JP6181082B2 - 発酵方法 - Google Patents
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Description
第1の態様において、
a)ボルデテラ(Bordetella)種の細菌の試料を準備するステップと、
b)第1環境において少なくとも1つのbvg(ボルデテラ毒性遺伝子)調節条件下でボルデテラ種の細菌の試料を少なくとも5世代インキュベートし、それによって成熟培養物を生成するステップと、
c)第2の環境において前記少なくとも1つのbvg調節条件の非存在下で成熟培養物をインキュベートするステップと
を含み、ステップc)がステップb)の後に行われる発酵方法が提供される。
a)少なくとも1種のbvg調節因子を含む第1の培養培地中にボルデテラ種の細菌の試料を準備するステップと、
b)少なくとも1種のbvg調節因子を含む第1の培養培地中で試料を少なくとも5世代インキュベートし、それによって成熟培養物を生成するステップと、
c)第2の培養培地で前記少なくとも1種のbvg調節因子の非存在下で成熟培養物をインキュベートするステップと
を含み、ステップc)がステップb)の後に行われる発酵方法が提供される。
a)第1の培養培地中にボルデテラ種の細菌の試料を準備するステップと、
b)少なくとも1種のbvg調節因子を含む第1の培養培地中で試料を少なくとも5世代インキュベートし、それによって成熟培養物を生成するステップと、
c)第2の培養培地で前記少なくとも1種のbvg調節因子の非存在下で成熟培養物をインキュベートするステップと
を含み、ステップc)がステップb)の後に行われる発酵方法が提供される。
bvg調節条件は百日咳種由来の毒性因子の発現を阻害すると一般に考えられているにもかかわらず、本発明者は、驚くべきことに、本明細書に記載の通り少なくとも1種のbvg調節条件の下で百日咳種を増殖させることによってより高収量の百日咳毒性因子が得られることを見出した。
a)ボルデテラ種の細菌の試料を準備するステップと、
b)第1の環境において少なくとも1つのbvg(ボルデテラ毒性遺伝子)調節条件下でボルデテラ種の細菌の試料を少なくとも5世代インキュベートし、それによって成熟培養物を生成するステップと、
c)第2の環境で前記少なくとも1つのbvg調節条件の非存在下で成熟培養物をインキュベートするステップと
を含み、ステップc)がステップb)の後に行われる発酵方法が提供される。
ステップa)は、bvg調節条件にボルデテラ種を曝露する前の発酵方法の段階について記述しており、これは、一定量の生きているボルデテラ細菌の試料を準備するステップのことを一般に指す。植菌される培地は、固体又は液体培地であり得る。一実施形態において、本方法は、ボルデテラ種の細菌の試料を選択するステップi)を更に含み、細菌の試料が主にBvg+遺伝子型であり、ステップi)はステップa)の前に行われる。場合によっては、50%超、60%超、70%超、75%超、80%超、85%超、90%超、95%超、98%超、85%〜100%、90%〜100%、95%〜100%又は98%〜100%の細菌の試料が、ステップa)においてBvg+遺伝子型である。
ステップb)は、少なくとも1つのbvg調節条件にステップa)の試料を曝露するステップについて記述しており、そのような条件は、Bvg-遺伝子型細胞の占有を減少させるか又はBvg+遺伝子型を保存する任意の条件であることができる。理論に束縛されるものではないが、ボルデテラが培養において(例えば研究室又は製造施設において)インキュベートされるとき、Bvg-遺伝子型である細胞の割合は経時的に(数世代)増加する傾向がある。これは、培養中のボルデテラに対して全く利益が無い毒性因子を発現しないことにより得られる選択的利点による可能性がある。このため、毒性因子の発現を減少させる条件でボルデテラをインキュベートすることにより、Bvg-遺伝子型に転換することによる選択的利点が減少し、したがって培養中のBvg-遺伝子型細胞の占有が減少する。それによって、試料中のBvg+遺伝子型集団を維持する。
ステップc)とは、ボルデテラが、ステップb)の少なくとも1つのbvg調節条件の非存在下で増殖されるステップのことを指す。一般に、ステップb)のbvg調節条件を除去し、例えばbvg調節条件が28℃より低い温度である場合、前記少なくとも1つのbvg調節条件の非存在下における成熟培養物のインキュベーションは、28℃を超える温度における成熟培養物のインキュベーションを含む。同様に、少なくとも1つのbvg調節条件がbvg調節因子の存在である場合、前記少なくとも1つのbvg調節条件の非存在下における成熟培養物のインキュベーションは、前記bvg調節因子の非存在下における成熟培養物のインキュベーションを含む。例えば、ナイアシンがbvg調節因子である場合、ステップb)の第1の培養培地にこれを添加することができ、ステップc)の第2の培養培地において濃度を(調節濃度以下になるように)減少させることができる。
