CN114456997A - 一种高效表达禽白血病p27蛋白的方法及其应用 - Google Patents
一种高效表达禽白血病p27蛋白的方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114456997A CN114456997A CN202210215990.5A CN202210215990A CN114456997A CN 114456997 A CN114456997 A CN 114456997A CN 202210215990 A CN202210215990 A CN 202210215990A CN 114456997 A CN114456997 A CN 114456997A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- avian leukosis
- culture
- fermentation tank
- culturing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 208000004668 avian leukosis Diseases 0.000 title claims abstract description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 54
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 36
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 66
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 64
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 64
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 55
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 47
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 44
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 28
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 26
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 19
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 17
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 16
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 16
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 15
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 15
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 14
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims description 12
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical group CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 12
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 10
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 10
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 claims description 10
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 9
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 9
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 9
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 claims description 8
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 7
- 238000010565 inoculated fermentation Methods 0.000 claims description 7
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 5
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims 3
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 claims 3
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 3
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 claims 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims 3
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 3
- 241000080590 Niso Species 0.000 claims 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 abstract description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 13
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 9
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 9
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 229910004619 Na2MoO4 Inorganic materials 0.000 description 6
- 229910003424 Na2SeO3 Inorganic materials 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 6
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 6
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 6
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 229910000363 nickel(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 6
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 6
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 6
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 4
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 3
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L nickel sulfate Chemical compound [Ni+2].[O-]S([O-])(=O)=O LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical class [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000012372 quality testing Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 241001664176 Alpharetrovirus Species 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000036750 egg laying performance Effects 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000005571 horizontal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000005570 vertical transmission Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus
- C12N2740/11022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及生物技术技术领域,具体涉及一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法及其应用。所述的方法包括:菌种培养、接种、扩繁、诱导表达、破碎离心、干燥,即得禽白血病P27蛋白。本发明提供的优点:禽白血病P27蛋白表达浓度高、表达量大。禽白血病P27蛋白产量高、表达量和产量稳定。生产周期短且成本低,生产效率高。稳定性和重复性好,适于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域,具体涉及一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法及其应用。
背景技术
禽白血病是一类由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的禽类不同组织良性和恶性肿瘤病的总称。该病毒为反转录病毒科的α反转录病毒属,可分为A~J共10个亚群。ALV主要引起感染鸡在性成熟前后发生肿瘤死亡,感染率和发病死亡率高低不等,死亡率最高可达20%。一些鸡感染后虽不发生肿瘤,但可造成产蛋性能下降甚至免疫抑制。控制此类疾病主要是通过种群净化来切断垂直传播,种鸡群一旦发ALV现阳性,应及时淘汰以阻断水平传播。
P27蛋白是禽白血病病毒重要的蛋白,是禽白血病检测试剂盒研发、生产和质检的必须材料,通常采用基因工程菌株三角摇瓶小规模表达P27蛋白。表达禽白血病P27蛋白有过很多报道,应用的表达系统有大肠杆菌、杆状病毒表达系统,但是均是小量表达,单位体积一般在300ml~1000ml,表达量在40mg/L左右;表达浓度低;经过纯化后,产量最该仅能达到80mg/批次;并且存在较大的批间差异,每次表达量和产量都不稳定,不仅耗时费力且产品满足不了试剂盒生产和质检的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达浓度高、表达量大、蛋白产量高、表达量和产量稳定、生产周期短且成本低的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法及其应用。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,所述的方法包括:
S101菌种培养:
重组大肠埃希杆菌BL21菌种涂板于LB平板,35~40℃培养过夜;
挑取培养平板上的单菌落于10mL LB液体培养基37℃,培养10~12h,得一级种子;
一级种子按1~3%接种量(V:V)接种于液体LB培养基中,37.0℃,培养10~12h,得二级种子;
S102接种:
二级种子按接种量(V:V)3~7%接种于发酵罐培养基中;
S103扩繁:
接种后的发酵罐调节温度35~40℃,转速300~600rpm,pH为7.0,溶氧量25~35%,培养4~6h;
S104诱导表达:
扩繁后的发酵罐中加入诱导剂,35~40℃,培养4~6h;
S105破碎离心:
诱导表达结束后,发酵罐中的菌液进行细胞破碎,破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min,上清液过滤后干燥,即得禽白血病P27蛋白。
进一步的,所述的重组大肠埃希杆菌BL21为重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)-pET-30a-p27。
进一步的,所述的发酵罐培养基的组成为:1%酵母粉、1%胰蛋白胨、1%甘油、0.4%KH2PO4、0.2%K2HPO4、0.7%Na2HPO4·12H2O、0.1%MgSO4、0.3%NH4Cl、0.02%1000×微量元素混合液。
进一步的,所述的1000×微量元素混合液为1M CaCl2 2ml、1M MnSO4 1ml、1MZnCl2 1ml、0.2M CoCl2 1ml、0.1M CuSO4 2ml、0.2M NiSO4 1ml、0.1M Na2MoO4 2ml、0.1MNa2SeO3 2ml、0.1M H3BO3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl350ml混合即得。
进一步的,所述的诱导剂为IPTG,其在发酵液中的终浓度为0.8~1.2mmol/L。
进一步的,所述的步骤S103扩繁中,菌种培养至2h流加补料培养基一,流加速度为3mL/min,连续流加至培养结束;
所述的补料培养基一为10~30%的甘油。
进一步的,所述的步骤S103扩繁中,菌种培养至3.5~4h流加补料培养基二,流加速度为3mL/min,连续流加至培养结束;
所述的补料培养基二的组成为10~30%蛋白胨和10~30%酵母粉。
本发明还提供另外一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法。
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,所述的方法包括:
