CN114456997A - 一种高效表达禽白血病p27蛋白的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术技术领域，具体涉及一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法及其应用。所述的方法包括：菌种培养、接种、扩繁、诱导表达、破碎离心、干燥，即得禽白血病P27蛋白。本发明提供的优点：禽白血病P27蛋白表达浓度高、表达量大。禽白血病P27蛋白产量高、表达量和产量稳定。生产周期短且成本低，生产效率高。稳定性和重复性好，适于规模化生产。

Description

一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，具体涉及一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法及其应用。
背景技术
禽白血病是一类由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)引起的禽类不同组织良性和恶性肿瘤病的总称。该病毒为反转录病毒科的α反转录病毒属，可分为A～J共10个亚群。ALV主要引起感染鸡在性成熟前后发生肿瘤死亡，感染率和发病死亡率高低不等，死亡率最高可达20％。一些鸡感染后虽不发生肿瘤，但可造成产蛋性能下降甚至免疫抑制。控制此类疾病主要是通过种群净化来切断垂直传播，种鸡群一旦发ALV现阳性，应及时淘汰以阻断水平传播。
P27蛋白是禽白血病病毒重要的蛋白，是禽白血病检测试剂盒研发、生产和质检的必须材料，通常采用基因工程菌株三角摇瓶小规模表达P27蛋白。表达禽白血病P27蛋白有过很多报道，应用的表达系统有大肠杆菌、杆状病毒表达系统，但是均是小量表达，单位体积一般在300ml～1000ml，表达量在40mg/L左右；表达浓度低；经过纯化后，产量最该仅能达到80mg/批次；并且存在较大的批间差异，每次表达量和产量都不稳定，不仅耗时费力且产品满足不了试剂盒生产和质检的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达浓度高、表达量大、蛋白产量高、表达量和产量稳定、生产周期短且成本低的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，所述的方法包括：
S101菌种培养：
重组大肠埃希杆菌BL21菌种涂板于LB平板，35～40℃培养过夜；
挑取培养平板上的单菌落于10mL LB液体培养基37℃，培养10～12h，得一级种子；
一级种子按1～3％接种量(V：V)接种于液体LB培养基中，37.0℃，培养10～12h，得二级种子；
S102接种：
二级种子按接种量(V：V)3～7％接种于发酵罐培养基中；
S103扩繁：
接种后的发酵罐调节温度35～40℃，转速300～600rpm，pH为7.0，溶氧量25～35％，培养4～6h；
S104诱导表达：
扩繁后的发酵罐中加入诱导剂，35～40℃，培养4～6h；
S105破碎离心：
诱导表达结束后，发酵罐中的菌液进行细胞破碎，破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min，上清液过滤后干燥，即得禽白血病P27蛋白。
进一步的，所述的重组大肠埃希杆菌BL21为重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)-pET-30a-p27。
进一步的，所述的发酵罐培养基的组成为：1％酵母粉、1％胰蛋白胨、1％甘油、0.4％KH2PO4、0.2％K2HPO4、0.7％Na2HPO4·12H2O、0.1％MgSO4、0.3％NH4Cl、0.02％1000×微量元素混合液。
进一步的，所述的1000×微量元素混合液为1M CaCl2 2ml、1M MnSO4 1ml、1MZnCl2 1ml、0.2M CoCl2 1ml、0.1M CuSO4 2ml、0.2M NiSO4 1ml、0.1M Na2MoO4 2ml、0.1MNa2SeO3 2ml、0.1M H3BO3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl350ml混合即得。
进一步的，所述的诱导剂为IPTG，其在发酵液中的终浓度为0.8～1.2mmol/L。
进一步的，所述的步骤S103扩繁中，菌种培养至2h流加补料培养基一，流加速度为3mL/min，连续流加至培养结束；
所述的补料培养基一为10～30％的甘油。
进一步的，所述的步骤S103扩繁中，菌种培养至3.5～4h流加补料培养基二，流加速度为3mL/min，连续流加至培养结束；
所述的补料培养基二的组成为10～30％蛋白胨和10～30％酵母粉。
本发明还提供另外一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法。
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，所述的方法包括：
S201菌种培养：
重组大肠埃希杆菌BL21为重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)-pET-30a-p27菌种涂板于LB平板，35～40℃培养过夜；
挑取培养平板上的单菌落于LB液体培养基35～40℃摇床培养过夜；
摇床培养液按1％接种量(V：V)接种于LB液体培养基，35～40℃，200r/min培养4h，得种子液；
S202扩繁：
