CN103898065A - 抗大肠杆菌o157:h7单克隆抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株，解决了可靠的该菌单克隆抗体不易获得的问题，经多年多次传代，能稳定分泌单克隆抗体，它分泌的单克隆抗体，应用于液相芯片和胶体金法检测食品中大肠杆菌O157:H7，具有良好的灵敏性、特异性、稳定性和可重复性等优点。病原在浓度很低的情况下也能被检出，进一步提高检测灵敏度和检出率，严防漏检和误检。

Description

抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，确切地说是抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体及应用。

背景技术

肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli， EHEC)主要包括O157:H7， O26:H11和O111等几种血清型，其中O157:H7是典型菌株。O157:H7感染能引起出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis，HC)、阑尾炎、食管狭窄和结肠穿孔等严重胃肠道并发症，在儿童和老年人中还可引起溶血性尿毒综合征及血栓性血小板减少性紫癫等严重并发症，重者可引起死亡。O157: H7 引起的肠道感染性疾病已成为一个严重的全球性公共卫生问题，在许多国家导致多起爆发流行。O157: H7 可引起出血性肠炎，约有10%的患者发展为溶血性尿毒综合征及血栓性血小板减少性紫癜, 死亡率高达30%以上。世界卫生组织(WHO) 已把EHEC O157: H7 出血性肠炎列为新发传染病。EHEC 0157:H7感染已成为全球性的公共卫生和食品安全问题，对其进行快速、特异的检测对于该病的早期诊断及疫情有效控制至关重要。

目前检测EHEC O157: H7常规采用山梨醇-麦康凯琼脂( SMAC) 培养基，选择山梨醇发酵阴性的大肠杆菌，进一步用生化和血清学试验做鉴定，需要24～48 h。采用PCR方法进行检测需要较昂贵的仪器，费用高，不易于基层单位推广。单克隆抗体因具有良好的特异性、稳定性和可重复性等优点，但是可靠的EHEC O157: H7的单克隆抗体杂交瘤不容易制备，目前我国一直靠进口。

发明内容

本发明的目的是一株抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤及其分泌的抗体和应用。

抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株，它的保藏编号为：CGMCC No.6251；

抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，它是由上述的抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的；

一种液相芯片检测株大肠杆菌O157:H7的试剂盒，它的检测抗体为上述的抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体；

一种胶体金检测大肠杆菌O157:H7的试纸条，它的检测抗体为上述的抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体。

本发明提供了抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株，解决了可靠的该菌单克隆抗体不易获得的问题，经多年多次传代，能稳定分泌单克隆抗体，它分泌的单克隆抗体，应用于液相芯片和胶体金法检测食品中大肠杆菌O157:H7，具有良好的灵敏性、特异性、稳定性和可重复性等优点。病原在浓度很低的情况下也能被检出，进一步提高检测灵敏度和检出率，严防漏检和误检。

附图说明

图1. 融合12天后倒置显微镜观察结果；

图2. 大肠杆菌O157:H7单克隆抗体ProtienG柱纯化结果；

图3. 单克隆抗体亚型测定结果；

图4. BCA法测定单抗蛋白含量标准曲线；

图5. 非竞争性酶免疫法测定抗体亲和力；

图6. 捕获抗体最佳工作浓度的确定；

图7. 灵敏度检测结果；

图8. 特异性检测结果；

图9特异性检测结果；

图10胶体金试纸条的组装顺序。

具体实施方式：

实施例1大肠杆菌O157:H7抗原菌液的制备和BALB/c小鼠免疫

取本研究实-80℃保存的标准大肠杆菌O157:H7（ATCC11229），经肉汤培养后，划线法于LB上培养，常规方法增菌培养，6000r/min离心10min，收集菌体沉淀，用灭菌生理盐水重复离洗三次后进行菌落计数（2.0×10⁸CFU/mL），加入终浓度为0.3%的甲醛4℃过夜使菌体灭活。次日将洗脱好的菌液在20KHz、150W的冰浴条件下进行超声波使菌体细胞破碎，每次破碎10s，间隔10s，总用时20min。采用BCA蛋白测定试剂盒测定菌体蛋白含量，结果为2.636 mg/mL。

