CN105412923A - 一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂及其制备方法 - Google Patents
一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂，含有以PEDV流行毒株保护性抗原基因COE蛋白免疫非免疫产蛋鸡后收集的鸡蛋卵黄中提取的卵黄抗体。本发明还提供了上述口服剂的制备方法，以当前流行毒株为基础，对猪流行性腹泻病毒的保护性抗原基因COE进行原核表达、纯化，获得目的蛋白，用弗氏佐剂制备成免疫原接种非免疫蛋鸡，免疫后收集鸡蛋，从蛋黄中提取出卵黄抗体并将其制备成安全、高效的卵黄抗体口服剂。本发明的卵黄抗体口服剂能对仔猪流行性腹泻病猪进行有效的治疗，同时也可运用该口服剂对同群未感染的仔猪进行预防，该口服剂制备工艺简单，适合规模化生产及临床应用。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种兽医生物制品，具体来说是一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂的制备方法。
背景技术
猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）所引起的猪的一种急性高度接触性传染病，各年龄段的猪均可发病，但对哺乳仔猪的危害最为严重。感染PEDV的仔猪常会因急性肠炎及致命性水泻而导致脱水死亡，20日龄以内仔猪死亡率可达95%以上，给养猪业带来巨大经济损失。
疫苗接种是预防疾病发生的主要途径之一，然而在此次国内的PED流行中，此方法并没有有效遏制PED的发生与流行。卵黄抗体作为一种有较强免疫功能的蛋白质，目前已有报道将其用于猪某些肠道疾病的防治，效果较好。而且PEDV主要通过肠道感染猪，具有明显的肠道组织嗜性，卵黄抗体经口服后在肠道内与PEDV作用，可阻止病毒的吸附和感染，同时病毒排出体外后失去感染力，对该病流行也有一定的抑制作用。除此之外，卵黄抗体还是一种高产、优质的多克隆抗体，产量高，价格低廉，对肠道正常菌群无副作用，不存在抗药性和药物残留问题。因此，发展特异、安全、高效的卵黄抗体口服制剂，具有重要的临床和现实意义，应用前景广阔。
目前为止，尚没有以PEDV中和表位COE蛋白制备卵黄抗体的研究和应用的文献报道。
S蛋白是PEDV的主要结构蛋白，在介导宿主产生中和抗体的过程中发挥着重要作用，如识别靶细胞、促进病毒和细胞膜的融合等，所以S蛋白被认为是有效抵抗PEDV的主要靶抗原。近年来，国内外许多学者对S蛋白进行了广泛研究。Chang等根据TGEVS基因的中和表位序列，推测出了PEDVS基因的一个抗原表位区（499-638aa），并命名为COE，随后也被很多研究人员用于基因工程疫苗的制备。Kang等已将PEDVBrl/87株的COE基因在烟草中表达，并通过动物试验证实其具有良好的抗原性。BaeJL等人将COE基因转入烟草中，给小鼠注射转基因植物蛋白，结果证明烟草表达的该疫苗具有免疫原性。此外，在使用ELISA检测PEDV抗体时，抗S蛋白的抗体较N蛋白抗体更容易被检出，而且抗S蛋白抗体比抗N蛋白抗体更为持久。因此，S蛋白在PEDV新型疫苗研究以及PEDV血清学诊断方面具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂的制备方法，所述的这种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂的制备方法解决了现有技术中没有很好的药物治疗仔猪流行性腹泻的技术问题。
本发明提供了一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂，含有以PEDV流行毒株保护性抗原基因COE蛋白免疫非免疫产蛋鸡后收集的鸡蛋卵黄中提取的卵黄抗体。
