CN102643850B

CN102643850B - 幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法

Info

Publication number: CN102643850B
Application number: CN 201210113718
Authority: CN
Inventors: 金守光; 杨洪江
Original assignee: TIANJIN TIANFOLUO BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: TIANJIN TIANFOLUO BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2012-04-18
Filing date: 2012-04-18
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2032-04-18
Also published as: CN102643850A

Abstract

本发明涉及一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，步骤如下：(1)分别扩增6种毒力蛋白基因，针对6种毒力蛋白设计引物，引物序列见序列1至序列12，引物分别插入限制性内切酶位点，这6种重组毒力蛋白的N端分别携带6个His标记；(2)分别克隆6种毒力蛋白编码基因；(3)分别亚克隆6种毒力蛋白编码基因到表达载体上；(4)大肠杆菌宿主细胞内分别表达6种毒力蛋白；(5)纯化。本6种蛋白编码基因或氨基酸序列具有高度保守性和特异性，并且与患者的症状相关，因此制备的毒力蛋白可以用于基因工程疫苗和临床诊断试剂盒的候选抗原。

Description

幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法

技术领域

本发明属于蛋白质组学领域，尤其是一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)在1983年由澳大利亚医生发现，呈螺旋状，为革兰氏阴性菌，定殖于人胃部。幽门螺旋杆菌感染是引起人类消化道疾病的重要原因，能够导致慢性胃炎、严重萎缩性胃炎、消化道溃疡和胃癌等相关疾病。

幽门螺旋杆菌存在多种毒力因子，包括鞭毛蛋白(flagellin)、空泡毒素(vacuolatingcytotoxin，VacA)、细胞毒素相关蛋白(cytotoxin associated gene A，CagA)和尿素酶(urease)等。鞭毛蛋白是幽门螺旋杆菌鞭毛的主要组成蛋白，是细菌运动的动力，鞭毛蛋白本身可以抵御酸性环境，对鞭毛具有保护作用，运动能力较强的菌株其致病性较高。空泡毒素VacA能够分泌到细菌外部，对胃上皮细胞造成损伤，产生空泡性病变，另外能够改变细胞膜的离子通透性，导致细胞整体病变。所有幽门螺旋杆菌存在VacA编码基因，但是只有约50％的菌株表达VacA蛋白。细胞毒素相关蛋白(CagA)分子量为128kD，存在于60-70％的幽门螺旋杆菌菌株中，具有CagA为I型菌株，具有较强致病性，CagA阴性为II型菌株，致病性较弱，在胃炎患者中中，CagA抗体阳性率为70-75％，在十二指肠溃疡患者中，CagA抗体阳性率几乎为100％。尿素酶产生高浓度氨，导致细胞空泡病变。

西方国家30-50％的人群感染过幽门螺旋杆菌，我国幽门螺旋杆菌感染率高达70-90％，随着年龄增长，感染率有增加的趋势。感染人群中的10％的患者会出现临床症状，包括胃炎、胃十二指肠溃疡等，若不接受抗菌素治疗，感染可持续终生，其中部分患者可能导致胃癌。

目前检测幽门螺旋杆菌感染的方法较多，包括检测患者血清中的幽门螺旋杆菌抗体、粪便中幽门螺旋杆菌的抗原、尿素呼气试验、定量PCR方法、细菌培养方法和病理学检测方法等。其中，检测患者血清中的幽门螺旋杆菌抗体，包括酶联免疫吸附试验、免疫印记和胶体金等方法，具有特异性高，能够定量分析的特点，但是试验中涉及的幽门螺杆菌抗原，为部分纯化的幽门螺旋杆菌全抗原，其特异性和稳定性等方面不能完全满足检测要求。

发明内容

本发明在于在于克服现有技术的不足之处，提供一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，本蛋白组可以用于基因工程疫苗和临床诊断试剂盒的候选抗原。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，步骤如下：

