BR112014017898B1 - Processo de fermentação - Google Patents
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Abstract
processo de fermentação. a presente invenção refere-se a um processo para fermentar bordetella compreendendo: a) fornecer uma amostra de bactérias de uma espécie de bordetella; b) incubar as amostras de bactérias de uma espécie de bordetella em um primeiro ambiente em pelo menos um bvg (genes de virulência de bordetella) que modula a condição por pelo menos 5 gerações, produzindo por meio disso uma cultura madura; c) incubar a cultura madura em um segundo ambiente na ausência do pelo menos um bvg que modula a condição; em que etapa c) corre após etapa b).
Description
[0001] A bactéria Bordetella pertussis é o agente etiológico da coqueluche, uma doença respiratória que pode ser grave em crianças e crianças pequenas. O curso clínico da doença é caracterizado por paroxismos de tosses rápidas seguido por esforço inspiratório, frequentemente associado a wo uqo ectceVgtíuVkeq òfg eqswgnwejgóo Go ecuqu itcxgu. c I'cltc fg qzkiêpkq pode levar ao dano cerebral; entretanto a complicação mais comum é pneumonia secundária.
[0002] Em geral, considera-se que a coqueluche é causada por B. pertussis, mas ocasionalmente B. parapertussis é isolada de pacientes com sinais e sintomas típicos de coqueluche. A infecção por B. parapertussis é de menor frequência que B. pertussis, com 5-10% de coqueluche sendo associada a B. parapertussis (Mertsola (1985) Eur J Clin Microbiol 4; 123; Lautrop (1971) Lancet 1(7711) 1195-1198). B. parapertussis está associada com sintomas clínicos menos graves, e combinada com sua reatividade cruzada sorológica com B. pertussis, torna B. parapertussis difícil de diagnosticar.
[0003] A primeira geração de vacinas contra B. pertussis foi de vacinas de célula completa, compostas de bactérias mortas completas. Foram introduzidas em muitos países nos anos de 1950 e 1960 e foram satisfatórias na redução da incidência de coqueluche. Um problema com as vacinas de célula complete de B. pertussis é o nível elevado de reatogenicidade associado às mesmas. Vacinas acelulares contendo proteínas purificadas de B. pertussis são menos reatogênicas e foram adotadas pelos programas de vacinação de muitos países. Vacinas acelulares contendo tipicamente toxina pertussis (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA) e muito frequentemente pertactina (PRN), são amplamente usadas e fornecem proteção eficiente contra a gravidade da coqueluche.
[0004] Em um primeiro aspecto, é fornecido um processo de fermentação compreendendo as seguintes etapas: a) fornecer uma amostra de bactérias de uma espécie de Bordetella; b) incubar as amostras de bactérias de uma espécie de Bordetella em um primeiro ambiente em pelo menos um bvg (genes de virulência de Bordetella) que modula a condição por pelo menos 5 gerações, produzindo por meio disso uma cultura madura; c) incubar a cultura madura em um segundo ambiente na ausência do pelo menos um bvg que modula a condição; em que etapa c) ocorre após etapa b).
[0005] Em um segundo aspecto, é fornecido um processo de fermentação compreendendo as seguintes etapas: a) fornecer uma amostra de bactérias de uma espécie de Bordetella em um primeiro meio de cultura compreendendo pelo menos um modulador de bvg; b) incubar a amostra no primeiro meio de cultura compreendendo o pelo menos um modulador de bvg por pelo menos 5 gerações, produzindo por meio disso uma cultura madura; c) incubar a cultura madura em um segundo meio de cultura na ausência do pelo menos um modulador de bvg; em que etapa c) ocorre após etapa b).
[0006] Em um terceiro aspecto, é fornecido um processo de fermentação compreendendo as seguintes etapas: a) fornecer uma amostra de bactérias de uma espécie de Bordetella em um primeiro meio de cultura; b) incubar a amostra no primeiro meio de cultura compreendendo pelo menos um modulador de bvg por pelo menos 5 gerações, produzindo por meio disso uma cultura madura; c) incubar a cultura madura em um segundo meio de cultura na ausência do pelo menos um modulador de bvg; em que etapa c) ocorre após etapa b).
[0007] Em um quarto aspecto, é fornecido um fator de virulência obtido pelo processo.
[0008] Em um quinto aspecto, é fornecido um fator de virulência obtido pelo processo.
[0009] Em um sexto aspecto, é fornecido uma composição imunogênica compreendendo o fator de virulência e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00010] Em um sétimo aspecto, é fornecido uma vacina compreendendo a composição imunogênica.
[00011] Em um oitavo aspecto, é fornecido um uso da composição imunogênica ou a vacina na prevenção ou tratamento de doença.
[00012] Em um nono aspecto, é fornecido um uso da composição imunogênica ou a vacina na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doença bacteriana.
[00013] Em um décimo aspecto, é fornecido um método de prevenir ou tratar doença compreendendo administrar a composição imunogênica ou a vacina a um paciente.
[00014] FIG 1. Gráfico que representa crescimento de células de Bordetella pertussis com genótipo de bvg- e genótipo de bvg+ contra tempo de fermentação. Crescimento das células bvg- é representado pela linha que conecta pontos em forma de diamante; crescimento das células bvg+ é representado pela linha que conecta os pontos em fora de quadrado.
[00015] FIG 2. Gráfico que representa a proporção de células de Bordetella pertussis que apresentam genótipo de bvg- contra o número de gerações com níveis variados do modulador de bvg niacina. A linha que conecta os pontos de forma quadrada representa a proporção das células que são bvg- quando 0,004g/L de niacina é usada, a linha que conecta os pontos em forma de círculo representa a proporção de células que apresentam genótipo de bvg- quando 0,021g/L de niacina é usado, a linha que conecta os pontos em forma de diamante representa a proporção de células que são bvg- quando 0,113g/L de niacina é usada, e a linha que conecta os pontos em forma triangular representa a proporção de células que são bvg- quando 0,604g/L de niacina é usada.
[00016] FIG 3 Gráfico que representa o perfil de oxigênio dissolvido para as duas fermentações descrito no exemplo 6. A linha superior descreve o perfil de oxigênio dissolvido quando a fermentação teve oxigênio suficiente, e a linha inferior descreve o perfil de oxigênio dissolvido quando a fermentação teve oxigênio limitado.
[00017] FIG 4. Gráfico que representa a proporção de células de genótipo de bvg- em 4 culturas fermentadas na presença de 0,004g/L de niacina contra números de gerações. Os pontos de forma quadrada representam uma cultura com uma proporção inicial de 95% de células de genótipo de bvg- no início da fermentação. Os pontos em forma de círculo representam uma cultura com uma proporção inicial de 75% de células de genótipo de bvg- no início da fermentação. Os pontos em forma triangular representam uma cultura com uma proporção inicial de 25% de células de genótipo de bvg- no início da fermentação. Os pontos em forma de diamante representam uma cultura com uma proporção inicial de 5% de células de genótipo de bvg- no início da fermentação.
[00018] FIG 5. Gráfico que representa a proporção de células de genótipo de bvg- em 4 culturas fermentadas na presença de 0,6 g/L de niacina contra número de gerações. Os pontos de forma quadrada representam uma cultura com uma proporção inicial de 95% de células de genótipo de bvg- no início da fermentação. Os pontos em forma de círculo representam uma cultura com uma proporção inicial de 75% de células de genótipo de bvg- no início da fermentação. Os pontos em forma triangular representam uma cultura com uma proporção inicial de 25% de células de genótipo de bvg- no início da fermentação. Os pontos em forma de diamante representam uma cultura com uma proporção inicial de 5% de células de genótipo de bvg- no início da fermentação.
[00019] Os inventores observaram surpreendentemente que maiores rendimentos de fatores de virulência de Pertussis podem ser obtidos crescendo espécies de Pertussis da maneira aqui descrita, na presença de pelo menos um bvg que modula a condição, embora as condições de modulação de bvg sejam em geral consideradas por inibir a expressão de fatores de virulência das espécies de Pertussis.
[00020] B. pertussis pode exibir diferentes fenótipos em termos de virulência. Estes fenótipos são denominados Bvg+ e Bvg- (Bvg indica a expressão ou perda destes genes de virulência de Bordetella). O fenótipo de Bvg+ é um fenótipo de virulência caracterizado pela expressão elevada de fatores de virulência, tal como toxina pertussis (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA) e pertactina (PRN), mas também outras toxinas e adesinas. O fenótipo de Bvg- é um fenótipo de avirulência, que não expressa fatores de virulência tal como PT ou outras toxinas/adesinas.
[00021] A transição entre os estados fenotípicos está no controle do sistema regulatório de dois componentes BvgAS, que detecta diretamente ou indiretamente condições ambientais tais como temperatura, sulfato, ácido nicotínico, e regula a expressão de genes em seu controle. Em certas condições, o sensor de proteína BvgS autofosforila, e por meio de uma cascata de fosforilação, o grupo fosforil é por fim transferido para a resposta do regulador BvgA. BvgA~P ativo (fosforilado) se liga à região promotora dos genes do fator de virulência, e modula seu nível de transcrição. Um sistema de regulação resulta na integração de sugestões ambientais em um nível de um único regulador transcricional central, BvgAS. Como um resultado, B. pertussis regula a expressão de fatores de virulência no nível transcricional, em resposta às condições ambientais.
[00022] Genes no controle transcricional do sistema BvgAS formam o a regulação de Bvg.
[00023] Compostos que inibem a produção de fatores de virulência de pertussis frequentemente agem modulando o locus genético bvg e consequentemente podem ser denominados moduladores de bvg. De maneira similar, as condições que favorecem o fenótipo de Bvg+ podem ser denominadas condições que modulam bvg.
