KR20020016163A - 어위니아 라폰티치 유래 유전자를 통한 이소말툴로스합성효소의 발현 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대체 감미료인 이소말툴로스를 생성시키는 이소말툴로스 합성효소 유전자를 어위니아 라폰티치로 부터 클로닝하고, 대장균 내로 도입시켜 이소말툴로스 합성효소를 대량 발현시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 이소말툴로스 합성효소의 유전자가 부분적으로 알려진 어위니아 라폰티치에서 이소말툴로스 합성효소 유전자를 서어던 하이브리다이제이션과 콜로니 혼성화를 통하여 얻어 전체 DNA 염기서열 1803bp를 밝히고, 이 염기서열을 이소말툴로스 합성효소를 대량으로 생산하기 위해 발현벡터인 pET16b에 클로닝하고, IPTG에 의한 유도를 통해 대장균에서 발현시킴으로서 이소말툴로스 합성효소의 대량 발현 및 이 형질전환 대장균을 이용하여 설탕으로부터 이소말툴로스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

어위니아 라폰티치 유래 유전자를 통한 이소말툴로스 합성효소의 발현 생산방법{Process for expressing a isomaltulose synthetase using the gene originated from Erwinia rhapontici}

본 발명은 대체 감미료인 이소말툴로스를 생성시키는 이소말툴로스 합성효소 유전자를 어위니아 라폰티치로 부터 클로닝하고, 대장균 내로 도입시켜 이소말툴로스 합성효소를 대량 발현시키는 방법에 관한 것이다.

더욱 상세하게는, 이소말툴로스 합성효소의 유전자가 부분적으로 알려진 어위니아 라폰티치에서 이소말툴로스 합성효소 유전자를 서어던 하이브리다이제이션과 콜로니 혼성화를 통하여 얻어 전체 DNA 염기서열 1803bp를 밝히고, 이 염기서열을 이소말툴로스 합성효소를 대량으로 생산하기 위해 발현벡터인 pET16b에 클로닝하고, IPTG에 의한 유도를 통해 대장균에서 발현시킴으로서 이소말툴로스 합성효소의 대량 발현 및 이 형질전환 대장균을 이용하여 설탕으로부터 이소말툴로스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

이소말툴로스는 6-O-알파-디-글루코필라노실-디-프럭토푸라노스(6-O-α -D-glucopyranosyl-D-fructofuranose, 상품명 팔라티노스)이고, 포도당과 과당이 α(1→6) 결합으로 이루어진 이당류로서 설탕의 구조 이성질체이다.

이소말툴로스는 자연 감미료로서 감미도가 설탕의 1/2정도이고, 저충치유발성 및 항충치유발성이 있고, 섭취한 이소말툴로스중에서 50% 정도만이 생체 내에서에너지로 사용되므로, 저 칼로리의 장점을 지니고 있는 고부가가치의 식품 소재 물질로서 제과류, 음료류 및 당뇨병 환자들을 위한 감미료로 사용되며 저칼로리 감미료인 이소말트 등의 중간 원료가 되기도 한다.

이소말툴로스 생산에 관여하는 이소말툴로스 합성효소(EC. 5. 4. 99. 11)는 설탕을 기질로 하여 이소말툴로스 및 부산물인 트레할룰로스(1-O-α-D- glucopyranosyl-D-fructose)를 생성한다.

이소말툴로스 합성효소는 프로타미노박터 루브럼(Protaminobacter rubrum), 세레샤 프리무티카(Serratia plymuthica), 어위니아 라폰티치,아그로박테리움 래디오박터(Agrobacterium radiobactor), 키에브시엘라(Kiebsiella)등의 미생물에 존재하는 것으로 보고되었고, 특히 어위니아 라폰티치 세포에는 이소말툴로스 합성효소가 원형질주변공간에 존재하여 산업적 촉매로의 이용도 가능하여, 공업적으로 이용이 가능한 것은 어위니아 라폰티치, 프로타미노박터 루브럼 정도로 밝혀져 있다.

이소말툴로스 합성효소는 기질인 설탕을 단당류인 포도당과 과당으로 분해하고 결합 위치를 바꿈으로써 이소말툴로스와 트레할룰로스를 생성시키는 효소반응이며, 대부분의 경우 이소말툴로스 생성이 유리한 방향으로(약 8 : 2) 일어난다. 또한 이소말툴로스를 분해하는 미약한 역반응도 존재하여, 설탕이 모두 소모된 이후 시간이 지남에 따라 서서히 이소말툴로스 양이 감소하고, 반면 열역학적으로 조금더 안정한 트레할룰로스의 생성량이 증가하는 결과를 보인다.

