CN109161575A - 禽法氏囊病毒vp2蛋白的高表达发酵工艺 - Google Patents

禽法氏囊病毒vp2蛋白的高表达发酵工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺，旨在解决工程菌禽法氏囊病毒VP2蛋白表达量低的技术问题。该发酵工艺包括以下步骤：（1）菌种活化；（2）种子培养；（3）补料分批发酵：I.细胞快速繁殖阶段：制备基础培养基置于发酵罐中，将二级种子液按4～6%的接种量接入发酵罐中发酵，待溶氧量急剧上升开始补料；II.蛋白表达阶段：加入终浓度为0.5mmol/L诱导剂；加入补料培养基之二，继续发酵至结束即成。本发明的工艺方法蛋白表达量高，能够缩短生产周期、减少设备投资，降低生产成本，提高生产效率，能够极大地提高产品在商场上的竞争力，为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制和生产奠定了基础。

Description

禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺。
背景技术
禽法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）是一种急性、高度接触性传染病，主要感染雏鸡的免疫器官法氏囊，引起免疫抑制甚至死亡，该病主要危及3～7周的雏鸡，对禽业影响巨大。
禽法氏囊病是由传染性法氏囊病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）引起的，病毒在感染后迅速侵入法氏囊，并在法氏囊内增殖，使得法氏囊中的B 淋巴细胞裂解、死亡，最终产生严重的免疫抑制。长期的免疫抑制使鸡群容易受到其他病原体的感染，且机体对疫苗的免疫反应力下降，不能正常诱导保护性免疫反应，从而造成免疫失败。IBDV的VP2蛋白是由454个氨基酸组成，分子量约为37 KD，占病毒总蛋白的51%，是IBDV的主要结构蛋白和保护性抗原，也是构成病毒衣壳的主要成分。VP2蛋白可以诱导与识别病毒中和抗体、也影响着病毒的毒力及抗原的变异、还可以诱导细胞凋亡等。因此，生产和科研上均迫切需要大量制备VP2 蛋白，以为 IBDV 的防治和新型亚单位疫苗的研发和生产提供的研究基础。
目前，重组外源蛋白的工业化生产，需要能够高效稳定表达外源基因产物的工程菌，以及能够大规模培养发酵工程菌的技术和工艺。然而，现有研究中工程菌的VP2 蛋白表达量均差强人意，纯化和浓缩需耗费大量人力、物力、财力，难以达到工业化生产应用。
因此，亟需开发一种能够大幅度提高工程菌产量的VP2 蛋白发酵工艺，以期能够缩短生产周期、降低生产成本、提高生产效率，实现禽法氏囊病毒VP2蛋白的工业化和产业化。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺，通过提高工程菌的发酵密度实现禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术研发思路：
发明人长期大量研究总结得出在工程菌的大规模的发酵过程中，外源基因的表达水平和菌体密度决定着重组外源蛋白产物的产量。
所选择的大肠杆菌具有遗传背景清晰、繁殖速度快、培养条件简单、表达产物产量高等优点，且原核表达系统中大规模生产成本较低、遗传背景清晰、重组目的蛋白的表达量高。发明人选择含有质粒 PlysS的BL21(DE3)PlysS菌株，PlysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够在降低目的基因的背景表达水平的同时而不影响目的蛋白的表达，该菌株适合表达毒性蛋白以及非毒性蛋白。
除了需要重组菌本身的表达性质稳定高效外，同时还必须保证重组菌的生长和产物表达的最适环境条件，这包括最佳的培养基组成、适宜的培养温度、pH、稳定的比生长速率、适宜的溶解氧和营养物的合理流加等。这些因素都是相互联系的，因此需要对这些条件因素进行综合考虑，找到一个平衡点。发明人选择则高密度培养技术(High cell-densityculture，HCDC)，即通过提高菌体的发酵密度，从而提高产物的比生产率（单位体积单位时间内产物的产量），采用补料分批发酵的方式以提高工程菌发酵密度，并结合长期的实践研究经验，对高密度发酵条件进行了大量的、全面的探索与优化，进而实现提高发酵菌体密度和目的产物水平的目的。
具体采用的技术方案如下：
设计一种禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将含有禽法氏囊病毒VP2蛋白基因的基因工程菌菌种在含有卡那霉素的LB固体培养基表面划线接种，于37℃培养8～16h；
（2）种子培养：将活化后的菌种接种一级种子培养基中，37℃振荡培养8～12h，得一级种子液；再将一级种子液按1～2%的接种量接入二级种子培养基中，37℃振荡培养4～6h，得二级种子液；
（3）补料分批发酵：
I. 细胞快速繁殖阶段