[00024] Em geral, as células de Bordetella são capazes de mutar entre os genótipos Bvg+ e Bvg-. Em particular, durante o cultivo, as células de Bordetella podem mutar para o genótipo de bvg- por meio de mutações espontâneas. As células com genótipo de bvg- apresentam o fenótipo de Bvg-, isto significa que elas produzem menos quantidade de fatores de virulência (e assim são indesejáveis em um processo de fermentação pretendido para produzir níveis elevados de fatores de virulência). O fato de que as células de genótipo de bvg- produzem menores níveis de fatores de virulência fornece as células com genótipo de o Bvg- com uma vantagem sobre aquelas do genótipo de bvg+, ou seja, aquelas que menos de sua energia é gasta na produção de fatores de virulência, permitindo que as mesmas cresçam mais rápido. Por esta razão, quando as células de Bordetella são cultivadas, a proporção de células que apresentam o genótipo de Bvg- tende a aumentar como o tempo (conhecido como aquisição de Bvg-). Os presentes inventores demonstraram que uma maior proporção de células pode ser mantida no genótipo de bvg+ pela adição de um Bvg que modula a condição. Estas condições, da maneira explicada anteriormente, favorecem o estado fenotípico de Bvg- e a presença de uma condição como esta permite que a Bordetella expresse o fenótipo de Bvg- (mantendo ao mesmo tempo seu genótipo de bvg+). Isto remove a vantagem competitiva das células com genótipo de bvg-, significando que a proporção de células com genótipo de bvg- na cultura final seja menor. Durante a fase de crescimento da fermentação, Bordetella pode ser crescida nestas condições que modulam bvg até que uma massa desejada de genótipo de células bvg+ seja atingida. Uma vez que a massa de células de Bordetella é suficientemente elevada, o bvg que modula a condição pode ser removido, permitindo que as células com o genótipo de bvg+ retornem ao fenótipo de Bvg+ e expressem níveis elevados dos fatores de virulência.
[00025] Rctc gxkVct fúxkfcu. swcnswgt fcu tefetêpekcu c òefinwncu Bvi-’ qw Òefinwncu dxi-Ó tghgtg-se às células que apresentam o genótipo de bvg+, de ocpektc ukoknct swcnswet tehetêpekc c Òefinwncu Bvi-Ó qw Òefinwncu dvi-Ó tehete- se às células que apresentam o genótipo de bvg-.
[00026] Assim, os presentes inventores observaram que um processo para fermentar uma espécie de Bordetella pode ser intensificado adicionando uma etapa de crescer uma espécie de Bordetella em pelo menos um bvg que modula a condição, isto garante que Bordetella possa crescer em massa elevada, mantendo ao mesmo tempo uma proporção elevada das células de Bordetella com genótipo de Bvg+, e quando a massa de células suficiente é atingida o bvg que modula a condição pode ser removido, levando a uma cultura contendo uma proporção elevada de células com genótipo de bvg+ que expressam fatores de virulência em um nível elevado. Isto leva ao maior rendimento de fatores de virulência produzidos a partir da espécie de Bordetella. Isto é independente do fato de que, em geral, as condições que modulam bvg da maneira aqui definida levam à redução de expressão de fatores de virulência.
[00027] Dessa maneira, em uma primeira forma de realização é fornecido um processo de fermentação compreendendo as seguintes etapas: a) fornecer uma amostra de bactérias de uma espécie de Bordetella; b) incubar as amostras de bactérias de uma espécie de Bordetella em um primeiro ambiente em pelo menos um bvg (genes de virulência de Bordetella) que modula a condição por pelo menos 5 gerações, produzindo por meio disso uma cultura madura; c) incubar a cultura madura em um segundo ambiente na ausência do pelo menos um bvg que modula a condição; em que etapa c) ocorre após etapa b).
[00028] Etapa b) descreve uma etapa em que um bvg que modula a condição está presente e a cultura de Bordetella é crescida a fim de fornecer massa celular suficiente para a expressão elevada, embora preservando o genótipo de bvg+ (que reduz a obtenção de células Bvg-).A espécie de Bordetella pode então ser transferida para condições na ausência do bvg que modula a condição para permitir a expressão de fatores de virulência (etapa c). A espécie de Bordetella pode ser exposta ao bvg que modula a condição mais cedo no processo de fermentação, por exemplo, o bvg que modula a condição pode ser usado durante uma etapa de armazenamento celular. Alternativamente, o bvg que modula a condição pode ser adicionado em um estágio posterior tal como durante a pré-cultura.
[00029] Q Vgtoq òrtqeguuq fg fgtogpVc>«qó tgfgtg-se a um processo em escala industrial (por exemplo, 20 litros ou mais) para crescer células e/ou expressar uma proteína a partir destas células. Neste caso, o processo da revelação pode ser usado para expressar concentrações elevadas de fatores de virulência da espécie de Bordetella. Alternativamente, outras aplicações são previstas, por exemplo, o processo pode ser usado para crescer a espécie de Bordetella para uso no preparo de vacinas de células completas de Bordetella. Opcionalmente, o processo de fermentação é um processo para produção de uma ou mais toxinas da espécie de Bordetella. Em uma forma de realização, o processo é um processo para conservar a espécie de Bordetella em um genótipo de bvg+ em cultura industrial. Em uma forma de realização, o processo é um processo para conservar perda de expressão de fatores de virulência em crescimento em cultura industrial. Em uma forma de realização, o processo é um processo para intensificar produção de fatores de virulência da espécie de Bordetella.
[00030] Q"vgtoq"Ògurfiekg" fg" BordetellaÓ"tghgtg-se a uma espécie do gênero Bordetella incluindo, mas sem limitação, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis e Bordetella bronchiseptica, preferivelmente Bordetella pertussis.
[00031] A menos que de outra forma explicada, todos os termos técnicos e científicos aqui usados apresentam o mesmo significado da maneira comumente entendida pelos versados na técnica aos quais esta revelação pertence. As definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[00032] Qu Vgtoqu ukpiwnctgu “wo”, “woc”. “c” e “o” kpenwgo qu referentes plurais, a menos que de outra forma claramente indicada. De maneira similar, pretende-se que a rcncxtc “qw” kpenwc “e”. c oepqu swe q eqpvezvq kpfkswe enctcoepve fe qwvtc hqtoc0 Q vetoq “rnwtcnkfcfe” tehete-se a dois ou mais. Certamente, entende-se que todos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácido, e todos os valores de peso molecular ou massa molecular fornecidos para ácidos nucleicos ou polipeptídeos são aproximados, e são fornecidos para descrição. Adicionalmente, as limitações numéricas fornecidas com relação às concentrações ou níveis de uma substância, tal como um antígeno, são pretendidas para serem aproximadas. Assim, onde uma concentração é indicada para ser pelo menos (por exemplo) 200 pg, pretende-se que a concentração seja entendida como pelo menos crtqzkocfcogpVg *qw “egtec fg” qw “\”+ 422 rio
[00033] Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste desta revelação, os ofiVqfqu g ocVgtkcku cfgswcfqu u«q fguetkVqu c uggim; Q Vgtoq “eoortggpfg” ukgpkfiec “kpenwko” Cuuko, c ogpqu swg q eqpVgzVq gzkjc fg qwVtc fotoc, c rcncxtc “eoortggpfg” g xctkc>õgu Vcku eooo “eoortggpfgo” g “eoortggpfgpfo” ugt«o gpVgpfkfcu rctc kornkect c kpenwu«o fg wo eoorouVo ou composição declarada (por exemplo, ácido nucléico, polipeptídeo, antígeno) ou etapa, ou grupo de compostos ou etapas, mas não a exclusão de nenhum de outros compostos, composição, etapas, ou grupos destes. Os Vgtoou “eoortggpfgpfo”, “eoortggpfgo” g “eoortggpfg” u«o cswk pretendidos pelos inventores para serem opcionalmente substituídos pelos vgtoou “eopukuvkpfo go”, “eopukuvgo go” g “eopukuvg go”, tgurgevkxcogpvg, em cada exemplo.
[00034] C cdtgxkc>«o “e.g. ” fi fgtkxcfc fo NcVkp exempli gratia, e é cswk wucfc rctc kpfkect wo gzgorno p«o nkokVcpVgo Cuuko, c cdtgxkc>«o “ e.g. ” fi ukp»pkoc fo vgtoo “rot gzgorno0”
[00035] Etapa a) descreve a fase do processo de fermentação antes de expor a espécie de Bordetella ao bvg que modula a condição; isto em geral refere-se a uma etapa de fornecer uma amostra de uma quantidade de bactérias vivas do gênero Bordetella. O meio que é inoculado pode ser um meio sólido ou um líquido. Em uma forma de realização, o processo compreende adicionalmente uma etapa i) de selecionar uma amostra da bactérias de uma espécie de Bordetella, em que a amostra da bactérias apresenta predominantemente o genótipo de bvg+ e em que etapa i) ocorre antes da etapa a). Opcionalmente mais de 50%, mais de 60%, mais de 70%, mais de 75%, mais de 80%, mais de 85%, mais de 90%, mais de 95%, mais de 98%, entre 85% e 100%, entre 90% e 100%, entre 95% e 100% ou entre 98% e 100% da amostra da bactérias apresenta o genótipo de bvg+ na etapa a).
[00036] O processo da revelação reduz a obtenção de células com genótipo de bvg- e, assim, é vantajoso iniciar o processo que usa uma amostra da espécie de Bordetella que apresenta predominantemente o genótipo de bvg+.
[00037] A amostra usada na etapa a) pode ser obtida de qualquer fonte, por exemplo, a amostra pode ser selecionada de uma linhagem celular mantida em um laboratório, ou pode ser obtida de uma instituição tal como a ATCC (American Type Culture Collection).
[00038] Etapa b) descreve a exposição da amostra da etapa a) a pelo menos um bvg que modula a condição, uma condição como esta pode ser qualquer condição que reduz a obtenção de células com genótipo de bvg- ou conserva o genótipo de bvg+. Sem ficar preso a nenhuma teoria, quando Bordetella é incubada em cultura (por exemplo, em um laboratório ou uma instalação de fabricação) a proporção do células que apresentam genótipo de bvg- tende a aumentar com o tempo (várias gerações). Isto pode ser em virtude de uma vantagem seletiva que resulta de fatores de virulência não expressos, os quais não apresentam benefício para a Bordetella em cultura. Por esta razão, incubar Bordetella na presença de uma condição que reduz a expressão de fatores de virulência reduz a vantagem seletiva de converter para genótipo de bvg-, reduzindo assim a obtenção de células com genótipo de bvg- em cultura. Mantendo ao mesmo tempo a população com genótipo de bvg+ na amostra.