기존의 문헌에서는 프로타미노박터 루부럼,엔테로박터 스피시즈(Enterobacter species), 슈도모나스 아씨도피리아(Pseudomonas acidophilia), 어위니아 라폰티치 등의 균주에서 이소말툴로스 생성과 관련된 효소인 이소말툴로스 합성효소의 유전자 염기서열이 발표되었고 프로타미노박터 루부럼,엔테로박터 스피시즈,슈도모나스 아씨도피리아의 경우에 밝혀진 염기서열은 약 1.8kb 정도의 크기를 지니고 있으나, 어위니아 라폰티치의 경우에 밝혀진 염기서열은 전 유전자의 염기서열이 아니라 일부분만 보고되고 있다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 직접 설탕에서 전환되어 생성되는 대체 감미료인 이소말툴로스를 생산하는 어위니아 라폰티치 유래의 이소말툴로스 합성효소 유전자를 클로닝하고, 대장균 내로 도입 형질 전환시켜 대량 발현시킴으로서 설탕에서 이소말툴로스를 고수율로 발효 생산시키는 방법을 완성한 것이다.

도 1은 어위니아 라폰티치의 염색체(genomic DNA) 내에서 이소말툴로스 합성효소를 지닌 단편의 서어던 하이브리다이제이션(southern hybridization)을 통한 탐색을 나타낸 도면으로, lane 1은 어위니아 라폰티치 염색체(genomic DNA)에 아무런 제한효소도 처리하지 않은 것, lane 2,3,4,5,6은 각각 제한 효소EcoRI,SalI,BamHI,HindIII, XbaI을 처리한 것이다.

도 2는 벡터 pUC-pal의 구조로서, 어위니아 라폰티치의 염색체에서 이소말툴로스 합성효소 유전자를 지니고 있는 단편을 찾아 대장균에서 이용되는 벡터에 클로닝 한 것이다.

도 3은 이소말툴로스 합성효소의 전체 유전자 염기서열로서, 염기서열 중에서 굵게 표시한 것이 단백질로 번역되는 곳이고 예상되는 크기는 약 66.9 kDa 이다.

도 4는 pETpal의 구조로서, 대장균에서 이소말툴로스 합성효소를 생산하기 위해 어위니아 라폰티치의 이소말툴로스 합성효소 유전자를 pET 벡터에 클로닝 한 것이다.

도 5는 pETpal을 이용하여 대장균에서 발현된 이소말툴로스 합성효소의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 도면으로, lane M : 표시자, lane 1 : 야생형 대장균, lane 2 : 야생형 대장균에 IPTG 처리한 것, lane 3 : pETpal이 형질도입된 대장균, lane 4 : pETpal이 형질 도입된 대장균를 IPTG 처리한 것이다.

도 6은 대장균에서 발현되는 어위니아 라폰티치 이소말툴로스 합성효소의 활성 측정을 나타낸 크로마토그램으로, A는 야생형 대장균의 설탕 전환 특징이고, B는 pETpal을 대장균에 형질도입하고 IPTG로 유도된 이소말툴로스 합성효소의 설탕 전환 특징을 나타낸 것이다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1의 DNA 염기서열을 지닌 어위니아 라폰티치로부터 유래된 이소말툴로스 합성효소 유전자 및 이 이소말툴로스 합성효소 유전자 cDNA를 클로닝시킨 플라스미드 pETpal을 도입하여 형질전환시킨 대장균E.ColipETpal을 제공하는 것이다.

상기 형질전환 대장균E.ColipETpal은 서울특별시 서대문구 홍제1동 361-221번지 한국미생물보존협회에 2000년 8월 10일자로 기탁번호 KCCM-10206호로 부다페스트 조약에 의거 국제 기탁되었다.

