CN113999300B

CN113999300B - 一种高效提取卵黄抗体的复合沉降剂及方法

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Publication number: CN113999300B
Application number: CN202111518439.XA
Authority: CN
Inventors: 杜新永; 刘爽; 盖春云; 李先胜; 李爽
Original assignee: Qingdao Runda Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Runda Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-13
Filing date: 2021-12-13
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2041-12-13
Also published as: CN113999300A

Abstract

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及提取卵黄抗体的复合沉降剂及方法。一种高效提取卵黄抗体的复合沉降剂，该复合沉降剂包括以下浓度的组分：泊落沙姆188，1.0～1.3%；山梨酸，0.01%～0.05%；磷酸氢二钠，0.04%～0.2%；海藻糖，0.01%～0.05%；柠檬酸，0.04%～0.2%。本发明提供高效提取卵黄抗体的方法，包括：将蛋黄与复合沉降剂以1:5‑1:10的体积比混合，搅拌均匀后静置沉降；离心，取上清，过滤除菌，即得卵黄抗体。本发明利用复合沉降剂提取卵黄抗体，操作简便，一次性沉降，步骤少，易于生产；该方法得到的卵黄抗体效价高、产量大，可代替现有的抗体提取工艺，具有较好的推广价值。

Description

一种高效提取卵黄抗体的复合沉降剂及方法

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及提取卵黄抗体的复合沉降剂及方法。

背景技术

卵黄抗体(Immunoglobulin of yolk, IgY):通过免疫注射产蛋鸡，即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗，这类制剂称为卵黄抗体。卵黄抗体在禽胚孵化过程中逐渐进入禽胚血液，为刚出壳雏鸡提供被动免疫保护，在雏鸡疾病预防中具有重要作用。但提取方法仍是制约IgY大量生产的因素之一。

卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1:2。大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的，而IgY是γ卵黄球蛋白。因此IgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离IgY。

目前，主要有4种IgY的常用提取方法：

1.辛酸法：酸性环境下，辛酸（CA）会与大多数蛋白产生不可逆的沉淀，可使蛋白析出，达到分离的效果。取卵黄加入二倍体积的醋酸－醋酸钠缓冲溶液，充分混匀，然后加入终体积1%～3%的辛酸混匀，4℃静置6～8h ，离心并收集滤液，最终得到提取样品，可在4℃下进行保存。

2. 氯仿萃取法：卵黄中的主要成分为水、蛋白质和脂类，当加入氯仿（CF）后，脂类溶于有机溶剂会产生分层现象，通过分液即可将蛋白质与脂类分离。一般将卵黄与生理盐水混匀，并加入两倍体积的氯仿，充分摇匀，室温放置1～2h 后离心抽提，收集上清并于4℃下保存。

3. 水稀释法：IgY是一种水溶性蛋白，将卵黄溶于水，IgY会进入水相中，以此与非水溶性的脂类分离。将卵黄用蒸馏水稀释4～10倍，HCl调节ｐＨ为5.0，加入卵黄液后再调配溶液至ｐＨ5.0，25℃静置，收集的上清液即含目标抗体。

4.聚乙二醇法：聚乙二醇（PEG）具有很强的亲水性，用PBS稀释的卵黄加入PEG后，会使蛋白产生聚集，从而以沉淀析出，达到分离的效果。具体方法：加入卵黄4倍体积的PBS，随后加入PEG6000干粉使其最终浓度为4%充分混合，随后静置，4℃离心，滤液中含有所需的IgY，将其保存在4℃冰箱中。

但以上几种方法各有缺点：1、水稀释法，该方法生产的抗体提取的IgY稀释度比较大，卵黄抗体的效价低，需要进一步的超滤浓缩才能达到一定的效价，在生产中需要大量的容器，不适合大规模生产；2、氯仿抽提法，该方法氯仿用量大，提取成本高，产品纯度低，且氯仿具有毒性；3、聚乙二醇法，该方法所需聚乙二醇较多，导致生产成本高，且提取纯度低，残留的聚乙二醇会导致IgY稳定性降低；4、辛酸法，该方法抗体损失大，纯度低。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够高效提取卵黄抗体的复合沉降及方法，该方法采用一次性沉降，步骤少，易于生产，提取得到的卵黄抗体效价高、产量大。