(1)分别扩增6种毒力蛋白基因，针对6种毒力蛋白设计引物，引物序列见序列1至序列12，引物分别插入限制性内切酶位点；

(2)分别克隆6种毒力蛋白编码基因；

(3)分别亚克隆6种毒力蛋白编码基因到表达载体上；

(4)大肠杆菌宿主细胞内分别表达6种毒力蛋白；

(5)纯化；

所述6种毒力蛋白为细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B。

而且，所述步骤(2)的6种毒力蛋白编码基因分别克隆到TOPO TA

Kits试剂盒或T-EASAY试剂盒的质粒载体上。

而且，所述步骤(3)的6种毒力蛋白编码基因分别亚克隆到表达载体pQE30上。

而且，所述步骤(5)利用Ni-NTA纯化填料制备的层析柱，分离纯化这6种重组毒力蛋白。

本发明的有益效果和优点是：

本发明涉及的6种毒力蛋白包括细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B，其编码基因或氨基酸序列具有高度保守性和特异性，并且与患者的症状相关，因此制备的毒力蛋白可以用于基因工程疫苗和临床诊断试剂盒的候选抗原，以及临床用药指导以及流行病学调查等多个领域。

附图说明

图1为本发明幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因的PCR扩增产物分析，其中，1cagA，2vacA，3ureA，4ureB，5flaA，6flaB；

图2为本发明重组质粒的限制性内切酶图谱。使用的限制性内切酶分别为BamHI和SalI，图谱中1.3kb和2.5kb的条带来自基因表达的辅助质粒pREP4，vector为克隆基因的载体，大小为3.4kb，三角形代表克隆的基因片段，大小与预期相同，其中ureB基因的部分片段与载体片段连接在一起，大小与预期也相同；

图3重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白表达与纯化结果分析，其中1CagA，2VacA，3FlaA，4FlaB，5UreA，6UreB，。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明采用生物信息学方法，利用幽门螺旋杆菌基因组序列信息，经过比对分析，确定6种幽门螺旋杆菌重要毒力蛋白，包括细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B。这6种蛋白氨基酸序列或编码基因核苷酸序列具有高度保守性，并且具有特异性，即与其它病原微生物蛋白或基因同源性很低；另一方面这些毒力蛋白的存在与患者的症状相关。综上所述，本发明制备的毒力蛋白可以用于基因工程疫苗和临床诊断试剂盒的候选抗原。

利用生物信息方法，设计特定引物，引物插入适当限制性内切酶位点，保证扩增DNA片段能够准确连接到表达载体上。引物合成后，以幽门螺旋杆菌染色体DNA为模板，利用PCR方法分别扩增该6种毒力蛋白编码基因，经琼脂糖凝胶电泳分析，确定扩增产物是否存在。

利用TA克隆的方法，将毒力蛋白编码基因的扩增产物分别克隆到TOPO TA

Kits试剂盒质粒载体上，转化大肠杆菌，在含有X-GAL和IPTG的LB平板上涂板，挑选白色菌落进行液体培养提取质粒DNA，质粒DNA经过限制性内切酶酶切后，利用琼脂糖凝胶电泳分析。含有毒力蛋白编码基因的质粒，经过限制性内切酶酶切，制备含有毒力蛋白编码基因的DNA片段，进一步亚克隆到经过同样限制性内切酶酶切的表达载体pQE30上，转化子经过分析确定正确后，用于蛋白表达的实验。

正确转化子中的重组质粒携带幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因，在IPTG的诱导下，毒力蛋白编码基因在大肠杆菌宿主细胞内表达，这6种重组毒力蛋白的N端分别携带6个His标记，便于纯化。通过优化诱导表达条件，大量表达重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE方法，鉴定重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白是否表达、是否可溶、是否形成包涵体以及表达量的多少。