取8周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫。首免采用上述灭活菌液（2×10⁸CFU/mL）与等量弗氏完全佐剂混合后腹腔注射50μL，皮下注射50μL，以后每隔2周免疫1次，换用弗氏不完全佐剂，剂量同前，共免3次。

实施例2免疫小鼠血清抗体效价的测定

3免后，小鼠断尾采血，用常规间接ELISA方法检测血清效价。其中，包被抗原是实施例1所制备的大肠杆菌O157:H7菌液，稀释度为1:50，小鼠血清浓度为200×稀释度开始的梯度浓度，酶标二抗为HRP(辣根过氧化物酶)标记的兔抗小鼠IgG（稀释度为1:15000）。测定结果表明，抗体效价为1:25600。

实施例3大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的制备

（1）杂交瘤细胞株的建立

①饲养细胞的制备：正常BABL/C小鼠断颈处死，将8mL HAT培养液注入腹腔，轻轻摇动小鼠身体数下后抽出培养液，调整细胞浓度至10⁵个/mL，加入96孔细胞培养板，每孔100μL，置细胞培养箱中培养过夜备用，此即为饲养细胞。

②骨髓瘤细胞的培养与细胞悬液的制备：融合前一周复苏骨髓瘤细胞（SP2/0），隔1天传代1次，融合选在传代后1天进行。融合前取约4瓶（25cm²）SP2/0细胞，用RPMI-1640培养液吹下各瓶细胞，1200r/min离心10min，重复2-3次，使用细胞计数板计数。

③脾细胞悬液的制备：免疫小鼠摘眼球采血，4℃过夜后2500r/min离心10min，取血清于-20℃保存备用。小鼠处死后，常规方法取脾并用RPMI-1640培养液制备脾细胞悬液，计数。

④细胞融合：调整上述制备SP2/0细胞与脾细胞数量比为1:5。1200r/min离心10min，弃上清液。轻弹离心瓶底，使细胞松散。在30s内逐滴缓慢加入37℃预热的PEG 0.8mL，静置60s。逐滴加入R/MINI1640培养液，稀释离心瓶内PEG浓度，逐渐加快滴加速度，共加入R/MINI1640培养液30mL。融合过程在8min内完成。1200r/min离心10min，弃上清液，加入40mL预热的HAT培养液，静置15min，滴到前一天制备的饲养细胞板中，每孔100μL。置于37℃，5%的CO₂培养箱中培养。融合后3-4天，在倒置显微镜下观察融合成功的细胞团出现，计算克隆数。第3-4天，6-7天用HAT培养液进行半量换液，第9-10天起用HT培养液进行半量换液。

⑤ 阳性杂交瘤细胞株的筛选：待融合细胞生长至1/2视野（100倍镜下）以上时，如图1所示，可以进行上清效价检测，方法为常规间接ELISA法（阴性对照用SP2/0培养上清）。

（2）杂交瘤细胞株亚克隆及扩大培养

①杂交瘤细胞的亚克隆：用HT完全培养液将检测阳性孔中的融合细胞轻轻吹打至1.5mL EP管中，计数细胞后取出100个细胞至10mL HT中。将此细胞悬液滴至前一天制备的饲养细胞板中，每孔100μL。放入37℃，5%CO₂的培养箱中培养。第4天起观察细胞生长状况及进行半量换液。第1次换液前纪录每孔克隆数，待克隆细胞生长至1/2视野（100倍镜下）以上时，常规间接ELISA法检测上清抗体效价，选取单克隆阳性孔进行再次克隆，直到所有的克隆细胞孔都为阳性。

