CN109280669A - 大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段及其应用 - Google Patents

大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段、融合基因及应用，所述大肠杆菌不耐热肠毒素(heat‑labile enterotoxin，LT)基因的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，所述基因片段为去除LT A亚单位基因编码核苷酸序列100‑585bp内任意连续片段后的基因片段。所述融合基因包括所述大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段和病原微生物富含抗原表位的基因片段。将候选抗原的基因片段插入LT的A1的基因片段中并替换其毒性部位作为疫苗抗原，通过A2片段与LTB连接，既保留了LT的粘膜佐剂结构基础及活性，又去除了其毒性，通过粘膜途径免疫可有效诱导机体粘膜免疫应答，产生特异性IgA抗体，提供一种用于预防病原微生物通过粘膜途径感染的疫苗方式，且目前还没有这方面的报道。

Description

大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段及其应用
技术领域
本发明涉及生物制药，具体涉及大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段及其应用。
背景技术
绝大部分感染发生在或者起源于粘膜表面，这些典型的感染包括：(1)胃肠道途径感染常见微生物：幽门螺杆菌、霍乱弧菌、致病性大肠杆菌、空肠弯曲菌、沙门氏菌、志贺氏菌、轮状病毒、脊髓灰质炎病毒等。(2)呼吸道途径感染常见微生物：肺炎支原体、呼吸道合胞病毒、流感病毒等。(3)泌尿生殖系统感染常见微生物：HIV、衣原体、淋病奈瑟氏菌、单纯疱疹病毒、致病性大肠杆菌某些菌株等。以上这些微生物仍然严重威胁人类健康，对疫苗的发展也是巨大挑战。大量研究表明胃肠外免疫激发的系统免疫能有效清除系统感染，却很难对粘膜有保护作用，粘膜疫苗的研制势在必行。
粘膜免疫系统(mucosal immune system,MIS)是呼吸道、消化道、泌尿生殖道等粘膜及粘膜下存在的淋巴组织通称，执行局部特异性免疫功能的主要场所，在免疫防御中发挥重要作用，是具有重要而独特功能的一个相对独立的免疫系统，又称粘膜相关淋巴组织。粘膜免疫系统与传统意义上的免疫系统有如下区别(1)MIS分泌一类粘膜相关免疫球蛋白，及分泌型IgA(secretory IgA,sIgA)；(2)MIS内有一类能下调全身免疫应答的效应T细胞；(3)MIS具有粘膜定向细胞运输系统，使粘膜滤泡中细胞迁移至广泛的粘膜下淋巴组织；(4)口服抗原比其他途径给予抗原更易诱导T细胞耐受。MIS功能特点：(1)参与抗原刺激的应答过程，不但参与局部免疫并与整个机体免疫系统紧密联系；(2)口服蛋白抗原刺激粘膜免疫系统后，常导致免疫耐受。粘膜要保护机体免受病原体的侵袭，同时又不能对食物等无害抗原产生反应，所以需要复杂而精确的调节机制才能维持平衡。所以，研发粘膜疫苗需要考虑MIS功能和特点，进行有针对性的设计和研究。
与肌肉或皮下注射的传统疫苗相比，口服或鼻腔接种的粘膜疫苗有很多优点：(1)高效，既能引起粘膜免疫反应，也能引起系统免疫反应，而且由于粘膜淋巴细胞的归巢性，一处免疫可引起多处反应；(2)简单廉价，省去了人工操作和专门器具的费用，适于大规模的人群接种；(3)病人易于接受，无针刺痛苦，而且不产生交叉感染。由于粘膜免疫系统特殊性，单纯可溶性抗原经粘膜途径免疫很难激发粘膜和系统免疫应答，必须辅以合适的粘膜佐剂才能激发免疫应答。即使具有一定载体系统，加不加佐剂免疫效果也有很大差别。所以要想引起粘膜保护反应，必须经粘膜途径免疫，而皮下注射、肌肉注射多数情况下效果不佳。寻找安全、高效的粘膜佐剂是粘膜疫苗开发中的一个重点和难点。
当前粘膜疫苗研究中使用最多的粘膜佐剂是CT和LT，CT和LT是迄今所知最强的粘膜佐剂，能和多数已知的疫苗候选抗原共免疫产生良好的抗原特异性粘膜和系统免疫应答[Conference Coverage(ICAAC).New mucosal adjuvant safe in humans.VaccineWeekly 1997；November 3.4]。但是CT和LT对人具有较强的毒性，限制了它们的应用。克服其毒性，保持和提高粘膜佐剂性成为研究热点，包括其无毒或低毒突变体和无毒性的亚单位。
在粘膜疫苗研究中，作为佐剂的CT突变体研究较少，而LT突变体研究较多，如LTK63、LTR72、LTR192G等。LTK63(LTA亚单位63位丝氨酸突变为赖氨酸)基本不具有LT毒性，LTR72(LTA亚单位72位丙氨酸突变为精氨酸)具有很强的粘膜佐剂性，但是其保留很大的ADP－核糖基转移酶毒性，LTR192G(LTA亚单位192位精氨酸突变为甘氨酸)作为粘膜佐剂曾用于人体试验，产生了很强的免疫应答，但是并不能根除已经存在的细菌感染，而且有几名志愿者发生腹泻[Park EJ,Chang JH,Kim JS,et al.The mucosal adjuvanticity of twonontoxic mutants of Escherichia coli heat-labile enterotoxin varies withimmunization routes.Exp.Mol.Med.,2000,32(2):72-78]。寻找更有效、更安全的LT突变体作为佐剂，成为了很多实验室研究方向，其中对LT进行突变研究，试图筛选出高效、低毒的粘膜佐剂，成为他们的主要目标。