a. 制备基础培养基置于发酵罐中，初始pH 6.54，121℃灭菌20min，降温至35℃，调节pH为6.8～7.2，再将二级种子液按4～6%的接种量接入发酵罐中发酵，控制发酵温度为35～37℃，溶氧量维持在20～30%；
b. 待基础培养基营养物质耗尽（表现为溶氧量急剧上升），加入补料培养基开始补料，补料速率为0.3～3L/h；
II. 蛋白表达阶段：
a. 待发酵液的OD600为75～85，将发酵液温度降至30℃，加入终浓度为0.5mmol/L诱导剂；
b. 溶氧量维持在20～30%；加入补料培养基之二，补料速率为0.3～3L/h；工程菌的比生长速率为0.01～0.1；继续发酵至结束即成。
优选的，所述基因工程菌的宿主为E.coliBL21(DE3)pLySs，其表达载体为pET-28a，表达重组蛋白为禽法氏囊病毒VP2蛋白。
优选的，所述一级种子培养基为LB培养基， pH值为7.0，接种前加入浓度为100ug/mL的卡那霉素。
优选的，所述二级种子培养基的组分为：12g/L蛋白胨，24g/L酵母提取物，16.43g/L K2HPO4•3H2O，2.31g/L KH2PO4，5.04g/L甘油，接种前加入浓度为100ug/mL的卡那霉素。
优选的，所述基础发酵培养基的组分为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母提取物，17.1g/L Na2HPO4•12H2O，3.0g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，0.6g/L NH4SO4，接种前加入浓度为50ug/mL的卡那霉素。
优选的，所述补料培养基之一的组分为：450～700 g/L甘油，48g/L蛋白胨，24g/L酵母抽提物。
优选的，所述补料培养基之二的组分为：700g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
优选的，在细胞快速繁殖阶段步骤a中，将最大通气量控制为50%，通气量控制为100～150VVM；将最大搅拌转速控制为50%，搅拌转速控制为150～300rpm。
优选的，在蛋白表达阶段步骤a中，所述诱导剂为半乳糖苷酶。
优选的，所述补料分批发酵过程中所述细胞快速繁阶段的发酵培养时间为18～24h；所述蛋白表达阶段的发酵培养时间为48～96h。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1.本发明的工艺方法不仅能够缩小培养体积、加强下游工艺的分离提取, 还能够缩短生产周期、减少设备投资，降低生产成本，提高生产效率，从而有利地提高产品的市场竞争力。
2.本发明的工艺方法菌体湿重达到10～15%，其表达量高达20～30%，使用小吨位的发酵罐即可满足大规模工业化的需求，具有良好的商业开发价值。
3.本发明的工艺方法将补料分批发酵分为两个阶段并对各阶段的培养条件加以控制，特别是工程菌的比生长速率和发酵过程中培养基的组成，使得重组禽法氏囊病毒VP2基因工程菌实现高密度发酵，提高基因工程菌的菌体密度，同时还提高禽法氏囊病毒VP2蛋白的产量。
4.本发明的工艺方法降低了禽法氏囊病毒VP2蛋白的生产成本，提高生产效率，能够极大地提高产品在商场上的竞争力，为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制和生产奠定了基础。
附图说明
图1为实施例1中禽法氏囊病毒VP2蛋白诱导表达后的SDS-PAGE图；
其中，1为蛋白marker，2～4为重组表达VP2蛋白；
图2为实施例1中禽法氏囊病毒VP2蛋白诱导表达后的Western blot图；
其中，1为蛋白marker，2为常规工艺表达VP2蛋白；3为实施例2工艺表达VP2蛋白；
图3为禽法氏囊病毒VP2蛋白自组装病毒样颗粒结构图；
其中，颗粒结构如三角形区域所示。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：基因工程菌的构建试验
参照中国专利文献CN 106148358 A构建基因工程菌E.coli BL21(DE3)PlysS/ pET-28a-IBDV-VP2，-80℃甘油管保存。
实施例2：基因工程菌的10L发酵试验
（1）菌种活化
用接种环将实施例1中-80℃甘油管保存的基因工程菌E.coliBL21(DE3)PlysS/pET-28a-IBDV-VP2菌种在含有卡那霉素的LB固体培养基表面划线接种，随后将平皿于37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。
（2）种子培养
I. 将活化后的菌种接种到50mL的一级种子培养基中，37℃振荡培养14小时，得到一级种子液；
其中，一级种子培养基为LB培养基，其组分为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH值为7.0。121℃灭菌20min，接种前加入浓度为100ug/mL的卡那霉素。
II. 将一级种子液按1%的接种量移入200mL的二级种子培养基中，37℃振荡培养4小时，得到二级种子液；