进一步的，所述的一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂，由植物油、卵黄、山梨酸钾、乙氧基喹啉、维生素、矿物质和益生菌，在所述的口服剂中，所述的植物油的质量百分比浓度为57%-60%，所述的的卵黄的质量百分比浓度为37%-40%，所述的山梨酸钾的质量百分比浓度为0.25%，所述的乙氧基喹啉的质量百分比浓度为0.25%，余量为所述的维生素、矿物质和益生菌，所述的维生素、矿物质和益生菌的质量比为1:1:1，所述的卵黄是以PEDV流行毒株保护性抗原基因COE蛋白免疫非免疫产蛋鸡后收集的鸡蛋卵黄。
本发明还提供了上述的一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂的制备方法，包括以下步骤：
1)采用猪流行性腹泻病毒阳性病料，使用RT-PCR方法扩增保护性抗原基因COE，连接到原核表达载体，对COE蛋白进行表达、纯化，使用弗氏佐剂对蛋白进行乳化，制备成免疫原；
2)利用制备的免疫原免疫非免疫蛋鸡；
3)免疫后收集鸡蛋，在无菌条件下收集卵黄，然后提取卵黄中的卵黄抗体；
4)运用蚀斑减数试验测定卵黄抗体对PEDV病毒的中和抗体效价；
5)收集卵黄抗体效价在1:64以上的鸡蛋，用75%酒精浸泡消毒20min-30min，晾干，打开鸡蛋，分离蛋黄，将蛋黄制备成卵黄抗体口服剂。
进一步的，在步骤5）中，用蛋黄分离器将蛋黄分离开后，按照质量百分比称取植物油、卵黄、山梨酸钾、乙氧基喹啉、维生素、矿物质和益生菌，先将山梨酸钾溶于卵黄中，搅拌均勾；将植物油水浴加热到65~75℃，在植物油中添加乙氧基喹啉，然后将添加了乙氧基喹啉的植物油加入到卵黄液中，边加入边搅拌，完全乳化后加入维生素、矿物质和益生菌，直至形成膏状液体即可。
进一步的，步骤1)中，COE蛋白，其纯度不低于85%，浓度不低于1mg/ml。
进一步的，步骤2）中，免疫程序如下：首次免疫剂量为1ml/羽，首次免疫后2周、4周、8周分别进行三次加强免疫，免疫剂量为2ml/羽。
本发明的卵黄抗体口服剂以当前流行毒株为基础，对猪流行性腹泻病毒（PEDV）的保护性抗原基因COE进行原核表达、纯化，获得目的蛋白，用弗氏佐剂制备成免疫原接种非免疫蛋鸡，免疫后收集鸡蛋，从蛋黄中提取出卵黄抗体并将其制备成安全、高效的卵黄抗体口服剂。
本发明中制备的卵黄抗体口服剂为鸡的免疫球蛋白，能够特异性的中和PEDV病毒，同时，添加的微生物、矿物质和益生菌对仔猪消化系统有营养和修复作用；可用于治疗临床上由PEDV病毒感染导致的仔猪腹泻，对于未感染的仔猪可以起到预防作用；临床试验表明，使用本发明制备的产品可以减少仔猪腹泻的发生率，提高猪场的经济效益；本发明制备成本低，无残留，适合大规模生产和推广。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。通过本发明的制备方法获得的抗仔猪腹泻高免卵黄抗体口服剂可减少仔猪的腹泻发生率，而且不会对仔猪带来应激等不良影响。同时也可运用该口服剂对同群未感染的仔猪进行预防，本发明的口服剂制备工艺简单，适合规模化生产及临床应用。
具体实施方式
实施例1PEDVCOE蛋白的表达和纯化
1.COE蛋白的表达
1)采集疑似PEDV发病猪肠道，取适量放入研钵中，加入适量PBS进行研磨。将研磨液3000rpm离心10分钟，取100μl上清，使用RNA提取试剂盒提取RNA。采用PrimerPremier5.0软件设计了一对引物，用于COE基因的扩增。上游引物M1：5’-CG GGATCC ACTTCTTTTGTTACTTTGCCATC-3’；下游引物M2：5’-CG GAATTC AACACCTTCAAGTGGTTTAGG-3’。在克隆引物5’端和3’端分别设计了BamHⅠ、EcoRⅠ限制性酶切位点，扩增大小为430bp，（如SEQIDNO:3所示）。氨基酸序列为（如SEQIDNO:4所示）
2)PCR产物胶回收纯化后，经限制性内切酶消化，回收的片段定向克隆于pMD18-T载体中，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性菌落，并送公司测序（如SEQIDNO:5所示）。将测序正确的阳性菌落扩大培养，提取质粒，经限制性内切酶消化，电泳观察，将目的片段切胶并回收，定向克隆于pColdⅡ载体，转化ChaperoneCompetentCellpG-Tf2/BL21，经PCR鉴定筛选获得阳性菌落。