S201菌种培养:
重组大肠埃希杆菌BL21为重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)-pET-30a-p27菌种涂板于LB平板,35~40℃培养过夜;
挑取培养平板上的单菌落于LB液体培养基35~40℃摇床培养过夜;
摇床培养液按1%接种量(V:V)接种于LB液体培养基,35~40℃,200r/min培养4h,得种子液;
S202扩繁:
种子液按接种量(V:V)3~7%接种于LB液体培养基中,振荡培养至OD600nm值为0.6-0.8;
S203诱导表达:
向扩繁液中加入终浓度为0.8~1.2mmol/L的IPTG诱导剂,调节pH至6.8~7.2,35~40℃培养诱导表达4~6h;
S204破碎离心:
诱导表达结束后,菌液进行细胞破碎,破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min,上清液过滤后干燥,即得禽白血病P27蛋白。
进一步的,所述的LB平板、LB培养基和发酵罐培养基含有硫酸卡那霉素,硫酸卡那霉素在培养基/培养液中的终浓度为0.5g/L。
本发明还提供一种高效表达禽白血病P27蛋白方法的应用。
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,用于高效表达禽白血病P27蛋白。
本发明还提供另一种高效表达禽白血病P27蛋白方法的应用。
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,用于禽白血病检测试剂盒研发、生产和质检。
本发明提供的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法利用重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)-pET-30a-p27作为菌种,建立了表达P27蛋白的重组大肠杆菌高密度表达的培养工艺,并对表达产物进行了亲和层系纯化,成功制备了P27蛋白。在高密度发酵阶段,菌体密度的大小直接影响最终目的产物的产量,因为菌体生长期累计的菌体量越高,到达诱导期后,单位体积内具有表达目的的外源蛋白的细胞就越多,使得外源蛋白的产量比低菌体量时会有显著提高。使用甘油作为碳源以减少副产物乙酸对发酵过程产生的不利影响。
本发明提供的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法在发酵罐中实现了重组大肠杆菌的高密度培养,培养过程中菌体密度达到109g/L以上,是摇瓶培养的70倍以上。
本发明提供的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,在菌体量己达到一定水平后(发酵4~6h),为了有利于细胞内目的蛋白的高效表达,控制菌体的生长,使得菌体量保持在一个相对恒定的范围内,并添加诱导剂。诱导时间的长短是影响诱导期蛋白产量的最主要的因素,诱导时间过短,蛋白的表达不完全,蛋白的积累量低;诱导时间过长,由于细胞中蛋白酶的存在,会使可溶性目的蛋白降解,最终目的蛋白含量下降,所以适宜的诱导时间是获得最高蛋白产量的关键。本发明提供的方法可溶性目的蛋白(禽白血病P27蛋白)的含量高,批次产量较摇瓶培养阶段提高了200倍以上。
本发明提供的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,使用发酵罐,用基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)-P27株实现了禽白血病P27蛋白的高效表达,菌体密度达到≥109g/L;禽白血病P27蛋白表达量≥30%;禽白血病P27蛋白表达浓度≥1000mg/L。将制备的蛋白用于试剂盒的生产和检验,提高试剂盒的稳定性。解决了禽白血病试剂盒生产过程中对P27蛋白产量、质量及稳定性的要求。
利用摇床三角瓶制备重组大肠杆菌表达的目的产物时,所得的蛋白产量低,制备时间长,很难实现规模化生产。本发明提供的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,能够大大提高菌体的发酵密度,进而提高比生产率,缩短生产周期,降低生产成本,顺应了生物制品行业的工业化生产需求。本发明提供的方法,发酵罐培养基中以甘油作为碳源,减少了代谢产物乙酸对菌体生长的影响,发酵罐培养基中有较为稳定的pH缓冲系统,并补充了适当的铵盐及微量元素,P和S用于合成细胞中的核蛋白类、蛋白质、维生素和类脂。P又起着能量调节作用。金属元素有Ca、Mg、Fe、Cu、Co、Mn等,都是合成一些重要酶类的组成成分。Mg、K对核酸、核糖体和细胞膜起稳定作用,Mg还能控制细胞膜的透性和细胞质的胶体特性,能影响蛋白质的合成。发酵罐培养基中提供了十余种微量元素以供细菌发酵和蛋白质合成。发酵罐培养基经通气搅拌培养,使用两步补料的培养策略,实现了P27蛋白的高效表达。
与现有技术相比,本发明提供的一种一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法及其应用的优点:
(1)禽白血病P27蛋白表达浓度高、表达量大。
(2)禽白血病P27蛋白产量高、表达量和产量稳定。
(3)生产周期短且成本低,生产效率高。
(4)稳定性和重复性好,适于规模化生产。
附图说明
图1是本发明实施例2禽白血病P27蛋白诱导表达SDS凝胶电泳试验结果。
图2是本发明实施例3禽白血病P27蛋白诱导表达SDS凝胶电泳试验结果。
图3是本发明实施例4禽白血病P27蛋白诱导表达SDS凝胶电泳试验结果。
图1、图2和图3中,M:Maker;1:实施例2诱导前;2:实施例2诱导后;3:实施例3诱导前;4:实施例3诱导后;5:实施例4诱导前;6:实施例4诱导后。
图4是本发明发酵罐(实施例4)和摇床制备(实施例1)的禽白血病P27蛋白比较SDS凝胶电泳试验结果。
图4中,1:摇床制备P27诱导前10倍浓缩;2:摇床制备P27诱导后10倍浓缩;M:Marker;3:发酵罐制备P27诱导前原倍;4:发酵罐制备P27诱导后原倍。
图5为本发明提供的发酵罐(实施例2)和摇床制备(实施例1)的禽白血病P27蛋白纯化SDS凝胶电泳试验结果。
图6为本发明提供的发酵罐(实施例3)和摇床制备(实施例1)的禽白血病P27蛋白纯化SDS凝胶电泳试验结果。
图7为本发明提供的发酵罐(实施例4)和摇床制备(实施例1)的禽白血病P27蛋白纯化SDS凝胶电泳试验结果。
图5、图6和图7中,M:Maker;1:实施例2批次制备纯化后P27蛋白;2:摇床制备(实施例1)纯化后P27蛋白;3:实施例3批次制备纯化后P27蛋白;4:摇床制备(实施例1)纯化后P27蛋白;5:实施例4批次制备纯化后P27蛋白;6:摇床制备(实施例1)纯化后P27蛋白。
具体实施方式
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,以下实施例对本发明的作进一步详细描述,以下实施例仅用于说明发明,但不用来限制本发明的范围。
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,所述的方法包括:
S101菌种培养:
重组大肠埃希杆菌BL21菌种涂板于LB平板,35~40℃培养过夜;
挑取培养平板上的单菌落于10mL LB液体培养基37℃,培养10~12h,得一级种子;
一级种子按1~3%接种量(V:V)接种于液体LB培养基中,37.0℃,培养10~12h,得二级种子;
S102接种:
二级种子按接种量(V:V)3~7%接种于发酵罐培养基中;