LT和CT的亚单位佐剂性研究是另一个分离其毒性和佐剂性的研究方向。LT和CT是由A和B亚单位组成，A亚单位能被蛋白酶裂解为两个片段：A1和A2，A1具有ADP-核糖基转移酶的作用，A2的主要功能是连接A1和B亚单位；在粘膜疫苗研究中，LT和CT的亚单位作为佐剂有：CTB、CTA2B(CT的B亚单位和A2部分)和LTB。研究发现LTB不仅是滴鼻途径而且是口服途径良好粘膜佐剂，与多种抗原经粘膜免疫均能产生良好的免疫应答[Haan L,Verweij WR,Holtrop M et al.Nasal or intramuscular immunization of mice with influenzasubunit antigen and the B subunit of Escherichia coli heat-labile toxininduces IgA-or IgG-mediated protective mucosal immunity.Vaccine.2001Apr 6；19(20-22):2898-907.]。而且LTB在与抗原融合时，更是良好的粘膜佐剂。Hazama等将LTB与Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白(t-gD)基因融合得到融合蛋白t-gD－LTB，融合蛋白滴鼻免疫小鼠，产生高滴度的血清IgG和粘膜sIgA，而且，免疫效果显著好于t-gD与LTB物理融合免疫[Hazama M,Mayumi AonoA,Miyazaki T et al.Intranasal immunization againstherpes simplex virus infection by using a recombinant glycoprotein D fusedwith immunomodulating proteins,the B subunit of Escherichia coli heat-labileenterotoxin and interleukin-2.Immunology.1993Apr；78(4):643-9]；O’Dowd等将LTB的C端基因融合连接14个氨基酸的小肽，将辣根过氧化物酶(HRP)化学融合与小肽连接形成融合蛋白LTB－HRP，滴鼻免疫小鼠，产生很好的系统和粘膜免疫应答，与HRP和LTB物理混合免疫效果相差不显著[O'Dowd AM,Botting CH,Precious B et al.Novel modifications tothe C-terminus of LTB that facilitate site-directed chemical coupling ofantigens and the development of LTB as a carrier for mucosalvaccines.Vaccine.1999Mar 17；17(11-12):1442-53]。
发明内容
综上所述，本发明目的在于提供大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段及其应用，将候选抗原的基因片段插入LT的A1的基因片段中并替换其毒性部位作为疫苗抗原，通过A2片段与LTB连接，既保留了LT的粘膜佐剂结构基础及活性，又去除了其毒性，通过粘膜途径免疫可有效诱导机体粘膜免疫应答，产生特异性IgA抗体，提供一种用于预防病原微生物通过粘膜途径感染的疫苗方式，且目前还没有这方面的报道。
本发明通过下述技术方案实现：
大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段，所述大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labileenterotoxin，LT)基因的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，所述基因片段为去除LT A亚单位基因编码核苷酸序列100-585bp内任意连续片段后的基因片段。
优选地，所述去除LT A亚单位基因编码核苷酸序列100-585bp内任意连续片段的长度范围为30～486bp。
基于上述大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段的融合基因，所述融合基因包括所述大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段和病原微生物富含抗原表位的基因片段。
优选地，所述病原微生物富含抗原表位的基因片段的长度范围为60～675bp。
优选地，所述病原微生物包括细菌、病毒和真菌。
优选地，所述细菌包括葡萄球菌、链球菌、结核菌、肺炎双球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、鲍曼不动杆菌、幽门螺杆菌、霍乱弧菌、致病性大肠杆菌、空肠弯曲菌、沙门氏菌或志贺氏菌。
预选的，所述病毒包括轮状病毒、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、艾滋病病毒、麻疹病毒、风疹病毒、天花病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、麻疹病毒、水痘病毒、肝炎病毒病毒、肠道病毒病毒、流行性乙型脑炎病毒或流行性出血热病毒。