3）将阳性菌株接种于氨苄青霉素（终浓度50μg/ml）和氯霉素（20μg/ml）抗性LB培养液中，37℃250rpm摇床培养过夜。第二日，按照1：100的比例将过夜培养物接种于氨苄青霉素（终浓度50μg/ml），氯霉素（终浓度50μg/ml）和四环素（终浓度5ng/ml）抗性LB培养液中，37℃250rpm摇床培养3h，待OD600≈0.8时，加入IPTG使其终浓度为1mM，30℃250rpm诱导表达5h。4℃8000rpm离心收集菌体。
离心收集的菌体加入40ml50mMPB、0.3MNaCl、10mM咪唑、5%甘油pH8.0的buffer重悬（每100ml培养液收集的菌体，加入10ml的buffer），置于冰上，使用超声波破碎仪破碎。然后4℃13000rpm离心30min。分别取未诱导全菌、诱导后全菌、破碎上清、破碎沉淀进行SDS-PAGE电泳检测。该蛋白为非可溶性表达。
蛋白的纯化
1）取（400ml）菌体破碎后收集的沉淀，加入20ml的PBS（包含0.5%的tritonx100、1mMDTT、1mMEDTA）彻底重悬后，放置于室温混匀1h，4℃13000rpm离心15min收集沉淀，然后重复洗涤一次；收集的菌体加入20ml的PBS（包含0.5%的tritonx100、1mMDTT、1mMEDTA、2M尿素）再次彻底重悬，放置于室温混匀1h后，4℃13000rpm离心15min收集洗涤后的包涵体。
2）洗涤后的包涵体，加入20ml的平衡buffer彻底重悬后，室温溶解过夜，4℃13000rpm离心15min，收集上清过镍柱进行亲和层析纯化，具体操作步骤如下：平衡：10个柱体积的平衡buffer平衡镍柱。上样：0.45μm滤膜处理好的样品全部上样。洗杂：20个柱体积洗杂buffer洗杂，直至流穿无物质流出。洗脱：250mM咪唑的洗脱buffer洗脱10个柱体积，收集洗脱产物。洗脱获得的目的蛋白，用20mMTris、0.15MNaCl、10%甘油、1mMGSSG、1mMGSH、pH8.0的buffer稀释4倍，然后放置于4度混匀过夜，第二天，稀释后的样品对同样的buffer进行透析透析，透析3次，一共24小时以上。复性好的目的蛋白，继续对PBSbuffer透析三次（4℃每次4h），然后4℃13000rpm离心15min收集上清。上清使用0.22μm的膜过滤后，使用截流量为3KD的millipore超滤管进行浓缩，浓缩好的样品使用BCA进行测浓度并进行SDS-PAGE检测。经检测，表达的蛋白浓度为1.05mg/ml，纯度大于90%。
实施例2免疫原的制备及免疫
1.免疫原的制备；
取弗氏佐剂和COE蛋白，按照1:1的体积比混合，开动磁力搅拌棒转动搅拌，直至形成油包水形态。其中首免时使用弗氏不完全佐剂，加强免疫时使用弗氏完全佐剂。
2.免疫；
5月龄海兰褐蛋鸡，首次免疫剂量为1ml/羽，首次免疫后2周、4周、8周分别进行三次加强免疫，免疫剂量为2ml/羽。
实施例3卵黄抗体的制备和效价测定
1.卵黄抗体的制备
第三次免疫后7天收集鸡蛋，用75%酒精对鸡蛋表面进行消毒，在无菌条件下收集卵黄，吸取200μl卵黄，加入1ml脂溶剂（0.06%k-卡拉胶，0.18%低脂果胶，10μMCaCl2），震荡混匀，4℃放置2h。11000g，4℃离心20min，将上清与沉淀分离，弃去沉淀，向上清中加入0.5倍体积的60%硫酸铵溶液，4℃放置1h。11000g，4℃离心20min，弃去上清，用1倍体积的PBS重悬，加入0.5倍体积的60%硫酸铵溶液，11000g，4℃离心20min，弃去上清，将沉淀用1倍PBS重悬，4℃保存备用。
2.PEDV卵黄抗体效价的测定
1)细胞接种，取培养好的Vero细胞，将其浓度调整为1×105/ml。传代至6孔板中，每孔2ml，轻轻振荡混匀。