为了实现上述目的，本发提供了一种高效提取卵黄抗体的复合沉降剂，该复合沉降剂包括以下浓度的组分：泊落沙姆188，1.0～1.3%；山梨酸， 0.01%～0.05% ；磷酸氢二钠， 0.04%～0.2%；海藻糖，0.01%～0.05%；柠檬酸，0.04%～0.2%。

本发明进一步提供了一种高效提取卵黄抗体的方法，该方法包括：将蛋黄与复合沉降剂以1:5-1:10的体积比混合，搅拌均匀后静置沉降；离心，取上清，过滤除菌，即得卵黄抗体。

进一步地，所述的复合沉降剂包含以下浓度的组分：泊落沙姆188，1.0～1.3%；山梨酸， 0.01%～0.05% ；磷酸氢二钠， 0.04%～0.2%；海藻糖，0.01%～0.05%；柠檬酸，0.04%～0.2%。

进一步地，所述的复合沉降剂pH为5.0。

进一步地，复合沉降剂与蛋黄混合后，pH调至6.0。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种高效提取卵黄抗体的复合沉降剂，利用该复合沉降剂提取卵黄抗体，操作简便，一次性沉降，步骤少，易于生产。

本发明提供的卵黄抗体提取方法，生产效率高，生产成本低，得率高，适用于大规模生产。该方法得到的卵黄抗体效价高、产量大，可代替现有的抗体提取工艺，具有较好的推广价值。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合具体实施例，对本发明进行更详细的说明。给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

实施例1本实施例提供一种高效提取卵黄抗体的复合沉降剂，该复合沉降剂包括以下终浓度的组分：泊落沙姆188，1.0%；山梨酸， 0.01% ；磷酸氢二钠， 0.04%；海藻糖，0.01%；柠檬酸，0.04%。

实施例2本实施例提供一种高效提取卵黄抗体的复合沉降剂，该复合沉降剂包括以下终浓度的组分：泊落沙姆188，1.2%；山梨酸， 0.03% ；磷酸氢二钠， 0.18%；海藻糖，0.04%；柠檬酸，0.1%。

实施例3本实施例提供一种高效提取卵黄抗体的复合沉降剂，该复合沉降剂包括以下终浓度的组分：泊落沙姆188，1.2%；山梨酸， 0.02% ；磷酸氢二钠， 0.08%；海藻糖，0.03%；柠檬酸，0.2%。

实施例4本实施例提供一种高效提取卵黄抗体的复合沉降剂，该复合沉降剂包括以下终浓度的组分：泊落沙姆188，1.3%；山梨酸， 0.04% ；磷酸氢二钠， 0.2%；海藻糖，0.05%；柠檬酸，0.09%。

实施例5本实施例提供一种高效提取卵黄抗体的方法，该方法包括以下步骤：

（1）利用禽腺病毒灭活疫苗免疫150日龄产蛋鸡，获得高免鸡蛋，将鸡蛋浸入0.1%新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，拿出晾干表面水分。打破蛋壳，除去蛋清、胎盘和系带，收集卵黄；

（2）配置复合沉降剂：向纯化水中加入泊落沙姆188（终浓度为1.2%）、山梨酸（终浓度为0.01%）、磷酸氢二钠（终浓度为0.04%）、海藻糖（终浓度为0.01%）、柠檬酸（终浓度为0.04%），调节溶液pH为5.0；

（3）将7倍卵黄体积的复合沉降剂与卵黄搅拌均匀，调节混合溶液pH为6.0，低速搅拌均匀，静置沉降1小时；

（4）将步骤（3）中静置沉降之后的溶液，以4000rpm的转速离心30min，得到上清液，将所得上清液过滤除菌即为卵黄抗体成品。

实施例6 本实施例提供一种高效提取卵黄抗体的方法，该方法包括以下步骤：

（1）利用鸭肝病毒灭活疫苗免疫150日龄产蛋鸡，获得高免鸡蛋，将鸡蛋浸入0.1%新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，拿出晾干表面水分。打破蛋壳，除去蛋清、胎盘和系带，收集卵黄；

（2）配置复合沉降剂溶液：向纯化水中加入泊落沙姆188（终浓度为1.0%）、山梨酸（终浓度为0.01%）、磷酸氢二钠（终浓度为0.04%）、海藻糖（终浓度为0.01%）、柠檬酸（终浓度为0.04%），使得调节溶液pH为5.2；