한편, 본 발명은 형질전환 대장균E.ColipETpal(기탁번호: KCCM-10206호)을 LB 배지에서 배양하여, 이소말툴로스 합성효소의 생성시키고, 설탕용액과 반응시켜 설탕을 이소말툴로스로 전환시킴을 특징으로 하는 이소말툴로스의 발효 생산방법을 제공하는 것으로, 이때 형질전환 대장균의 이소말툴로스 합성효소의 발현은 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactoside)에 의해 유도됨을 특징으로 하고, 상기 LB 배지는 LB 아가(agar) 및 3∼5% 설탕, 0.3∼0.5% 쇠고기 추출물, 0.9∼1.1% 박토 펩톤, 1.3∼1.7% 아가 조성의 아가 프레이트 배지임을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

이소말툴로스 합성효소 유전자를 얻기 위해 이소말툴로스 생성효율이 높다고알려진 그람 음성 세균인 어위니아 라폰티치를 사용하였다. 일반적으로 유사한 기능을 지니는 유전자의 경우에는 각 염기서열도 어느 정도 유사하고 그 크기도 유사하다고 알려져 있다. 따라서 어위니아 라폰티치의 이소말툴로스 합성효소의 유전자도 약 1.8kb정도의 크기를 지녔을 것으로 추정하고 알려진 염기서열을 바탕으로 어위니아 라폰티치의 이소말툴로스 합성효소의 전체 유전자를 클로닝하였다.

클로닝에는 대장균 XL1-Blue와, pUC18 벡터를 이용하였고, 이소말툴로스 합성효소의 발현을 위해서는 대장균 BL21(DE3)와 발현용 벡터 pET16b (Novagen)를 사용하였다. 대장균의 배양 배지로는 일반적 조성의 LB 배지를 사용하였고, 어위니아 라폰티치의 배양에는 4∼6% 설탕, 0.8∼1.2% 효모추출물, 0.4∼0.6% Na₂HPO₄·12H₂O 조성의 배지를 이용하였다.

대장균과 어위니아 라폰티치의 평판(plate) 배지로는 각각 LB 아가(agar)와 3∼5% 설탕, 0.3∼0.5% 쇠고기 추출물, 0.9∼1.1% 박토 펩톤, 1.3∼1.7% 아가 조성의 아가 프레이트를 사용하였다. 필요에 따라 50 ㎍/ml 엠피실린(amipicillin)을 첨가하였다.

배양 방법은 어위니아 라폰티치의 경우, 배지 50 ml이 들어 있는 250 ml의 삼각 플라스크에 접종하여 28∼32 ℃, 180∼220 rpm 조건에서 16∼18 시간 배양하였고, 대장균의 경우에는 36∼38 ℃, 180∼220 rpm 조건에서 10∼14 시간 배양하였다.

대부분의 DNA는 아가로스겔(TBE buffer, 0.5%) 전기영동법으로 확인하였고, 겔 상에서 DNA 밴드의 정제는 QIAXII 겔 추출장지(QIAGEN, USA)를 이용하였으며, DNA간의 연결(ligation) 반응은 T4 DNA 연결효소(Boehringer Mannheim)를 이용하였다.

(실시 예 1) 어위니아 라폰티치의 이소말툴로스 합성효소 유전자 함유 DNA의 클로닝

이소말툴로스 합성효소 유전자를 클로닝 하기 위하여 어위니아 라폰티치의 염색체를 분리하였다. 어위니아 라폰티치의 이소말툴로스 합성효소 유전자중 일부분의 염기서열만이 알려져 있었으므로, 우선 이를 이용하여 중합효소 연쇄반응 프라이머(PCR primer)를 제작하였다. 연쇄중합반응을 이용하여 기존에 알려진 염기서열을 지니는 이소말툴로스 합성효소 유전자의 일부를 어위니아 라폰디치의 염색체에서 증폭하였다.

전방 프라이머 (Forward Primer)

5'-CCTTTCACCTCTACATCTTCG-3' (서열번호 2)

후방 프라이머 (Reverse Primer)

5'-ATGTCCTCTCAAGGATTGAAAACG-3' (서열번호 3)

그리고 어위니아 라폰티치의 알려진 이소말툴로스 유전자 중 그 절단 부위가 존재하지 않는 제한 효소인BamHI,EcoRI,HindIII, SalI,XbaI을 이용하여 어위니아 라폰티치의 genomic DNA를 완전히 절단하였다. 그리고 앞서 중합효소 연쇄반응을 통하여 얻은 DNA 단편을 이용하여 방사능 표지된 탐침자(probe)를 만들었다. 이를 이용하여 서어던 하이브리다이제이션으로 찾고자 하는 유전자를 지닌 DNA 단편을 탐색하였다(도 1).BamHI,HindIII, XbaI으로 염색체를 자른 경우에 있어서는 서어던 혼성화의 결과 나타난 이소말툴로스 합성효소의 유전자를 지닌 DNA의 크기가 약 20∼23 kb정도 되어 너무 큰 관계로 이용하지 않았고, 2.5kb 정도의EcoRI으로 잘린 조각과 약 5.5 kb정도의SalI으로 잘린 조각을 이용하여 원하는 유전자를 탐색하였다. 어위니아 라폰티치의 엄색체를EcoRI으로 절단한 후 분리한 2.5kb정도 크기의 DNA 조각과SalI으로 절단한 5.5kb 정도의 DNA 단편들을 pUC18에 클로닝하고 이를 pUC-pal이라고 명명하였다(도 2).