2)将制备的卵黄抗体进行稀释，制备2-1-2-10共10个稀释度，同时将PEDV病毒液稀释至100PFU/0.3ml。取0.3ml卵黄抗体稀释液与等量被稀释的病毒液混合，37℃孵育1h，进行病毒中和反应。
3)待细胞铺满80%后，将6孔板中的细胞培养液弃去，加入中和反应后的混合液，每孔0.6ml，37℃吸附1h，弃去混合液，加入琼脂覆盖培养，3天后加入中性红染色，观察每孔蚀斑数，以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，卵黄抗体稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
实施例4PEDV卵黄抗体口服制剂的制备
收集卵黄抗体效价在1:64以上的鸡蛋，用75%酒精对鸡蛋表面进行消毒，晾干。打碎蛋壳，用蛋黄分离器将蛋黄分离开，将山梨酸钾溶于其中，搅拌均勾。将植物油水浴加热到70℃。将添加乙氧基喹啉的植物油分批缓慢加入到卵黄液中，边加入边搅拌，使其完全融合。观察乳化程度，最后加入维生素、矿物质和益生菌等。直至达到类似牙膏状半固体的乳化程度为止。将制作好的卵黄抗体膏分装入塑料软管中，放入65℃烘箱中巴氏灭菌10min。其中，植物油占总质量的比例为57%，卵黄40%，山梨酸钾0.25%，乙氧基喹啉0.25%，维生素、矿物质和益生菌共2.5%。
实施例5
2015年2月上海松江区某猪场8-15日龄仔猪236头出现腹泻症状，发病率达65%。发病仔猪明显脱水，体重迅速下降，少数仔猪出现呕吐症状。对病死仔猪解剖发现其胃内含有大量凝乳块，肠道充满气体，有较多黄色内容物，肠壁变薄、透明。采集发病猪肠道进行荧光PCR检测，证实为PEDV病毒阳性。对全群仔猪服用实施例4制备的卵黄抗体口服剂，每头猪每次2ml，3次/天，连用3天。同时，对腹泻仔猪进行补液，每天一次。两天后，新发病例迅速减少，症状较轻的仔猪明显好转。三天后无仔猪因腹泻死亡。
Claims (6)
1.一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂，其特征在于：含有以PEDV流行毒株保护性抗原基因COE蛋白免疫非免疫产蛋鸡后收集的鸡蛋卵黄中提取的卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂，其特征在于：由植物油、卵黄、山梨酸钾、乙氧基喹啉、维生素、矿物质和益生菌，在所述的口服剂中，所述的植物油的质量百分比浓度为57%-60%，所述的的卵黄的质量百分比浓度为37%-40%，所述的山梨酸钾的质量百分比浓度为0.25%，所述的乙氧基喹啉的质量百分比浓度为0.25%，余量为所述的维生素、矿物质和益生菌，所述的维生素、矿物质和益生菌的质量比为1:1:1，所述的卵黄是以PEDV流行毒株保护性抗原基因COE蛋白免疫非免疫产蛋鸡后收集的鸡蛋卵黄。
3.权利要求1所述的一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
采用猪流行性腹泻病毒阳性病料，使用RT-PCR方法扩增保护性抗原基因COE，连接到原核表达载体，对COE蛋白进行表达、纯化，使用弗氏佐剂对蛋白进行乳化，制备成免疫原；
利用制备的免疫原免疫非免疫蛋鸡；
免疫后收集鸡蛋，在无菌条件下收集卵黄，然后提取卵黄中的卵黄抗体；
运用蚀斑减数试验测定卵黄抗体对PEDV病毒的中和抗体效价；
收集卵黄抗体效价在1:64以上的鸡蛋，用75%酒精浸泡消毒20min-30min，晾干，打开鸡蛋，分离蛋黄，将蛋黄制备成卵黄抗体口服剂。
4.根据权利要求3所述的一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂的制备方法，其特征在于：在步骤5）中，用蛋黄分离器将蛋黄分离开后，按照质量百分比称取植物油、卵黄、山梨酸钾、乙氧基喹啉、维生素、矿物质和益生菌，先将山梨酸钾溶于卵黄中，搅拌均勾；将植物油水浴加热到65~75℃，在植物油中添加乙氧基喹啉，然后将添加了乙氧基喹啉的植物油加入到卵黄液中，边加入边搅拌，完全乳化后加入维生素、矿物质和益生菌，直至形成膏状液体即可。