优选地，所述真菌包括组织胞浆菌、副球孢子菌、花斑癣菌、掌黑癣菌、毛结节菌、念珠菌、孢子丝菌、着色芽生菌、曲霉菌、隐球菌、接合菌、霉菌或酵母菌。
基于上述融合基因的应用，所述融合基因用于表达为重组蛋白，作为抗原疫苗活性成分。
基于上述大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段的应用，包括以下步骤：
步骤A，将大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)基因的A亚单位基因编码核苷酸序列100-585bp内任意连续片段除去制成所述基因片段；
步骤B，将病原微生物的富含抗原表位的基因片段插入所述基因片段中形成融合基因；获得包含抗原基因的重组质粒；
步骤C，将所述融合基因通过质粒载体转入宿主菌进行表达获取重组蛋白作为抗原疫苗活性成分。
采用本发明提供的基因片段，将病原微生物对应的各种蛋白候选抗原插入LT的A1片段中并替换其毒性部位作为疫苗抗原，表达获得的重组融合目的蛋白通过A2片段与LTB连接获得重组蛋白可直接用作疫苗。由于本发明提供的重组蛋白疫苗主要用于病原微生物感染，根据需要可替换不同的抗原片段，从而获得一系列的用于预防感染的疫苗，因此本发明可以作为预防感染的疫苗方式。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段及其应用，将候选抗原插入LT的A1片段中并替换其毒性部位作为疫苗抗原，通过A2片段与LTB连接，既保留了LT的粘膜佐剂结构基础及活性，又去除了其毒性，既能通过粘膜途径免疫可有效诱导机体粘膜免疫应答，产生特异性IgA抗体，又能通过注射途径免疫，有效诱导机体产生血清特异性IgG抗体，提供一种用于预防病原微生物感染的疫苗方式，目前还没有这方面的报道。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明重组质粒构建结构示意图；
图2为本发明质粒pET-11cX酶切鉴定结果；
图3为本发明合成质粒pUC19/hpaA1及pUC19/hexon-1酶切鉴定结果；
图4为本发明合成基因tubulin-1酶切鉴定结果；
图5为本发明重组质粒pET-11cX、pET-11cX/hpaA1、pET-11cX/hexon-1和pET-11cX/tubulin-1经NdeI和BamHI双酶切鉴定电泳图；
图6(a)为本发明重组工程菌pET-11cX/hpaA1/BL21诱导表达鉴定结果；图6(b)为重组工程菌pET-11cX/hexon-1/BL21诱导表达鉴定结果；图6(c)为重组工程菌和pET-11cX/tubulin-1/BL21诱导表达鉴定结果；
图7为HpaA1蛋白、Hexon-1蛋白和Tubulin-1蛋白纯化鉴定结果；
图8为重组质粒pET-11c/lt-hpaA2经NdeI和BamHI双酶切鉴定结果；
图9为重组蛋白HpaA2的诱导表达和纯化鉴定结果；
图10为重组蛋白HpaA1、Hexon-1和Tubulin-1的Western抗原性检测结果；
图11为为重组蛋白HpaA2的Western抗原性检测结果；
图12为注射重组蛋白HpaA1的ELISA检测检测结果；
图13为口服重组蛋白HpaA1的ELISA检测检测结果；
图14为注射重组蛋白Hexon-1的ELISA检测检测结果；
图15为口服重组蛋白Hexon-1的ELISA检测检测结果；
图16为注射重组蛋白Tubulin-1的ELISA检测检测结果；
图17为口服重组蛋白Tubulin-1的ELISA检测检测结果；
图18为注射重组蛋白HpaA2的ELISA检测检测结果；
图19为口服重组蛋白HpaA2的ELISA检测检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
重组质粒的构建：
以GenBank公布的大肠杆菌不耐热肠毒素基因(GenBank:AB011677.1)核苷酸序列为模板，完整核苷酸序列如Seq ID No.1所示，设计改造序列，引入多克隆位点，具体设计如下：
编码LT的基因全长1148bp，包括：LTA信号肽(18个氨基酸)基因、编码LTA(240个氨基酸)的基因、编码LTB信号肽(21个氨基酸)基因及编码LTB(103个氨基酸)的基因。在编码LTA的基因末尾与编码LTB信号肽基因开头处有一个移码阅读框，因而编码整个LT的基因是一个连续的DNA序列。
编码LTA的基因核苷酸序列如Seq ID No.2所示，经生物信息学分析及结构分析，去除LT A亚单位基因编码核酸序列100-585bp，然后引入多克隆位点序列：CCATGGACTAGTGGTACCCCGCGGGTCGACGCGGCCGCACTCGAG(NcoI、SpeI、KpnI、SacII、SalI、NotI、XhoI)，并在5’端引入NdeI酶切位点，3’端引入BamHI酶切位点，如Seq ID No.3所示。
基因序列由北京六合华大基因科技有限公司合成，将所述引入多克隆位点和酶切位点的基础基因连接到pET-11c质粒NdeI酶切位点和BamHI酶切位点间，获得含有基础基因的重组质粒：pET-11cX。重组质粒构建如图1所示，表达载体采用的pET-11c，购于Novagen公司。
表1重组质粒构建酶切反应体系
将上述反应物混匀，37℃酶切1h，1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，酶切鉴定结果如图2所示，Lane1：为本发明重组质粒pET-11cX经NcoI+XhoI双酶切结果；