种子液按接种量(V：V)3～7％接种于LB液体培养基中，振荡培养至OD600nm值为0.6-0.8；
S203诱导表达：
向扩繁液中加入终浓度为0.8～1.2mmol/L的IPTG诱导剂，调节pH至6.8～7.2，35～40℃培养诱导表达4～6h；
S204破碎离心：
诱导表达结束后，菌液进行细胞破碎，破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min，上清液过滤后干燥，即得禽白血病P27蛋白。
进一步的，所述的LB平板、LB培养基和发酵罐培养基含有硫酸卡那霉素，硫酸卡那霉素在培养基/培养液中的终浓度为0.5g/L。
本发明还提供一种高效表达禽白血病P27蛋白方法的应用。
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，用于高效表达禽白血病P27蛋白。
本发明还提供另一种高效表达禽白血病P27蛋白方法的应用。
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，用于禽白血病检测试剂盒研发、生产和质检。
本发明提供的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法利用重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)-pET-30a-p27作为菌种，建立了表达P27蛋白的重组大肠杆菌高密度表达的培养工艺，并对表达产物进行了亲和层系纯化，成功制备了P27蛋白。在高密度发酵阶段，菌体密度的大小直接影响最终目的产物的产量，因为菌体生长期累计的菌体量越高，到达诱导期后，单位体积内具有表达目的的外源蛋白的细胞就越多，使得外源蛋白的产量比低菌体量时会有显著提高。使用甘油作为碳源以减少副产物乙酸对发酵过程产生的不利影响。
本发明提供的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法在发酵罐中实现了重组大肠杆菌的高密度培养，培养过程中菌体密度达到109g/L以上，是摇瓶培养的70倍以上。
本发明提供的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，在菌体量己达到一定水平后(发酵4～6h)，为了有利于细胞内目的蛋白的高效表达，控制菌体的生长，使得菌体量保持在一个相对恒定的范围内，并添加诱导剂。诱导时间的长短是影响诱导期蛋白产量的最主要的因素，诱导时间过短，蛋白的表达不完全，蛋白的积累量低；诱导时间过长，由于细胞中蛋白酶的存在，会使可溶性目的蛋白降解，最终目的蛋白含量下降，所以适宜的诱导时间是获得最高蛋白产量的关键。本发明提供的方法可溶性目的蛋白(禽白血病P27蛋白)的含量高，批次产量较摇瓶培养阶段提高了200倍以上。
本发明提供的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，使用发酵罐，用基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)-P27株实现了禽白血病P27蛋白的高效表达，菌体密度达到≥109g/L；禽白血病P27蛋白表达量≥30％；禽白血病P27蛋白表达浓度≥1000mg/L。将制备的蛋白用于试剂盒的生产和检验，提高试剂盒的稳定性。解决了禽白血病试剂盒生产过程中对P27蛋白产量、质量及稳定性的要求。
利用摇床三角瓶制备重组大肠杆菌表达的目的产物时，所得的蛋白产量低，制备时间长，很难实现规模化生产。本发明提供的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，能够大大提高菌体的发酵密度，进而提高比生产率，缩短生产周期，降低生产成本，顺应了生物制品行业的工业化生产需求。本发明提供的方法，发酵罐培养基中以甘油作为碳源，减少了代谢产物乙酸对菌体生长的影响，发酵罐培养基中有较为稳定的pH缓冲系统，并补充了适当的铵盐及微量元素，P和S用于合成细胞中的核蛋白类、蛋白质、维生素和类脂。P又起着能量调节作用。金属元素有Ca、Mg、Fe、Cu、Co、Mn等，都是合成一些重要酶类的组成成分。Mg、K对核酸、核糖体和细胞膜起稳定作用，Mg还能控制细胞膜的透性和细胞质的胶体特性，能影响蛋白质的合成。发酵罐培养基中提供了十余种微量元素以供细菌发酵和蛋白质合成。发酵罐培养基经通气搅拌培养，使用两步补料的培养策略，实现了P27蛋白的高效表达。
与现有技术相比，本发明提供的一种一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法及其应用的优点：
(1)禽白血病P27蛋白表达浓度高、表达量大。
(2)禽白血病P27蛋白产量高、表达量和产量稳定。
(3)生产周期短且成本低，生产效率高。
(4)稳定性和重复性好，适于规模化生产。
附图说明
图1是本发明实施例2禽白血病P27蛋白诱导表达SDS凝胶电泳试验结果。
图2是本发明实施例3禽白血病P27蛋白诱导表达SDS凝胶电泳试验结果。
图3是本发明实施例4禽白血病P27蛋白诱导表达SDS凝胶电泳试验结果。
图1、图2和图3中，M：Maker；1：实施例2诱导前；2：实施例2诱导后；3：实施例3诱导前；4：实施例3诱导后；5：实施例4诱导前；6：实施例4诱导后。
图4是本发明发酵罐(实施例4)和摇床制备(实施例1)的禽白血病P27蛋白比较SDS凝胶电泳试验结果。
图4中，1：摇床制备P27诱导前10倍浓缩；2：摇床制备P27诱导后10倍浓缩；M：Marker；3：发酵罐制备P27诱导前原倍；4：发酵罐制备P27诱导后原倍。