[00039] Por esta razão, condições que modulam bvg incluem condições que reduzem a gzrtguu«q fg haVqtgu fg xktwnêpekCo Woc eqpfk>«q fg òdxi swg oqfwnc a eqpfk>«qó fi. qrekqpalogpVg, woc eqpfk>«q swg rtgxkpg wo cwogpVq na proporção de células com genótipo de bvg- em mais de 25 vezes, 15 vezes, 10 vezes, 9 vezes, 8 vezes, 7 vezes, 6 vezes, 5 vezes, 4, 3 vezes, 2 vezes, 1,5 vez, após crescimento em cultura por 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais gerações. Uma geração refere-se ao tempo que leva para o número de bactérias em uma cultura dobrar, que é aproximadamente 4 horas para Bordetella pertussis, entretanto, isto varia dependendo das condições em que a Bordetella pertussis é crescida. É possível determinar se um potencial bvg que modula a condição é, de fato, um bvg que modula a condição crescendo células no potencial bvg que modula a condição por pelo menos 8 gerações, e plaqueando as células no meio Bordet-Gengou (que contém 5% de sangue) *Dqtfgv L g Igpiqw Q. Ng Oketqdg fg lc eqswglwejg. Cppclgu fg lÓKpuvkvwv Pasteur 1906; 20:731-41), a fim de obter colônias simples. No meio BG, as células com genótipo de bvg+ aparecem como colônias abauladas, compactas, hemolíticas, ao passo que células com genótipo de bvg- aparecem como colônias planas, não hemolíticas. Os resultados deste teste podem ser comparados às células que foram crescidas nas mesmas condições, mas sem o uso do potencial bvg que modula a condição. Se a proporção de células com genótipo de bvg- for significativamente menor que a proporção de células com genótipo de bvg- na amostra de referência, a condição é um bvg que modula a condição.
[00040] Qualquer bvg que modula a condição pode ser usado no contexto da presente revelação; os exemplos particulares incluem condições de ph elevado ou baixo, condições de baixo oxigênio, condições de temperatura baixa ou a presença de um modulador de bvg.
[00041] C htcug Òoqfwlcfqt fg dxiÓ tghgtg-se a um composto em uma concentração adequada (uma concentração modulatória) que reduz a obtenção de células com genótipo de bvg-. A concentração do modulador de bvg não é necessariamente constante em toda a etapa b), mas permanece em uma concentração modulatória em toda a etapa b). Por exemplo, niacina em várias concentrações, incluindo 0,604g/L, é um modulador de bvg. Em geral, compostos que inibem a expressão de toxinas, tal como toxina pertussis de Bordetella pertussis são moduladores de bvg.
[00042] Etapa b) refere-se a qualquer fase de um processo de fermentação em que pelo menos um bvg que modula a condição está presente, por exemplo, esta etapa pode incluir armazenamento celular e/ou pré-cultura e/ou fermentação em itcpfg guecnco Q Vgtoq òctoczgpcogpVq egnwnctó fi evidente para os versados na técnica. Em geral, armazenamento celular envolve preparar uma cepa de bactérias para estocagem e pode envolver obter um clone de bactérias (que pode ser o inoculo referido ao anterior) e incubar o clone de bactérias até um volume pequeno de bactérias ser obtido. As amostras deste volume de bactérias podem ser preparadas, congeladas rapidamente e mantidas em um congelador. A pré-cultura envolve em geral obter uma cultura menor e permitir que as células se reproduzam, a fim de atingir uma concentração suficiente de células para a próxima etapa no processo, por exemplo, expressão do fator de virulência. Isto pode envolver várias incubações pequenas, por exemplo, uma amostra pequena de Bordetella pode ser crescida em um frasco de agitação pequeno, e os conteúdos deste frasco de agitação pequeno podem ser transferidos para um frasco de agitação maior. Isto pode ainda envolver uma etapa em que as células são crescidas em um fermentador pequeno.
[00043] Opcionalmente, uma fase de pré-cultura pode compreender a produção de aproximadamente 8,9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 gerações de Pertussis. Opcionalmente, a fase de pré-cultura é entre 1 hora e 200 horas, entre 2 horas e 150 horas, entre 5 horas e 125 horas, entre 10 horas e 100 horas, entre 20 horas e 50, maior que ou igual a 1 hora, maior que ou igual a 2 horas, maior que ou igual a 5 horas, maior que ou igual a 10 horas, maior que ou igual a 20 horas, maior que ou igual a 50 horas, menor que ou igual a 200 horas, menor que ou igual a 150 horas, menor que ou igual a 125 horas, menor que ou igual a 100 horas ou menor que ou igual a 50 horas. Opcionalmente, a fase de pré-cultura é realizada em um vaso menor que 10 litros, menor que 8 litros, menor que 5 litros, entre 1 e 10 litros, entre 1 e 8 litros, entre 1 e 5 litros, entre 1 e 3 litros, entre 2 e 8 litros, entre 2 e 5 litros ou entre 2 e 3 litros.
[00044] Durante a etapa b) a Bordetella fi" etguekfc" go" wo" Òrtkogktq" codkgpvgÓ."swg"tghgtg-se a um ambiente que compreende o bvg que modula a condição. Por exemplo, este ambiente pode se referir a um ambiente sem qzkiêpkq qw wo codkgpVg eqo pH gngxcfqo Q Vgtoq òcodkgpVgó Vcodfio rqfg se referir a um meio compreendendo o pelo menos um modulador de bvg. O primeiro ambiente, portanto, pode se referir a um primeiro meio de cultura compreendendo pelo menos um modulador de bvg e o segundo ambiente pode se referir a um segundo meio de cultura que não compreende pelo menos um modulador de bvg. Opcionalmente, o pelo menos um bvg que modula a condição compreende a presença de pelo menos um modulador de bvg no primeiro meio de cultura. Opcionalmente, o primeiro e segundo meio de cultura são os mesmos. Opcionalmente, o primeiro e segundo meio de cultura são diferentes. Opcionalmente, o segundo meio de cultura compreende o meio Stainer Scholte. Alternativamente, o segundo meio de cultura compreende meio Stainer Scholte modificado. A composição do meio Stainer Scholte é descrita em Cohen e Wheeler, American Journal of Public Health (1946) 36: 371-376. Um meio é um meio Stainer Scholte modificado se contiver essencialmente os mesmos componentes do meio essencialmente nas mesmas concentrações, entretanto, contendo modificação da concentração entre 1 e 5 dos componentes do meio, perdendo entre 1 e 3 do componentes do meio, ou contendo entre 1 e 20 componentes adicionais do meio.
[00045] Etapa b) resulta na produção de uma cultura madura que pode ugt"wucfc"rctc"c"gvcrc"e+."c"htcug"Òewnvwtc"ocfwtcÓ"tghgtg-se a um inoculo que foi crescido na presença de pelo menos um bvg que modula a condição por pelo menos 5 gerações.
[00046] Opcionalmente, pelo menos parte da etapa b) é realizada em um vaso entre 50 mL e 25 litros, entre 50 mL e 20 litros, entre 50 mL e 15 litros entre 50 mL e 10 litros, entre 50 mL e 5 litros, menor que ou igual a 25 litros, menor que ou igual a 20 litros, menor que ou igual a 15 litros, menor que ou igual a 10 litros, menor que ou igual a 5 litros, maior que ou igual a 25 mL, maior que ou igual a 50 mL, maior que ou igual a 100 mL, maior que ou igual a 250 mL, maior que ou igual a 500 mL, maior que ou igual a 1 litro ou maior que ou igual a 2 litros em volume.
[00047] Opcionalmente, a etapa c) é realizada em um fermentador. O volume de funcionamento do fermentador pode ser entre 5 e 10.000 litros, entre 10 e 5.000 litros, entre 20 e 2.000 litros 50 litros e 1.000 litros, maior que ou igual a 5 litros, maior que ou igual a 10 litros, maior que ou igual a 15 litros, maior que ou igual a 20 litros, maior que ou igual a 25 litros, maior que ou igual a 50 litros, maior que ou igual a 100 litros, menor que ou igual a 10.000 litros, menor que ou igual a 5.000 litros ou menor que ou igual a 2.500 litros.
[00048] Opcionalmente, a etapa b) compreende uma fase de armazenamento celular. Alternativamente, o armazenamento celular ocorre entre a etapa a) e etapa b).
[00049] Em uma forma de realização, a etapa b) compreende pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, ou 17 gerações. Opcionalmente, a etapa b) compreende menos que 40, menos que 35, menos que 30, menos que 25, menos que 20 ou menos que 18 gerações. Opcionalmente, a etapa b) é menor que ou igual a 200 horas, menor que ou igual a 150 horas, menor que ou igual a 100 horas, menor que ou igual a 80 horas, menor que ou igual a 70 horas, menor que ou igual a 60 horas, menor que ou igual a 55 horas, mais de ou igual a 10 horas, mais de ou igual a 15 horas, mais de ou igual a 20 horas, mais de ou igual a 25 horas, mais de ou igual a 30 horas, mais de ou igual a 35 horas, mais de ou igual a 40 horas, entre 10 horas e 200 horas, entre 15 horas e 150 horas, entre 20 horas e 100 horas, entre 25 horas e 80 horas ou entre 30 horas e 70 horas.
[00050] Em uma forma de realização, a etapa b) é realizada em uma temperatura entre 20°C e 45°C, entre 22°C e 43°C, entre 24°C e 42°C, entre 28°C e 42°C, entre 30°C e 42°C, ou entre 32°C e 40°C.
[00051] Em uma forma de realização, a etapa b) é realizada em um pH entre 6,5 e 7,8, entre 6,7 e 7,5, entre 6,9 e 7,3 ou entre 7,0 e 7,2.
[00052] Em uma forma de realização, a etapa b) é realizada na presença entre 10% e 50%, entre 15% e 45%, entre 20% e 35% de oxigênio dissolvido.
[00053] Etapa c) refere-se a uma etapa em que a Bordetella é crescida na ausência do pelo menos um bvg que modula a condição de etapa b). Em geral, a presença do bvg que modula a condição de etapa b) é removida, por exemplo, se o bvg que modula a condição estiver em uma temperatura menor que 28°C, incubar a cultura madura na ausência do pelo menos um bvg que modula a condição envolve incubar a cultura madura em uma temperatura maior que 28°C. De maneira similar, se o pelo menos um bvg que modula a condição estiver na presença de um modulador de bvg, incubar a cultura madura na ausência do pelo menos um bvg que modula a condição envolve incubar a cultura madura na ausência do modulador de bvg. Por exemplo, se niacina for o modulador de bvg, este pode ser adicionado ao primeiro meio de cultura para a etapa b) e reduzido em concentração (de maneira tal que fique abaixo da concentração modulatória) no segundo meio de cultura para a etapa c).
[00054] Em geral, a etapa c) precisa ocorrer imediatamente após a etapa b), isto pode ser um intervalo de vários dias ou semanas, por exemplo, na situação onde o armazenamento celular é realizado semanas ou meses antes das células serem realmente usadas em uma fermentação. Opcionalmente, a etapa c) não ocorre diretamente após a etapa b).
[00055] Etapa b) pode ocorrer na presença de mais de um bvg que modula a condição. Neste caso, pelo menos uma, preferivelmente todas, estas condições que modulam bvg podem ser removidas durante a etapa c).