Lane2：核酸Marker DL5000(TaKaRa，3428)。
实施例2
幽门螺杆菌粘附素HpaA基因片段插入pET-11cX表达重组蛋白制备疫苗：
(1)幽门螺杆菌粘附素HpaA基因片段hpaA1的获得：
所述幽门螺杆菌粘附素hpaA1基因片段的核苷酸序列如Seq ID No.4所示，基因序列由北京六合华大基因科技有限公司合成，上游引入NcoI酶切位点，下游引入XhoI酶切位点，插入常用克隆载体pUC19得到pUC19/hpaA1合成质粒。
(2)酶切：
将合成获得的pET-11cX与pUC19/hpaA1合成质粒，用限制性内切酶NcoI+XhoI做双酶切，按照说明书操作。酶切反应体系配制如下：
表2重组质粒构建酶切反应体系
将上述反应物混匀，37℃酶切1h。pUC19/hpaA1合成质粒酶切鉴定结果如图3所示，Lane1：核酸Marker DL5000(TaKaRa，3428)；Lane2：pUC19/hpaA1合成质粒经NcoI+XhoI双酶切结果。琼脂糖凝胶电泳，分别回收6.3kb pET-11cX载体片段和687bp hpaA1基因片段。
(3)连接：
通过紫外分光光度计检测pET-11cX和hpaA1基因浓度，根据外源片段与载体摩尔数比一般为l:2～10的原则，进行连接反应，连接反应体系(TaKaRa，Code：D6022A)如下：
hpaA1基因酶切回收产物4μl；pET-11cX酶切回收产物lμl；连接溶液(Solution I)5μl。总体积10μl，16℃连接反应2h。
(4)转化：
将连接产物，转化E.coli/DH5a，氨苄抗性LB平板筛选阳性重组子。
(5)鉴定重组质粒：
挑取氨苄抗性筛选平板上的单个菌落培养，抽提质粒，NdeI+BamHI做双酶切鉴定，鉴定电泳图结果如图5所示，Lane1：为本发明重组质粒pET-11cX酶切鉴定结果；Lane2：核酸Marker DL5000(TaKaRa，3428)；Lane4：为本发明重组质粒pET-11cX/hpaA1酶切鉴定结果；见5.7kb载体片段和1357bp lt-hpaA1基因片段。鉴定正确后，质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，融合基因序列与预计完全一致。
(6)转化E.coli/BL21(DE3)及表达鉴定：
(a)转化
取重组质粒pET-11cX/hpaA1，转化E.coli/BL21(DE3)感受态细胞(TIANGEN，Code：CB105)，按操作说明书进行，氨苄抗性LB平板筛选阳性重组子。
(b)重组工程菌鉴定
挑取氨苄抗性筛选平板上的单个菌落培养，抽提质粒，用NdeI+BamHI做双酶切鉴定，鉴定结果与重组质粒鉴定结果图5一致。鉴定正确后，进行表达鉴定。
(c)HpaA1蛋白表达鉴定
1)重组工程菌的诱导
取鉴定正确的重组工程菌pET-11cX/hpaA1/BL21接种于10ml含0.1mg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜，然后转种于LB培养液中，16℃IPTG诱导12h收获，SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。
2)SDS-PAGE鉴定HpaA1蛋白的表达
取1m1诱导12h的菌液，离心处理，双蒸水重悬沉淀，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液(Beyotime，Code：P0015)，混匀，沸水浴5分钟。SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，与蛋白Marker(Thermo，26616)对照分析电泳结果，有与设计的重组融合蛋白理论分子量(35.8kd)相符的蛋白表达，鉴定结果如图6(a)所示，其中
Lane1：蛋白Marker(Thermo，26616)；
Lane2：pET-11cX/hpaA1/BL21诱导前全菌；
Lane3：pET-11cX/hpaA1/BL21诱导后超声破菌上清；
Lane4：pET-11cX/hpaA1/BL21诱导后超声破菌沉淀；
Lane5：pET-11cX/hpaA1/BL21诱导后全菌。
(7)HpaA1蛋白纯化：
取诱导表达的菌液离心，沉淀称重，1:10质量体积比加入PBS(pH7.2)缓冲液，超声破菌；离心，取上清，D-半乳糖(Thermo，20372)柱纯化，用含100mMD-半乳糖的PBS(pH7.2)缓冲液洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE电泳鉴定，如图7所示，其中，Lane1：蛋白Marker(Thermo，26616)，Lane2：HpaA1纯化样品。
实施例3
腺病毒壳粒蛋白Hexon基因片段插入pET-11cX表达重组蛋白制备疫苗：
(1)腺病毒壳粒蛋白Hexon基因片段hexon-1的获得：
腺病毒壳粒蛋白Hexon基因片段hexon-1的核苷酸序列如Seq ID No.5所示，基因序列由北京六合华大基因科技有限公司合成，上游引入NcoI酶切位点，下游引入XhoI酶切位点，插入常用克隆载体pUC19得到pUC19/hexon-1合成质粒。
(2)酶切：
将合成获得的pET-11cX与pUC19/hexon-1合成质粒，用限制性内切酶NcoI+XhoI做双酶切，按照说明书操作。酶切反应体系配制如下：