本発明の文脈において、どんなbvg調節条件も使用できる。いくつかの例を、以下に提供する。
一実施形態において、ボルデテラ種は、百日咳毒素、線維状血球凝集素、線毛状凝集原及びパータクチンからなる群から選択される少なくとも1種の毒性因子を発現する。場合によっては、ステップb)において、百日咳毒素は、2.8 mgL-1 OD 650nm -1、2.7mgL-1 OD 650nm -1、2.6mgL-1 OD 650nm -1、2.5mgL-1 OD 650nm -1、2.4mgL-1 OD 650nm -1、2.3 mgL-1 OD 650nm -1、2.2 mgL-1 OD 650nm -1、2.1 mgL-1 OD 650nm -1、2.0 mgL-1 OD 650nm -1、1.9mgL-1 OD 650nm -1、1.8 mgL-1 OD 650nm -1、1.7 mgL-1 OD 650nm -1、又は1.6 mgL-1 OD 650nm -1より小さい比百日咳毒素産生率で生成される。場合によっては、ステップc)の間に、百日咳毒素は、8mgL-1 650nm -1、2.9mgL-1 650nm -1、3.0mgL-1 650nm -1、3.1mgL-1 650nm -1又は3.2mgL-1 650nm -1より大きい比百日咳毒素産生率で生成される。
20L-規模発酵での百日咳菌bvg+及びbvg-変異体による増殖及び毒性因子産生
百日咳菌の振とうフラスコ培養物を、Bordet-Gengou培地(5%ヒツジ血液を含有)に播いて、溶血性(bvg+)及び非溶血性(bvg-)コロニーを検出することができる。1つの単一bvg+コロニー及び1つの単一bvg-コロニーをこれらのプレートから単離し、使用して、20L-規模発酵を実行した。
百日咳菌の20L-規模発酵におけるbvg-細胞の蓄積
bvg+とbvg-細胞の比が99:1を表す109CFUの百日咳菌で第1の前培養を植菌したことを除いて、実施例1に記載の通り百日咳菌の20L-発酵を実行した。
振とうフラスコ連続培養におけるbvg-細胞の占有に対する調節化合物の効果
実施例1に記載の修正によりStainer及びScholte(J. Gen. Microbiol. 63巻:211〜220頁(1971年))から変更した培地で4系列の培養を並行して実行し、表3に記載の通り、各系列はMgSO4(10mM)及び/又はナイアシン(0g/L又は0.604g/L)を含有した。各系列に対して、新鮮培地7.5mlを含有する第1の振とうフラスコを、bvg+とbvg-細胞の比が99:1を表す109CFUの百日咳菌で植菌した。以降の振とうフラスコ培養物は全て、新鮮培地100mlを含有した。全ての培養物を、35℃(+/-1℃)で24時間(+/-1時間)インキュベートした。3及び4回目の継代の終了時に、5%血液を含有するBG培地に適当な希釈率の培養物を播くことによってbvg+及びbvg-細胞の割合を測定した(表3)。
振とうフラスコ連続培養におけるbvg-細胞の占有に対する調節化合物ナイアシンの用量効果
百日咳菌の振とうフラスコ連続培養におけるbvg-細胞の占有に対するナイアシンの用量効果を評価した。実施例1に記載の修正によりStainer及びScholte(J. Gen. Microbiol. 63巻:211〜220頁(1971年))から変更した培地で、4系列の培養を並行して実行した。培地は、以下の修正も含んだ:10g/Lカゼイン加水分解物で得られるのと同等の濃度の12種類のアミノ酸(L-アスパラギン酸、グリシン、L-バリン、L-メチオニン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、L-アラニン、L-チロシン、L-セリン及びL-リシン)の混合物による酸性カゼイン加水分解物の置きかえ、高濃度のNa-L-グルタミン酸(20g/L)及びL-プロリン(1.04g/L)、並びにNaClの欠如。表4に記載の通り、各系列は異なる濃度のナイアシンを含有した。各系列に対して、新鮮培地100mlを含有する第1の振とうフラスコを、bvg+とbvg-細胞の比が94:6を表すおよそ4x109CFUの百日咳菌で植菌した。以降の振とうフラスコは全て、新鮮培地100mlを含有し、初期細胞濃度およそ4x108CFU/mlの先の培養物で植菌した。全ての培養物を、35℃(+/-1℃)、150rpmで24時間(+/-1時間)インキュベートした。各継代の終了時に、5%血液を含有するBG培地に適当な希釈率の培養物を播くことによってbvg+及びbvg-細胞の割合を測定した(表4)。各継代における世代数を、光学密度測定(OD650nm)に基づいて算出した。世代数の関数としてのbvg-細胞の占有を、図2に表す。
20L-規模発酵におけるbvg-細胞の占有を制御するための調節化合物ナイアシンの使用