（3）将6倍卵黄体积的复合沉降剂与卵黄搅拌均匀，调节混合溶液pH为6.0，低速搅拌均匀，静置沉降1小时；

对上述实施例5和6提取的卵黄抗体进行无菌与安全性检测和效价检测：

将制备的卵黄抗体接种于普通 LB 琼脂培养基上，37℃恒温培养箱培养 36 h，观察并无细菌生长。将制备的卵黄抗体 4 只健康小白鼠，2 mL/ 只。72 h 后观察发现小白鼠精神，采食状态良好，未见异常情况。

采用琼脂扩散法测定制备的的卵黄抗体的效价。

经检测，本发明提供的方法提取的卵黄抗体，无菌、安全性及效价均检测合格。

实施例7 测定实施例5提取的卵黄抗体对SPF鸡的腺病毒保护实验

选取100只21日龄SPF鸡，随机分为5组，每组20只鸡，具体实验方案如表1，连续观察10d，记录鸡的采食状况、精神状况、发病规律、发病症状、死亡数量，统各组成活率、保护率和治愈率，结果见表2。结果表明，本发明方法提取的卵黄抗体对鸡腺病毒具有显著的免疫效果。

表1 动物实验方案

表2 动物实验结果

实施例8 本发明提供的复合沉降剂中各组分之间协同效果测定

（1）.收取腺病毒高免鸡蛋，用0.1%新洁尔灭消毒液进行蛋壳消毒，用打蛋器打蛋，将蛋黄混匀，得到40kg蛋黄液。将其平均分为4份，每份10kg；

（2）.按照表3的沉降剂分别配置沉降溶液；

（3）.将6倍卵黄体积的不同沉降溶液分别与卵黄搅拌均匀，调节混合溶液pH为6.0，低速搅拌均匀，静置沉降1小时；

（4）.将步骤3中静置之后的溶液，以4000rpm的转速离心30min，得到上清液，即为卵黄抗体成品。最终得到卵黄抗体陈品都约为60L。

表3 几种沉降溶液与本发明的复合沉降剂的对比测试

从表3可以看出，复合沉降剂中各成分单独使用时会都会有各自的问题，有的会除脂不彻底，有的会效价不高，有的会不易操作等，组合使用时这些问题会相互弥补，各组分会起到协同作用。

柠檬酸和磷酸氢二钠构成柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，维持整个体系的PH稳定，使卵黄分离的过程处于酸性条件下，增强其提取效果。

泊洛沙姆可以使卵黄液脱脂，其原因是：泊洛沙姆是一种非离子型表面活性剂，它可以破坏卵黄脂类水化膜，打破了卵黄的乳化状态，卵黄脂类相互凝结而发生沉淀。

山梨酸具有较高的抗菌性能，抑制菌的生长繁殖，通过抑制微生物体内的脱氢酶系统，达到抑制微生物的生长和起防腐作用，对霉菌、酵母菌和许多好气菌都有抑制作用。

海藻糖具有独特的生物学功能，能在逆境中有效地维持蛋白质、活性肽的稳定性和完整性，能非常有效地保护蛋白质分子的天然结构,海藻糖可很好地防止蛋白质在冷冻、高温或干燥时变性，可以使提取的卵黄抗体具有很好的稳定性。

实施例9本发明提供的高效提取卵黄抗体的方法与现有其他方法的对比实验

1、卵黄抗体提取

取腺病毒高免鸡蛋，用0.1%新洁尔灭消毒液进行蛋壳消毒，用打蛋器打蛋，将蛋黄混匀，得到50kg蛋黄液。将其平均分为5份，每份10kg，分别用5种提取卵黄抗体。

（1）辛酸法提取卵黄抗体

将蛋黄液与配制好的pH为4.5的醋酸盐缓冲液(0.816 g乙酸钠，0.54mL冰醋酸和100 mL蒸馏水)按体积比为1：2的比例充分混合，然后缓慢加入辛酸(加入辛酸的量应为混合后总体积的3％)，搅拌30 min后，4500r／min离心30 min，过滤，收集滤液，得到卵黄抗体约为19L。

（2）氯仿萃取法提取卵黄抗体

将蛋黄液与PBS缓冲液（pH 7.5）和氯仿按体积比为1：2：1的比例混合，充分摇匀静置2-3h，4000r/min离心20min取上清即为提取的卵黄抗体，得到卵黄抗体约为17.7L。