[00056] A espécie de Bordetella expressa em geral um nível mais elevado de fatores de virulência na etapa c), os quais podem ser purificados para uso em uma composição imunogênica ou vacina. Pelo menos parte da etapa c) é realizada em geral em um fermentador, embora a etapa c) possa ser realizada em qualquer vaso apropriado. Em uma forma de realização, o volume de funcionamento do fermentador é entre 5 e 10.000 litros, entre 10 e 5.000 litros, entre 20 e 2.000 litros, entre 50 litros e 1.000 litros, maior que ou igual a 5 litros, maior que ou igual a 10 litros, maior que ou igual a 15 litros, maior que ou igual a 20 litros, maior que ou igual a 25 litros, maior que ou igual a 50 litros, maior que ou igual a 100 litros, menor que ou igual a 10.000 litros, menor que ou igual a 5000 litros ou menor que ou igual a 2500 litros.
[00057] Etapa c) pode ser um processo em lote alimentado. Em um processo em lote alimentado o novo meio é continuamente adicionado ao fermentador. Em uma forma de realização, a etapa c) é menor que ou igual a 100 horas, menor que ou igual a 80 horas, menor que ou igual a 60 horas, menor que ou igual a 40 horas, mais de ou igual a 5 horas, mais de ou igual a 10 horas, mais de ou igual a 15 horas, mais de ou igual a 25 horas entre 5 horas e 100 horas, entre 10 horas e 80 horas, entre 15 horas e 60 horas, entre 25 horas e 40 horas.
[00058] Opcionalmente menor que ou igual a 20%, menor que ou igual a18%, menor que ou igual a 15%, menor que ou igual a 12%, menor que ou igual a 10%, menor que ou igual a 8%, menor que ou igual a 6%, menor que ou igual a 5%, menor que ou igual a 4%, menor que ou igual a 3%, mais de ou igual a 1%, mais de ou igual a 2%, mais de ou igual a 3%, entre 2% e 10%, entre 2% e 8%, entre 2% e 12%, entre 2% e 10%, entre 2% e 6% ou entre 2% e 5% da cultura madura é bvg- no início da etapa c) ou no final da etapa b).
[00059] Etapa c) pode ser realizada em uma temperatura maior que ou igual a 32°C, maior que ou igual a 33°C, maior que ou igual a 34°C, maior que ou igual a 35°C, menor que ou igual a 45°C, menor que ou igual a 42°C, menor que ou igual a 40°C, menor que ou igual a 38°C, entre 32°C e 45°C, entre 33°C e 42°C, entre 34°C e 40°C ou entre 35°C e 38°C.
[00060] Opcionalmente, um disjuntor de espuma mecânico é usado na etapa c).
[00061] Em uma forma de realização, a etapa c) é menor que ou igual a 200 horas, menor que ou igual a 150 horas 100 horas, menor que ou igual a 80 horas, menor que ou igual a 60 horas, menor que ou igual a 40 horas, mais de ou igual a 5 horas, mais de ou igual a 10 horas, mais de ou igual a 15 horas, mais de ou igual a 25 horas entre 5 horas e 200 horas, entre 10 horas e 150 horas, entre 15 horas e 100 horas ou entre 25 horas e 80 horas. Em uma forma de realização, a etapa c) compreende incubar a cultura madura em um segundo ambiente/segundo meio de cultura por pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20 gerações ou menor que 200, 175, 150 ou 125 gerações.
[00062] Em uma forma de realização, a etapa c) é realizada em um pH entre 6,5 e 7,8, entre 6,8 e 7,5, entre 6,9 e 7,3 ou entre 7,0 e 7,2.
[00063] Em uma forma de realização, a etapa c) é realizada na presença entre 10% e 50%, entre 15% e 45%, entre 20% e 35% de oxigênio dissolvido.
[00064] Qualquer bvg que modula a condição pode ser usado no contexto da presente invenção. Alguns exemplos são fornecidos a seguir.
[00065] Em uma forma de realização, o pelo menos um bvg que modula a condição compreende incubar a amostra em uma temperatura inferior ou igual a 28°C, inferior ou igual a 27°C, inferior ou igual a 26°C, inferior ou igual a 25°C, superior ou igual a 18°C, superior ou igual a 20°C, superior ou igual a 22°C, superior ou igual a 24°C, entre 0°C e 28°C, entre 0°C e 27°C, entre 0°C e 26°C ou entre 0°C e 25°C.
[00066] Em uma forma de realização, o pelo menos um bvg que modula a condição compreende incubar a amostra em uma concentração de oxigênio inferior ou igual a 0,100, inferior ou igual a 0,090, inferior ou igual a 0.,080, inferior ou igual a 0,070, superior ou igual a 0,001, superior ou igual a 0,050, superior ou igual a 0,010, superior ou igual a 0,015, superior ou igual a 0,020, superior ou igual a 0,025, entre 0,010 e 0,100, entre 0,010 e 0,090, entre 0,010 e 0,080 ou entre 0,010 e 0,070 mmol de O2 dissolvido por litro.
[00067] Em uma forma de realização, o pelo menos um bvg que modula a condição compreende incubar a amostra em um pH básico. Opcionalmente, o pH é um pH maior que ou igual a 7,2, maior que ou igual a 7,3, maior que ou igual a 7,4, menor que ou igual a 9,5, menor que ou igual a 9,0, menor que ou igual a 8,5, menor que ou igual a 8,0, entre 7,2 e 8,0, entre 7,3 e 8,0 ou entre 7,4 e 8,0.
[00068] Em uma forma de realização, o pelo menos um bvg que modula a condição compreende incubar a amostra em um pH acídico. Opcionalmente, o pH acídico é um pH menor que ou igual a 7,0, menor que ou igual a 6,8, menor que ou igual a 6,6, menor que ou igual a 6,4, menor que ou igual a 6,2, superior ou igual a 4,5, superior ou igual a 5,0, superior ou igual a 5,5, superior ou igual a 6,0, superior ou igual a 6,5, entre 5,0 e 7,0, entre 5,0 e 6,9 ou entre 5,0 e 6,8.
[00069] Em uma forma de realização, o pelo menos um modulador de bvg compreende niacina. Opcionalmente, o modulador de bvg compreende niacina em uma concentração maior que ou igual a 0,004g/L, maior que ou igual a 0,01g/L, maior que ou igual a 0,1g/L, maior que ou igual a 0,2g/L maior que ou igual a 0,3g/L, maior que ou igual a 0,004g/L, menor que ou igual a 400g/L, menor que ou igual a 300 g/L, menor que ou igual a 200g/L, menor que ou igual a 100g/L, menor que ou igual a 50g/L, menor que ou igual a 5g/L, entre 0,004g/L e 500g/L, entre 0,01g/L e 400g/L, entre 0,1g/L e 300g/L, entre 0,4g/L e 200g/L ou entre 0,2g/L e 100g/L.
[00070] Em uma forma de realização, o pelo menos um modulador de bvg compreende um sal inorgânico selecionado do grupo que consiste em um sal de magnésio, um sal de sulfato, um sal fosfato e um sal carbonato. Opcionalmente, o sal inorgânico é um sal sulfato. O sal sulfato pode estar em uma concentração maior que ou igual a 0,04 mM, maior que ou igual a 0,08 mM, maior que ou igual a 1 mM, maior que ou igual a 4 mM, maior que ou igual a 8 mM, maior que ou igual a 10 mM, menor que ou igual a 50 mM, menor que ou igual a 40 mM, menor que ou igual a 35 mM, menor que ou igual a 30 mM, menor que ou igual a 25 mM, menor que ou igual a 20 mM, menor que 15 mM, entre 0,04 mM e 40 mM, entre 0,08 mM e 1 mM, entre 4 mM e 40 mM, entre 8 mM e 10 mM, entre 15 mM e 40 mM, ou entre 17 mM e 40 mM.
[00071] Opcionalmente, o sal inorgânico é um sal fosfato. O sal fosfato pode estar em uma concentração maior que ou igual a 0,4 g/L, maior que ou igual a 0,5 g/L, maior que ou igual a 0,6 g/L, maior que ou igual a 0,7 g/L, menor que ou igual a 20 g/L, menor que ou igual a 18 g/L, menor que ou igual a 16 g/L, menor que ou igual a 10 g/L, menor que ou igual a 5 g/L, menor que ou igual a 2 g/L, entre 0,4 g/L e 20 g/L, entre 0,5 g/L e 20 g/L, entre 0,6 g/L e 20 g/L ou entre 0,7 g/L e 20 g/L.
[00072] Em uma forma de realização, o pelo menos um modulador de bvg compreende sacarose. A sacarose pode estar em uma concentração maior que ou igual a 10 mM, maior que ou igual a 15 mM, maior que ou igual a 20 mM, maior que ou igual a 25 mM, maior que ou igual a 30 mM, maior que ou igual a 35 mM, maior que ou igual a 40 mM, menor que ou igual a 100 mM, menor que ou igual a 90 mM, menor que ou igual a 85 mM, menor que ou igual a 80 mM, menor que ou igual a 75 mM, menor que ou igual a 70 mM, menor que ou igual a 50 mM, entre 10 mM e 100 mM, entre 15 mM e 95 mM, entre 20 mM e 90 mM, entre 25 mM e 85 mM ou entre 30 mM e 80 mM.
[00073] Opcionalmente, o pelo menos um modulador de bvg compreende um componente de meio complexo selecionado do grupo que consiste em extrato de levedura, ágar Tryptic Soy, triptose fosfatos, peptonas e infusões de tecido de cérebro e coração e peptonas. O componente de meio complexo pode estar em uma concentração maior que ou igual a 1 g/L, maior que ou igual a 3 g/L, maior que ou igual a 5 g/L, maior que ou igual a 10 g/L, menor que ou igual a 40 g/L, menor que ou igual a 35 g/L, menor que ou igual a 30 g/L, menor que ou igual a 25 g/L, menor que ou igual a 20 g/L, entre 1 g/L e 40 g/L, entre 3 g/L e 40 g/L, entre 5 g/L e 40 g/L, ou entre 10 g/L e 40 g/L.
[00074] Opcionalmente o pelo menos um modulador de bvg compreende prolina. A prolina pode estar em uma concentração maior que ou igual a 0,25 g/L, maior que ou igual a 0,4 g/L, maior que ou igual a 0,5 g/L, maior que ou igual a 0,6 g/L, maior que ou igual a 1 g/L, maior que ou igual a 2 g/L, maior que ou igual a 3 g/L maior que ou igual a 4 g/L, menor que ou igual a 50 g/L, menor que ou igual a 30 g/L, menor que ou igual a 25 g/L, menor que ou igual a 20 g/L, menor que ou igual a 15 g/L, entre 0,25 g/L um 50 g/L, entre 0,4 g/L e 50 g/L, entre 0,5 g/L e 50 g/L, entre 0,6 g/L e 50 g/L, entre 1 g/L e 50 g/L, entre 2 g/L e 50 g/L, entre 3 g/L e 50 g/L, ou entre 4 g/L e 50 g/L.