②杂交瘤细胞的扩大培养：将进行3-4次阳性亚克隆后达到阳性率100%，长满视野80%以上的孔中细胞吹起，移至24孔板中，进行传代和移至6孔板及细胞培养瓶中。

在众多杂交瘤中，意外获得的抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株；5C3B12F1H5D1，已于2012年06月20日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市北辰西路1号院3号)保藏，保编号为：CGMCC No.6251。

（3）单克隆抗体的大量制备（腹水法）

接种杂交瘤细胞前一周将降植烷打入小鼠腹腔，每只0.1mL。用R/MINI-1640培养液将细胞吹下，1000r/min离心10min，重悬后计数，调整细胞浓度为10⁶个/mL，每只鼠腹腔注射0.5mL。观察小鼠腹腔变化，至腹部明显明显膨大，行动不便时，在腹部插入5mL注射器，抽取淡黄色腹水。一般可抽取2-3次。并用SP2/0细胞打入另外的小鼠腹腔制备阴性对照腹水。

（4）腹水的纯化与保存

①粗提腹水IgG：腹水3000r/min离心20min，吸弃表层脂肪，上层几乎透明的液体为未纯化腹水。腹水中加入4倍体积的醋酸缓冲液（0.06mol/L，pH4.0），逐滴加入辛酸（33μl/mL腹水）边加边搅，加完后水浴震荡10min，全速漩涡震荡30s，重复3次后4℃静止2h，6000r/min，离心30min，去沉淀。取上清加入1/10体积的PBS（0.1mol/L），依次加入终浓度为33%、50%的饱和硫酸铵，每次加完后4℃静置2h或过夜，6000r/min，离心15min。弃上清，将沉淀溶于少量0.01mol/L PBS中。

② ProtienG柱纯化腹水IgG：粗提后的腹水经0.22μm过滤，使用AKTA蛋白纯化系统进行过滤。选用IgG纯化柱洗脱得到纯化后的小鼠腹水IgG。用PBS对得到的单克隆抗体进行超滤离心（超滤离心管为30KD），6000r/min，30min，重复4-5次，去除盐离子及浓缩，收集第二峰流出液，如图2所示。纯化后的单克隆抗体中可加入终浓度0.03%叠氮纳，于-20℃保存。

实施例4单克隆抗体性质的鉴定

（1）单克隆抗体效价的测定

纯化浓缩后的O157：H7单克隆抗体采用间接ELISA法测定其效价，方法同实施例2。测得抗体OD值与阴性腹水OD值比较，经AKTA纯化后的腹水效价为1:512000，如表1所示。

表1 大肠杆菌O157:H7单克隆抗体效价测定（OD450nm）

单抗稀释倍数	O157:H7	阴性腹水对照
			2000	1.595	0.117
4000	1.544	0.117
			8000	1.477	0.117
16000	1.409	0.117
			32000	1.239	0.117
64000	0.955	0.117
			128000	0.638	0.117
256000	0.401	0.117
			512000	0.271	0.117
1024000	0.197	0.117
			2048000	0.146	0.117

（3）单克隆抗体亚型的鉴定

应用Sigma抗体亚型鉴定试纸条对收集的腹水和细胞上清进行单抗亚型的鉴定，结果表明，单抗的亚型为IgG1，如图3所示。

（4）单克隆抗体特异性的鉴定

分别用20种肠道菌的灭活菌液包被ELISA板，采用常规间接ELISA方法测定单抗腹水与上述菌液反应的OD₄₅₀值，以大肠杆菌O157:H7液做阳性对照，以阴性腹水做阴性对照。结果表明，制备的单抗与大肠杆菌O157:H7具有较高的特异性，P/N为13.30，如表2所示。 