图5为本发明提供的发酵罐(实施例2)和摇床制备(实施例1)的禽白血病P27蛋白纯化SDS凝胶电泳试验结果。
图6为本发明提供的发酵罐(实施例3)和摇床制备(实施例1)的禽白血病P27蛋白纯化SDS凝胶电泳试验结果。
图7为本发明提供的发酵罐(实施例4)和摇床制备(实施例1)的禽白血病P27蛋白纯化SDS凝胶电泳试验结果。
图5、图6和图7中，M：Maker；1：实施例2批次制备纯化后P27蛋白；2：摇床制备(实施例1)纯化后P27蛋白；3：实施例3批次制备纯化后P27蛋白；4：摇床制备(实施例1)纯化后P27蛋白；5：实施例4批次制备纯化后P27蛋白；6：摇床制备(实施例1)纯化后P27蛋白。
具体实施方式
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明的作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，所述的方法包括：
S101菌种培养：
重组大肠埃希杆菌BL21菌种涂板于LB平板，35～40℃培养过夜；
挑取培养平板上的单菌落于10mL LB液体培养基37℃，培养10～12h，得一级种子；
一级种子按1～3％接种量(V：V)接种于液体LB培养基中，37.0℃，培养10～12h，得二级种子；
S102接种：
二级种子按接种量(V：V)3～7％接种于发酵罐培养基中；
S103扩繁：
接种后的发酵罐调节温度35～40℃，转速300～600rpm，pH为7.0，溶氧量25～35％，培养4～6h；
S104诱导表达：
扩繁后的发酵罐中加入诱导剂，35～40℃，培养4～6h；
S105破碎离心：
诱导表达结束后，发酵罐中的菌液进行细胞破碎，破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min，上清液过滤后干燥，即得禽白血病P27蛋白。
进一步的，所述的重组大肠埃希杆菌BL21为重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)-pET-30a-p27。
进一步的，所述的发酵罐培养基的组成为：1％酵母粉、1％胰蛋白胨、1％甘油、0.4％KH2PO4、0.2％K2HPO4、0.7％Na2HPO4·12H2O、0.1％MgSO4、0.3％NH4Cl、0.02％1000×微量元素混合液。
进一步的，所述的1000×微量元素混合液为1M CaCl2 2ml、1M MnSO4 1ml、1MZnCl2 1ml、0.2M CoCl2 1ml、0.1M CuSO4 2ml、0.2M NiSO4 1ml、0.1M Na2MoO4 2ml、0.1MNa2SeO3 2ml、0.1M H3BO3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl350ml混合即得。
进一步的，所述的诱导剂为IPTG，其在发酵液中的终浓度为0.8～1.2mmol/L。
进一步的，所述的步骤S103扩繁中，菌种培养至2h流加补料培养基一，流加速度为3mL/min，连续流加至培养结束；
所述的补料培养基一为10～30％的甘油。
进一步的，所述的步骤S103扩繁中，菌种培养至3.5～4h流加补料培养基二，流加速度为3mL/min，连续流加至培养结束；
所述的补料培养基二的组成为10～30％蛋白胨和10～30％酵母粉。
本发明还提供另外一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法。
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，所述的方法包括：
S201菌种培养：
重组大肠埃希杆菌BL21为重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)-pET-30a-p27菌种涂板于LB平板，35～40℃培养过夜；
挑取培养平板上的单菌落于LB液体培养基35～40℃摇床培养过夜；
摇床培养液按1％接种量(V：V)接种于LB液体培养基，35～40℃，200r/min培养4h，得种子液；
S202扩繁：
种子液按接种量(V：V)3～7％接种于LB液体培养基中，振荡培养至OD600nm值为0.6-0.8；
S203诱导表达：
向扩繁液中加入终浓度为0.8～1.2mmol/L的IPTG诱导剂，调节pH至6.8～7.2，35～40℃培养诱导表达4～6h；
S204破碎离心：
诱导表达结束后，菌液进行细胞破碎，破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min，上清液过滤后干燥，即得禽白血病P27蛋白。
进一步的，所述的LB平板、LB培养基和发酵罐培养基含有硫酸卡那霉素，硫酸卡那霉素在培养基/培养液中的终浓度为0.5g/L。
本发明还提供一种高效表达禽白血病P27蛋白方法的应用。
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，用于高效表达禽白血病P27蛋白。
本发明还提供另一种高效表达禽白血病P27蛋白方法的应用。
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，用于禽白血病检测试剂盒研发、生产和质检。
实施例1
摇床培养诱导重组大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-30a-p27