[00075] Em uma forma de realização, o pelo menos um modulador de bvg compreende íons sódio em uma concentração maior que 100 mM, maior que 120 mM, maior que 150 mM, maior que 175 mM, maior que 200 mM, maior que 250 mM, menor que 2.000 mM, menor que 1.000 mM, menor que 800 mM, entre 100 mM e 2.000 mM, entre 120 mM e 2.000 mM, entre 150 mM e 2.000 mM, entre 175 mM e 2.000 mM, ou entre 200 mM e 2.000 mM.
[00076] Em uma forma de realização, o modulador de bvg compreende um agente antiespuma. Opcionalmente o agente antiespuma é Polidimetilsiloxano. O polidimetilsiloxano pode estar em uma concentração maior que ou igual a 5 g/L, maior que ou igual a 10 g/L, maior que ou igual a 15 g/L, maior que ou igual a 20 g/L, maior que ou igual a 25 g/L, maior que ou igual a 30 g/L, maior que ou igual a 40 g/L, menor que ou igual a 250 g/L, menor que ou igual a 230 g/L, menor que ou igual a 200 g/L, menor que ou igual a 180 g/L, menor que ou igual a 150 g/L entre 5 g/L e 250 g/L, entre 10 g/L e 230 g/L, entre 15 g/L e 200 g/L, entre 20 g/L e 180 g/L, entre 25 g/L e 150 g/L ou entre 25 g/L e 150 g/L.
[00077] Em uma forma de realização, o pelo menos um modulador de bvg compreende glutationa. A glutationa pode estar em uma concentração maior que ou igual a 0,15 g/L, maior que ou igual a 0,20 g/L, maior que ou igual a 0,25 g/L, maior que ou igual a 0,30 g/L, maior que ou igual a 0,35 g/L, maior que ou igual a 0,40 g/L, menor que ou igual a 20 g/L, menor que ou igual a 15 g/L, menor que ou igual a 12 g/L, menor que ou igual a 10 g/L, entre 0,15 g/L e 20 g/L, entre 0,20 g/L e 20 g/L, entre 0,25 g/L e 20 g/L, entre 0,30 g/L e 20 g/L, entre 0,35 g/L e 20 g/L, entre 0,35 g/L e 20 g/L ou entre 0,40 g/L e 20 g/L.
[00078] Em uma forma de realização, o pelo menos um modulador de bvg compreende um aminoácido contendo enxofre, estes aminoácidos incluem, Cisteína, Cistina, Metionina, mas também inclui qualquer dos aminoácidos adicionais que contêm um átomo de enxofre (tanto aminoácidos naturais quanto e não naturais). Estes aminoácidos podem ser derivados de uma fonte de proteína ou peptídeo ou podem ser originados como aminoácidos individuais. Em uma forma de realização adicional, o pelo menos um modulador de bvg compreende um aminoácido contendo enxofre em uma concentração maior que ou igual a 0,25 mM, maior que ou igual a 0,5 mM, maior que ou igual a 0,8 mM, menor que ou igual a 1000 mM, menor que ou igual a 500 mM, menor que ou igual a 250 mM, menor que ou igual a 100 mM, menor que ou igual a 50 mM, menor que ou igual a 25 mM, menor que ou igual a 10 mM, entre 0,25 mM e 1000 mM, entre 0,5 mM e 500 mM, entre 0,8 mM e 250 mM, ou entre 0,5 mM e 100 mM.
[00079] Em uma forma de realização, a espécie de Bordetella expressa pelo menos um fator de virulência selecionado do grupo que consiste em Toxina pertussis, Hemaglutinina filamentosa, aglutinogênio fimbrial e Pertactina. Opcionalmente, a toxina pertussis é produzida em uma taxa produção específica de Toxina pertussis menor que 2,8 mgL-1 OD 650nm-1, 2,7 mgL-1 OD 650nm- , 2,6 mgL-1 OD 650nm- , 2,5 mgL-1 OD 650nm- , 2,4 mgL-1 OD 650nm- , 2,3 mgL-1 OD 650nm- , 2,2 mgL-1 OD 650nm- , 2,1 mgL-1 OD 650nm- , 2,0 mgL-1 OD 650nm- 1,9 mgL-1, OD 650nm- , 1,8 mgL-1 OD 650nm- , 1,7 mgL-1 OD 650nm-1, ou 1,6 mgL-1 OD 650nm-1 na etapa b). Opcionalmente, a toxina pertussis é produzida em uma taxa de produção específica de toxina pertussis maior -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 que 8 mgL 650nm , 2,9 mgL 650nm , 3,0 mgL 650nm , 3,1 mgL 650nm ou 3,2 mgL-1650nm-1 durante a etapa c).
[00080] O processo da revelação pode incluir uma etapa adicional d) de purificar o fator de virulência para produzir um fator de virulência purificado. O fator de virulência purificado pode ser uma toxina pertussis purificada (PT), Hemaglutinina filamentosa (FHA), Pertactina (PRN), aglutinogênio 2 ou aglutinogênio 3. O fator de virulência purificado pode ser alterado após purificação, por exemplo, a toxina pertussis pode ser desintoxicada quimicamente após purificação. Ver também EP 427462 e WO 91/12020 para a preparação de antígenos pertussis. Em uma forma de realização, uma etapa d) envolve a purificação de célula usando cromatografia. Em uma forma de realização, a técnica de cromatografia é cromatografia por afinidade, filtração em gel, cromatografia líquida em alta pressão (HPLC) ou cromatografia de troca iônica. Opcionalmente, a cromatografia por afinidade usa uma coluna de purificação com marca de afinidade, uma coluna de purificação de anticorpo, uma coluna de afinidade por lectina, uma coluna de purificação de prostaglandina ou uma coluna de estrepavidina. Opcionalmente, a HPLC usa uma coluna de troca iônica, uma coluna de fase reversa ou uma coluna de exclusão por tamanho. Opcionalmente, a coluna de troca iônica é uma coluna de troca aniônica ou uma coluna de troca catiônica.
[00081] O processo pode compreende adicionalmente uma etapa e) de formular uma composição imunogênica compreendendo o fator de virulência purificado.
[00082] O processo pode compreender adicionalmente uma etapa f) de adicionar pelo menos um antígeno adicional à composição imunogênica. Em uma forma de realização, o pelo menos um antígeno adicional é selecionado do grupo que consiste em Toxina pertussis, hemaglutinina filamentosa, Pertactina, um Aglutinogênio fimbrial, toxóide de Diphtheria, toxóide tetânico, pelo menos um antígeno sacarídeo conjugado de N.meningitidis, antígeno de superíficie de Hepatitis B, vírus pólio inativado (IPV) e um antígeno de sacarídeo conjugado de Haemophilus influenzae b. O pelo menos um antígeno de sacarídeo conjugado de N.meningitidis pode ser MenC, MenY, MenA e MenW (por exemplo A+C, A+Y, A+W, C+Y, C+W, Y+W, A+C+Y, A+C+W, A+Y+W, C+Y+W, A+C+Y+W); opcionalmente MenC e/ou MenY é incluído, opcionalmente, todos os quatro são incluídos.
[00083] Alternativamente, ou além dos antígenos meningocócicos anteriores, a composição imunogênica pode compreender um ou mais conjugados de oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular pneumocócico - proteína carreadora.
[00084] Tipicamente, os oligossacarídeos ou polissacarídeos capsulares pneumocócicos (preferivelmente os últimos) representados nas composições da invenção compreendem antígenos derivados de pelo menos quatro sorotipos de pneumococcus. Preferivelmente, os quatro sorotipos compreendem 6B, 14, 19F e 23F. Mais preferivelmente, pelo menos 7 sorotipos são compreendidos na composição, por exemplo, aqueles derivados de sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, e 23F. Ainda mais preferivelmente, pelo menos 11 sorotipos são compreendidos na composição (11 valente), por exemplo, aqueles derivados dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Ainda mais preferivelmente, pelo menos 10 sorotipos são compreendidos na composição (10 valente), por exemplo, aqueles derivados de sorotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Em uma forma de realização preferida da invenção pelo menos 13 de tais antígenos pneumocócicos conjugados são compreendidos, embora antígenos adicionais, por exemplo, 23 valente (tais como sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F), também sejam contemplados pela invenção.
[00085] Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização, o processo de fermentação compreende uma etapa g) de adicionar um excipiente farmaceuticamente aceitável à composição imunogênica.
[00086] Em uma forma de realização a composição imunogênica compreende um adjuvante tal como fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio. Em uma forma de realização, o processo de fermentação compreende uma etapa f) de adicionar um adjuvante à composição imunogênica. Métodos de adsorver os antígenos DTPa e DTPw em adjuvantes de alumínio são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, WO 93/24148 e WO 97/00697. Em geral, os componentes adsorvidos no adjuvante são deixados por um período de pelo menos 10 minutos em temperatura ambiente em um pH apropriado para adsorver mais e preferivelmente todo o antígeno antes de misturar os antígenos juntos na combinação de composições imunogênicas da presente invenção.
[00087] Outros componentes são preferivelmente não adsorvidos (tal como IPV) ou adsorvidos especificamente em outros adjuvantes - antígeno de superfície de Hepatitis B (HBsAg) sendo preferivelmente adsorvido em fosfato de alumínio (descrito em WO 93/24148) antes de misturar com outros componentes.
[00088] Em uma forma de realização adicional é fornecido um fator de virulência obtido pelo processo. Em uma forma de realização adicional é fornecido um fator de virulência obtido pelo processo.
[00089] Em uma forma de realização adicional, é fornecida uma composição imunogênica compreendendo o fator de virulência e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende pelo menos um antígeno adicional. Em uma forma de realização, o pelo menos um antígeno adicional é selecionado do grupo que consiste em Toxina pertussis, Hemaglutinina filamentosa, Pertactina, um Aglutinogênio fimbrial, toxóide da Diphtheria, toxóide tetânico, pelo menos um antígeno de sacarídeo conjugado de N.meningitidis, antígeno de superfície de Hepatitis B, Polio Vírus inativado (IPV) e um antígeno de sacarídeo conjugado de Haemophilus influenzae b (opcionalmente conjugado ao Toxóide tetânico). O pelo menos um antígeno de sacarídeo conjugado de N.meningitidis pode ser MenC, MenY, MenA e MenW (por exemplo, A+C, A+Y, A+W, C+Y, C+W, Y+W, A+C+Y, A+C+W, A+Y+W, C+Y+W, A+C+Y+W); opcionalmente MenC e/ou MenY é incluído, opcionalmente todos os quatro são incluídos. Em uma forma de realização, a vacina compreende toxóide diftérico, toxóide tetânico, e pelo menos um de PT, FHA e PRN (uma vacina DTPa).