其中，二级种子培养基组分为：12g/L蛋白胨，24g/L酵母提取物，16.43g/L K2HPO4•3H2O，2.31g/L KH2PO4，5.04g/L甘油，121℃灭菌20min，接种前加入浓度为100ug/mL的卡那霉素。酸-碱调节试剂为：氨水和磷酸。
（3）补料分批发酵
I. 细胞快速繁殖阶段：
a. 先制备5L基础培养基置于发酵罐中，初始pH 6.54，121℃灭菌20min，降温至35℃，调节pH为6.8，然后将250mL二级种子液接入发酵罐中，进行发酵24h，控制发酵温度为35℃，通过通气与搅拌控制溶氧量维持在20～30%之间。
最大通气量为50%，通气量范围为100～150VVM；最大搅拌转速为50%，搅拌转速范围为150～300rpm；
基础发酵培养基组分为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母提取物，17.1g/LNa2HPO4•12H2O，3.0g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，0.6g/L NH4SO4，接种前加入浓度为50ug/mL的卡那霉素。
b. 配置3L补料培养基，121℃灭菌20min，冷却至室温后，待用。
补料培养基组分为：450～700 g/L甘油，48g/L蛋白胨，24g/L酵母抽提物。
c. 待基础培养基营养物质耗尽（表现为溶氧量急剧上升），开始补料，补料速率为300mL/h。
II. 蛋白表达阶段：
a. 发酵液的OD600为79.1，将发酵液温度降至30℃，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续发酵48h，期间溶氧量维持在20～30%；加入补料培养基，补料速率为300mL/h。工程菌的比生产速率为0.01～0.1。
补料培养基组分为：700g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
b. 发酵结束后，发酵液的OD600为188，细胞干重为112.3g/L。
c. 将发酵液进行SDS-PAGE，结果如图1所示，重组表达VP2蛋白大小在48kD左右。
实施例3：基因工程菌的100L发酵试验
（1）菌种活化
用接种环将实施例1中-80℃甘油管保存的基因工程菌E.coliBL21(DE3)PlysS/pET-28a-IBDV-VP2菌种在含有卡那霉素的LB固体培养基表面划线接种，随后将平皿于37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。
（2）种子培养
I. 将活化后的菌种接种到500mL的一级种子培养基中，37℃振荡培养14小时，得到一级种子液；
其中，一级种子培养基为LB培养基，其组分为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，氢氧化钠溶液调节pH值为7.0。121℃灭菌20min，接种前加入浓度为100ug/mL的卡那霉素。
II. 将一级种子液按1%的接种量移入2L的二级种子培养基中，35℃发酵培养4h，期间溶氧量维持在30%以上，得到二级种子液；
其中，二级种子培养基组分为：12g/L蛋白胨，24g/L酵母提取物，16.43g/L K2HPO4•3H2O，2.31g/L KH2PO4，5.04g/L甘油，121℃灭菌20min，接种前加入浓度为100ug/mL的卡那霉素。
（3）补料分批发酵
I. 细胞快速繁殖阶段：
a. 先制备50L基础培养基置于发酵罐中，初始pH 6.54，121℃灭菌20min，降温至35℃，调节pH为7.2，然后将2.5 L二级种子液接入发酵罐中，进行发酵18h，控制发酵温度为37℃，通过通气与搅拌控制溶氧量维持在20～30%之间。
基础发酵培养基组分为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母提取物，17.1g/LNa2HPO4•12H2O，3.0g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，0.6g/L NH4SO4，接种前加入浓度为50ug/mL的卡那霉素。
b. 配置30L补料培养基，121℃灭菌20min，冷却至室温后，待用。
补料培养基组分为：450～700 g/L甘油，48g/L蛋白胨，24g/L酵母抽提物。
c. 待基础培养基营养物质耗尽（表现为溶氧量急剧上升），开始补料，补料速率为3L/h。
II. 蛋白表达阶段：
a. 发酵液的OD600为81.2，将发酵液温度降至30℃，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续发酵96h，期间溶氧量维持在20～30%；加入补料培养基，补料速率为3000mL/h。
上述补料培养基为：600g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