百日咳菌の20L-発酵を2つ並行して実行した。発酵COQ255の始めの2回の前培養におけるbvg-占有を制御するための高濃度のナイアシン(0.604g/L)の存在を除いて、2つの発酵は同一であった、一方、発酵COQ255の次の2回の前培養は低濃度のナイアシン(0.004g/L)を含有した。発酵COQ254においては、4回全ての前培養を0.004g/Lナイアシンの存在下で実行した。本方法の各ステップにおけるナイアシン濃度を表5に示す。各前培養ステップにおける培地希釈により、20L-発酵槽内の初期ナイアシン濃度は0.004g/L、すなわち調節濃度未満であり、PT産生が可能であった。
PT産生を阻害する条件である低溶存酸素
百日咳菌の20L-発酵を2つ並行して実行した。実施例2に記載の通り前培養ステップを実行した。同じ一連の前培養を使用して、2つの20L-発酵槽を植菌した。最大攪拌速度を第1の発酵において550rpm(COQ238、酸素十分条件)に及び第2の発酵において280rpm(COQ239、酸素制限条件)に設定したことを除いて、実施例1に記載の通り20L-発酵を実行した。酸素消費の急停止から明らかなように、炭素源が完全に枯渇したときに発酵は停止した。
PT産生を阻害するための酵母抽出物の使用
百日咳菌の20L-発酵を2つ並行して実行した。Na-L-グルタミン酸濃度(20g/L)を除いて、実施例2に記載の通り前培養ステップを実行した。培地組成に対する以下の変更を除いて、実施例1に記載の通り20L-発酵を実行した:発酵COQ199において、20g/Lの濃度で培地に酵母抽出物を添加し、一方発酵COQ182において、10g/Lの濃度でカゼイン加水分解物を添加した。両方の発酵において、泡制御装置によるポリジメチルシロキサン乳液の自動添加によって発泡を制御した。酸素消費の急停止から明らかなように、炭素源が完全に枯渇したときに発酵は停止した。
PT産生を阻害するための高プロリン濃度及び低ナトリウム濃度の使用
百日咳菌の20L-発酵を3つ並行して実行した。実施例4に記載の通り、培地組成を除いて、実施例2に記載の通り前培養ステップを実行した。培地組成を除いて、実施例1に記載の通り20L-発酵を実行した:発酵COQ280において、1g/Lの最終濃度になるようにプロリンを添加し、一方発酵COQ278において、プロリン濃度は12g/Lであった。2つの条件の間で炭素源の量を同程度に保つため、グルタミン酸(グルタミン酸ナトリウムとして与えられる)濃度を、発酵COQ280における20g/Lから発酵COQ278における7g/Lへと減少させた。発酵COQ281において、プロリン及びグルタミン酸濃度はCOQ278と同一であったが、COQ280と比較してグルタミン酸ナトリウムの減少に対して補償するために、4g/Lの濃度でNaClを添加した。酸素消費の急停止から明らかなように、炭素源が完全に枯渇したときに発酵は停止した。
PT産生を阻害するための高リン酸濃度の使用
百日咳菌の20L-発酵を2つ並行して実行した。実施例8に記載の通り前培養ステップを実行した。培地組成に対する以下の変更を除いて、実施例1に記載の通り20L-発酵を実行した:発酵COQ280において、0.5g/Lの濃度でKH2PO4を添加し、一方発酵COQ279において、KH2PO4濃度は0.8g/Lであった。酸素消費の急停止から明らかなように、炭素源が完全に枯渇したときに発酵は停止した。
PT産生を阻害するための高リン酸濃度、高プロリン濃度、及び低ナトリウム濃度の組合せ
百日咳菌の20L-発酵を2つ並行して実行した。実施例8に記載の通り前培養ステップを実行した。培地組成に対する以下の変更を除いて、実施例1に記載の通り20L-発酵を実行した(表11に詳述される):発酵COQ269において、培地は、高リン酸(KH2PO4 0.8g/L)、低ナトリウム(グルタミン酸ナトリウム7g/L及びNaClなし)、及び高プロリン(12g/L)濃度の組合せを含有した。酸素消費の急停止から明らかなように、炭素源が完全に枯渇したときに発酵は停止した。
PT産生を阻害するための高システイン濃度の使用
百日咳菌の20L-発酵を2つ並行して実行した。実施例2に記載の通り前培養ステップを実行した。培地組成の以下の変更を除いて、実施例1に記載の通り20L-発酵を実行した:発酵COQ280において、0.04g/Lの濃度でL-システインを添加し、一方発酵COQ396において、L-システイン濃度は0.2g/Lであった。炭素源が完全に枯渇したとき(酸素消費が急停止したとき)に発酵は停止した。
ナイアシンを用いるbvg-占有の長期間制御
実施例3及び4は、比較的低い割合のbvg-細胞(多くとも6%)から開始したとしても、0.6g/Lナイアシンを使用して、限られた世代数に渡ってbvg-細胞の占有を制御できることを示している。より多い世代数及びより広範囲なbvg-細胞の初期割合へとこの観察を広げるために、後述するように、4つの振とうフラスコ連続培養物について2つの群を実行した。
Claims (37)