S103扩繁:
接种后的发酵罐调节温度35~40℃,转速300~600rpm,pH为7.0,溶氧量25~35%,培养4~6h;
S104诱导表达:
扩繁后的发酵罐中加入诱导剂,35~40℃,培养4~6h;
S105破碎离心:
诱导表达结束后,发酵罐中的菌液进行细胞破碎,破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min,上清液过滤后干燥,即得禽白血病P27蛋白。
进一步的,所述的重组大肠埃希杆菌BL21为重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)-pET-30a-p27。
进一步的,所述的发酵罐培养基的组成为:1%酵母粉、1%胰蛋白胨、1%甘油、0.4%KH2PO4、0.2%K2HPO4、0.7%Na2HPO4·12H2O、0.1%MgSO4、0.3%NH4Cl、0.02%1000×微量元素混合液。
进一步的,所述的1000×微量元素混合液为1M CaCl2 2ml、1M MnSO4 1ml、1MZnCl2 1ml、0.2M CoCl2 1ml、0.1M CuSO4 2ml、0.2M NiSO4 1ml、0.1M Na2MoO4 2ml、0.1MNa2SeO3 2ml、0.1M H3BO3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl350ml混合即得。
进一步的,所述的诱导剂为IPTG,其在发酵液中的终浓度为0.8~1.2mmol/L。
进一步的,所述的步骤S103扩繁中,菌种培养至2h流加补料培养基一,流加速度为3mL/min,连续流加至培养结束;
所述的补料培养基一为10~30%的甘油。
进一步的,所述的步骤S103扩繁中,菌种培养至3.5~4h流加补料培养基二,流加速度为3mL/min,连续流加至培养结束;
所述的补料培养基二的组成为10~30%蛋白胨和10~30%酵母粉。
本发明还提供另外一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法。
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,所述的方法包括:
S201菌种培养:
重组大肠埃希杆菌BL21为重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)-pET-30a-p27菌种涂板于LB平板,35~40℃培养过夜;
挑取培养平板上的单菌落于LB液体培养基35~40℃摇床培养过夜;
摇床培养液按1%接种量(V:V)接种于LB液体培养基,35~40℃,200r/min培养4h,得种子液;
S202扩繁:
种子液按接种量(V:V)3~7%接种于LB液体培养基中,振荡培养至OD600nm值为0.6-0.8;
S203诱导表达:
向扩繁液中加入终浓度为0.8~1.2mmol/L的IPTG诱导剂,调节pH至6.8~7.2,35~40℃培养诱导表达4~6h;
S204破碎离心:
诱导表达结束后,菌液进行细胞破碎,破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min,上清液过滤后干燥,即得禽白血病P27蛋白。
进一步的,所述的LB平板、LB培养基和发酵罐培养基含有硫酸卡那霉素,硫酸卡那霉素在培养基/培养液中的终浓度为0.5g/L。
本发明还提供一种高效表达禽白血病P27蛋白方法的应用。
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,用于高效表达禽白血病P27蛋白。
本发明还提供另一种高效表达禽白血病P27蛋白方法的应用。
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,用于禽白血病检测试剂盒研发、生产和质检。
实施例1
摇床培养诱导重组大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-30a-p27
菌种培养:取一支-80℃保存的BL21(DE3)-pET-30a-p27甘油菌种,用接种环蘸取菌种在LB平板上四区划线,37℃培养过夜;
一级种子液制备:取培养过夜的单克隆于5ml的液体LB试管中,37.0℃、150r/min培养12h作为一级种子;
二级种子制备:将培养的一级种子5ml接入500ml液体LB培养基中,37.0℃、150r/min培养12h作为二级种子。
摇床诱导表达:
菌种的繁殖:取一级种子液10ml分别接种于两个1000ml LB液体培养基中,以220r/min振荡培养至OD600nm值为0.6~0.8。
诱导:向菌液中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导剂(诱导剂终浓度为1mmol/L),置37℃、220r/min培养诱导表达5小时。
菌体收获:收集诱导后菌液。
实施例2
发酵罐培养诱导重组大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-30a-p27
S101菌种培养:
菌种培养:取一支-80℃保存的BL21(DE3)-pET-30a-p27甘油菌种,用接种环蘸取菌种在LB平板上四区划线,37℃培养过夜;
一级种子液制备:取培养过夜的单克隆于5ml的液体LB试管中,37.0℃、150r/min培养10h作为一级种子;
二级种子制备:将培养的一级种子5ml接入500ml液体LB培养基中,37.0℃、150r/min培养10h作为二级种子。
S102接种:
PH电极校准:将pH电极用纯化水清洗,滤纸擦干放入pH为6.86的缓冲液中进行标定,取出pH电极用纯化水清洗滤纸吸干水分然后放入到pH为4.01的缓冲液中进行零点标定。DO电极校准:溶氧电极极化完后用纯化水洗净,擦拭干净然后加入到饱和的亚硫酸钠溶液中,待溶氧显示数值在1%时进行零点标定。BIOSTAT C生物反应器和发酵培养基的灭菌:加入发酵培养基后,打开安全阀,关闭空气加热套的冷凝水开关,调节泡沫高度电极位置。设定灭菌温度为121℃、灭菌时间20min以及发酵温度37℃。所述的发酵罐培养基的组成为:1%酵母粉、1%胰蛋白胨、1%甘油、0.4%KH2PO4、0.2%K2HPO4、0.7%Na2HPO4·12H2O、0.1%MgSO4、0.3%NH4Cl、0.02%1000×微量元素混合液。所述的1000×微量元素混合液为1MCaCl2 2ml、1M MnSO4 1ml、1M ZnCl2 1ml、0.2M CoCl2 1ml、0.1M CuSO4 2ml、0.2M NiSO41ml、0.1M Na2MoO4 2ml、0.1M Na2SeO3 2ml、0.1M H3BO3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl3 50ml混合即得。二级种子按接种量(V:V)3%接种于发酵罐培养基中。
S103扩繁:
接种后的发酵罐调节温度35℃,转速300rpm,pH为7.0,溶氧量25%,培养6h;
菌种培养至2h流加补料培养基一,流加速度为3mL/min,连续流加至培养结束;补料培养基一为10%的甘油;
菌种培养至3.5h流加补料培养基二,流加速度为3mL/min,连续流加至培养结束;补料培养基二的组成为10%蛋白胨和30%酵母粉。
S104诱导表达:
向培养基中加入终浓度为1mmol/L的IPTG,35℃,继续培养6h。
S105破碎离心:
诱导表达结束后,发酵罐中的菌液进行细胞破碎,破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min,上清液过滤后干燥,即得禽白血病P27蛋白。
实施例3
发酵罐培养诱导重组大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-30a-p27
S101菌种培养:
菌种培养:取一支-80℃保存的BL21(DE3)-pET-30a-p27甘油菌种,用接种环蘸取菌种在LB平板上四区划线,37℃培养过夜;
一级种子液制备:取培养过夜的单克隆于5ml的液体LB试管中,37.0℃、150r/min培养12h作为一级种子;
二级种子制备:将培养的一级种子5ml接入500ml液体LB培养基中,37.0℃、150r/min培养12h作为二级种子。
S102接种:
PH电极校准:将pH电极用纯化水清洗,滤纸擦干放入pH为6.86的缓冲液中进行标定,取出pH电极用纯化水清洗滤纸吸干水分然后放入到pH为4.01的缓冲液中进行零点标定。DO电极校准:溶氧电极极化完后用纯化水洗净,擦拭干净然后加入到饱和的亚硫酸钠溶液中,待溶氧显示数值在1%时进行零点标定。BIOSTAT C生物反应器和发酵培养基的灭菌:加入发酵培养基后,打开安全阀,关闭空气加热套的冷凝水开关,调节泡沫高度电极位置。设定灭菌温度为121℃、灭菌时间20min以及发酵温度37℃。所述的发酵罐培养基的组成为:1%酵母粉、1%胰蛋白胨、1%甘油、0.4%KH2PO4、0.2%K2HPO4、0.7%Na2HPO4·12H2O、0.1%MgSO4、0.3%NH4Cl、0.02%1000×微量元素混合液。所述的1000×微量元素混合液为1MCaCl2 2ml、1M MnSO4 1ml、1M ZnCl2 1ml、0.2M CoCl2 1ml、0.1M CuSO4 2ml、0.2M NiSO41ml、0.1M Na2MoO4 2ml、0.1M Na2SeO3 2ml、0.1M H3BO3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl3 50ml混合即得。
二级种子按接种量(V:V)7%接种于发酵罐培养基中;
S103扩繁:
接种后的发酵罐调节温度40℃,转速600rpm,pH为7.0,溶氧量35%,培养4h;
菌种培养至2h流加补料培养基一,流加速度为3mL/min,连续流加至培养结束;补料培养基一为30%的甘油;
菌种培养至3.5h流加补料培养基二,流加速度为3mL/min,连续流加至培养结束;补料培养基二的组成为30%蛋白胨和10%酵母粉。
S104诱导表达:
向培养基中加入终浓度为1mmol/L的IPTG,40℃,继续培养4h。
S105破碎离心:
诱导表达结束后,发酵罐中的菌液进行细胞破碎,破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min,上清液过滤后干燥,即得禽白血病P27蛋白。
实施例4
发酵罐培养诱导重组大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-30a-p27
S101菌种培养:
菌种培养:取一支-80℃保存的BL21(DE3)-pET-30a-p27甘油菌种,用接种环蘸取菌种在LB平板上四区划线,37℃培养过夜;
一级种子液制备:取培养过夜的单克隆于5ml的液体LB试管中,37.0℃、150r/min培养11h作为一级种子;
二级种子制备:将培养的一级种子5ml接入500ml液体LB培养基中,37.0℃、150r/min培养11h作为二级种子。
S102接种:
PH电极校准:将pH电极用纯化水清洗,滤纸擦干放入pH为6.86的缓冲液中进行标定,取出pH电极用纯化水清洗滤纸吸干水分然后放入到pH为4.01的缓冲液中进行零点标定。DO电极校准:溶氧电极极化完后用纯化水洗净,擦拭干净然后加入到饱和的亚硫酸钠溶液中,待溶氧显示数值在1%时进行零点标定。BIOSTAT C生物反应器和发酵培养基的灭菌:加入发酵培养基后,打开安全阀,关闭空气加热套的冷凝水开关,调节泡沫高度电极位置。设定灭菌温度为121℃、灭菌时间20min以及发酵温度37℃。所述的发酵罐培养基的组成为:1%酵母粉、1%胰蛋白胨、1%甘油、0.4%KH2PO4、0.2%K2HPO4、0.7%Na2HPO4·12H2O、0.1%MgSO4、0.3%NH4Cl、0.02%1000×微量元素混合液。所述的1000×微量元素混合液为1MCaCl2 2ml、1M MnSO4 1ml、1M ZnCl2 1ml、0.2M CoCl2 1ml、0.1M CuSO4 2ml、0.2M NiSO41ml、0.1M Na2MoO4 2ml、0.1M Na2SeO3 2ml、0.1M H3BO3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl3 50ml混合即得。
二级种子按接种量(V:V)5%接种于发酵罐培养基中;
S103扩繁:
接种后的发酵罐调节温度37℃,转速450rpm,pH为7.0,溶氧量30%,培养5h;
菌种培养至2h流加补料培养基一,流加速度为3mL/min,连续流加至培养结束;补料培养基一为20%的甘油;
菌种培养至4h流加补料培养基二,流加速度为3mL/min,连续流加至培养结束;补料培养基二的组成为20%蛋白胨和20%酵母粉。
S104诱导表达:
向培养基中加入终浓度为1mmol/L的IPTG,37℃,继续培养5h。
S105破碎离心:
诱导表达结束后,发酵罐中的菌液进行细胞破碎,破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min,上清液过滤后干燥,即得禽白血病P27蛋白。
实施例5
发酵罐发酵培养基对比试验
对LB培养基、TB培养基、2×YT培养基、SOB培养基、本发明提供的发酵罐培养基进行效果对比。所述各培养基组成如下:
LB培养基:0.5%酵母粉、1%蛋白胨、0.5%NaCl。
TB培养基:1.2%蛋白胨,2.4%酵母提取物,0.4%甘油,0.231%磷酸二氢钾,1.254%磷酸氢二钾。
2YT培养基:1.6%蛋白胨,1%酵母提取物,0.5%氯化钠。
SOB培养基:1%250mmol/L氯化钾,0.05%2mol/L氯化镁,2%胰蛋白胨,0.5%酵母提取物,0.05%氯化钠。
发酵罐培养基:1%酵母粉、1%胰蛋白胨、1%甘油、0.4%KH2PO4、0.2%K2HPO4、0.7%Na2HPO4·12H2O、0.1%MgSO4、0.3%NH4Cl、0.02%1000×微量元素混合液。
1000×微量元素混合液为1M CaCl2 2ml、1M MnSO4 1ml、1M ZnCl2 1ml、0.2MCoCl2 1ml、0.1M CuSO4 2ml、0.2M NiSO4 1ml、0.1M Na2MoO4 2ml、0.1M Na2SeO3 2ml、0.1MH3BO3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl3 50ml混合即得。
称量7L培养基所需成分溶于双蒸水中,培养基溶解后流加到15L发酵罐,并加入7mL泡敌,按发酵罐的操作规程对罐体、管路和培养基进行灭菌操作,待灭菌结束后温度降至37℃使用火焰灭菌法在火焰圈下加入500mL种子液和7mL硫酸卡那霉素,通过调整发酵罐转速和通气量维持溶氧量为30%以上,最大转速不超过700r/min,全程自动流加3mol/L氨水调节pH7.0,自动流加消泡剂,培养温度为37℃,发酵至4h加入浓度为1mmol/L的IPTG,诱导表达4h,结束发酵。测定菌体湿重和P27蛋白的表达量,平行重复3次试验。结果见表1。