b. 发酵结束后，发酵液的OD600为173，细胞干重为98.5g/L，菌体干重达到9.85%。
对比例：
将实施例1的工程菌分别采用实施例2的发酵工艺与常规工艺对比进行10L发酵试验，定量进行Western blot电泳。
结果显示实施例2的发酵工艺菌体干重达到11.23%，显著提高了工程菌的收获量；如图2所示：实施例2工艺表达VP2蛋白量与常规工艺相比，表达量高达10～15%，显著提高了重组禽法氏囊病毒VP2蛋白的表达量。
发酵蛋白样品经纯化与扫描电镜观察显示重组禽法氏囊病毒VP2蛋白自组装形成了病毒样颗粒结构，该结构直径为25nm（见图3）。上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

Claims (10)

1.一种禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将含有禽法氏囊病毒VP2蛋白基因的基因工程菌菌种划线接种在含有卡那霉素的LB固体培养基表面，于37℃培养8～16h；
（2）种子培养：将活化后的菌种接种一级种子培养基中，37℃振荡培养8～10～12h，得一级种子液；再将一级种子液按1～2%的接种量接入二级种子培养基中，37℃振荡培养4～6h，得二级种子液；
（3）补料分批发酵：
I. 细胞快速繁殖阶段
a. 制备基础培养基置于发酵罐中，初始pH 6.54，121℃灭菌20min，降温至35℃，调节pH为6.8～7.2，再将二级种子液按4～6%的接种量接入发酵罐中发酵，控制发酵温度为35～37℃，溶氧量维持在20～30%；
b. 待基础培养基营养物质耗尽时，以0.3～3L/h的速率加入补料培养基之一；
II. 蛋白表达阶段：
a. 待发酵液的OD600达到75～85，将发酵液温度降至30℃，加入终浓度为0.5mmol/L诱导剂；
b. 溶氧量维持在20～30%；以0.3～3L/h的速率加入补料培养基之二；工程菌的比生长速率为0.01～0.1；继续发酵至结束即成。
2.根据权利要求1所述的禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺，其特征在于，所述基因工程菌的宿主为E.coliBL21(DE3)pLySs，其表达载体为pET-28a，表达重组蛋白为禽法氏囊病毒VP2蛋白。
3.根据权利要求1所述的禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺，其特征在于，所述一级种子培养基为LB培养基， pH值为7.0，接种前加入浓度为100ug/mL的卡那霉素。
4.根据权利要求1所述的禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺，其特征在于，所述二级种子培养基的组分为：12g/L蛋白胨，24g/L酵母提取物，16.43g/L K2HPO4•3H2O，2.31g/L KH2PO4，5.04g/L甘油，接种前加入浓度为100ug/mL的卡那霉素。
5.根据权利要求1所述的禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺，其特征在于，所述基础发酵培养基的组分为：20g/L甘油，8g/L蛋白胨，12g/L酵母提取物，17.1g/L Na2HPO4•12H2O，3.0g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，0.6g/L NH4SO4，接种前加入浓度为50ug/mL的卡那霉素。
6.根据权利要求1所述的禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺，其特征在于，所述补料培养基之一的组分为：450～700 g/L甘油，48g/L蛋白胨，24g/L酵母抽提物。
7.根据权利要求1所述的禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺，其特征在于，所述补料培养基之二的组分为：700g/L甘油，20g/L蛋白胨，10g/L酵母抽提物。
8.根据权利要求1所述的禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺，其特征在于，在细胞快速繁殖阶段步骤a中，将最大通气量控制为50%，通气量控制为100～150VVM；将最大搅拌转速控制为50%，搅拌转速控制为150～300rpm。
9.根据权利要求1所述的禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺，其特征在于，在蛋白表达阶段步骤a中，所述诱导剂为半乳糖苷酶。
10.根据权利要求1所述的禽法氏囊病毒VP2蛋白的高表达发酵工艺，其特征在于，所述补料分批发酵过程中所述细胞快速繁阶段的发酵培养时间为18～24h；所述蛋白表达阶段的发酵培养时间为48～96h。
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