（3）水稀释法提取卵黄抗体

将蛋黄液与去离子水按体积比为1:9的比例充分混合，搅拌均匀；用1mol/L HCl调节卵黄液pH为5.0~5.2。4 ℃下10000r/min 离心 25 min，取上清液得到卵黄抗体约为75.2L。

（4）聚乙二醇(PEG)法提取卵黄抗体

将蛋黄液与PBS缓冲液（pH 7.5）按体积比为1：4的比例充分混合，再加入终浓度为3.5%（W/V）的PEG-6000充分搅拌溶解，1M的盐酸调节溶液至PH5.0、静置。4000r/min离心20min，取上清液得到卵黄抗体约为28.3L。

（5）本发明的一步沉降法提取卵黄抗体

将蛋黄液与复合沉降剂（泊落沙姆188终浓度为1.0%、山梨酸终浓度为0.01%、磷酸氢二钠终浓度为0.04%、海藻糖终浓度为0.01%、柠檬酸终浓度为0.04%， pH为5.1），按体积比为1：6的比例充分混合，调节混合溶液pH为6.0，低速搅拌均匀，沉降1小时，以4000rpm的转速离心30min，得到上清液，将上清液过滤除菌，得到卵黄抗体约为61L。

2、卵黄抗体效价测定

使用病毒中和实验法测腺病毒高免蛋蛋黄以及上述方法所得的卵黄抗体的效价，具体步骤如下：

（1）将待使用的96孔板提前用0.1%的明胶包被，包被结束后倒掉96孔板中的明胶，用含10%FBS的DMEM培养液将LMH 细胞分散成1.5-2.5*106细胞悬液，加入到包被好的96孔板中，每孔50uL 。放置于含5%二氧化碳的37℃培养箱过夜；

（2）为使血清内非特异性的病毒抑制成分能被灭活，收集的血清样品使用前要在56℃的水浴锅中放置30min；

(3)用细胞维持液对待检测的血清做连续2倍稀释，使待测血清的浓度分别稀释为2^-3、2^-4、2^-5、2^-6、2^-7、2^-8、2^-9、2^-10、2^-11、2^-12，10个稀释梯度，并将每个稀释梯度分成3份；

（4）将100TCID₅₀的腺病毒液分别加入稀释好的待测血清中，形成血清病毒混合液，混合均匀，于37℃培养箱中作用1h ；

（5）从培养箱中取出前一天铺好LMH细胞的96孔板，倒掉培养液，用无菌PBS清洗一次，然后加入制作好的血清病毒混合液，0.1mL/孔；

（6）每种血清型的病毒液每个稀释梯度做8个复孔，同时设血清阳性对照、阴性对照，病毒阳性对照和健康细胞对照。放置于含5%二氧化碳的37℃培养箱中5-7d ，每天观察并记录细胞病变情况，根据观察结果计算出抗体水平效价。

3、卵黄抗体含量测定

参照黄青松口等(2008)的方法，用紫外分光光度法测定IgY含量。

具体做法为：用紫外分光光度计分别测定提取液在260 nm和280 nm处的吸光值，并以生理盐水作为对照，然后根据公式：

IgY浓度(mg／mL)=1.50A₂₈₀－0.75A₂₆₀，分别计算出原卵黄中和提取液中IgY的含量，并计算IgY得率。

表4 本发明的方法与其他方法提取的卵黄抗体对比结果

从表4结果可以看出，选用本发明的方法提取的卵黄抗体得率、澄清度、沉淀和抗体效价均较高于其他四种方法。

Claims

1.一种高效提取卵黄抗体的方法，其特征在于，包括：将蛋黄与复合沉降剂以1:5-1:10的体积比混合，搅拌均匀后静置沉降；离心，取上清，过滤除菌，即得卵黄抗体；所述的复合沉降剂包含以下浓度的组分：泊落沙姆188，1.0～1.3%；山梨酸， 0.01%～0.05% ；磷酸氢二钠， 0.04%～0.2%；海藻糖，0.01%～0.05%；柠檬酸，0.04%～0.2%。

2.根据权利要求1所述的高效提取卵黄抗体的方法，其特征在于，所述的复合沉降剂pH为5.0。

3.根据权利要求2所述的高效提取卵黄抗体的方法，其特征在于，复合沉降剂与蛋黄混合后，pH调至6.0。