CN117757760A - 一种谷氨酰半胱氨酸合成酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种谷氨酰半胱氨酸合成酶及其应用。本发明基于Citrobacter koseri来源的野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶GshA(Glutamate‑cysteine ligase[EC:6.3.2.2])的氨基酸进行改造，通过改变野生型蛋白结构表面的氨基酸序列，筛选得到一种稳定性和活性提高的谷氨酰半胱氨酸合成酶。所述谷氨酰半胱氨酸合成酶将野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶的第262位甘氨酸突变为丙氨酸，第456位异亮氨酸突变为亮氨酸，第470位丙氨酸突变为谷氨酰胺，第496位苏氨酸突变为色氨酸得到的。在本发明中利用该高活性和高稳定性的谷氨酰半胱氨酸合成酶催化生产谷胱甘肽的同时，引入了ATP能量循环系统，提高了产物浓度，又降低了生产成本，极大的提高了催化应用的潜力，具有重要的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种谷氨酰半胱氨酸合成酶及其应用。
背景技术
谷胱甘肽(GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合的含巯基的三肽，有还原型和氧化型两种形式，在生理条件下以还原型谷胱甘肽占多数。谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂，能够帮助细胞对抗自由基的损害，保护细胞免受氧化应激的伤害。它还具有调节免疫系统、促进细胞增殖和修复等多种生理功能，在化妆品、保健品和食品等领域都有着广泛的应用前景。
还原型谷胱甘肽的合成方法有化学法、发酵法和酶法。化学法成本高，复杂耗时，已被淘汰。目前主要是通过酵母发酵产GSH，但也存在产物含量不高，分离难度大，发酵周期长的问题。近几年来，酶催化法合成谷胱甘肽发展迅速。谷胱甘肽的酶法合成需要γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GshA，EC 6.3.2.2)和谷胱甘肽合成酶(GshB，EC 6.3.2.3)两个酶，研究发现GshA的催化活性受到产物GSH的反馈抑制，无法合成高浓度的GSH。随后又发现了双功能酶GshF，该酶同时具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的活性，且不受产物GSH的反馈抑制。但GshF的活性低于GshA和GshB双酶系统。因此发掘更具活性、稳定性和产物耐受性的GshA，仍然具有重要的应用价值。
在先前的研究中，本公司已经对柠檬酸杆菌Citrobacter koseri(strain ATCCBAA-895)来源的野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶进行了定点突变(专利：CN116769738A)，其酶活力和还原型谷胱甘肽产量都得到了显著的提高，但反应体系中使用的ATP价格比较昂贵，为了进一步降低成本，引入了ATP能量循环系统，使反应体系更加复杂，盐离子浓度增高，从而对酶的稳定性要求变高，所以需要寻找一种活性高且稳定性好的谷氨酰半胱氨酸合成酶。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种稳定性和活性提高的谷氨酰半胱氨酸合成酶。
本发明还要解决的技术问题是提供上述谷氨酰半胱氨酸合成酶在酶催化反应制备谷胱甘肽中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种谷氨酰半胱氨酸合成酶，所述的谷氨酰半胱氨酸合成酶的氨基酸序列，是将野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶的第262位甘氨酸突变为丙氨酸，第456位异亮氨酸突变为亮氨酸，第470位丙氨酸突变为谷氨酰胺，第496位苏氨酸突变为色氨酸得到的。
其中，所述的谷氨酰半胱氨酸合成酶经氨基酸位点改造后，其活性和稳定性都得到了显著的提高；其中，酶活力约是野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶的4.7倍，37℃水浴热处理2h后残余酶活约是野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶的2.7倍，即稳定性得到了显著提高。
具体的，所述的酶活定义为每分钟产生1μmol谷胱甘肽所需的酶量，按每g湿菌体计算酶活单位。