表2.大肠杆菌O157:H7与20种肠道菌特异性测定结果

包被菌	5C3B12F1H5D1	阴性腹水	P/N
				韦氏柠檬酸杆菌	0.220	0.118
志贺菌	0.169	0.108
				单增李斯特菌	0.348	0.106
奇异变形杆菌	0.167	0.096
				黏质沙雷菌	0.155	0.085
肺炎克雷伯菌	0.172	0.091
				大肠杆菌	0.207	0.088
坂崎肠杆菌	0.205	0.083
				邻单孢菌	0.179	0.089
粪肠球菌	0.184	0.084
				大肠杆菌	0.194	0.083
大肠杆菌	0.168	0.086
				克雷伯菌	0.169	0.078
变形杆菌	0.169	0.071
				阴沟肠杆菌	0.194	0.073
蜡状芽孢杆菌	0.241	0.065
				弗氏柠檬酸杆菌	0.190	0.105
金黄色葡萄球菌	0.213	0.084
				沙门杆菌	0.186	0.085
PBS	0.207	0.101
				大肠杆菌O157：H7	1.410	0.106	13.30

（5）单克隆抗体蛋白含量测定

用BCA蛋白含量测定试剂盒按说明书操作，进行单抗蛋白浓度的测定。结果表明，蛋白含量为18.459mg/mL，标准曲线如图4所示。

（6）单克隆抗体亲和力测定

利用非竞争性酶免疫法测定抗体亲和力。用包被抗原蛋白浓度为1.25、2.5、5.0、10.0μg/mL进行包板，每孔100μL，37℃，2h。封闭后将单抗从5μg/mL开始进行倍比稀释，按间接ELISA方法测定四种包被浓度下不同抗体浓度的OD₄₅₀值。以抗体浓度为横坐标，以相应的吸光度值为纵坐标，可得到四条S形曲线。将S形的顶部设定为ODmax，分别找出四条曲线中50% ODmax对应的抗体浓度。将4个浓度两两一组，根据公式计算单抗的亲和常数。

Ka=(n-1)/2(n[Ab`]t-[Ab]t)

注：n为每组中两个包被浓度的倍数，[Ab`]t和[Ab]t分别为每组中两个50% ODmax对应的抗体浓度（mol/L）。

结果表明，得到6个Ka的平均值为1.01×10⁸M^-1，如图5所示。

（7）单克隆抗体分子量测定

使用SDS-PAGE试剂盒按说明书操作，配制分离胶（12%）与浓缩胶（5%），上样电泳后，测定单克隆抗体蛋白的分子量约为28Ku。

实施例5生物素标记的大肠杆菌O157:H7多克隆抗体的制备

（1）抗原的制备

抗原菌液的制备方法同实施例1所述。

（2）动物免疫及多抗效价测定

取体重为2kg的新西兰大耳兔进行首免，免疫剂量为1mL/只，皮下多点注射。每隔2周进行1次免疫，免疫前耳缘静脉采血，-20℃保存。4次免疫后应用常规间接ELISA法测定血清多抗效价。结果表明，血清抗体效价为1:25600。

（3）血清IgG的分离

兔麻醉后心脏采血，4℃倾斜放置过夜后，3000r/min离心30min，收集血清，按照辛酸-饱和硫酸铵法粗提及AKTA蛋白纯化系统纯化多克隆抗体。应用30KD超滤离心管离洗多抗，3000r/min，离心30min，重复3-4次。-20℃保存多抗。

（4）多克隆抗体性质鉴定

多抗蛋白含量测定方法同实施例4中（5）所述，结果表明蛋白含量为23.6mg/mL。

多抗效价测定采用常规间接ELISA方法，结果表明，纯化后多抗效价为1:25600。

多抗特异性测定同实施例4中（4）所述，结果表明，与大肠杆菌O157:H7反应的P/N值为2.847。

多抗分子量测定同实施例4中（7）所述。

（5）生物素用量计算及标记多抗反应

所需生物素量（mmol）=标记蛋白体积×标记蛋白含量×(20/标记蛋白分子量)

所需生物素溶液体积（μL）=所需生物素量×433×500/2.2

生物素标记多抗反应采用常规方法进行。

（6）生物素标记水平的测定

①试剂：1.94mLPBS中加入10mg生物素（Avidin）和10mmol/L的4’-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA) 100μL，配制成HABA/Avidin溶液。