- a)少なくとも1種のボルデテラ毒性遺伝子(bvg)調節因子を含む第1の培養培地中にボルデテラ種の細菌の試料を準備するステップであって、前記bvg調節因子が、ナイアシン及び含硫黄アミノ酸から選択され、試料の85%超のボルデテラ細胞がbvg+遺伝子型を有する、前記ステップと、
b)少なくとも1種のbvg調節因子を含む第1の培養培地中で試料を少なくとも5世代インキュベートし、それによって成熟培養物を生成するステップと、
c)第2の培養培地で前記少なくとも1種のbvg調節因子の非存在下で成熟培養物をインキュベートするステップと
を含み、ステップc)がステップb)の後に行われ、ステップb)の少なくとも一部が、25ml以上の容量の容器で実施され、且つステップc)において、百日咳毒素(PT)、線維状血球凝集素(FHA)、パータクチン(PRN)及び線毛状凝集原から成る群から選択される少なくとも1種の毒性因子が発現される、発酵方法。 - ボルデテラ種が、百日咳菌、パラ百日咳菌及び気管支敗血症菌から成る群から選択される種である、請求項1に記載の発酵方法。
- ステップb)が、40未満、35未満、30未満、25未満、20未満又は18未満の世代を含む、請求項1〜2のいずれか1項に記載の発酵方法。
- 産業的培養においてbvg+遺伝子型のボルデテラ種を保存する方法である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の発酵方法。
- 産業的培養において増殖中の毒性因子の発現の消失を最小限に抑える方法である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の発酵方法。
- ボルデテラ種の毒性因子の産生を増強する方法である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の発酵方法。
- bvg調節因子が、0.2g/l以上、0.3g/l以上、又は0.2g/l〜100g/lの濃度のナイアシンである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の発酵方法。
- bvg調節因子がシステインである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の発酵方法。
- bvg調節因子がメチオニンである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の発酵方法。
- 含硫黄アミノ酸が、0.5mM以上、若しくは0.8mM以上、又は0.5mM〜100mMの濃度である、請求項1〜6及び8〜9のいずれか1項に記載の発酵方法。
- 第2の培養培地がStainer Scholte培地を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の発酵方法。
- 第2の培養培地が変法Stainer Scholte培地を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の発酵方法。
- ステップb)の少なくとも一部が、
(i)50ml〜25リットル、50ml〜20リットル、50ml〜15リットル、50ml〜10リットル、若しくは50ml〜5リットル、
(ii)25リットル以下、20リットル以下、15リットル以下、10リットル以下、若しくは5リットル以下、又は
(iii)25ml以上、50ml以上、100ml以上、250ml以上、500ml以上、1リットル以上、若しくは2リットル以上
の容量の容器で実施される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の発酵方法。 - ステップc)が、発酵槽で実施される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の発酵方法。
- 発酵槽の作業容量が、
(i)5〜10000リットル、10〜5000リットル、20〜2000リットル、若しくは50リットル〜1000リットル、
(ii)5リットル以上、10リットル以上、15リットル以上、20リットル以上、25リットル以上、50リットル以上、若しくは100リットル以上、又は
(iii)10000リットル以下、5000リットル以下、若しくは2500リットル以下
である、請求項14に記載の発酵方法。 - ステップc)が、
(i)32℃以上、33℃以上、34℃以上、若しくは35℃以上、
(ii)45℃以下、42℃以下、40℃以下、若しくは38℃以下、又は
(iii)32℃〜45℃、33℃〜42℃、34℃〜40℃、若しくは35℃〜38℃
の温度で実施される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。 - ステップb)が前培養段階を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の発酵方法。