表1重组P27蛋白大肠杆菌在不同培养基中的菌体湿重及P27蛋白表达量
由表1可知,TB培养基、2YT培养基和本发明提供的发酵罐培养基均与LB培养基的菌体湿重和P27表达量呈显著性差异(P<0.05),结果表明使用本发明提供的发酵罐培养基发酵获得的P27蛋白产量最高。
实施例6
P27蛋白诱导表达结果
对发酵罐诱导的三个实施例重组大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-30a-p27株诱导收获的菌液离心收集菌体(实施例2、实施例3、实施例4)用等体积PBS溶解后加入1/4体积上样buffer混合后煮沸10分钟,离心后进行SDS-PAGE凝胶电泳试验,结果表明三批次实验室试制均能诱导产生37kDa的P27蛋白,结果详见图1~图3。目标蛋白表达量菌超过30%,收集的全部菌液离心后菌泥称重,分装菌体于-20℃保存,结果详见表2。
表2重组大肠埃希氏菌pET-30a-P27-BL21(DE3)株诱导收获的菌体(实施例2、实施例3、实施例4)湿重
批次 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 |
菌体湿重(g) | 1300 | 1297 | 1255 |
对摇床诱导(实施例1)的重组大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-30a-p27株诱导收获的菌液10倍浓缩后进行SDS-PAGE凝胶电泳试验,与发酵罐(实施例4)诱导重组大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-30a-p27株收获的菌液原倍相比,均能诱导产生37kDa的P27蛋白,单位体积发酵罐诱导产生的P27蛋白明显高于摇瓶10倍以上,详见图4。
实施例7
禽白血病P27蛋白纯化
1、液压破碎菌体
分别取实施2~4发酵罐制备的和实施例1摇床诱导表达的P27菌液,5000g离心20min离心后菌体用平衡液重悬,调节液压破碎仪压力为0.8bar,开始破碎并收集破碎菌液。将破碎好的菌液4℃、12000rpm/min离心40min,上清用0.45μm滤器过滤,收集液体准备上样。
2、Ni Focurose FF(IMAC)填料装填HK26/20型号空柱
柱子使用前需先用20%乙醇润洗。
用注射器装满20%乙醇,连接底部,注入乙醇,排出空气,让乙醇停留在滤网上,将底部与柱子连接。
柱子用柱夹固定,向柱中加入20%乙醇或者纯水至几厘米高度。
将装柱器连接在空柱上,确保柱子没有倾斜。
装柱前设好报警压0.3MPa。
将填料一次性贴壁加入装柱器中,用装柱液冲洗管壁,并补齐液面至装柱器顶部,盖上上方顶盖。
点击Pump Wash A,排出设备及管路中空气。
在柱底部放废液缸,拧开底部堵头。
将顶部与管路连接;设流速为5ml/min,开始装柱;随着压力增加,填料不断被压实,稳定,稳定后标记液面位置,停止流速,将柱底用堵头堵住,将管路与装柱器断开;拆下装柱器;在柱头滴入适量装柱和缓冲液,补齐柱头液面;用注射器连接顶端适配器,推入20%乙醇,排除顶端适配器的空气让乙醇停留在柱网上;将适配器倾斜45°角,对准液面,向下盖紧,将溢出的液体吸走拧紧至胶面,此时液体会从柱头排出,将适配器拧到标记线下2~3cm处,将上端黑色螺纹拧至最紧。
重新将上端管路连接至机器;打开底部堵头,继续运行流速,如果胶面改变,需重新调整;如暂时不用,填装20%乙醇,先下后上拆卸用堵头封闭,柱子装填完毕。
3、AKTA层析系统纯化P27蛋白
运行系统:启动AKTA pure仪器,进入Unicorn7.0系统。
洗泵:运行Pumps wash程序清洗管道,排除管道气泡。
设置系统参数:设置柱压为0.3Mpa,设置流速为5mL/min。
装柱:采用液滴对液滴的方式将Ni Focurose FF连接到层析系统上。
平衡:用5-10CV缓冲液A以5.0ml/min平衡介质,直至基线平稳。
上样:以5.0ml/min速度将HK26/20柱处理的样品上样。出液口收集流穿液。
洗杂:以5.0ml/min流速设置2%浓度的缓冲液B洗脱杂蛋白,清洗直至基线为零。出液口收集洗杂液。
洗脱:设置50%浓度的缓冲液B洗脱目的蛋白,根据UV吸收峰值收集洗脱蛋白样品,并收集紫外峰值的洗脱液。
纯化结果验证:取各流穿液加入1/4体积的5×SDS-PAGE Loading Buffer,煮沸裂解10min,冰浴2min,12,000rpm离心10min,取上清进行SDS-PAGE蛋白质电泳鉴定。
通过AKTA蛋白质层析纯化系统过Ni Focurose FF(IMAC)层析柱对发酵罐的三批(实施例2、实施例3、实施例4)禽白血病P27蛋白和和摇床制备(实施例1)的禽白血病P27蛋白进行纯化,纯化收集的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳,结果表明,用50%缓冲液B收集吸收峰处的蛋白均为目的蛋白,约37kD,详见图5~7。
经BCA试剂盒测得实施例2禽白血病P27蛋白批次产量为11000mg;实施例3禽白血病P27蛋白产量为12000mg;实施例4禽白血病P27蛋白产量为10900mg;实施例1产量为80mg。使用发酵罐高效表达的禽白血病P27蛋白的批次产量是使用传统摇床批次产量的100倍以上。
以上结果说明:用发酵罐高效表达禽白血病P27蛋白的稳定性和重复性较好,最终菌体密度达到109g/L以上,目的蛋白表达量30%以上,表达浓度达到1000mg/L,纯化蛋白产量达到10g/批次以上。发酵产量大幅提高。为后续生产工艺控制提供了理论与技术支持,并对禽白血病P27蛋白的大规模发酵生产和推广具有重要的技术指导意义。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种变换,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (12)
1.一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,其特征在于,所述的方法包括:
S101菌种培养:
重组大肠埃希杆菌BL21菌种培养得二级种子;
S102接种:
二级种子接种于发酵罐培养基中;
S103扩繁:
接种后的发酵罐调节温度35~40℃,转速300~600rpm,溶氧量25~35%,培养4~6h;
S104诱导表达:
扩繁后的发酵罐中加入诱导剂,35~40℃,培养4~6h;
S105破碎离心:
得禽白血病P27蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,其特征在于:所述的重组大肠埃希杆菌BL21为重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)-pET-30a-p27。
3.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,其特征在于,所述的发酵罐培养基的组成为:1%酵母粉、1%胰蛋白胨、1%甘油、0.4%KH2PO4、0.2%K2HPO4、0.7%Na2HPO4·12H2O、0.1%MgSO4、0.3%NH4Cl、0.02%1000×微量元素混合液。