表达的6种重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白，采用Ni-NTA纯化填料制备的层析柱，进行分离纯化。6种重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白N端均具有6×His的标签，通过与Ni-NTA填料结合，经过洗涤和洗脱等步骤，制备单一的重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白纯品。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE方法，鉴定重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白纯化的程度以及制备的数量等。

具体制备方法如下：

一、幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因的扩增与克隆

(1)利用BHI培养基液体培养幽门螺旋杆菌，10000g离心5min收集细菌细胞；

(2)利用TE缓冲液重悬细胞，加入0.1％SDS破壁，然后加入10μg/mL蛋白酶K，37℃过夜消化，用苯酚氯仿抽提若干次至无白色膜状物存在，氯仿抽提一次，加入2.5倍体积95％乙醇沉淀染色体DNA，10000g离心10min弃上清，用70％乙醇洗涤一次，沉淀干燥后加入TE缓冲液重悬成为染色体DNA溶液；

(3)扩增幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因。

扩增体系包括1μL提取的幽门螺旋杆菌染色体DNA为模板(0.1μg)、4μL设计的扩增引物(20pmol/L)、10μL缓冲液(10×)、8μL dNTPs(2.5mmol/L)、1μL Taq DNA聚合酶(2.5u)和76μL ddH₂O。在PCR仪上进行扩增，扩增参数为：

1个循环：95℃预变性5min

35个循环：

95℃变性1min

56℃复性1min

72℃延伸2min

1个循环：72℃保温10min。

6种幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因大小不同，设计的引物保证特异性的同时，引物加入了不同的限制性内切酶位点，保证扩增的基因能够亚克隆到表达载体质粒上，并且毒力蛋白编码基因与载体质粒上的组氨酸编码序列连接中不产生移码突变。6种毒力蛋白编码基因PCR扩增所用引物序列如表1所示。

表1、扩增幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因的引物

PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，不同的毒力蛋白编码基因的大小与预期的产物完全相同，扩增结果如图1所示，PCR扩增成功，扩增产物可以用于下一步克隆实验。

(4)利用TA克隆的方法，将毒力蛋白编码基因的扩增产物分别克隆到TOPO TA

Kits试剂盒或T-EASAY试剂盒的质粒载体上。

连接体系包括1μL连接载体pCR2.1TOPO或

-T Easy、5μL连接缓冲液、1μL扩增产物、1μL连接酶和2μL水，37℃连接0.5h，连接产物转化大肠杆菌。

首先制备大肠杆菌化学感受态细胞，挑取大肠杆菌XL1-Gold单个菌落于液体LB培养基中，37℃过夜培养。转接过夜培养物至200mL LB培养基中，接种量为1％，继续培养对数期(OD₆₀₀约0.5)，将培养液转入离心管中冰浴，至完全冷却；将培养液于4℃、3500rpm离心10min。菌体沉淀用10mL 0.1mol/L氯化镁溶液重悬冰浴5min，然后于4℃、3500rpm离心10min；10mL 0.1mol/L氯化钙溶液重悬沉淀冰浴30min，而后4℃、3500rpm离心10min；用2mL混合溶液(0.1mol/L氯化钙/15％甘油保存)重悬沉淀，混匀后以200μL/管(离心管预先冰浴10min)分装，最终于-70℃保存；

其次进行转化，取上述5μL PCR产物的连接产物和200μL大肠杆菌XL1-Gold感受态细胞混匀，冰浴30min，42℃热激30s，而后于冰上静置2min。加入200μL LB液体培养基，于37℃振荡培养20min后，取100μL涂于蓝白筛选培养基(Amp 100μg/mL、X-GAL 40μg/mL和IPTG 1mmol/L)的平板上，37℃过夜培养。

