、小于或等于42℃、小于或等于40℃、或小于或等于38℃；或

(iii) 32℃至45℃、33℃至42℃、34℃至40℃、或35℃至38℃。

49.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中在步骤c)中使用机械消泡器。

50.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中步骤b)包括预培养阶段。

51.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中步骤b)包括细胞建库阶段。

52.权利要求1-49中任一项的发酵方法，其中细胞建库在步骤a)和步骤b)之间发生。

53.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述方法进一步包括选择博德特氏菌属物种的细菌样品的步骤i)，其中所述细菌样品主要是Bvg+基因型，并且其中步骤i)在步骤a)之前发生。

54.权利要求53的发酵方法，其中所述细菌样品的大于85%、大于90%、大于95%、大于98%、85%至100%、90%至100%、95%至100%或98%至100%是Bvg+基因型。

55.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中步骤b)包括至少8、10、12、14、16或17代。

56.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中步骤b)是

(i) 小于或等于200小时、小于或等于150小时、小于或等于100小时、小于或等于80小时、小于或等于70小时、小于或等于60小时、或小于或等于55小时；

(ii) 大于或等于10小时、大于或等于15小时、大于或等于20小时、大于或等于25小时、大于或等于30小时、大于或等于35小时、或大于或等于40小时；或

(iii) 10小时至200小时、15小时至150小时、20小时至100小时、25小时至80小时、或30小时至70小时。

57.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤c)是

(i) 小于或等于200小时、小于或等于150小时、小于或等于100小时、小于或等于80小时、小于或等于60小时、或小于或等于40小时；

(ii) 大于或等于5小时、大于或等于10小时、大于或等于15小时、或大于或等于25小时；或

(iii) 5小时至200小时、10小时至150小时、15小时至100小时、或25小时至80小时。

58.权利要求1或3-57中任一项的发酵方法，其中步骤b)在20℃至45℃、22℃至43℃、24℃至42℃、28℃至42℃、30℃至42℃、或32℃至40℃的温度下进行。

59.权利要求1-3和8-58中任一项的发酵方法，其中步骤b)在6.5至7.8或6.8至7.5的pH进行。

60.任何前述权利要求的发酵方法，其中步骤c)在6.5至7.8或6.8至7.5的pH进行。

61.权利要求1-2和4-60中任一项的发酵方法，其中步骤b)在10%至50%、15%至45%、20%至35%溶解氧存在的情况下进行。

62.任何前述权利要求的发酵方法，其中步骤c)在0%至50%、0%至45%、0%至35%溶解氧存在的情况下进行。

63.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述博德特氏菌属物种表达至少一种选自百日咳毒素、丝状血细胞凝集素、百日咳杆菌粘附素和菌毛凝集原的毒力因子。

64.权利要求63的发酵方法，其中所述百日咳毒素在步骤b)中以小于

的百日咳毒素比生产速率产生。

65.权利要求53或65的发酵方法，其中所述百日咳毒素在步骤c)过程中以大于的百日咳毒素比生产速率产生. 66. 权利要求63-65中任一项的发酵方法，其进一步包括纯化所述毒力因子以产生纯化的毒力因子的步骤d)。

66.权利要求63-65中任一项的发酵方法，其进一步包括纯化所述毒力因子以产生纯化的毒力因子的步骤d)。

67.权利要求66的发酵方法，其进一步包括配制包含所述纯化的毒力因子的免疫原性组合物的步骤e)。

68.权利要求67的发酵方法，其进一步包括将至少一种抗原添加至所述免疫原性组合物的步骤f)。

69.权利要求68的发酵方法，其中所述抗原选自百日咳毒素、丝状血细胞凝集素、百日咳杆菌粘附素、菌毛凝集原、白喉类毒素、破伤风类毒素、缀合的来自脑膜炎奈瑟氏球菌的糖抗原、乙型肝炎表面抗原、灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)和缀合的来自b型流感嗜血杆菌的糖抗原。

70.权利要求67-69中任一项的发酵方法，其包括将药学上可接受的赋形剂添加至所述免疫原性组合物的步骤g)。

71.权利要求67-70中任一项的发酵方法，其包括将佐剂添加至所述免疫原性组合物的步骤f)。

72.权利要求71的发酵方法，其中所述佐剂包含磷酸铝或氢氧化铝。