菌种培养：取一支-80℃保存的BL21(DE3)-pET-30a-p27甘油菌种，用接种环蘸取菌种在LB平板上四区划线，37℃培养过夜；
一级种子液制备：取培养过夜的单克隆于5ml的液体LB试管中，37.0℃、150r/min培养12h作为一级种子；
二级种子制备：将培养的一级种子5ml接入500ml液体LB培养基中，37.0℃、150r/min培养12h作为二级种子。
摇床诱导表达：
菌种的繁殖：取一级种子液10ml分别接种于两个1000ml LB液体培养基中，以220r/min振荡培养至OD600nm值为0.6～0.8。
诱导：向菌液中加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导剂(诱导剂终浓度为1mmol/L)，置37℃、220r/min培养诱导表达5小时。
菌体收获：收集诱导后菌液。
实施例2
发酵罐培养诱导重组大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-30a-p27
S101菌种培养：
菌种培养：取一支-80℃保存的BL21(DE3)-pET-30a-p27甘油菌种，用接种环蘸取菌种在LB平板上四区划线，37℃培养过夜；
一级种子液制备：取培养过夜的单克隆于5ml的液体LB试管中，37.0℃、150r/min培养10h作为一级种子；
二级种子制备：将培养的一级种子5ml接入500ml液体LB培养基中，37.0℃、150r/min培养10h作为二级种子。
S102接种：
PH电极校准：将pH电极用纯化水清洗，滤纸擦干放入pH为6.86的缓冲液中进行标定，取出pH电极用纯化水清洗滤纸吸干水分然后放入到pH为4.01的缓冲液中进行零点标定。DO电极校准：溶氧电极极化完后用纯化水洗净，擦拭干净然后加入到饱和的亚硫酸钠溶液中，待溶氧显示数值在1％时进行零点标定。BIOSTAT C生物反应器和发酵培养基的灭菌：加入发酵培养基后，打开安全阀，关闭空气加热套的冷凝水开关，调节泡沫高度电极位置。设定灭菌温度为121℃、灭菌时间20min以及发酵温度37℃。所述的发酵罐培养基的组成为：1％酵母粉、1％胰蛋白胨、1％甘油、0.4％KH2PO4、0.2％K2HPO4、0.7％Na2HPO4·12H2O、0.1％MgSO4、0.3％NH4Cl、0.02％1000×微量元素混合液。所述的1000×微量元素混合液为1MCaCl2 2ml、1M MnSO4 1ml、1M ZnCl2 1ml、0.2M CoCl2 1ml、0.1M CuSO4 2ml、0.2M NiSO41ml、0.1M Na2MoO4 2ml、0.1M Na2SeO3 2ml、0.1M H3BO3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl3 50ml混合即得。二级种子按接种量(V：V)3％接种于发酵罐培养基中。
S103扩繁：
接种后的发酵罐调节温度35℃，转速300rpm，pH为7.0，溶氧量25％，培养6h；
菌种培养至2h流加补料培养基一，流加速度为3mL/min，连续流加至培养结束；补料培养基一为10％的甘油；
菌种培养至3.5h流加补料培养基二，流加速度为3mL/min，连续流加至培养结束；补料培养基二的组成为10％蛋白胨和30％酵母粉。
S104诱导表达：
向培养基中加入终浓度为1mmol/L的IPTG，35℃，继续培养6h。
S105破碎离心：
诱导表达结束后，发酵罐中的菌液进行细胞破碎，破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min，上清液过滤后干燥，即得禽白血病P27蛋白。
实施例3
发酵罐培养诱导重组大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-30a-p27
S101菌种培养：
菌种培养：取一支-80℃保存的BL21(DE3)-pET-30a-p27甘油菌种，用接种环蘸取菌种在LB平板上四区划线，37℃培养过夜；
一级种子液制备：取培养过夜的单克隆于5ml的液体LB试管中，37.0℃、150r/min培养12h作为一级种子；
二级种子制备：将培养的一级种子5ml接入500ml液体LB培养基中，37.0℃、150r/min培养12h作为二级种子。
S102接种：
PH电极校准：将pH电极用纯化水清洗，滤纸擦干放入pH为6.86的缓冲液中进行标定，取出pH电极用纯化水清洗滤纸吸干水分然后放入到pH为4.01的缓冲液中进行零点标定。DO电极校准：溶氧电极极化完后用纯化水洗净，擦拭干净然后加入到饱和的亚硫酸钠溶液中，待溶氧显示数值在1％时进行零点标定。BIOSTAT C生物反应器和发酵培养基的灭菌：加入发酵培养基后，打开安全阀，关闭空气加热套的冷凝水开关，调节泡沫高度电极位置。设定灭菌温度为121℃、灭菌时间20min以及发酵温度37℃。所述的发酵罐培养基的组成为：1％酵母粉、1％胰蛋白胨、1％甘油、0.4％KH2PO4、0.2％K2HPO4、0.7％Na2HPO4·12H2O、0.1％MgSO4、0.3％NH4Cl、0.02％1000×微量元素混合液。所述的1000×微量元素混合液为1MCaCl2 2ml、1M MnSO4 1ml、1M ZnCl2 1ml、0.2M CoCl2 1ml、0.1M CuSO4 2ml、0.2M NiSO41ml、0.1M Na2MoO4 2ml、0.1M Na2SeO3 2ml、0.1M H3BO3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl3 50ml混合即得。