[00090] Em uma forma de realização a composição imunogênica compreende adicionalmente um adjuvante. Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio. Os métodos de adsorver antígenos DTPa em adjuvantes de alumínio são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, WO 93/24148 e WO 97/00697. Em geral, os componentes adsorvidos em adjuvantes são deixados por um período de pelo menos 10 minutos em temperatura ambiente, em um pH adequado para adsorver mais e preferivelmente todo o antígeno antes de misturar os antígenos juntos na combinação de composições imunogênicas da presente invenção.
[00091] Outros componentes são preferivelmente não adsorvidos (tal como IPV) ou adsorvidos especificamente em outros adjuvantes - antígeno de superfície de Hepatitis B (HBsAg) sendo preferivelmente adsorvido em fosfato de alumínio (descrito em WO 93/24148) antes de misturar com outros componentes.
[00092] Em uma forma de realização, é fornecida uma vacina compreendendo a composição imunogênica.
[00093] A preparação da vacina é em geral descrita em Vaccine Design - The Subunit and adjuvante approach Ed Powell e Newman; Pellum Press. Vantajosamente, a vacina de combinação de acordo com o invenção é uma vacina pediátrica.
[00094] A quantidade de antígeno conjugado ao polissacarídeo ou oligossacarídeo em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem significância, efeitos colaterais adversos em vacinados típicos. Tal quantidade poderá variar dependendo de quais imunógenos específicos são empregados. Em geral, espera-se que cada dose possa compreender 1-3o222 μi fg rqnkuucecrífgq qw qnkiquucecrífgq conjugado (expresso em quantidade de sacarídeo), preferivelmente 2-322 μi. mais preferivelmente 4-40, 2-15, ou 3-32 μi. cekoc fg vwfq rtghgtkxgnogpvg go Vqtpq qw gzcVcogpVg 7 μio
[00095] O teor de antígenos proteicos na vacina será tipicamente na faixa de 1-100 og, preferivelmente 5-50 og, acima de tudo tipicamente na faixa de 5 - 25 og.
[00096] Uma quantidade ideal de antígeno para uma vacina particular pode ser acertada por estudos padrões que envolvem a observação de titulações de anticorpo e outras respostas nos sujeitos. Após uma vacinação inicial, os sujeitos podem receber uma ou duas injeções de reforço em intervalos de cerca de 4 semanas ou mais.
[00097] As preparações de vacina da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um mamífero (preferivelmente humano) susceptível à infecção, por meio da administração da dita vacina por meio da via sistêmica ou mucosa. Estas administrações podem incluir injeção por meio de vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea.
[00098] Em um aspecto adicional, é fornecida a composição imunogênica ou a vacina previamente descrita para uso na prevenção ou tratamento de doença.
[00099] Em um aspecto adicional, é fornecida a composição imunogênica ou a vacina previamente descrita para uso na prevenção ou tratamento de doença associada à Bordetella pertussis.
[000100] Em um aspecto adicional, é fornecido um uso da composição imunogênica ou a vacina previamente descrita na prevenção ou tratamento de doença.
[000101] Em um aspecto adicional, é fornecido um uso da composição imunogênica ou a vacina previamente descrita na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doença bacteriana.
[000102] Em um aspecto adicional, é fornecido um método de prevenir ou tratar doença compreendendo administrar a composição imunogênica ou a vacina previamente descrita a um paciente.
[000103] Em uma forma de realização, a doença é doença associada à Bordetella pertussis.
[000104] Uma cultura em frasco de agitação de B. pertussis foi plaqueada em meio Bordet-Gengou (contendo 5% de sangue de carneiro), a fim de ser possível detectar colônias hemolíticas (bvg+) e não hemolíticas (bvg-). Uma única colônia bvg+ e uma única colônia bvg- foram isoladas destas placas, e usadas para realizar fermentações em escala de 20L.
[000105] Uma primeira pré-cultura em frasco de agitação contendo 7,5 mL de meio fresco (adaptado de Stainer e Scholte (J. Gen. Microbiol. 63:211220 (1971)) pela adição de dimetil-β-ciclodextrina 1 g/L e hidrolisado de caseína ácida 10 g/L, a substituição de L-cistina 40 m g/L por L-cisteína 40 m g/L, e o uso de concentrações maiores de Na-L-Glutamato (11,84 g/L), glutationa reduzida (150 m g/L) e ácido ascórbico (400 m g/L)) foi inoculado com 109 CFUs de B. pertussis e incubado a 35°C (+/- 1°C) e 150 rpm por 24h (+/- 1h) para produzir uma primeira pré-cultura. A primeira pré-cultura foi usada para inocular uma segunda pré-cultura em frasco de agitação contendo 100 mL de meio fresco. A segunda pré-cultura foi incubada a 35°C (+/- 1°C) e 150 rpm por 24h (+/- 1h), e usada para inocular dois frascos de agitação contendo cada um 1L de meio fresco. Após crescimento a 35°C (+/- 1°C) e 150 rpm por 24h (+/- 4h), os dois frascos de agitação a partir da terceira pré- cultura foram agrupados. A pré-cultura agrupada foi usada para inocular um fermentador assim que a terceira pré-cultura terminou. Em paralelo, a proporção de células bvg+ e bvg- no final da terceira pré-cultura foi medida plaqueando diluições adequadas em meio BG (Bordet Gengou) (contendo 5% de sangue). Esta proporção representou a proporção inicial de células bvg- na fermentação de 20L (Tabela 1).
[000106] Um fermentador de 20L (BiolafitteTM) foi usado. 10L de meio foram assepticamente transferidos para o fermentador. As seguintes condições foram usadas a fim de calibrar o nível de 100%-oxigênio dissolvido (DO): temperatura (35°C), pressão principal (0,4 bar), vazão do ar (4,6L ar aspergido por minuto) e velocidade de agitação (50 rpm ou rotações por minuto).
[000107] A inoculação foi atingida pela adição de 1,5L da pré-cultura agrupada.
[000108] Durante a fermentação, a temperatura (35°C) e pressão principal (0,4 bar) foram mantidas em um nível constante. Um disjuntor de espuma mecânico foi usado para controlar a formação de espuma durante a fermentação. A vazão do ar aumentou progressivamente durante a fermentação, de acordo com uma curva pré-definida. O nível de oxigênio dissolvido foi ajustado para 25% e regulado aumentando a agitação quando o DO ficou abaixo de 25%. A velocidade de agitação mínima foi ajustada para 50 rpm; a velocidade de agitação máxima foi ajustada para 550 rpm. O pH foi regulado em 7,2 pela adição de ácido acético 50% (p/v ou peso/volume).
[000109] Durante a fermentação, o crescimento das culturas de bvg- e bvg+ foi monitorado como densidade ótica a 650 nm (OD650nm; Figura 1). No final da fermentação (definida como o tempo no qual o consumo de oxigênio diminui - como uma consequência da exaustão de glutamato-, resultando em uma diminuição na velocidade de agitação), a produção de toxina pertussis (PT) no sobrenadante da cultura foi determinada por ELISA padrão, e a proporção de células bvg+ e bvg- foi medida plaqueando diluições adequadas de caldo de fermentação no meio BG contendo 5% de sangue (Tabela 1). Esta proporção representou a proporção final de células bvg- na fermentação de 20L (Tabela 1).
[000110] Fermentação com o isolado bvg- resultou em crescimento mais rápido, mas muito pouca produção de PT, comparada à fermentação com o isolado bvg+. Entretanto, a concentração máxima de biomassa não foi diferente entre os dois isolados.
[000111] Uma fermentação de 20L de Bordetella pertussis foi realizada da maneira descrita no exemplo 1, com a exceção de que a primeira pré- cultura foi inoculada com 109 CFUs de B. pertussis representando uma razão de 99,1 de células bvg+ para bvg-.
[000112] A proporção de células bvg+ e bvg- foi medida no início e no final da fermentação de 20L, plaqueando diluições apropriadas do caldo de fermentação no meio BG contendo 5% de sangue (Tabela 2). A proporção de células bvg- aumentou a medida que o número de gerações aumentou.
[000113] Quatro sÈries de culturas foram realizadas em paralelo em meio adaptado de Stainer e Scholte (J. Gen. Microbiol. 63:211-220 (1971)) com as modificaÁıes descritas no exemplo 1, cada uma das sÈries contendo MgSO4 (10 mM) e/ou niacina (0 g/L ou 0.604 g/L), da maneira descrita na tabela 3. Para cada uma das sÈries, o primeiro frasco de agitaÁ„o contendo 7,5 mL de meio fresco foi inoculado com 109 CFUs de B. pertussis, representando uma raz„o de 99:1 de cÈlulas bvg+ para bvg-. Todas as culturas de frasco de agitaÁ„o subsequentes continham 100 mL de meio fresco. Todas as culturas foram incubadas por 24h (+/- 1h) a 35ºC (+/- 1ºC). No final da terceira e quarta passagens, a proporÁ„o de cÈlulas bvg+ e bvg- foi medida plaqueando diluiÁıes adequadas da cultura no meio BG contendo 5% de sangue (Tabela 3).
[000114] Na ausência de concentrações modulares de MgSO4 ou niacina (séries A), as células bvg- se acumularam rapidamente. A adição tanto de MgSO4 (20 mM; séries C) quanto de niacina (0,604 g/L; série B), ou ambas, resultou em um acúmulo significativamente menor de células bvg-.