其中，所述的谷氨酰半胱氨酸合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，对应的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
其中，所述的野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶来源于柠檬酸杆菌Citrobacterkoseri，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应的编码野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶和氨基酸改造后的谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因序列均委托通用生物(安徽)股份有限公司进行全基因合成，为了便于后续克隆，基因片段5′端增加GAATTC六个碱基，形成EcoRI酶切位点，3′端增加CTCGAG六个碱基，形成XhoI酶切位点。
一种含有上述谷氨酰半胱氨酸合成酶编码基因核苷酸序列的重组表达载体也在本发明所保护的范围之内。
其中，所述的重组表达载体可通过本领域常规方法，将本发明所述的谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的核苷酸序列连接于各种市售空载载体上构建而成。所述的市售空载载体可以是本领域常规的各种质粒载体，只要所述的重组表达载体可以在相应的表达宿主中正常复制，并表达所述的谷氨酰半胱氨酸合成酶即可。在本发明的一些实施例中，所述的市售空载载体为针对宿主大肠杆菌BL21(DE3)的pET28a载体。
一种含有上述谷氨酰半胱氨酸合成酶编码基因核苷酸序列或含有上述重组表达载体的重组菌株也在本发明所保护的范围之内。
上述谷氨酰半胱氨酸合成酶在催化反应制备谷胱甘肽中的应用也在本发明所保护的范围之内。
其中，所述的催化反应，引入了ATP能量循环系统，以L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、腺苷三磷酸、乙酰磷酸为底物，以镁离子作为辅助底物，通过加入乙酸激酶、谷胱甘肽合成酶和上述谷氨酰半胱氨酸合成酶进行催化合成谷胱甘肽。
具体的，所述的乙酸激酶为ACK，所述的谷胱甘肽合成酶为谷胱甘肽合成酶GshB。
具体的，所述的引入ATP能量循环系统是指，利用乙酸激酶(ACK，EC 2.7.2.1)偶联谷氨酰半胱氨酸合成酶GshA和谷胱甘肽合成酶GshB合成还原型谷胱甘肽。反应中只需要投入浓度极低的ATP，ATP参与反应后生成ADP，乙酸激酶ACK再催化ADP和乙酰磷酸合成ATP，实现ATP的循环再生。
其中，所述的催化反应，其反应体系包括：5-80mM L-半胱氨酸、5-85mM L-甘氨酸、5-85mM L-谷氨酸、0.5-2mM ATP、5-180mM氯化镁、10-200mM乙酰磷酸、10-30g/L谷氨酰半胱氨酸合成酶、2-8g/L谷胱甘肽合成酶和0.5-2g/L乙酸激酶。优选的，反应体系包括：60mM L-半胱氨酸、65mM L-甘氨酸、65mM L-谷氨酸、1mM ATP、150mM氯化镁、150mM乙酰磷酸、20g/L谷氨酰半胱氨酸合成酶、5g/L谷胱甘肽合成酶和1g/L乙酸激酶。
其中，所述的催化反应，其反应条件为：35-40℃，pH＝7.0-8.0条件下反应1-5h。优选的，反应条件为：反应温度维持在37℃，反应时间2小时，pH 7.5。
有益效果：本发明通过对柠檬酸杆菌Citrobacter koseri(strain ATCC BAA-895)来源的野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶进行定点改造，获得了一种稳定性和活性都得到显著提高的谷氨酰半胱氨酸合成酶，酶活力和稳定性分别是野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶的4.7倍和2.7倍。在本发明中利用该高活性和高稳定性的谷氨酰半胱氨酸合成酶催化生产谷胱甘肽的同时，引入了ATP能量循环系统，降低了生产成本，又极大的提高了催化应用的潜力，具有重要的工业应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1是野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶和突变体催化合成谷胱甘肽的结果。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：稳定性和活性提高的谷氨酰半胱氨酸合成酶突变体的构建与表达