어위니아 라폰티치의 부분 엄색체 라이브러리(library) 제조에는 이소말툴로스 합성효소의 전체 유전자가 들어있을 가능성이 큰SalI으로 절단한 게놈 DNA 단편을 이용하였다.

pUC-pal 벡터의 라이브러리에서 앞서 만든 1.3kb 크기의 탐침자를 이용하여 콜로니 혼성화를 수행하여 원하는 이소말툴로스 합성효소의 유전자를 지닌 클론을 결정하였다. 그리고 결정한 클론을 이용하여 염기서열을 분석하여 이소말툴로스 합성효소의 유전자 염기서열을 밝혔다(도 3). 앞서 예상한 바와 같이 다른 여러 미생물에서 밝혀진 이소말툴로스 합성효소 유전자와 크기가 비슷한 1803bp 크기의 이소말툴로스 합성효소 유전자(서열번호 1)를 어위니아 라폰티치가 가지고 있음을 알 수 있었다.

(실시 예 2) 어위니아 라폰티치로 부터 유래한 이소말툴로스 합성효소의 대장균내 발현 시스템 구축

어위니아 라폰티치에서의 이소말툴로스 합성효소는 번역후 변형과정을 요구하지 않으므로, 대장균와 같은 원핵생물에서 대량으로 발현시킬 수 있다. 이소말툴로스 합성효소의 대량 발현을 위해 대장균 재조합 단백질 발현 시스템 중에서 잘 알려진 pET 시스템을 사용하였다. pET 시스템은, 발현시키고자 하는 목적 유전자를 pET 플라스미드 상의 강력한 T7 파지 프로모터 하류에 삽입한다. 이 때 숙주 세포인 대장균 BL21(DE3)내의 λDE3 lysogen으로부터 T7 RNA 중합효소가 생성된다. 숙주 대장균으로부터 도입된 T7 RNA 중합효소 유전자는LacUV5 프로모터 하류에 위치하여 Isopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG) 첨가에 의한 유도로 단백질의 발현을 조절할 수 있다.

밝혀낸 1,803 bp의 이소말툴로스 합성효소 유전자 염기서열을 기본으로 5′말단 위치에AflIII 절단위치와 3′말단 위치에BamHI 절단위치를 가진 프라이머를 제작하여, 원하는 유전자를 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭하였다.

전방 프라이머

5'-ACATGTCCTCTCAAGAATTG-3' (서열번호 4)

후방 프라이머

5'-CGCGGATCCCTAAAAGCAGGCTTGATAC-3' (서열번호 5)

클론되어질 유전자에 제한효소AflIII,BamHI을 동시에 처리한 후, 아가로스겔 상에서 추출하여 1.8 kb 이소말툴로스 합성효소 유전자의 DNA를 정제, 분리하였다. 다음으로 발현용 벡터 pET16b(5.7 kb)를 마찬가지로AflIII,BamHI 이중 제한 효소 처리를 수행하고, 1.8 kb인 클론 되어질 유전자를 삽입하였다. 이를 pETpal이라고 명명하였다(도 4).

(실시 예 3) IPTG 유도를 통한 이소말툴로스 합성효소의 대장균 내에서의 대량발현과 SDS 전기영동 분석

pETpal 벡터가 형질 도입된 대장균 BL21(DE3)을 배양한 후 흡광도(600nm)가 0.5일 때 0.4mM의 IPTG을 처리하고 4시간 동안 반응시켜 이소말툴로스 합성효소를발현 유도하였다. 발현된 단백질은 10% SDS 전기영동를 이용하여 확인하였다. 분석 시료는 샘플 용액(1% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 10% 글리세롤, 브로모페놀 블루)과 함께 10분간 끓인 후 사용하였고, Coomassie Brilliant Blue R-250을 이용하여 염색 확인하였다.

pET 발현 시스템을 이용하여 IPTG를 처리하여 이소말툴로스 합성효소의 발현여부를 SDS 전기영동를 이용하여 확인하였다(도 5).