表3重组质粒构建酶切反应体系
将上述反应物混匀，37℃酶切1h。pUC19/hexon-1合成质粒酶切鉴定结果如图3所示，Lane3：pUC19/hexon-1合成质粒经NcoI+XhoI双酶切结果。琼脂糖凝胶电泳，分别回收6.3kbpET-11cX载体片段和384bp hexon-1基因片段。
(3)连接：
通过紫外分光光度计检测pET-11cX和hexon-1基因浓度，根据外源片段与载体摩尔数比一般为l:2～10的原则，进行连接反应，连接反应体系(TaKaRa，Code：D6022A)如下：
hexon-1基因酶切回收产物4μl；pET-11cX酶切回收产物lμl；连接溶液(SolutionI)5μl。总体积10μl，16℃连接反应2h。
(4)转化：
将连接产物，转化E.coli/DH5a，氨苄抗性LB平板筛选阳性重组子。
(5)鉴定重组质粒：
挑取氨苄抗性筛选平板上的单个菌落培养，抽提质粒，用NdeI+BamHI做双酶切鉴定，鉴定结果如图5所示，Lane3：见5.7kb载体片段及1066bp重组lt-hexon-1基因片段，鉴定正确后，质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，融合基因序列与预计完全一致。
(6)转化E.coli/BL21(DE3)及表达鉴定：
(a)转化
取重组质粒pET-11cX/hexon-1，转化E.coli/BL21(DE3)感受态细胞(TIANGEN，Code：CB105)，按操作说明书进行，氨苄抗性LB平板筛选阳性重组子。
(b)重组工程菌鉴定
挑取氨苄抗性筛选平板上的单个菌落培养，抽提质粒，用NdeI+BamHI做双酶切鉴定，鉴定结果与重组质粒鉴定结果图5一致。鉴定正确后，进行表达鉴定。
(c)Hexon-1表达鉴定
1)重组工程菌的诱导
取鉴定正确的重组工程菌pET-11cX/hexon-1/BL21接种于10ml含0.1mg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜，37℃摇床培养过夜，转种LB培养液中，16℃IPTG诱导12小时收获，SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。
2)SDS-PAGE鉴定hexon-1的表达
取1m1诱导12h的菌液，离心双蒸水重悬沉淀，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液(Beyotime，Code：P0015)，混匀，沸水浴5分钟。SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，与蛋白Marker(Thermo，26616)对照分析电泳结果，有与设计的重组融合蛋白理论分子量(23.2kd)相符的蛋白表达。鉴定结果如图6(b)所示，其中：
Lane1：蛋白Marker(Thermo，26616)；
Lane2：pET-11cX/hexon-1/BL21诱导后超声破菌沉淀；
Lane3：pET-11cX/hexon-1/BL21诱导后全菌；
Lane4：pET-11cX/hexon-1/BL21诱导后超声破菌上清；
Lane5：pET-11cX/hexon-1/BL21诱导前全菌。
(7)Hexon-1纯化：
取诱导表达的菌液离心，沉淀称重，1:10质量体积比加入PBS(pH7.2)缓冲液，超声破菌，离心取上清，D-半乳糖(Thermo，20372)柱纯化，用含100mMD-半乳糖的PBS(pH7.2)缓冲液洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE电泳鉴定，鉴定结果如图7所示，其中，Lane3：hexon-1纯化样品。
实施例4
白假丝酵母菌β-微管蛋白Tubulin基因片段插入pET-11cX表达重组蛋白制备疫苗：
(1)白假丝酵母菌β-微管蛋白基因片段tubulin-1的获得：
白假丝酵母菌β-微管蛋白的tubulin-1基因片段的核苷酸序列如Seq ID No.6所示，基因序列按引物合成方式由北京六合华大基因科技有限公司合成单链，上游引入NcoI酶切位点，下游引入XhoI酶切位点，各取0.5nmol，放入annealing buffer(10mM tris,50mMNacl,1mM EDTA)95℃4分钟，20℃5分钟，获得双链tubulin-1DNA。
(2)酶切：
将pET-11cX与tubulin-1，用限制性内切酶NcoI+XhoI做双酶切，按照说明书操作。酶切反应体系配制如下：
表4重组质粒构建酶切反应体系
将上述反应物混匀，37℃酶切1h。酶切鉴定结果如图4所示，其中，Lane1：50bp DNALadder(TIANGEN，MD108)，Lane2：tubulin-1双链DNA经NcoI+XhoI双酶切结果。琼脂糖凝胶电泳，分别回收6.3kb pET-11cX载体片段，超薄回收试剂盒(TIANGEN，DP208-02)直接回收66bp tubulin-1基因片段。
(3)连接：
通过紫外分光光度计检测pET-11cX和tubulin-1基因浓度，根据外源片段与载体摩尔数比一般为l:2～10的原则，进行连接反应，连接反应体系(TaKaRa，Code：D6022A)如下：
tubulin-1基因酶切回收产物4μl；pET-11cX酶切回收产物lμl；连接溶液(Solution I)5μl。总体积10μl，16℃连接反应2h。
(4)转化：
将连接产物，转化E.coli/DH5a，氨苄抗性LB平板筛选阳性重组子。