二级种子按接种量(V：V)7％接种于发酵罐培养基中；
S103扩繁：
接种后的发酵罐调节温度40℃，转速600rpm，pH为7.0，溶氧量35％，培养4h；
菌种培养至2h流加补料培养基一，流加速度为3mL/min，连续流加至培养结束；补料培养基一为30％的甘油；
菌种培养至3.5h流加补料培养基二，流加速度为3mL/min，连续流加至培养结束；补料培养基二的组成为30％蛋白胨和10％酵母粉。
S104诱导表达：
向培养基中加入终浓度为1mmol/L的IPTG，40℃，继续培养4h。
S105破碎离心：
诱导表达结束后，发酵罐中的菌液进行细胞破碎，破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min，上清液过滤后干燥，即得禽白血病P27蛋白。
实施例4
发酵罐培养诱导重组大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-30a-p27
S101菌种培养：
菌种培养：取一支-80℃保存的BL21(DE3)-pET-30a-p27甘油菌种，用接种环蘸取菌种在LB平板上四区划线，37℃培养过夜；
一级种子液制备：取培养过夜的单克隆于5ml的液体LB试管中，37.0℃、150r/min培养11h作为一级种子；
二级种子制备：将培养的一级种子5ml接入500ml液体LB培养基中，37.0℃、150r/min培养11h作为二级种子。
S102接种：
PH电极校准：将pH电极用纯化水清洗，滤纸擦干放入pH为6.86的缓冲液中进行标定，取出pH电极用纯化水清洗滤纸吸干水分然后放入到pH为4.01的缓冲液中进行零点标定。DO电极校准：溶氧电极极化完后用纯化水洗净，擦拭干净然后加入到饱和的亚硫酸钠溶液中，待溶氧显示数值在1％时进行零点标定。BIOSTAT C生物反应器和发酵培养基的灭菌：加入发酵培养基后，打开安全阀，关闭空气加热套的冷凝水开关，调节泡沫高度电极位置。设定灭菌温度为121℃、灭菌时间20min以及发酵温度37℃。所述的发酵罐培养基的组成为：1％酵母粉、1％胰蛋白胨、1％甘油、0.4％KH2PO4、0.2％K2HPO4、0.7％Na2HPO4·12H2O、0.1％MgSO4、0.3％NH4Cl、0.02％1000×微量元素混合液。所述的1000×微量元素混合液为1MCaCl2 2ml、1M MnSO4 1ml、1M ZnCl2 1ml、0.2M CoCl2 1ml、0.1M CuSO4 2ml、0.2M NiSO41ml、0.1M Na2MoO4 2ml、0.1M Na2SeO3 2ml、0.1M H3BO3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl3 50ml混合即得。
二级种子按接种量(V：V)5％接种于发酵罐培养基中；
S103扩繁：
接种后的发酵罐调节温度37℃，转速450rpm，pH为7.0，溶氧量30％，培养5h；
菌种培养至2h流加补料培养基一，流加速度为3mL/min，连续流加至培养结束；补料培养基一为20％的甘油；
菌种培养至4h流加补料培养基二，流加速度为3mL/min，连续流加至培养结束；补料培养基二的组成为20％蛋白胨和20％酵母粉。
S104诱导表达：
向培养基中加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃，继续培养5h。
S105破碎离心：
诱导表达结束后，发酵罐中的菌液进行细胞破碎，破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min，上清液过滤后干燥，即得禽白血病P27蛋白。
实施例5
发酵罐发酵培养基对比试验
对LB培养基、TB培养基、2×YT培养基、SOB培养基、本发明提供的发酵罐培养基进行效果对比。所述各培养基组成如下：
LB培养基：0.5％酵母粉、1％蛋白胨、0.5％NaCl。
TB培养基：1.2％蛋白胨，2.4％酵母提取物，0.4％甘油，0.231％磷酸二氢钾，1.254％磷酸氢二钾。
2YT培养基：1.6％蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％氯化钠。
SOB培养基：1％250mmol/L氯化钾，0.05％2mol/L氯化镁，2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.05％氯化钠。
发酵罐培养基：1％酵母粉、1％胰蛋白胨、1％甘油、0.4％KH2PO4、0.2％K2HPO4、0.7％Na2HPO4·12H2O、0.1％MgSO4、0.3％NH4Cl、0.02％1000×微量元素混合液。
1000×微量元素混合液为1M CaCl2 2ml、1M MnSO4 1ml、1M ZnCl2 1ml、0.2MCoCl2 1ml、0.1M CuSO4 2ml、0.2M NiSO4 1ml、0.1M Na2MoO4 2ml、0.1M Na2SeO3 2ml、0.1MH3BO3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl3 50ml混合即得。
称量7L培养基所需成分溶于双蒸水中，培养基溶解后流加到15L发酵罐，并加入7mL泡敌，按发酵罐的操作规程对罐体、管路和培养基进行灭菌操作，待灭菌结束后温度降至37℃使用火焰灭菌法在火焰圈下加入500mL种子液和7mL硫酸卡那霉素，通过调整发酵罐转速和通气量维持溶氧量为30％以上，最大转速不超过700r/min，全程自动流加3mol/L氨水调节pH7.0，自动流加消泡剂，培养温度为37℃，发酵至4h加入浓度为1mmol/L的IPTG，诱导表达4h，结束发酵。测定菌体湿重和P27蛋白的表达量，平行重复3次试验。结果见表1。