对柠檬酸杆菌Citrobacter koseri(strain ATCC BAA-895)来源的野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶WT第262位甘氨酸、第456位异亮氨酸，第470位丙氨酸、第496位苏氨酸位点突变得到的谷氨酰半胱氨酸合成酶突变体M。
具体的，是将野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶的第262位甘氨酸突变为丙氨酸，第456位异亮氨酸突变为亮氨酸，第470位丙氨酸突变为谷氨酰胺，第496位苏氨酸突变为色氨酸。
上述野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶WT的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，对应的编码野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。上述谷氨酰半胱氨酸合成酶突变体M的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其氨基酸序列对应的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
将野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶WT的基因(SEQ ID NO:2)和突变体M的基因(SEQID NO:4)全都委托通用生物(安徽)股份有限公司进行全基因合成，为了便于后续克隆，分别在基因片段5′端增加GAATTC六个碱基，形成EcoRI酶切位点，3′端增加CTCGAG六个碱基，形成XhoI酶切位点。
将上述合成的两种谷氨酰半胱氨酸合成酶gshA基因和pET28a载体分别用EcoRI和XhoI(购于TaKaRa公司)进行双酶切，用DNA凝胶试剂盒(购于TaKaRa公司)分别回收片段。将两种gshA基因片段分别与线性化pET28a载体进行连接，连接体系如下：4μL DNA片段纯化产物，6μL线性化pET28a载体，10μL Solution I在16℃反应1.5h，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，在LB平板(含终浓度50mg/L的卡那霉素)上37℃培养12小时，得到克隆子。各挑取3个克隆子在LB培养基(含终浓度50mg/L的卡那霉素)中37℃、200rpm培养12小时后送测序。
将测序正确的野生型和突变体谷氨酰半胱氨酸合成酶的重组大肠杆菌分别在LB培养基(含终浓度50mg/L的卡那霉素)中37℃、200rpm培养12小时。以1％v/v接种量转接到1L TB培养基中(含终浓度50mg/L的卡那霉素)，37℃、200rpm培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度0.2mM诱导，30℃、150rpm条件下继续培养12-16h，离心收集菌体，储存于-80℃冰箱。
实施例2：稳定性和活性提高的谷氨酰半胱氨酸合成酶突变体的改造效果检测
取出实施例1收集的谷氨酰半胱氨酸合成酶野生型和突变体菌体，分别称取2g到50mL离心管中，用0.1mol/L的PBS(pH7.5)溶液清洗2次，离心收集菌体，加入20mL的0.1mol/L的PBS(pH7.5)溶液重悬得到100g/L的菌液，于冰水浴下用超声破碎仪破碎细胞，仪器参数设定为功率200W，超声3s停顿7s，大约40min直至菌液澄清。结束后4℃离心8000rpm、10min，离心管内的上清液即为野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶WT及突变体M的粗酶液。
50mL的酶活测定体系为：60mM L-半胱氨酸、65mM L-甘氨酸、65mM L-谷氨酸、1mMATP、150mM氯化镁、150mM乙酰磷酸，调pH至7.5后，加入20g/L谷氨酰半胱氨酸合成酶粗酶液、5g/L谷胱甘肽合成酶粗酶液和1g/L乙酸激酶粗酶液，37℃下200rpm振荡反应，每10min取一次样品，煮沸水浴猝灭。酶活定义为每分钟产生1μmol谷胱甘肽所需的酶量，按每g湿菌体计算酶活单位。
将野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶WT及突变体M的粗酶液在37℃水浴热处理2h后，以上述50mL的酶活测定体系进行酶活测定，以上述未经处理的粗酶液的酶活为参比，得到残余酶活百分比。相对比酶活＝突变体酶活/野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活。
表1野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶及突变体酶活和稳定性对比