4.根据权利要求3所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,其特征在于:所述的1000×微量元素混合液为1M CaCl2 2ml、1M MnSO4 1ml、1MZnCl2 1ml、0.2M CoCl2 1ml、0.1M CuSO4 2ml、0.2M NiSO4 1ml、0.1M Na2MoO42ml、0.1M Na2SeO3 2ml、0.1M H3BO3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl3 50ml混合即得。
5.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,其特征在于:所述的诱导剂为IPTG,其在发酵液中的终浓度为0.8~1.2mmol/L。
6.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,其特征在于:所述方法包括:
S101菌种培养:
重组大肠埃希杆菌BL21菌种涂板于LB平板,35~40℃培养过夜;
挑取培养平板上的单菌落于10mL LB液体培养基37℃,培养10~12h,得一级种子;
一级种子按1~3%接种量(V:V)接种于液体LB培养基中,37.0℃,培养10~12h,得二级种子;
S102接种:
二级种子按接种量(V:V)3~7%接种于发酵罐培养基中;
S103扩繁:
接种后的发酵罐调节温度35~40℃,转速300~600rpm,pH为7.0,溶氧量25~35%,培养4~6h;
S104诱导表达:
扩繁后的发酵罐中加入诱导剂,35~40℃,培养4~6h;
S105破碎离心:
诱导表达结束后,发酵罐中的菌液进行细胞破碎,破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min,上清液过滤后干燥,即得禽白血病P27蛋白。
7.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,所述的步骤S103扩繁中,菌种培养至2h流加补料培养基一,流加速度为3mL/min,连续流加至培养结束;
所述的补料培养基一为10~30%的甘油。
8.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法,其特征在于:所述的步骤S103扩繁中,菌种培养至3.5~4h流加补料培养基二,流加速度为3mL/min,连续流加至培养结束;
所述的补料培养基二的组成为10~30%蛋白胨和10~30%酵母粉。
9.一种高效表达禽白血病P27蛋白的发酵罐培养基,所述的发酵罐培养基的组成为:2-5%酵母粉、2-5%胰蛋白胨、2-5%甘油、0.1-0.8%KH2PO4、0.1-0.7%K2HPO4、0.2-1.5%Na2HPO4·12H2O、0.01-0.8%MgSO4、0.1-0.7%NH4Cl、0.00.1-0.07%1000×微量元素混合液。
10.如权利要求9的发酵罐培养基,所述的发酵罐培养基的组成为:1%酵母粉、1%胰蛋白胨、1%甘油、0.4%KH2PO4、0.2%K2HPO4、0.7%Na2HPO4·12H2O、0.1%MgSO4、0.3%NH4Cl、0.02%1000×微量元素混合液。
11.如权利要求9-10所述发酵罐培养基,所述的1000×微量元素混合液为1M CaCl22ml、1M MnSO4 1ml、1M ZnCl2 1ml、0.2M CoCl2 1ml、0.1M CuSO42ml、0.2M NiSO4 1ml、0.1M Na2MoO4 2ml、0.1M Na2SeO3 2ml、0.1M H3BO32ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl3 50ml混合即得。
12.一种由权利要求1-8所述方法制备的禽白血病P27蛋白。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210215990.5A CN114456997B (zh) | 2022-03-07 | 2022-03-07 | 一种高效表达禽白血病p27蛋白的方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210215990.5A CN114456997B (zh) | 2022-03-07 | 2022-03-07 | 一种高效表达禽白血病p27蛋白的方法及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114456997A true CN114456997A (zh) | 2022-05-10 |
CN114456997B CN114456997B (zh) | 2024-05-28 |
Family
ID=81418173
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210215990.5A Active CN114456997B (zh) | 2022-03-07 | 2022-03-07 | 一种高效表达禽白血病p27蛋白的方法及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114456997B (zh) |
Citations (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0107525D0 (en) * | 2001-03-26 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Culture medium |
KR20020016163A (ko) * | 2000-08-24 | 2002-03-04 | 정수련 | 어위니아 라폰티치 유래 유전자를 통한 이소말툴로스합성효소의 발현 생산방법 |
CN103243077A (zh) * | 2013-05-03 | 2013-08-14 | 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 | 一种禽白血病p27单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 |
CN103589769A (zh) * | 2013-10-29 | 2014-02-19 | 王明丽 | 一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法 |
CN107815446A (zh) * | 2017-10-16 | 2018-03-20 | 浙江大学 | 一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺 |
CN107937459A (zh) * | 2017-12-06 | 2018-04-20 | 慎东 | 一种可规模化产trim72蛋白的高密度发酵方法 |
CN108949662A (zh) * | 2018-08-10 | 2018-12-07 | 固安鼎泰海规生物科技有限公司 | 一种用于裸质粒pSFVK1-NMM生产的大肠杆菌发酵培养基 |
CN109053867A (zh) * | 2018-08-24 | 2018-12-21 | 艾美汉信疫苗(大连)有限公司 | 一种高密度发酵表达重组轮状病毒δvp8*抗原的培养方法 |
CN109161575A (zh) * | 2018-09-17 | 2019-01-08 | 河南省农业科学院 | 禽法氏囊病毒vp2蛋白的高表达发酵工艺 |
CN110819582A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-02-21 | 华派生物工程集团有限公司 | 大肠杆菌表达口蹄疫病毒样颗粒抗原的发酵培养基及培养方法 |