②微孔板模式测定标记水平：每孔中加入180μL HABA/Avidin溶液，测500nm处吸光度值，记为A₅₀₀HABA/Avidin。再加入20μL生物素标记蛋白，混匀后测定500nm处吸光度值，记为A₅₀₀HABA/Avidin/Biotin-sample。

③计算标记水平：

光度变化值（△A500）=A₅₀₀HABA/Avidin-A₅₀₀HABA/Avidin/Biotin-sample。

反应混合物中生物素浓度（mmol/mL）=△A500/34000

实施例6捕获抗体与微球偶联形成偶联体的制备及工作浓度测定

取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声3min，漩涡震荡30s，使微球均匀分布。用无菌水分别配制50mg/mL的EDC和NHS。然后取200μL 的微球原液置于1.5mL的离心管中，14000 r/min，离心5min。取出后弃上清，加入NHS和EDC各10μL，再加入80μL的活化缓冲液。混匀后，用铝箔纸包好，置于37℃摇床120 r/min，20min，然后14000 r/min，离心5min，小心移去上清。加入500μL稀释至250ug/mL的捕获抗体，重悬混匀，置于37℃摇床120 r/min，孵育2h。取出后离心弃上清，用500μL的PBS进行洗涤，洗涤后加入500μL 1％BSA的 PBS溶液，重悬微球，37℃水浴摇床孵育两个小时进行封闭。封闭后4℃保存。

检测结果表明，当单抗浓度为250ug/mL时，其MFI值达到最大，故单抗最佳的工作浓度为250ug/mL，如图6所示。

实施例7应用液相芯片检测单增生李斯特氏菌的方法

将已偶联的微球混合液室温恢复10min，漩涡振荡器震荡约3min。取约5000个微球，加入10⁸ CFU/mL 的大肠杆菌O157:H7 10μL，用PBS-TBN补足体积到100μL。置于37℃摇床120r/min，1h。取出后离心弃上清，用200μL PBS-TBN洗两次。加入已稀释的检测抗体10μL，用PBS-TBN补足体积到100μL。 置于37℃摇床120r/min，1h。取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次。然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG 10μL，用PBS-TBN补足体积到100μL。 置于37℃摇床反应1h。取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次。再加入SA-PE，用PBS-TBN补足体积到100μL，置于37℃摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次。重悬于100μL PBS-TBN中，上机进行检测。

灵敏度检测结果表明，所建立方法在菌液浓度达到10³CFU/mL时仍可被检出。因此本方法的灵敏度较高，如图7所示。

特异性检测结果表明，所建立的方法分别检测单增李斯特菌（ATCC54002），空肠弯曲杆菌（ATCC33291），霍乱弧菌(JL080118)，沙门氏菌(ATCC9150)，绿脓杆菌，志贺氏菌（JL08036），阪崎杆菌（JL08106），粪肠球菌（ATCC14506），金葡菌，以及大肠杆菌O157:H7（ATCC11229），从图8可看出此方法特异性良好，与其它细菌无交叉反应。

重复性检测结果表明，在1d，5d，7d用所建立的方法分别检测阳性菌和阴性菌，如图9所示可见阳性菌和阴性菌MFI值上下浮动都不大，由此证明本方法重复性较好。

实际样品检测结果表明，分别在鸡肉和兔肉中添加大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌，并做空白对照，如表3所示在添加了实际样品后应用本方法仍可将大肠杆菌O157:H7检出。

表3.实际样品检测结果

实施例8 大肠杆菌O157:H7胶体金试纸条的制备

（1）胶体金探针的制备

取0.01%氯金酸水溶液100ml于洁净的锥形瓶中，加热至沸腾，磁力搅拌器下准确加入1.5mL新鲜配制的1%柠檬酸三钠水溶液，煮沸2-3min，溶液颜色由黄色变为紫红色，继续煮沸15min，冷却至室温后以蒸馏水恢复到原体积，4℃避光保存。