| 菌株 | 酶活力(U/g) | 相对比酶活(％) | 热处理2h后的残余酶活(％) |
| 野生型 | 33 | 100 | 28 |
| 突变体 | 156 | 473 | 76 |
实验结果如表1所示。结果表明，野生型的酶活为33U/g，突变体的酶活为156U/g，突变体的酶活约是野生型的4.7倍。当野生型在37℃水浴热处理2h后残余酶活为28％，而突变体在37℃水浴热处理2h后残余酶活为76％，约是野生型的2.7倍，这说明经过氨基酸序列改造的突变体，其稳定性得到了显著的提高。
实施例3：稳定性和活性提高的谷氨酰半胱氨酸合成酶突变体用于酶催化制备还原型谷胱甘肽的应用
本发明的酶催化制备还原型谷胱甘肽反应体系引入ATP能量循环系统，利用乙酸激酶(ACK，EC 2.7.2.1)偶联谷氨酰半胱氨酸合成酶GshA和谷胱甘肽合成酶GshB合成还原型谷胱甘肽。反应中只需要投入浓度极低的ATP，ATP参与反应后生成ADP，乙酸激酶ACK再催化ADP和乙酰磷酸合成ATP，实现ATP的循环再生。
反应体系：10L反应体系中，分别加入60mM L-半胱氨酸、65mM L-甘氨酸、65mM L-谷氨酸、1mM ATP、150mM氯化镁、150mM乙酰磷酸，调pH至7.5后，37℃再加入20g/L谷氨酰半胱氨酸合成酶粗酶液、5g/L谷胱甘肽合成酶粗酶液和1g/L乙酸激酶粗酶液，反应5小时，每1小时取样500μL，沸水浴3分钟终止反应，测定谷胱甘肽浓度。具体结果见图1和表2，谷氨酰半胱氨酸合成酶突变体反应2小时达到最高浓度为16.6g/L，野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶为3.9g/L，谷氨酰半胱氨酸合成酶突变体是野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶的4.3倍。
表2野生型WT和突变体M催化合成谷胱甘肽的结果
本发明提供了一种谷氨酰半胱氨酸合成酶及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种谷氨酰半胱氨酸合成酶，其特征在于，所述的谷氨酰半胱氨酸合成酶的氨基酸序列，是对野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶进行点突变得到的；
其中，所述的点突变位点为第262位、第456位、第470位和第496位。
2.根据权利要求1所述的谷氨酰半胱氨酸合成酶，其特征在于，所述的点突变具体为将野生型谷氨酰半胱氨酸合成酶的第262位甘氨酸突变为丙氨酸，第456位异亮氨酸突变为亮氨酸，第470位丙氨酸突变为谷氨酰胺，第496位苏氨酸突变为色氨酸。
3.根据权利要求1所述的谷氨酰半胱氨酸合成酶，其特征在于，所述的谷氨酰半胱氨酸合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求3所述的谷氨酰半胱氨酸合成酶，其特征在于，所述的谷氨酰半胱氨酸合成酶，其氨基酸序列对应的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体含有权利要求3所述谷氨酰半胱氨酸合成酶突变体编码基因的核苷酸序列。
6.一种重组菌株，其特征在于，含有权利要求3所述谷氨酰半胱氨酸合成酶突变体编码基因的核苷酸序列或含有权利要求5所述的重组表达载体。
7.权利要求1-4中任意一项所述的谷氨酰半胱氨酸合成酶在催化反应制备谷胱甘肽的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的催化反应，引入了ATP能量循环系统，以L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、ATP、乙酰磷酸为底物，以镁离子作为辅助底物，通过加入乙酸激酶、谷胱甘肽合成酶和权利要求1所述的谷氨酰半胱氨酸合成酶进行催化合成谷胱甘肽。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的乙酸激酶为ACK，所述的谷胱甘肽合成酶为谷胱甘肽合成酶GshB。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的催化反应，其反应体系包括：5-80mM L-半胱氨酸、5-85mM L-甘氨酸、5-85mM L-谷氨酸、0.5-2mM ATP、5-180mM氯化镁、10-200mM乙酰磷酸、10-30g/L谷氨酰半胱氨酸合成酶、2-8g/L谷胱甘肽合成酶和0.5-2g/L乙酸激酶；其反应条件为：35-40℃，pH＝7.0-8.0条件下反应1-5h。
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