[000115] O efeito da dose de niacina na obtenção de células bvg- foi avaliado durante culturas de frasco de agitação em série de Bordetella pertussis. Quatro séries de culturas foram realizadas em paralelo em meio adaptado de Stainer e Scholte (J. Gen. Microbiol. 63:211-220 (1971)), com as modificações descritas no exemplo 1. Meio continha também as seguintes modificações: substituição do hidrolisado de caseína ácida por uma mistura de 12 aminoácidos (L-Aspartato, Glicina, L-Valina, L-Metionina, L-Isoleucina, L-Leucina, L-fenilalanina, L-Histidina, L-Alanina, L-Tirosina, L-Serina e L- Lisina) em concentrações equivalentes àquelas obtidas com 10 g/L de hidrolisado de caseína, maiores concentrações de Na-L-Glutamato (20 g/L) e L-Prolina (1,04 g/L), e ausência de NaCl. Cada uma das séries continha diferentes concentrações de niacina, da maneira descrita na tabela 4. Para cada uma das séries, o primeiro frasco de agitação contendo 100 mL de meio fresco foi inoculado com aproximadamente 4x109 CFUs de B. pertussis representando uma razão de 94:6 de células bvg+ para bvg-. Todos os frascos de agitação subsequentes continham 100 mL de meio fresco, e foram inoculados com a cultura anterior, em uma concentração inicial de células de aproximadamente 4x108 CFU/ mL. Todas as culturas foram incubadas por 24h (+/- 1h) a 35°C (+/- 1°C) e 150 rpm. No final de cada passagem, a proporção de células bvg+ e bvg- foi medida plaqueando diluições adequadas da cultura no meio BG contendo 5% de sangue (Tabela 4). O número de gerações em cada passagem foi calculado com base mas medidas de densidade ótica (OD650nm). A obtenção de células bvg- como uma função do número de gerações é representada na figura 2.
[000116] As concentrações baixas de niacina foram menos eficientes em controlar a obtenção de células bvg-. Entretanto, quando a niacina foi adicionada em uma concentração elevada (0,604 g/L), nenhuma obtenção de bvg- foi observada, até 15 gerações.
[000117] Duas fermentações de 20L de B. pertussis foram realizadas em paralelo. As duas fermentações foram idênticas, exceto pela presença de uma concentração elevada de niacina (0,604 g/L) nas primeiras duas pré-culturas de fermentação COQ255, a fim de controlar a obtenção de bvg-, enquanto as próximas duas pré-culturas de fermentação COQ255 continham uma baixa concentração de niacina (0,004 g/L). Na fermentação COQ254, todas as quatro pré-culturas foram realizadas na presença de 0,004 g/L de niacina. A concentração de niacina em cada etapa do processo é indicada na tabela 5. Em virtude da diluição do meio em cada etapa de pré-cultura, a concentração inicial de niacina no fermentador de 20L foi 0,004 g/L, isto é, abaixo da concentração de modulação, permitindo a produção de PT.
[000118] O mesmo armazenamento celular congelado foi usado para inocular as primeiras prÈ-culturas das fermentaÁıes de caldo, consistindo em um frasco de agitaÁ„o contendo 30 mL de meio fresco (adaptado de Stainer e Scholte (J. Gen. Microbiol. 63:211-220 (1971)), com as modificaÁıes descritas no exemplo 1) com aproximadamente 1x109 CFUs de B. pertussis representando uma raz„o de 99:1 de cÈlulas bvg+ para bvg-. A primeira prÈ- cultura foi incubada a 35ºC (+/- 1ºC) e 150 rpm por 24h (+/- 1h), e usada para inocular uma segunda prÈ-cultura em frasco de agitaÁ„o contendo 1L de meio fresco. A segunda prÈ-cultura foi incubada a 35ºC (+/- 1ºC) e 150 rpm por 24h (+/- 2h), e usada para inocular um terceiro frasco de agitaÁ„o contendo 1L de meio fresco. ApÛs incubaÁ„o a 35ºC (+/- 1ºC) e 150 rpm por 24h (+/- 1h), a terceira prÈ-cultura foi usada para inocular dois frascos de agitaÁ„o contendo cada qual 1L de meio fresco. Após crescimento a 35°C (+/- 1°C) e 150 rpm por 13h (+/- 1h), os dois frascos de agitação da quarta pré-cultura foram agrupados. A pré-cultura agrupada foi usada para inocular um fermentador assim que a quarta pré-cultura terminou. Em paralelo, a proporção de células bvg+ e bvg- no final da quarta pré-cultura foi medida plaqueando diluições adequadas em BG contendo 5% de sangue meio. Esta proporção representou a proporção inicial de células bvg- na fermentação de 20L (Tabela 6). O número de gerações da cepa de pré-cultura (18 gerações, calculada a partir das medições de OD650nm) representa inúmeras gerações que podem ser usadas para realizar fermentação em escala comercial (aproximadamente 2.000L de caldo de fermentação).
[000119] Um fermentador de 20L (Biolafitte) foi usado. 10L de meio foram assepticamente transferidos para o fermentador. As seguintes condições foram usadas a fim de calibrar o nível de 100%-oxigênio dissolvido (DO): temperatura (35°C), pressão principal (0,4 bar), vazão do ar (4,6L ar aspergido por minuto) e velocidade de agitação (50 rpm).
[000120] Inoculação foi atingida pela adição de 1,5L da pré-cultura agrupada.
[000121] Durante a fermentação, a temperatura (35°C) e pressão principal (0,4 bar) foram mantidas constantes. Um disjuntor de espuma mecânico foi usado para controlar a formação de espuma durante a fermentação. A vazão do ar aumentou progressivamente durante a fermentação, de acordo com uma curva pré-definida. O nível de oxigênio dissolvido foi ajustado para 25% e regulado aumentando a agitação quando o DO ficou abaixo de 25%. A velocidade de agitação mínima foi ajustada para 50 rpm; a velocidade de agitação máxima foi ajustada para 550 rpm. O pH foi regulado para 7,2 pela adição de ácido acético 50% (p/v).
[000122] Durante a fermentação, o crescimento foi monitorado como densidade ótica a 650 nm (OD650nm). No final da fermentação (definido como o tempo no qual o consumo de oxigênio diminui - como uma consequência da exaustão de glutamato -, resultando em uma diminuição na velocidade de agitação), a produção de toxina pertussis (PT) no sobrenadante da cultura foi determinado por ELISA, e a proporção de células bvg+ e bvg- foi medida plaqueando diluições adequadas de caldo de fermentação no meio BG contendo 5% de sangue (Tabela 6). Esta proporção representou a proporção final de células bvg- na fermentação de 20L (Tabela 6).
[000123] A adição de concentração elevada de niacina durante as primeiras duas etapas de pré-cultura resultou em uma proporção menor de células bvg- no início da fermentação de 20L. Embora nenhum controle tenha sido exercido na obtenção de bvg- durante a própria fermentação (0,004 g/L de niacina, para permitir a expressão de PT), a menor proporção inicial de células bvg- foi refletida no final da fermentação, e resultou em um aumento significativo nas titulações de PT no caldo de fermentação. A fermentação COQ255 foi significativamente mais lenta, de acordo com a observação de que as células bvg- crescem mais rápido que as células bvg+. A concentração de biomassa final foi similar entre as duas fermentações: apenas a composição da população bacteriana nos termos de razão bvg+:bvg- foi afetada. Isto é ilustrado pelo aumento na produção específica de PT (Tabela 6).
[000124] Duas fermentaÁıes de 20L de B. pertussis foram realizadas emparalelo. As etapas de pré-cultura foram realizadas da maneira descrita no exemplo 2. O memo grupo de pré-cultura foi usado para inocular dois fermentadores de 20L. As fermentações de 20L foram realizadas da maneira descrita no exemplo 1, exceto que a velocidade de agitação máxima foi ajustada para 550 rpm na primeira fermentação (COQ238; condições de oxigênio suficiente) e 280 rpm na segunda fermentação (COQ239; condições limitadas de oxigênio). As fermentações terminaram quando as fontes de carbono foram completamente eliminadas, da maneira evidenciada por uma parada abrupta no consumo de oxigênio.
[000125] O perfil de oxigênio dissolvido para as fermentações em caldo é comparado na figura 3 (oxigênio absoluto dissolvido calculado das medições atualizadas de temperatura, pressão principal, e oxigênio relativo dissolvido, usando a lei de Henry). Os rendimentos de biomassa e PT são mostrados na tabela 7. O fornecimento de oxigênio limitado (COQ239) apresentou um efeito negativo tanto na biomassa final quanto na concentração de PT. A taxa de crescimento da cultura também foi afetada negativamente nas condições limitadas de oxigênio.
[000126] Duas fermentaÁıes de 20L de B. pertussis foram realizadas em paralelo. As etapas de prÈ-cultura foram realizadas da maneira descrita no exemplo 2, exceto para concentraÁ„o de Na-L-Glutamato (20 g/L). As fermentaÁıes de 20L foram realizadas da maneira descrita no exemplo 1, exceto para as seguintes adaptaÁıes para a composiÁ„o do meio: em fermentação COQ199, extrato de levedura foi adicionado ao meio em uma concentração de 20 g/L, ao passo que em fermentação COQ182, hidrolisado de caseína foi adicionado em uma concentração de 10 g/L. Em ambas as fermentações, a formação de espuma foi controlada por adição automática de uma emulsão de polidimetilsiloxano por meio de um controlador de espuma. As fermentações terminaram quando as fontes de carbono foram completamente esgotadas, da maneira evidenciada por uma parada abrupta no consumo de oxigênio.
[000127] Os rendimentos de biomassa e PT são mostrados na tabela 8. O uso de extrato de levedura (COQ199) sem ser hidrolisado de caseína (COQ182) apresentou um efeito positivo na concentração da biomassa, e um efeito negativo na produção de PT (43% menor, comparado às condições de referência).
[000128] Três fermentações de 20L de B. pertussis foram realizadas em paralelo. As etapas de pré-cultura foram realizadas da maneira descrita no exemplo 2, exceto para a composição de meio, que foi da maneira descrita no exemplo 4. As fermentações de 20L foram realizadas da maneira descrita no exemplo 1, exceto para composição de meio: em fermentação COQ280, prolina foi adicionada para obter uma concentração final de 1 g/L, ao passo que em fermentação COQ278, a concentração de prolina foi 12 g/L. A fim de manter uma quantidade similar de fonte de carbono entre as duas condições, a concentração de glutamato (fornecida como glutamato de sódio) foi reduzida de 20 g/L em fermentação COQ280 para 7 g/L em fermentação COQ278. Em fermentação COQ281, a concentração de prolina e glutamato foram idênticas a COQ278, mas NaCl foi adicionado em uma concentração de 4 g/L para compensar a redução em glutamato de sódio comparado a COQ280. As fermentações pararam quando as fontes de carbono foram completamente eliminadas, da maneira evidenciada por uma parada abrupta no consumo de oxigênio.
[000129] Os rendimentos de biomassa e PT são mostrados na tabela 9. Quando prolina estava presente em uma concentração elevada (COQ278), uma redução significativa na produção de PT foi observada (58% menor comparada a COQ280). Este efeito foi parcialmente liberado quando NaCl foi adicionado ao compensado pela menor concentração de glutamato de sódio (COQ281; 37% menor comparado a COQ280). Estas observações indicam que tanto a concentração elevada de prolina quanto a concentração baixa de sódio apresentam um efeito negativo na produção de PT, e que estes efeitos são aditivos (isto é, não redundantes).