采用0.1mol/L的K₂CO₃溶液调节上述处理胶体金溶液pH值为8.0-8.5，优选8.3，将纯化的大肠杆菌O157单克隆抗体用5mM PB（pH8.0）稀释至25.5 μg/mL。

（2）胶体金的抗体标记

 取20mL胶体金溶液（pH8.3），在室温磁力搅拌下缓慢加入0.2mL待标记的单克隆抗体（终浓度为25.5μg/mL），搅拌20-30min。加入一定量的10%的BSA，使之终浓度为0.1%，搅拌5min。继续加入一定量的10%的PEG2000，使之终浓度为0.2%，搅拌5min。14000 r/min离心50rnin，小心吸除上清液，加2ml保存液悬浮沉淀，用0.45μm滤膜过滤，获得胶体金标记的单克隆抗体，4℃保存备用。

（3）金标垫的制备

取上述金标抗体原液1mL，加入工作液2-5mL稀释，混匀后均匀地喷涂在玻璃纤维素膜上，制成金标抗体玻璃纤维素膜，自然干燥后密封保存子4℃冰箱中备用。

（4）包被抗体硝酸纤维素膜的制备

用10mM pH7.6的PBS分别稀释O157:H7多克隆抗体（1.5 mg/mL）和羊抗鼠IgG（1.0 mg/mL），采用隔流金划线机以50mm/s的速度喷膜包被到硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和对照线，检测线与对照线平行，室温自然干燥。

（5）胶体金试纸条的组装

以PVC为基础底板，分别将样品垫、金标垫、包被有多抗和羊抗鼠IgG硝酸纤维素膜及吸水垫按图10顺序组装。

实施例9大肠杆菌O157:H7胶体金试纸条的使用方法

将待检样品检测液滴在试纸条上的样品垫上或将试纸条的样品垫插入样品检测液中，然后平放1-5min，判定结果。检测线和对照线均出现红色或棕红色为阳性，仅对照线显色为阴性，若二者均不显色，表明操作有误或试纸条失效。

实施例10大肠杆菌O157:H7胶体金试纸条的检验

（1）特异性

将大肠杆菌O157:H7 标准株、大肠杆菌O26:H11、大肠杆菌O127:H6、大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、金黄色葡萄球菌、志贺杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、腊样芽孢杆菌、链球菌、弗氏柠檬酸杆菌、魏氏梭菌等15种细菌培养物用无菌PBS稀释至10⁹CFU/mL，用检测试纸条检验其特异性，结果表明，仅O157:H7为阳性，其他均为阴性。

（2）敏感性

将大肠杆菌 O157:H7培养物用无菌PBS分别稀释至10⁴-10⁹CFU/mL，用胶体金免疫层析检测试纸条检测其敏感度，结果表明，敏感性为10⁵ CFU/mL。

（3）实用性

分别在奶粉、面粉、自来水、饮料、饼干、蛋糕和牛肉等食品样品中加入终浓度为10⁴-10⁹CFU/mL的大肠杆菌O157:H7，制成模拟现场检测样品，用检测试纸条检测其实用性，结果表明，大肠杆菌O157:H7的检出数为10⁵ CFU/mL，在1-5min内得出检测结果，适用于现场样品的检测。

（4）重复性

用制备的10个批次试纸条，分别对15种各10份样品进行检测，其检测结果完全一致，即10份O157:H7样品全为阳性，其他受试样品均为阴性。

（5）稳定性

用置于4℃和25℃存放不同时间的试纸条与新制备的试纸条平行检测阳性和阴性样本，结果表明，4℃保存有效期为18个月，25℃保存有效期为12个月。

Claims (4)

1.抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株，它的保藏编号为：CGMCC No.6251。

2.抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，它是由权利要求1所述的抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的。

3.一种液相芯片检测株大肠杆菌O157:H7的试剂盒，它的检测抗体为权利要求2所述的抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体。

4.一种胶体金检测大肠杆菌O157:H7的试纸条，它的检测抗体为权利要求2所述的抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体。

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