5.根据权利要求3所述的一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂的制备方法，其特征在于：步骤1)中，COE蛋白，其纯度不低于85%，浓度不低于1mg/ml。
6.根据权利要求3所述的一种用于治疗仔猪流行性腹泻的卵黄抗体口服剂的制备方法，其特征在于：步骤2）中，免疫程序如下：首次免疫剂量为1ml/羽，首次免疫后2周、4周、8周分别进行三次加强免疫，免疫剂量为2ml/羽。
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|---|---|
| CN (1) | CN105412923A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111217906A (zh) * | 2018-11-27 | 2020-06-02 | 郑洪杰 | 猪消化系统疾病的预防或治疗用卵黄抗体的制造方法以及基于此而制造的卵黄抗体及其用途 |
| CN113683665A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-11-23 | 山东农业大学 | 一种圆圈病毒3型卵黄抗体的制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101081866A (zh) * | 2006-05-29 | 2007-12-05 | 雅臣药业集团（远东）有限公司 | 抗家畜和水产病原体的特异性IgY或复合IgY及其应用 |
| CN103694348A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-04-02 | 刘聚祥 | 一种治疗猪病毒性腹泻生物制剂的制备和应用方法 |
| CN104970224A (zh) * | 2015-06-12 | 2015-10-14 | 青岛大信饲料有限公司 | 一种预防和治疗猪流行性腹泻的组合物及配合饲料 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101081866A (zh) * | 2006-05-29 | 2007-12-05 | 雅臣药业集团（远东）有限公司 | 抗家畜和水产病原体的特异性IgY或复合IgY及其应用 |
| CN103694348A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-04-02 | 刘聚祥 | 一种治疗猪病毒性腹泻生物制剂的制备和应用方法 |
| CN104970224A (zh) * | 2015-06-12 | 2015-10-14 | 青岛大信饲料有限公司 | 一种预防和治疗猪流行性腹泻的组合物及配合饲料 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| QINGSONG HU: "Production of Egg Yolk Antibody (IgY) against Recombinant Porcine Epidemic Diarrhea Virus COE Protein", 《ACTA SCIENTIAE VETERINARIAE》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111217906A (zh) * | 2018-11-27 | 2020-06-02 | 郑洪杰 | 猪消化系统疾病的预防或治疗用卵黄抗体的制造方法以及基于此而制造的卵黄抗体及其用途 |
| CN113683665A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-11-23 | 山东农业大学 | 一种圆圈病毒3型卵黄抗体的制备方法 |
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