DNA 염기서열을 바탕으로 얻은 아미노산 서열을 통해 이소말툴로스 합성효소의 크기는 69.9kDa로 추정되었는데 SDA 전기영동를 통하여 이를 확인할 수 있었다. 다른 단백질에 비해 뚜렷하게 많이 발현되는 것을 알 수가 있다. 즉 IPTG를 이용, 이소말툴로스 합성효소를 유도해 어위니아 라폰티치의 이소말툴로스 합성효소를 대장균에서 대량 생산할 수 있었다.

(실시 예 4) 이소말툴로스의 정량 및 이소말툴로스 합성효소의 활성측정

기질 및 변환산물의 농도는 KR100-NH₂컬럼 (Kromasil, 스웨덴)과 굴절율 검출기(Waters, USA)를 부착한 고속액체크로마토그래프 시스템를 사용하였다. 용매 조성은 아세토나이트릴 : 물 = 80 : 20 이고, 유속은 2 ml/min으로 설정하였다.

이소말툴로스 합성효소의 활성을 측정하기 위해 균체 배양액을 탈이온수로 1회 세척, 회수한 후 pH 5.5, 0.04N 아세테이트 완충액으로 20 % (w/v) 세포현탁액을 제조하였다. 세포현탁용액 0.5 ml(건조중량 100 mg)과 pH 5.5, 0.04 N 아세테이트 완충액 2.5 ml를 혼합하고, 78.6% 설탕 7.0 ml 첨가 후 최종적으로 설탕의 농도를 550 g/l, 10 ml로 맞춘 후, 30 ℃ 반응조에서 1시간 동안 반응시키고, 100 ℃ 끓는 물에 10분간 방치하여 세포 내 효소를 완전히 불활성화 시킨 다음 냉각시키고 반응액을 고속액체크로마토그래프로 분석하였다.

다음으로 대장균 내에 도입 및, 발현된 효소 활성의 존재 유무를 확인하기 위하여 재조합 대장균(E.ColipETpal : 기탁번호 KCCM-10206호)을 LB 배지에서 배양하고, 균체를 회수하여 55% 설탕 용액과 반응시켰다. 그 반응액을 고속액체크로마토그래프로 분석한 결과, IPTG를 첨가한 경우 대부분의 설탕이 이소말툴로스로 변환되었음을 확인하였다. 즉, IPTG의 유도에 의하여 발현된 이소말툴로스 합성효소가 설탕을 기질로 하여 이소말툴로스로 전환하는 강한 활성을 지니고 있음을 확인할 수 있었다. 이미 보고된 바와 같이 설탕이 이소말툴로스로 전환되는 과정에서 트레할룰로스가 생성되었고, 미미한 양의 포도당과 과당도 생산되었다(도 6). 또한 이소말툴로스 합성효소의 효소활성을 측정해본 결과 어위니아 라폰티치와 유사수준인 775 Umg^-1임을 확인하였다.

본 발명의 효과는 전 유전자의 염기서열이 아닌 일부분만 보고된 바 있는 어위니아 라폰티치의 이소말툴로스 합성효소 전체 염기서열을 규명, 유전공학적 관점으로 접근하여 이 효소와 관련된 유전자를 클로닝 한 후, 대장균 내로 도입 및 대량 발현시킴으로써 이소말툴로스를 대량으로 생산 가능하게 한 것이다.

Claims (5)

1. 서열번호 1의 DNA 염기서열을 지닌 어위니아 라폰티치로부터 유래된 이소말툴로스 합성효소 유전자
2. 제 1항의 이소말툴로스 합성효소 유전자 cDNA를 클로닝시킨 플라스미드 pETpal을 도입하여 형질 전환시킨 대장균E.ColipETpal(기탁번호: KCCM-10206호)
3. 형질전환 대장균E.ColipETpal(기탁번호: KCCM-10206호)을 LB 배지에서 배양하여, 이소말툴로스 합성효소의 생성시키고, 설탕용액과 반응시켜 설탕을 이소말툴로스로 전환시킴을 특징으로 하는 이소말툴로스의 발효 생산방법
4. 제 3항에 있어서, 형질전환 대장균의 이소말툴로스 합성효소의 발현은 IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactoside)에 의해 유도됨을 특징으로 하는 이소말툴로스의 발효 생산방법
5. 제 3항에 있어서, 상기 LB 배지는 LB 아가(agar) 및 3∼5% 설탕, 0.3∼0.5% 쇠고기 추출물, 0.9∼1.1% 박토 펩톤, 1.3∼1.7% 아가 조성의 아가 프레이트 배지임을 특징으로 하는 이소말툴로스의 발효 생산방법