表1重组P27蛋白大肠杆菌在不同培养基中的菌体湿重及P27蛋白表达量
Figure BDA0003534682360000161
Figure BDA0003534682360000171
由表1可知，TB培养基、2YT培养基和本发明提供的发酵罐培养基均与LB培养基的菌体湿重和P27表达量呈显著性差异(P<0.05)，结果表明使用本发明提供的发酵罐培养基发酵获得的P27蛋白产量最高。
实施例6
P27蛋白诱导表达结果
对发酵罐诱导的三个实施例重组大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-30a-p27株诱导收获的菌液离心收集菌体(实施例2、实施例3、实施例4)用等体积PBS溶解后加入1/4体积上样buffer混合后煮沸10分钟，离心后进行SDS-PAGE凝胶电泳试验，结果表明三批次实验室试制均能诱导产生37kDa的P27蛋白，结果详见图1～图3。目标蛋白表达量菌超过30％，收集的全部菌液离心后菌泥称重，分装菌体于-20℃保存，结果详见表2。
表2重组大肠埃希氏菌pET-30a-P27-BL21(DE3)株诱导收获的菌体(实施例2、实施例3、实施例4)湿重
批次 实施例2 实施例3 实施例4
菌体湿重(g) 1300 1297 1255
对摇床诱导(实施例1)的重组大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-30a-p27株诱导收获的菌液10倍浓缩后进行SDS-PAGE凝胶电泳试验，与发酵罐(实施例4)诱导重组大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET-30a-p27株收获的菌液原倍相比，均能诱导产生37kDa的P27蛋白，单位体积发酵罐诱导产生的P27蛋白明显高于摇瓶10倍以上，详见图4。
实施例7
禽白血病P27蛋白纯化
1、液压破碎菌体
分别取实施2～4发酵罐制备的和实施例1摇床诱导表达的P27菌液，5000g离心20min离心后菌体用平衡液重悬，调节液压破碎仪压力为0.8bar，开始破碎并收集破碎菌液。将破碎好的菌液4℃、12000rpm/min离心40min，上清用0.45μm滤器过滤，收集液体准备上样。
2、Ni Focurose FF(IMAC)填料装填HK26/20型号空柱
柱子使用前需先用20％乙醇润洗。
用注射器装满20％乙醇，连接底部，注入乙醇，排出空气，让乙醇停留在滤网上，将底部与柱子连接。
柱子用柱夹固定，向柱中加入20％乙醇或者纯水至几厘米高度。
将装柱器连接在空柱上，确保柱子没有倾斜。
装柱前设好报警压0.3MPa。
将填料一次性贴壁加入装柱器中，用装柱液冲洗管壁，并补齐液面至装柱器顶部，盖上上方顶盖。
点击Pump Wash A，排出设备及管路中空气。
在柱底部放废液缸，拧开底部堵头。
将顶部与管路连接；设流速为5ml/min，开始装柱；随着压力增加，填料不断被压实，稳定，稳定后标记液面位置，停止流速，将柱底用堵头堵住，将管路与装柱器断开；拆下装柱器；在柱头滴入适量装柱和缓冲液，补齐柱头液面；用注射器连接顶端适配器，推入20％乙醇，排除顶端适配器的空气让乙醇停留在柱网上；将适配器倾斜45°角，对准液面，向下盖紧，将溢出的液体吸走拧紧至胶面，此时液体会从柱头排出，将适配器拧到标记线下2～3cm处，将上端黑色螺纹拧至最紧。
重新将上端管路连接至机器；打开底部堵头，继续运行流速，如果胶面改变，需重新调整；如暂时不用，填装20％乙醇，先下后上拆卸用堵头封闭，柱子装填完毕。
3、AKTA层析系统纯化P27蛋白
运行系统：启动AKTA pure仪器，进入Unicorn7.0系统。
洗泵：运行Pumps wash程序清洗管道，排除管道气泡。
设置系统参数：设置柱压为0.3Mpa，设置流速为5mL/min。
装柱：采用液滴对液滴的方式将Ni Focurose FF连接到层析系统上。
平衡：用5-10CV缓冲液A以5.0ml/min平衡介质，直至基线平稳。
上样：以5.0ml/min速度将HK26/20柱处理的样品上样。出液口收集流穿液。
洗杂：以5.0ml/min流速设置2％浓度的缓冲液B洗脱杂蛋白，清洗直至基线为零。出液口收集洗杂液。
洗脱：设置50％浓度的缓冲液B洗脱目的蛋白，根据UV吸收峰值收集洗脱蛋白样品，并收集紫外峰值的洗脱液。
纯化结果验证：取各流穿液加入1/4体积的5×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解10min，冰浴2min，12,000rpm离心10min，取上清进行SDS-PAGE蛋白质电泳鉴定。
通过AKTA蛋白质层析纯化系统过Ni Focurose FF(IMAC)层析柱对发酵罐的三批(实施例2、实施例3、实施例4)禽白血病P27蛋白和和摇床制备(实施例1)的禽白血病P27蛋白进行纯化，纯化收集的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果表明，用50％缓冲液B收集吸收峰处的蛋白均为目的蛋白，约37kD，详见图5～7。
经BCA试剂盒测得实施例2禽白血病P27蛋白批次产量为11000mg；实施例3禽白血病P27蛋白产量为12000mg；实施例4禽白血病P27蛋白产量为10900mg；实施例1产量为80mg。使用发酵罐高效表达的禽白血病P27蛋白的批次产量是使用传统摇床批次产量的100倍以上。