- ステップa)とステップb)の間において細胞バンキングが行われる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の発酵方法。
- ボルデテラ種の細菌の試料を選択するステップi)を更に含み、細菌の試料が主にBvg+遺伝子型であり、ステップi)がステップa)の前に行われる、請求項1〜18のいずれか1項に記載の発酵方法。
- 90%超、95%超、98%超、85%〜100%、90%〜100%、95%〜100%又は98%〜100%の細菌の試料がBvg+遺伝子型である、請求項1〜19のいずれか1項に記載の発酵方法。
- ステップb)が、少なくとも8、10、12、14、16、又は17世代を含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の発酵方法。
- ステップb)が、
(i)200時間以下、150時間以下、100時間以下、80時間以下、70時間以下、60時間以下、若しくは55時間以下、
(ii)10時間以上、15時間以上、20時間以上、25時間以上、30時間以上、35時間以上、若しくは40時間以上、又は
(iii)10時間〜200時間、15時間〜150時間、20時間〜100時間、25時間〜80時間、若しくは30時間〜70時間
である、請求項1〜21のいずれか1項に記載の発酵方法。 - ステップc)が、
(i)200時間以下、150時間以下、100時間以下、80時間以下、60時間以下、若しくは40時間以下、
(ii)5時間以上、10時間以上、15時間以上、若しくは25時間以上、又は
(iii)5時間〜200時間、10時間〜150時間、15時間〜100時間、若しくは25時間〜80時間である、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。 - ステップb)が、20℃〜45℃、22℃〜43℃、24℃〜42℃、28℃〜42℃、30℃〜42℃、又は32℃〜40℃の温度で実施される、請求項1〜23のいずれか1項に記載の発酵方法。
- ステップb)が、6.5〜7.8又は6.8〜7.5のpHで実施される、請求項1〜24のいずれか1項に記載の発酵方法。
- ステップc)が、6.5〜7.8又は6.8〜7.5のpHで実施される、請求項1〜25のいずれか1項に記載の発酵方法。
- ステップb)が、10%〜50%、15%〜45%、20%〜35%の溶存酸素の存在下で実施される、請求項1〜26のいずれか1項に記載の発酵方法。
- ステップc)が、0%〜50%、0%〜45%、0%〜35%の溶存酸素の存在下で実施される、請求項1〜27のいずれか1項に記載の発酵方法。
- ボルデテラ種が、百日咳毒素、線維状血球凝集素、パータクチン及び線毛状凝集原から成る群から選択される少なくとも1種の毒性因子を発現する、請求項1〜28のいずれか1項に記載の発酵方法。
- ステップb)において、百日咳毒素が、2.8mgL-1 OD 650nm -1、2.7mgL-1 OD 650nm -1、2.6mgL-1 OD 650nm -1、2.5mgL-1 OD 650nm -1、2.4mgL-1 OD 650nm -1、2.3mgL-1 OD 650nm -1、2.2mgL-1 OD 650nm -1、2.1mgL-1 OD 650nm -1、2.0mgL-1 OD 650nm -1、1.9mgL-1 OD 650nm -1、1.8mgL-1 OD 650nm -1、1.7mgL-1 OD 650nm -1、又は1.6mgL-1 OD 650nm -1より小さい比百日咳毒素産生率で生成される、請求項29に記載の発酵方法。
- 毒性因子を精製して、精製された毒性因子を生成するステップd)を更に含む、請求項29又は30に記載の発酵方法。
- 精製された毒性因子を含む免疫原性組成物を配合するステップe)を更に含む、請求項31に記載の発酵方法。
- 免疫原性組成物に少なくとも1種の抗原を添加するステップf)を更に含む、請求項32に記載の発酵方法。
- 抗原が百日咳毒素、線維状血球凝集素、パータクチン、線毛状凝集原、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、髄膜炎菌由来コンジュゲート糖抗原、B型肝炎表面抗原、不活化ポリオウイルス(IPV)及びインフルエンザ菌b由来コンジュゲート糖抗原から成る群から選択される、請求項33に記載の発酵方法。
- 免疫原性組成物に薬学的に許容される賦形剤を添加するステップg)を含む、請求項32〜34のいずれか1項に記載の発酵方法。
- 免疫原性組成物にアジュバントを添加するステップf)を含む、請求項32〜35のいずれか1項に記載の発酵方法。
- アジュバントが、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウムを含む、請求項36に記載の発酵方法。
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