(5)鉴定重组质粒：
挑取氨苄抗性筛选平板上的单个菌落培养，抽提质粒，用NdeI+BamHI做双酶切鉴定，鉴定结果如图5所示，Lane5：见5.7kb载体片段及736bp重组lt-hexon-1入片段；鉴定正确后，质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，融合基因序列与预计完全一致。
(6)转化E.coli/BL21(DE3)及表达鉴定：
(a)转化
取重组质粒pET-11cX/tubulin-1，转化E.coli/BL21(DE3)感受态细胞(TIANGEN，Code：CB105)，按操作说明书进行，氨苄抗性LB平板筛选阳性重组子。
(b)重组工程菌鉴定
挑取氨苄抗性筛选平板上的单个菌落培养，抽提质粒，用NcoI+XhoI做双酶切鉴定，鉴定结果与重组质粒鉴定结果图5一致。鉴定正确后，进行表达鉴定。
(c)Tubulin-1表达鉴定
1)重组工程菌的诱导
取鉴定正确的重组工程菌pET-11cX/tubulin-1/BL21接种于10ml含0.1mg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜，转种LB培养液中，16℃IPTG诱导12小时收获，SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。
2)SDS-PAGE鉴定Tubulin-1的表达
取1m1诱导12小时的菌液，离心双蒸水重悬沉淀，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液(Beyotime，Code：P0015)，混匀，沸水浴5分钟。SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，与蛋白Marker(Fermentas，Code：#SM0671)对照分析电泳结果，有与设计的重组融合蛋白理论分子量(12.1kd)相符的蛋白表达。鉴定结果如图6(c)所示，其中：
Lane1：蛋白Marker(Thermo，26616)；
Lane2：pET-11cX/tubulin-1/BL21诱导前全菌；
Lane3：pET-11cX/tubulin-1/BL21诱导后全菌；
Lane4：pET-11cX/tubulin-1/BL21诱导后超声破菌沉淀；
Lane5：pET-11cX/tubulin-1/BL21诱导后超声破菌上清。
(7)Tubulin-1纯化：
取诱导表达的菌液离心，沉淀称重，1:10质量体积比加入PBS(pH7.2)缓冲液，超声破菌，离心取上清，D-半乳糖(Thermo，20372)柱纯化，用含100mMD-半乳糖的PBS(pH7.2)缓冲液洗脱，收集洗脱峰，SDS-PAGE电泳鉴定，鉴定结果如图7所示，其中，Lane4：Tubulin-1纯化样品。
实施例5
制备HpaA2重组蛋白疫苗，具体方法如下：
以GenBank公布的大肠杆菌不耐热肠毒素基因(GenBank:AB011677.1)核苷酸序列为模板，完整核苷酸序列如Seq ID No.1所示，设计改造序列，具体设计如下：
经生物信息学分析及结构分析，去除LT A亚单位基因编码核酸序列361-390bp获得基础基因，核苷酸序列表如Seq ID No.7所示；然后将去除了的基因片段部分替换为幽门螺杆菌粘附素基因片段hpaA2，所述幽门螺杆菌粘附素基因片段hpaA2的核苷酸序列如SeqID No.8所示。由北京六合华大基因科技有限公司合成基因序列，做法与合成pET-11cX相同，通过NdeI和BamHI双酶切连接到pET-11c。如图8所示，为本发明重组质粒pET-11c/lt-hpaA2经NdeI和BamHI双酶切鉴定结果，其中，Lane1：核酸Marker DL5000(TaKaRa，3428)；Lane2：为本发明重组质粒pET-11cX/hpaA2酶切鉴定结果，见5.7kb载体片段和1148bp lt-hpaA2基因片段。
然后，采用同实施例1相同的方法进行转化、诱导表达和纯化处理获得重组蛋白HpaA2，HpaA2蛋白的诱导表达和纯化鉴定结果如图9所示，其中：
Lane1：蛋白Marker(Thermo，26616)
Lane2：pET-11cX/hpaA2/BL21诱导前全菌
Lane3-4：pET-11cX/hpaA2/BL21诱导后全菌
Lane5：pET-11cX/hpaA2/BL21诱导后超声破菌上清
Lane6：pET-11cX/hpaA2/BL21诱导后超声破菌沉淀
Lane7：HpaA2纯化样品。
重组蛋白疫苗HpaA1、Hexon-1和Tubulin-1的抗原性检测：
(一)Western检测重组HpaA1蛋白的免疫反应性
取纯化得到的重组HpaA1蛋白，SDS-PAGE电泳后电转印PVDF膜，以兔抗幽门螺杆菌抗血清(ATCC 700824，免疫家兔制备)1:1,000稀释作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG1:5,000稀释作为二抗，进行Western检测。如图10所示，其中Lane1：蛋白Marker(Thermo，26616)，Lane2：HpaA1Western检测结果。结果表明重组蛋白与兔抗幽门螺杆菌抗血清有很好的免疫反应性，
(二)动物实验检测重组HpaA1蛋白的免疫原性