以上结果说明：用发酵罐高效表达禽白血病P27蛋白的稳定性和重复性较好，最终菌体密度达到109g/L以上，目的蛋白表达量30％以上，表达浓度达到1000mg/L，纯化蛋白产量达到10g/批次以上。发酵产量大幅提高。为后续生产工艺控制提供了理论与技术支持，并对禽白血病P27蛋白的大规模发酵生产和推广具有重要的技术指导意义。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (12)

1.一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括：
S101菌种培养：
重组大肠埃希杆菌BL21菌种培养得二级种子；
S102接种：
二级种子接种于发酵罐培养基中；
S103扩繁：
接种后的发酵罐调节温度35～40℃，转速300～600rpm，溶氧量25～35％，培养4～6h；
S104诱导表达：
扩繁后的发酵罐中加入诱导剂，35～40℃，培养4～6h；
S105破碎离心：
得禽白血病P27蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，其特征在于：所述的重组大肠埃希杆菌BL21为重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)-pET-30a-p27。
3.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，其特征在于，所述的发酵罐培养基的组成为：1％酵母粉、1％胰蛋白胨、1％甘油、0.4％KH2PO4、0.2％K2HPO4、0.7％Na2HPO4·12H2O、0.1％MgSO4、0.3％NH4Cl、0.02％1000×微量元素混合液。
4.根据权利要求3所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，其特征在于：所述的1000×微量元素混合液为1M CaCl2 2ml、1M MnSO4 1ml、1MZnCl2 1ml、0.2M CoCl2 1ml、0.1M CuSO4 2ml、0.2M NiSO4 1ml、0.1M Na2MoO42ml、0.1M Na2SeO3 2ml、0.1M H3BO3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl3 50ml混合即得。
5.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，其特征在于：所述的诱导剂为IPTG，其在发酵液中的终浓度为0.8～1.2mmol/L。
6.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括：
S101菌种培养：
重组大肠埃希杆菌BL21菌种涂板于LB平板，35～40℃培养过夜；
挑取培养平板上的单菌落于10mL LB液体培养基37℃，培养10～12h，得一级种子；
一级种子按1～3％接种量(V:V)接种于液体LB培养基中，37.0℃，培养10～12h，得二级种子；
S102接种：
二级种子按接种量(V:V)3～7％接种于发酵罐培养基中；
S103扩繁：
接种后的发酵罐调节温度35～40℃，转速300～600rpm，pH为7.0，溶氧量25～35％，培养4～6h；
S104诱导表达：
扩繁后的发酵罐中加入诱导剂，35～40℃，培养4～6h；
S105破碎离心：
诱导表达结束后，发酵罐中的菌液进行细胞破碎，破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min，上清液过滤后干燥，即得禽白血病P27蛋白。
7.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，所述的步骤S103扩繁中，菌种培养至2h流加补料培养基一，流加速度为3mL/min，连续流加至培养结束；
所述的补料培养基一为10～30％的甘油。
8.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，其特征在于：所述的步骤S103扩繁中，菌种培养至3.5～4h流加补料培养基二，流加速度为3mL/min，连续流加至培养结束；
所述的补料培养基二的组成为10～30％蛋白胨和10～30％酵母粉。
9.一种高效表达禽白血病P27蛋白的发酵罐培养基，所述的发酵罐培养基的组成为：2-5％酵母粉、2-5％胰蛋白胨、2-5％甘油、0.1-0.8％KH2PO4、0.1-0.7％K2HPO4、0.2-1.5％Na2HPO4·12H2O、0.01-0.8％MgSO4、0.1-0.7％NH4Cl、0.00.1-0.07％1000×微量元素混合液。
10.如权利要求9的发酵罐培养基，所述的发酵罐培养基的组成为：1％酵母粉、1％胰蛋白胨、1％甘油、0.4％KH2PO4、0.2％K2HPO4、0.7％Na2HPO4·12H2O、0.1％MgSO4、0.3％NH4Cl、0.02％1000×微量元素混合液。
11.如权利要求9-10所述发酵罐培养基，所述的1000×微量元素混合液为1M CaCl22ml、1M MnSO4 1ml、1M ZnCl2 1ml、0.2M CoCl2 1ml、0.1M CuSO42ml、0.2M NiSO4 1ml、0.1M Na2MoO4 2ml、0.1M Na2SeO3 2ml、0.1M H3BO32ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl3 50ml混合即得。