[000130] Duas fermentações de 20L de B. pertussis foram realizadas em paralelo. As etapas de pré-cultura foram realizadas da maneira descrita no exemplo 8. As fermentações de 20L foram realizadas da maneira descrita no exemplo 1, exceto para as seguintes adaptações para a composição de meio: em fermentação COQ280, KH2PO4 foi adicionado em uma concentração de 0,5 g/L, ao passo que em fermentação COQ279, a concentração de KH2PO4 foi 0,8 g/L. As fermentações pararam quando as fontes de carbono foram completamente eliminadas, da maneira evidenciada por uma parada abrupta no consumo de oxigênio.
[000131] Os rendimentos de biomassa e PT são mostrados na tabela 10. Quando fosfato estava presente em uma concentração elevada, uma redução significativa na produção de PT foi observada (32% menor comparada a COQ280).
[000132] Duas fermentações de 20L de B. pertussis foram realizadas em paralelo. As etapas de pré-cultura foram realizadas da maneira descrita no exemplo 8. As fermentações de 20L foram realizadas da maneira descrita no exemplo 1, exceto para as seguintes adaptações para a composição de meio (detalhado na tabela 11): em fermentação COQ269, o meio continha uma combinação de concentração elevada de fosfato (0,8 g/L de KH2PO4), baixa de sódio (7 g/L de glutamato de sódio e nenhum NaCl), e elevada de prolina (12 g/L). As fermentações pararam quando as fontes de carbono foram completamente eliminadas, da maneira evidenciada por uma parada abrupta no consumo de oxigênio.
[000133] Os rendimentos de biomassa e PT são mostrados na tabela 11. Na presença de concentrações elevadas de fosfato, baixas de sódio e elevadas de prolina (COQ269), nenhum impacto negativo no rendimento da biomassa foi observado. Entretanto, a produção de PT foi muito reduzida (84% menorcomparada a COQ280).
[000134] Duas fermentações de 20L de B. pertussis foram realizadas em paralelo. As etapas de pré-cultura foram realizadas da maneira descrita no exemplo 2. As fermentações de 20L foram realizadas da maneira descrita no exemplo 1, exceto para as seguintes adaptações da composição de meio: em fermentação COQ280, L-cisteína foi adicionada em uma concentração de 0,04 g/L, ao passo que em fermentação COQ396, a concentração de L-cisteína foi 0,2 g/L. As fermentações pararam quando as fontes de carbono foram completamente eliminadas (quando existe uma parada abrupta no consumo de oxigênio).
[000135] Os rendimentos de biomassa e PT são mostrados na tabela 12. Quando L-cisteína estava presente em uma concentração elevada, uma redução significativa na produção de PT foi observada (32% menor comparado a COQ280).
[000136] Exemplos 3 e 4 indicam que a niacina em 0,6 g/L pode ser usada para controlar a obtenção de células bvg- acima de um número limitado de gerações, mesmo iniciando a partir de uma proporção relativamente baixa de células bvg- (até 6%). A fim de extender esta observação para um número maior de gerações e uma faixa maior de proporção inicial de células bvg-, dois grupos de quatro culturas de frasco de agitação em série foram realizadas, da maneira descrita a seguir.
[000137] Primeiro, um isolado bvg+ e um isolado bvg- foram inoculados separadamente em 100 mL de meio fresco adaptado de Stainer e Scholte (da maneira descrita no exemplo 4) (J. Gen. Microbiol. 63:211-220 (1971)), e contendo 0,004 g/L de niacina. Os dois frascos de agitação foram incubados por 24h (+/- 1h) a 35°C (+/- 1°C) e 150 rpm. As células foram coletadas por centrifugação, lavadas duas vezes com meio fresco, e ressuspensas em meio fresco. Diferentes misturas das duas suspensões celulares foram então conservadas, a fim de obter suspensões contendo 93,8%, 72,1%, 4,2% ou 4% de células bvg-. Cada uma destas quatro suspensões de células mistas foi usada para inocular dois frascos de agitação separados contendo 100 mL de meio fresco tanto com 0,004 g/L de niacina ou 0,6 g/L de niacina. Após incubação por 24h (+/- 1h) a 35°C (+/- 1°C) e 150 rpm, cada cultura foi usada para inocular um frasco de agitação contendo 100 mL de meio fresco contendo a mesma concentração de niacina. Para cada um dos 8 frasco de agitação em cultura, o procedimento foi repetido 17 vezes em total, a fim de atingir um número total de gerações de aproximadamente 90 a 100. No final de cada passagem (aproximadamente 5 gerações), a proporção de células bvg+ e bvg- foi medida plaqueando diluições adequadas da cultura no meio BG. Os resultados são representados na figura 4 para as quatro culturas seriadas com niacina a 0,004 g/L, e na figura 5 para as quatro culturas seriadas com niacina a 0,6 g/L.
[000138] Estes resultados demonstram que o uso de niacina a 0,6 g/L além de 0,004 g/L, pode controlar de maneira eficiente a obtenção de células bvg-, independente da proporção inicial destas células. Isto também mostra que este controle é eficiente por até 100 gerações, o que corresponde tipicamente ao número de gerações exigido para produzir um armazenamento de célula funcional e biomassa suficiente (agrupamento de pré-cultura) para a inoculação de uma fermentação em escala industrial, começando a partir de uma cepa recentemente isolada de B. pertussis.
Claims (20)
1. Processo de fermentação, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) fornecer uma amostra de bactérias de uma espécie de Bordetella; b) incubar a amostra de bactérias de uma espécie de Bordetella em um primeiro meio de cultura na presença de pelo menos um modulador de bvg (genes de virulência de Bordetella) por pelo menos 5 gerações, produzindo por meio disso uma cultura madura, em que o modulador de bvg é selecionado do grupo que consiste em niacina, um sal de magnésio, um sal sulfato, um sal fosfato, um sal carbonato, sacarose, prolina, íons de sódio está em uma concentração maior do que 100mM, um agente antiespuma, glutationa e um aminoácido contendo enxofre; c) incubar a cultura madura em um segundo meio de cultura na ausência do pelo menos um modulador de bvg; em que etapa c) ocorre após etapa b), e em que pelo menos parte da etapa b) é realizada em um vaso maior do que ou igual a 25ml em volume.
2. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a espécie de Bordetella expressa pelo menos um fator de virulência selecionado do grupo que consiste em Toxina pertussis, Hemaglutinina filamentosa, Pertactina e aglutinogênio fimbrial e é uma espécie selecionada do grupo que consiste em Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, e Bordetella bronchiseptica.
3. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o processo é um processo para (i) conservar a espécie de Bordetella em um genótipo de bvg+ em cultura industrial; (ii) diminuir a perda de expressão de fatores de virulência em crescimento de cultura industrial; ou (iii) intensificar produção de fatores de virulência da espécie de Bordetella.
4. Processo de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a niacina é em uma concentraçãomaior que ou igual a 0,004 g/L, maior que ou igual a 0,01 g/L, maior que ou igual a 0,1 g/L, maior que ou igual a 0,2 g/L, maior que ou igual a 0,3 g/L, ou maior que ou igual a 0,6 g/L, menor que ou igual a 400 g/L, menor que ou igual a 300 g/L, menor que ou igual a 200 g/L, menor que ou igual a 100 g/L, menor que ou igual a 50 g/L, ou menor que ou igual a 5 g/L, entre 0,004 g/L e 500 g/L, entre 0,01 g/L e 400 g/L, entre 0,1 g/L e 300 g/L, entre 0,4 g/L e 200 g/L ou entre 0,2 g/L e 100 g/L.
5. Processo de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o sal sulfato está em uma concentração maior que ou igual a 10 mM.
6. Processo de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o sal de magnésio ou sal sulfato é MgSO4 em uma concentração de 20 mM.
7. Processo de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o modulador de bvg compreende íons sódio em uma concentração: (i) maior que 120 mM, maior que 150 mM, maior que 175 mM, maior que 200 mM, ou maior que 250 mM; ou (ii) entre 100 mM e 2000 mM, entre 120 mM e 2000 mM, entre 150 mM e 2000 mM, entre 175 mM e 2000 mM, ou entre 200 mM e 2000 mM.
8. Processo de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o agente antiespuma é Polidimetilsiloxano.
9. Processo de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que etapa c) é realizada em um fermentador, opcionalmente em que o volume de funcionamento do fermentador é: (i) entre 5 e 10000 litros, entre 10 e 5000 litros, entre 20 e 2000 litros, ou entre 50 litros e 1000 litros; (ii) maior que ou igual a 5 litros, maior que ou igual a 10 litros, maior que ou igual a 15 litros, maior que ou igual a 20 litros, maior que ou igual a 25 litros, maior que ou igual a 50 litros, ou maior que ou igual a 100 litros; ou (iii) menor que ou igual a 10000 litros, menor que ou igual a 5000 litros, ou menor que ou igual a 2500 litros.
10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a etapa c) é realizada em uma temperatura: (i) maior que ou igual a 32°C, maior que ou igual a 33°C, maior que ou igual a 34°C, ou maior que ou igual a 35°C; (ii) menor que ou igual a 45°C, menor que ou igual a 42°C, menor que ou igual a 40°C, ou menor que ou igual a 38°C; ou (iii) entre 32°C e 45°C, entre 33°C e 42°C, entre 34°C e 40°C, ou entre 35°C e 38°C.
11. Processo de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que etapa b) compreende uma fase de pré-cultura.
12. Processo de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a etapa b) compreende uma fase de armazenamento celular.
13. Processo de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que armazenamento celular ocorre entre etapa a) e etapa b).
14. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa d) de purificar o fator de virulência para produzir um fator de virulência purificado.
15. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa e) de formular uma composição imunogênica compreendendo o fator de virulência purificado.
16. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa f) de adicionar pelo menos um antígeno à composição imunogênica.
17. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o antígeno é selecionado do grupo que consiste em Toxina pertussis, Hemaglutinina filamentosa, Pertactina, um Fimbrial Aglutinogênio, Toxóide diftérico, Toxóide tetânico, um antígeno de sacarídeo conjugado de N. meningitidis, antígeno de superfície de Hepatitis B, Polio Vírus inativado (IPV) e um antígeno de sacarídeo conjugado de Haemophilus influenzae b.
18. Processo de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa g) de adicionar um excipiente farmaceuticamente aceitável à composição imunogênica.
19. Processo de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa f) de adicionar um adjuvante à composição imunogênica.
20. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o adjuvante compreende fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio.
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