最后进行转化子鉴定，用无菌牙签挑取白色菌落，于LB液体培养基(Amp 100μg/mL)中扩增培养后，取1mL菌液保存，剩余培养液用于质粒的提取和酶切鉴定。

(5)含有毒力蛋白编码基因的质粒，经过限制性内切酶酶切，制备含有毒力蛋白编码基因的DNA片段，进一步亚克隆到经过同样限制性内切酶酶切的表达载体pQE30上。

转化子经过提取质粒，用限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳后，挑选重组质粒，即包括载体本身和PCR片段的质粒，经过上述分析确定正确后，进一步进行DNA序列分析，确定载体质粒与插入DNA片段连接正确，正确的克隆用于蛋白表达的实验。结果见图2。

二、重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白的表达与纯化

(1)挑取正确转化子的单菌落，接种于含有抗菌素的LB液体培养基中，37℃，250rpm/min振荡培养过夜。将过夜培养物按照10％转接至含有抗菌素的LB液体培养基中，37℃，250rpm/min振荡培养至OD₆₀₀＝0.4-0.5。取1ml菌液离心收集菌体，-20℃冻存备用；

(2)加入诱导剂IPTG终浓度为1mM，28℃，200rpm/min振荡培养6～8小时。取1ml菌液离心收集菌体，-20℃冻存备用；

(3)将诱导前后菌体沉淀分别加入100μL的2×SDS上样缓冲液，煮沸加热10min，利用SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析，考马斯亮蓝染色3小时后，脱色观察结果；

(4)选取诱导成功的细菌克隆，扩大培养规模，收集菌体沉淀，准备做下一步纯化；

(5)将菌体沉淀溶于适量裂解液中，室温下搅拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。10000g 4℃离心30min，收集上清液；

(6)将Ni-NTA Agarose充填柱子，并连接于Bio-rad低压液相层析系统，用5倍柱体积的裂解液平衡Ni-NTA Agarose，调节A₂₈₀值至零线；

(7)将上清液上样到Ni-NTA Agarose柱子中，并用lysis buffer冲洗至A₂₈₀值低于0.01。分别用5～10倍柱体积的清洗液1和清洗液2(Wash buffer 1 and 2市售产品)清洗柱子，直至洗脱液A₂₈₀值低于0.01；

(8)用洗脱液(Elution buffer)洗脱重组蛋白质，在A₂₈₀值监测下，收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液；

利用聚丙烯先凝胶电泳SDS-PAGE分析产物的纯度和数量，结果如图3所示，在SDS-PAGE图谱上，呈现为6种重组毒力蛋白的条带，基本不存在其它条带。

Claims

1.一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，其特征在于：步骤如下：

⑴分别扩增 6 种毒力蛋白基因，针对 6 种毒力蛋白设计引物，引物序列见序列 1 至序列12，引物分别插入限制性内切酶位点；

⑵分别克隆6种毒力蛋白编码基因；

⑶分别亚克隆6种毒力蛋白编码基因到表达载体上；

⑷大肠杆菌宿主细胞内分别表达6种毒力蛋白；

⑸纯化；

所述6种毒力蛋白为细胞毒素相关蛋白CagA 、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、

鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基 A和尿素酶亚基B；

所述细胞毒素相关蛋白CagA的上游引物为序列1，下游引物为序列2；

所述空泡毒素蛋白VacA的上游引物为序列3，下游引物为序列4；

所述鞭毛蛋白亚基A的上游引物为序列5，下游引物为序列6；

所述鞭毛蛋白亚基B的上游引物为序列7，下游引物为序列8；

所述尿素酶亚基 A的上游引物为序列9，下游引物为序列10；

所述尿素酶亚基B的上游引物为序列11，下游引物为序列12。

2.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，其特征在于：所述步

骤⑵的6种毒力蛋白编码基因分别克隆到TOPO TA Cloning? Kits试剂盒的质粒载体上。

3.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，其特征在于：所述步

骤⑶的6种毒力蛋白编码基因分别亚克隆到表达载体pQE30上。

4.根据权利要求1所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，其特征在于：所述步

骤⑸利用Ni-NTA 纯化填料制备的层析柱，分离纯化这6种重组毒力蛋白。