12.一种由权利要求1-8所述方法制备的禽白血病P27蛋白。
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Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0107525D0 (en) * 2001-03-26 2001-05-16 Chiron Spa Culture medium
KR20020016163A (ko) * 2000-08-24 2002-03-04 정수련 어위니아 라폰티치 유래 유전자를 통한 이소말툴로스합성효소의 발현 생산방법
CN103243077A (zh) * 2013-05-03 2013-08-14 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 一种禽白血病p27单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN103589769A (zh) * 2013-10-29 2014-02-19 王明丽 一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法
CN107815446A (zh) * 2017-10-16 2018-03-20 浙江大学 一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺
CN107937459A (zh) * 2017-12-06 2018-04-20 慎东 一种可规模化产trim72蛋白的高密度发酵方法
CN108949662A (zh) * 2018-08-10 2018-12-07 固安鼎泰海规生物科技有限公司 一种用于裸质粒pSFVK1-NMM生产的大肠杆菌发酵培养基
CN109053867A (zh) * 2018-08-24 2018-12-21 艾美汉信疫苗（大连）有限公司 一种高密度发酵表达重组轮状病毒δvp8*抗原的培养方法
CN109161575A (zh) * 2018-09-17 2019-01-08 河南省农业科学院 禽法氏囊病毒vp2蛋白的高表达发酵工艺
CN110819582A (zh) * 2019-11-28 2020-02-21 华派生物工程集团有限公司 大肠杆菌表达口蹄疫病毒样颗粒抗原的发酵培养基及培养方法
CN113341140A (zh) * 2021-06-02 2021-09-03 贵州大学 一种检测禽白血病p27的间接elisa方法
CN113969257A (zh) * 2020-07-25 2022-01-25 鲁南制药集团股份有限公司 一种用于生产甘精胰岛素的培养基

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020016163A (ko) * 2000-08-24 2002-03-04 정수련 어위니아 라폰티치 유래 유전자를 통한 이소말툴로스합성효소의 발현 생산방법
GB0107525D0 (en) * 2001-03-26 2001-05-16 Chiron Spa Culture medium
CN103243077A (zh) * 2013-05-03 2013-08-14 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 一种禽白血病p27单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN103589769A (zh) * 2013-10-29 2014-02-19 王明丽 一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法
CN107815446A (zh) * 2017-10-16 2018-03-20 浙江大学 一种重组腈水合酶大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵工艺
CN107937459A (zh) * 2017-12-06 2018-04-20 慎东 一种可规模化产trim72蛋白的高密度发酵方法
CN108949662A (zh) * 2018-08-10 2018-12-07 固安鼎泰海规生物科技有限公司 一种用于裸质粒pSFVK1-NMM生产的大肠杆菌发酵培养基
CN109053867A (zh) * 2018-08-24 2018-12-21 艾美汉信疫苗（大连）有限公司 一种高密度发酵表达重组轮状病毒δvp8*抗原的培养方法
CN109161575A (zh) * 2018-09-17 2019-01-08 河南省农业科学院 禽法氏囊病毒vp2蛋白的高表达发酵工艺
CN110819582A (zh) * 2019-11-28 2020-02-21 华派生物工程集团有限公司 大肠杆菌表达口蹄疫病毒样颗粒抗原的发酵培养基及培养方法
CN113969257A (zh) * 2020-07-25 2022-01-25 鲁南制药集团股份有限公司 一种用于生产甘精胰岛素的培养基
CN113341140A (zh) * 2021-06-02 2021-09-03 贵州大学 一种检测禽白血病p27的间接elisa方法

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