取重组HpaA1蛋白50μg，腹腔注射免疫BalB/c小鼠，每周1次，共3次。末次免疫后21d，眶静脉取血，分离血清。用幽门螺杆菌(ATCC 700824)全菌超声上清包被(100ng/孔)酶标板，ELISA检测BalB/c小鼠血清抗幽门螺杆菌IgG抗体，检测结果如图12所示。重组蛋白注射免疫组特异性血清IgG效价达1:524288，而对照缓冲液注射组血清特异性IgG水平无显著变化。结果表明，重组蛋白具有良好的免疫原性，注射免疫可刺激机体产生高滴度的特异性血清IgG。
取重组HpaA1蛋白200μg，口服免疫BalB/c小鼠，每周1次，共3次。末次免疫后21d，采集唾液标本。用幽门螺杆菌全菌超声上清包被(100ng/孔)酶标板，ELISA检测BalB/c小鼠唾液抗幽门螺杆菌sIgA，检测结果如图13所示。重组蛋白免疫组唾液特异性sIgA效价达1:128，对照缓冲液免疫组唾液特异性sIgA水平无显著变化。结果表明，重组蛋白口服免疫可刺激机体产生较高滴度的特异性唾液sIgA。
(三)Western检测重组蛋白Hexon-1、Tubulin-1和HpaA2的免疫反应性
按与“Western检测重组蛋白HpaA1的免疫反应性”相同方法，分别用兔抗腺病毒抗血清(Hanbio，货号mLEPR，免疫家兔制备)对Hexon-1进行Western检测，用兔抗白假丝酵母菌抗血清(广东省微生物菌种保藏中心GIM2.178，免疫家兔制备)对Tubulin-1进行Western检测，检测结果如图10所示，其中Lane3：hexon-1Western检测结果，Lane4：Tubulin-1Western检测结果。采用与HpaA1相同的抗血清对HpaA2进行Western检测，检测结果如图11所示，其中，Lane1：HpaA2Western检测结果，Lane2：蛋白Marker(Thermo，26616)。结果表明：重组蛋白Hexon-1与兔抗腺病毒抗血清有很好的免疫反应性，重组蛋白Tubulin-1与兔抗白假丝酵母菌抗血清有很好的免疫反应性，重组蛋白HpaA2与兔抗幽门螺杆菌抗血清有很好的免疫反应性。
(四)动物实验检测重组蛋白Hexon-1、Tubulin-1和HpaA2的免疫原性
按与“动物实验检测重组蛋白HpaA1的免疫原性”相同方法，分别用腺病毒(Hanbio，货号mLEPR)超声上清包被酶标板检测重组Hexon-1蛋白的免疫原性，用白假丝酵母菌(广东省微生物菌种保藏中心GIM2.178)超声上清包被酶标板检测重组Tubulin-1蛋白的免疫原性，用于与HpaA1相同的幽门螺杆菌全菌超声上清包被酶标板检测重组HpaA2蛋白的免疫原性，检测结果如图14～19所示。结果表明：重组蛋白Hexon-1、Tubulin-1和HpaA2均具有良好的免疫原性，可有效的刺激小鼠产生特异性血清IgG和唾液sIgA。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 刘开云
<120> 大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段及其应用
<130> 1
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1148
<212> DNA
<213> 大肠杆菌不耐热肠毒素基因的完整核苷酸序列
<400> 1
atgaaaaata taactttcat tttttttatt ttattagcat cgccattata tgcaaatggc 60
gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt 120
atgcccagag ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat 180
gatcacgcga gaggaacaca aaccggcttt gtcagatatg atgacggata tgtttccact 240
tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact 300
tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc 360
gtatacagcc ctcacccata tgaacaggag gtttctgcgt taggtggaat accatattct 420
cagatatatg gatggtatcg tgttaatttt ggtgtaattg atgaacgatt acatcgtaac 480
agggaatata gagaccggta ttacagaaat ctgaatatag ctccggcaga ggatggttac 540
agattagcag gtttcccacc ggatcaccaa gcttggagag aagaaccctg gattcatcat 600
gcaccacaag gttgtggaaa ttcatcaaga acaattacag atgatacttg taatgaggag 660
acccagaatc tgagcacaat atatctcagg aaatatcaat caaaagttaa gaggcagata 720
ttttcagact atcagtcaga ggttgacata tataacagaa ttcgggatga attatgaata 780
aagtaaaatg ttatgtttta tttacggcgt tactatcctc tctatgtgca tacggagctc 840
cccagtctat tacagaacta tgttcggaat atcgcaacac acaaatatat acgataaatg 900
acaagatact atcatatacg gaatcgatgg caggtaaaag agaaatggtt atcattacat 960
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<213> 大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位基因的核苷酸序列
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<213> 引入多克隆位点后的大肠杆菌基因片段核苷酸序列
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gacaaattat accgtgctga ctctagaccc ccagatgaaa taaaacgttc cggaggtctt 120
atgcccagag ggcataatga gtacttcgat agaggaactc aaatgaatat taatctttat 180
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tctcttagtt tgagaagtgc tcacttagca ggacagtcta tattatcagg atattccact 300
tactatatat atgttatagc gacagcacca aatatgttta atgttaatga tgtattaggc 360
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caggtaaaag agaaatggtt atcattacat ttaagagcgg cgcaacattt caggtcgaag 960
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<212> DNA
<213> 幽门螺杆菌粘附素基因片段hpaA2的核苷酸序列
<400> 8
gatggaatgc ctgcaaaaca gcagcacaat 30

Claims (10)

1.大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段，其特征在于，所述大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)基因的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，所述基因片段为去除LTA亚单位基因编码核苷酸序列100-585bp内任意连续片段后的基因片段。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段，其特征在于，所述去除LT A亚单位基因编码核苷酸序列100-585bp内任意连续片段的长度范围为30～486bp。
3.基于权利要求1所述的大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段的融合基因，其特征在于，所述融合基因包括所述大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段和病原微生物富含抗原表位的基因片段。
4.根据权利要求3所述的融合基因，其特征在于，所述病原微生物富含抗原表位的基因片段的长度范围为60～675bp。
5.根据权利要求3所述的融合基因，其特征在于，所述病原微生物包括细菌、病毒和真菌。
6.根据权利要求5所述的融合基因，其特征在于，所述细菌包括葡萄球菌、链球菌、结核菌、肺炎双球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、鲍曼不动杆菌、幽门螺杆菌、霍乱弧菌、致病性大肠杆菌、空肠弯曲菌、沙门氏菌或志贺氏菌。
7.根据权利要求5所述的融合基因，其特征在于，所述病毒包括轮状病毒、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、艾滋病病毒、麻疹病毒、风疹病毒、天花病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、麻疹病毒、水痘病毒、肝炎病毒病毒、肠道病毒病毒、流行性乙型脑炎病毒或流行性出血热病毒。
8.根据权利要求5所述的融合基因，其特征在于，所述真菌包括组织胞浆菌、副球孢子菌、花斑癣菌、掌黑癣菌、毛结节菌、念珠菌、孢子丝菌、着色芽生菌、曲霉菌、隐球菌、接合菌、霉菌或酵母菌。
9.基于权利要求3～8任一项所述的融合基因的应用，其特征在于，所述融合基因用于表达为重组蛋白，作为抗原疫苗活性成分。
10.权利要求1～2任一项所述大肠杆菌不耐热肠毒素基因片段的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A，将大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)基因的A亚单位基因编码核苷酸序列100-585bp内任意连续片段除去制成所述基因片段；
步骤B，将病原微生物的富含抗原表位的基因片段插入所述基因片段中形成融合基因；获得包含抗原基因的重组质粒；
步骤C，将所述融合基因通过质粒载体转入宿主菌进行表达获取重组蛋白作为抗原疫苗活性成分。
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