CN113341140A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-09-03 | 贵州大学 | 一种检测禽白血病p27的间接elisa方法 |
CN113969257A (zh) * | 2020-07-25 | 2022-01-25 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种用于生产甘精胰岛素的培养基 |
-
2022
- 2022-03-07 CN CN202210215990.5A patent/CN114456997B/zh active Active
Patent Citations (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20020016163A (ko) * | 2000-08-24 | 2002-03-04 | 정수련 | 어위니아 라폰티치 유래 유전자를 통한 이소말툴로스합성효소의 발현 생산방법 |
GB0107525D0 (en) * | 2001-03-26 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Culture medium |
CN103243077A (zh) * | 2013-05-03 | 2013-08-14 | 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 | 一种禽白血病p27单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 |
CN103589769A (zh) * | 2013-10-29 | 2014-02-19 | 王明丽 | 一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法 |
CN107815446A (zh) * | 2017-10-16 | 2018-03-20 | 浙江大学 | 一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺 |
CN107937459A (zh) * | 2017-12-06 | 2018-04-20 | 慎东 | 一种可规模化产trim72蛋白的高密度发酵方法 |
CN108949662A (zh) * | 2018-08-10 | 2018-12-07 | 固安鼎泰海规生物科技有限公司 | 一种用于裸质粒pSFVK1-NMM生产的大肠杆菌发酵培养基 |
CN109053867A (zh) * | 2018-08-24 | 2018-12-21 | 艾美汉信疫苗(大连)有限公司 | 一种高密度发酵表达重组轮状病毒δvp8*抗原的培养方法 |
CN109161575A (zh) * | 2018-09-17 | 2019-01-08 | 河南省农业科学院 | 禽法氏囊病毒vp2蛋白的高表达发酵工艺 |
CN110819582A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-02-21 | 华派生物工程集团有限公司 | 大肠杆菌表达口蹄疫病毒样颗粒抗原的发酵培养基及培养方法 |
CN113969257A (zh) * | 2020-07-25 | 2022-01-25 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种用于生产甘精胰岛素的培养基 |
CN113341140A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-09-03 | 贵州大学 | 一种检测禽白血病p27的间接elisa方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114456997B (zh) | 2024-05-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107142225B (zh) | 一种强化表达Streptomyces sp.FA1来源木聚糖酶的毕氏酵母重组菌 | |
CN106459901A (zh) | 发酵体系 | |
CN102617724B (zh) | 一种猪防御素pBD1多肽及其在抑制猪病原菌中应用 | |
CN100357441C (zh) | 重组人神经生长因子的酵母表达系统及制备重组人神经生长因子的方法 | |
CN105543144A (zh) | 一种适用于表达crybb2抗原蛋白的大肠杆菌的培养基及发酵方法和应用 | |
CN108085280A (zh) | 一种高密度发酵醋酸杆菌的方法 | |
CN114456997A (zh) | 一种高效表达禽白血病p27蛋白的方法及其应用 | |
CN109161575A (zh) | 禽法氏囊病毒vp2蛋白的高表达发酵工艺 | |
CN107604036A (zh) | 一种制备β‑胡萝卜素的方法以及β‑胡萝卜素制品 | |
CN111621528B (zh) | 一种生物合成乙醇胺的方法 | |
CN102559730B (zh) | 一种提高cp4-epsps在汉逊酵母中表达量的方法 | |
CN104131021A (zh) | 抗菌肽共表达载体及其构建和表达方法 | |
CN116891808A (zh) | 一种亚细胞结构定位的大麻二酚酸合成酶的酿酒酵母菌株构建方法和应用 | |
Zhang et al. | Alginate lyase of a novel algae fermentation strain | |
US11639515B2 (en) | Genetically engineered strain for producing porcine myoglobin and food-grade fermentation and purification thereof | |
CN116179582A (zh) | 一种通用型基因重组蛋白质a亲和纯化填料制备方法和应用 | |
CN103194481B (zh) | 表达人血清白蛋白的质粒和重组菌以及它们的应用 | |
CN116287040A (zh) | 一种链霉菌-霉菌混合发酵合成ε-聚赖氨酸的工艺 | |
CN107236680A (zh) | 一种表达Streptomyces sp. FA1来源木聚糖酶的毕氏酵母重组菌 | |
CN106995793A (zh) | 一种重组牛粒细胞集落刺激因子工程菌的高密度发酵方法 | |
CN102533841B (zh) | 一种提高Bt杀虫蛋白在汉逊酵母中表达量的方法 | |
CN103194482B (zh) | 一种表达人血清白蛋白的质粒和重组菌以及它们的应用 | |
CN103087934A (zh) | 高产s-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法 | |
CN112210523A (zh) | 一株产阿魏酸酯酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用 | |
CN101948837A (zh) | 在重组大肠杆菌中生产人的类胰岛素生长因子-1的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |