WO1999055835A1 - Vacuna anti-vibrio anguillarum (gava-3) para la prevencion de la enfermedad vibriosis en rodaballo y peces salmonidos, y procedimiento de obtencion - Google Patents

Vacuna anti-vibrio anguillarum (gava-3) para la prevencion de la enfermedad vibriosis en rodaballo y peces salmonidos, y procedimiento de obtencion Download PDF

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  • Anti-Vibrio ⁇ nguill ⁇ rum vaccine (GAVA-3) for the prevention of vibriosis disease in turbot and salmonid fish, and obtaining procedure.
  • An ⁇ -Vibrio ⁇ nguill ⁇ rum vaccine (GAVA-3) for the prevention of vibriosis disease in turbot and salmonid fish, and obtaining procedure.
  • the present invention patent is intended to disclose a new vaccine to protect turbot and salmon fish grown in seawater against vibriosis, and is based on the combination of cells and extracellular products of Vibrio ⁇ nguill ⁇ rum strains, causing mortality of fish, belonging to serotypes O ⁇ and 02 (subgroups O2 ⁇ and O2 ⁇ ).
  • the advantage of this vaccine over the existing ones is that it covers a greater antigenic spectrum, giving the fish a high degree of protection (80%) against the O ⁇ serotype and the two antigenic subgroups of serotype 02 (O2 ⁇ and 02 ⁇ ).
  • Vibriosis mainly caused by the Vibrio ⁇ nguill ⁇ rum species, is one of the most important bacterial diseases that affect marine fish, molluscs and crustaceans worldwide.
  • serotype 02 shows heterogeneity at the biochemical, genetic and serological level, detecting the existence of two antigenically distinct subgroups (O2 ⁇ and O2 ⁇ ) (Toranzo et al., (1987); Santos et al., (1995) alphabet cited.
  • extracellular products of strains belonging to the serotype O ⁇ and the two antigenic subgroups of serotype 02 (O2 ⁇ and O2 ⁇ ) are toxic when inoculated in fish, have qualitative differences and / or quantitative in the enzymatic composition and are immunologically distinct (Santos et al, (1991): Journal of Applied Ichthyology, 7: 160-167; Santos et al., (1995) op.
  • Vibrio anguillarum strains included in this vaccine are isolates R-82 (serotype O ⁇ ), RG-111 (serotype 02, subgroup O2 ⁇ ) and RV-22 (serotype 02, subgroup O2 ⁇ ), which have been deposited by the inventors of this patent in the Spanish Type Culture Collection with references CECT 5031, CECT 5032 and CECT 5033, respectively. These strains have the typical characteristics of the species, being Gram-negative, mobile, oxidase positive, fermentative and sensitive to the vibriostatic agent 0/129.
  • two-liter flasks are inoculated containing a liter of tryptone broth (TSC) with NaCl at a final concentration of 1% (TSC-1, tryptone 17 gr / L; peptone of soybean 3 gr / L; glucose 2.5 gr / L; bipotassium phosphate 2.5 gr / L; sodium chloride 10 gr / L; pH 7.3 ⁇ 0.2).
  • TSC-1 tryptone broth
  • glucose 2.5 gr / L peptone of soybean 3 gr / L
  • bipotassium phosphate 2.5 gr / L sodium chloride 10 gr / L
  • pH 7.3 ⁇ 0.2 pH 7.3 ⁇ 0.2
  • Incubation is performed at 25 ° C for 48 hours. At the end of the incubation period, formalin is added to the final concentration of 0.35% to kill the bacteria and inactivate the extracellular products, and it is kept under stirring for three more hours, after which it is transferred to 4 ° C.
  • the cultures of the three strains used in the vaccine are adjusted to an optical density of 1 (A 550 : Absorbance 550 ) and mixed in a 50: 25: 25% ratio (CECT 5031: CECT 5032: CECT 5033).
  • the vaccine mixture contains approximately 10 10 cells / mL and 160 ⁇ g of extracellular protein / mL.
  • Sterility control is carried out by sowing the vaccine mixture on tryptone soy agar plates (TSA) with NaCl at a final concentration of 1% (TSA-1) and on thioglycolate tubes, incubating for 72 hours at 25 and 37 ° C, respectively.
  • the specificity control is carried out by means of agglutination on slides, using the antisera obtained in rabbit against each one of the strains used in the manufacture of the vaccine (CECT 5031, CECT 5032, CECT 5033) and as an antigen the whole cells of said strains.
  • the product must be stored at 4 ° C until use.
  • the vaccine To administer the vaccine by a short bath, it is diluted 1/10 in the culture water and the fish are introduced into this vaccine bath and kept in it for 1 min. With each liter of vaccine, 100 kg of fish can be vaccinated in 20 batches of 5 kg, keeping the vaccine bath aerated. A 1/1000 dilution of the vaccine can also be used, and in this case the fish are kept in this bath for 1 hour with strong aeration (prolonged bath). To administer the vaccine by injection, the fish are inoculated with 0.1-0.2 mL / fish (depending on the weight of the fish) of undiluted vaccine mixture.
  • Vibrio anguillarum strains used in this vaccine are R-82 (serotype O ⁇ ),
  • RG-111 (Serotype 02, subgroup O2 ⁇ ) and RV-22 (Serotype 02, subgroup O2 ⁇ ) and have been isolated from turbot grown in Galicia.
  • the efficacy of this vaccine was evaluated in turbot both on a laboratory scale and on an industrial scale.
  • the power expressed as Relative Survival Percentage (RSP) has been greater than 80%.

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Abstract

La vacuna está compuesta, por tres cepas bacterianas de Vibrio anguillarum aisladas a partir del rodaballo: cepa CECT 5031 (serotipo 01), cepa CECT 5032 (serotipo 02, subgrupo 02α) y CECT 5033 (serotipo 02, subgrupo 02β), y por sus productos extracelulares. Tanto las cepas como los productos extracelulares se encuentran inactivados con formol. La vacuna es de aplicación en acuicultura.

Description

TÍTULO
Vacuna anti-Vibrio αnguillαrum (GAVA-3) para la prevención de la enfermedad vibriosis en rodaballo y peces salmónidos, y procedimiento de obtención.
DESCRIPCIÓN
Vacuna anú-Vibrio αnguillαrum (GAVA-3) para la prevención de la enfermedad vibriosis en rodaballo y peces salmónidos, y procedimiento de obtención.
La presente patente de invención está destinada a dar a conocer una nueva vacuna para proteger al rodaballo y peces salmónidos cultivados en agua de mar contra la vibriosis, y está basada en la combinación de células y productos extracelulares de cepas de Vibrio αnguillαrum, causantes de mortalidades de peces, pertenecientes a los serotipos OÍ y 02 (subgrupos O2α y O2β). La ventaja de esta vacuna frente a las ya existentes es que cubre un mayor espectro antigénico, confiriendo a los peces un elevado grado de protección (80 %) frente al serotipo OÍ y los dos subgrupos antigénicos del serotipo 02 (O2α y 02 β). La vibriosis, causada principalmente por la especie Vibrio αnguillαrum, es una de las enfermedades bacterianas más importantes que afectan a peces marinos, moluscos y crustáceos a nivel mundial. Esta enfermedad fue diagnosticada por primera vez en rodaballo cultivado en Galicia en el año 1985 (Devesa et al, (1985): In Fish and Shellfish Pathology, A. E. Ellis, ed. Chapter XIV pp 131-140, Academic Press) convirtiéndose desde entonces en uno de los principales problemas patológicos para la piscicultura marina de nuestra área. Aunque se han descrito un total de 10 serotipos en esta especie bacteriana, prácticamente todos los aislados de Vibrio αnguillαrum implicados en mortalidades de peces pertenecen a los serotipos OÍ y O2 (Toranzo et al., (1987): Aquaculture, 67: 41-51 ; Santos et al., (1995): Applied and Environmental Microbiology, 61 : 2495 - 2498). Además, mientras el serotipo OÍ constituye un grupo fenotípica y genéticamente homogéneo, el serotipo 02 muestra heterogeneidad a nivel bioquímico, genético y serológico, detectándose la existencia de dos subgrupos antigénicamente distintos (O2α y O2β) (Toranzo et al., (1987); Santos et al., (1995) opus cited. Además, se ha demostrado que los productos extracelulares de cepas pertenecientes al serotipo OÍ y a los dos subgrupos antigénicos del serotipo 02 (O2α y O2β) son tóxicos al ser inoculados en peces, presentan diferencias cualitativas y/o cuantitativas en la composición enzimática y son inmunológicamente distintos (Santos et al, (1991): Journal of Applied Ichthyology, 7: 160-167; Santos et al., (1995) op. cited. Teniendo en cuenta todo esto se ha realizado la selección de los componentes de la vacuna. Las cepas de Vibrio anguillarum incluidas en esta vacuna son los aislados R-82 (serotipo OÍ), RG-111 (serotipo 02, subgrupo O2α) y RV-22 (serotipo 02, subgrupo O2β), que han sido depositadas por los inventores de esta patente en la Colección Española de Cultivos Tipo con las referencias CECT 5031, CECT 5032 y CECT 5033, respectivamente. Estas cepas presentan las características típicas de la especie, siendo bacilos halófilos Gram-negativos, móviles, oxidasa positivos, fermentativos y sensibles al agente vibriostático 0/129.
En cuanto a los productos extracelulares, los de las tres cepas han mostrado actividad hemolítica, proteolítica y citotóxica. Las cepas CECT 5031 y CECT 5032 mostraron además actividades valina arilamidasa, tripsina, quimiotripsina y dermonecrótica que estaban ausentes en la cepa CECT 5033. Los productos extracelulares de las tres cepas presentan componentes proteicos y lipopolisacarídicos inmunológicamente distintos (Santos et al, (1995) op. cited.
PREPARACIÓN
A partir de preinóculos en fase logarítmica de crecimiento se inoculan matraces de dos litros conteniendo un litro de medio de cultivo caldo triptona de soja (TSC) con NaCl a una concentración final del 1 % (TSC-1, triptona 17 gr/L; peptona de soja 3 gr/L; glucosa 2,5 gr/L; fosfato bipotásico 2,5 gr/L; cloruro sódico 10 gr/L; pH 7,3 ± 0,2).
La incubación se realiza a 25 °C durante 48 horas. Finalizado el período de incubación, se añade al cultivo formol a una concentración final de 0,35 % para matar las bacterias e inactivar los productos extracelulares, y se mantiene durante tres horas más en agitación, al cabo de las cuales se transfiere a 4 °C. Los cultivos de las tres cepas empleadas en la vacuna se ajustan a una densidad óptica de 1 (A550: Absorbancia550) y se mezclan en proporción 50 : 25 : 25 % (CECT 5031: CECT 5032: CECT 5033). La mezcla vacunal contiene aproximadamente 1010 células/mL y 160 μg de proteína extracelular/mL.
El control de esterilidad se lleva a cabo sembrando la mezcla vacunal en placas de agar triptona de soja (TSA) con NaCl a una concentración final del 1 % (TSA-1) y en tubos de tioglicolato, incubando durante 72 horas a 25 y 37 °C, respectivamente.
El control de especificidad se realiza mediante aglutinación en portaobjetos, utilizando los antisueros obtenidos en conejo frente a cada una de las cepas empleadas en la fabricación de la vacuna (CECT 5031, CECT 5032, CECT 5033) y como antígeno las células enteras de dichas cepas.
El producto debe ser conservado a 4 °C hasta su utilización.
MODO DE ADMINISTRACIÓN
Para administrar la vacuna por baño corto, esta se diluye 1/10 en el agua de cultivo y los peces se introducen en este baño vacunal y se mantienen en el mismo durante 1 min. Con cada litro de vacuna se pueden vacunar 100 Kg de peces en 20 tandas de 5 Kg, manteniendo aireado el baño vacunal. También se puede emplear una dilución 1/1000 de la vacuna, y en este caso los peces se mantienen en este baño durante 1 hora con fuerte aireación (baño prolongado). Para administrar la vacuna por inyección, se inoculan los peces con 0,1 - 0,2 mL/pez (dependiendo del peso del pez) de mezcla vacunal sin diluir.
Para mejorar la protección obtenida se recomienda realizar la vacunación en peces de aproximadamente 1,0 g, así como la revacunación al cabo de un mes. Las cepas de Vibrio anguillarum empleadas en esta vacuna son R-82 (serotipo OÍ),
RG-111 (Serotipo 02, subgrupo O2α) y RV-22 (Serotipo 02, subgrupo O2β) y han sido aisladas a partir de rodaballo cultivado en Galicia.
La eficacia de esta vacuna fue evaluada en rodaballo tanto a escala de laboratorio como a escala industrial. La potencia, expresada como Porcentaje de Supervivencia Relativa (RSP) ha sido superior al 80 %.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Cepas de Vibrio anguillarum R-82 (serotipo OÍ), RG-111 (serotipo 02, subgrupo O2α) y RV-22 (serotipo 02, subgrupo O2β), aisladas a partir de rodaballo cultivado en Galicia, depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo con las referencias CECT 5031 , CECT 5032 y CECT 5033, respectivamente.
2.- Vacuna anti-Vibrio αnguillαrum para proteger al rodaballo y peces salmónidos cultivados en agua de mar frente a la vibriosis causada por los serotipos OÍ y O2 (subgrupos antigénicos O2α y O2β) compuesta por las células bacterianas y los productos extracelulares inactivados con formol de las cepas CECT 5031 (serotipo OÍ), CECT 5032 (serotipo O2, subgrupo O2α) y CECT 5033 (serotipo O2, subgrupo O2β) de este microorganismo.
3.- Procedimiento para la preparación de la vacuna de la reivindicación 2, caracterizado por el cultivo de las cepas bacterianas en medio líquido caldo triptona de soja suplementado con cloruro sódico, por la inactivación de las células bacterianas y sus productos extracelulares por tratamiento de los cultivos con formol a una concentración final del 0,35 % durante tres horas a 25 °C y porque los cultivos inactivados de las cepas se ajustan a una densidad óptica de 1 (Absorbancia550).
4.- Procedimiento según las reivindicaciones 2 y 3, caracterizado porque la proporción final de mezcla de las tres cepas y sus productos extracelulares en la vacuna es 50 : 25 : 25 % (CECT 5031 : CECT 5032: CECT 5033).
5.- Procedimiento según las reivindicaciones 2, 3, y 4, caracterizado porque la concentración de células bacterianas en la preparación vacunal es de 1010 células/mL y la concentración proteica de los productos extracelulares es de 160 μg/mL.
6.- Procedimiento de administración de la vacuna de la reivindicación 2, caracterizado porque la vacuna se puede administrar por baño corto (1 min. en la vacuna diluida 1/10), baño prolongado (1 hora en vacuna diluida 1/1000), o por inyección intraperitoneal de la vacuna sin diluir en dosis de 0,1 mL, en peces menores de 20 gramos, o de 0,2 mL en peces mayores de 20 gramos. REIVINDICACIONES MODIFICADAS
[recibidas por la oficina Internacional el 6 de agosto de 1999 (06.08.99); reivindicaciones 1 a 6 remplazadas por las reivindicaciones 1 a 5 (1 página)]
1.- Cepas de Vibrio anguillarum R-82 (serotipo OÍ), RG-1 11 (serotipo 02. subgrupo O2α) y RV-22 (serotipo 02, subgrupo O2B), aisladas a partir de rodaballo cultivado en Galicia, depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo con las referencias CECT 5031, CECT 5032 y CECT5033, respectivamente.
2.- Vacuna anü-Vibrio αnguillαrum para proteger al rodaballo y peces salmónidos cultivados en agua de mar frente a la vibriosis causada por los serotipos OÍ y O2 (subgrupos antigénicos O2α y O2β) compuesta por las células bacterianas y los productos extracelulares inactivados con formol de las cepas CECT 5031 (serotipo OÍ), CECT 5032 (serotipo O2, subgrupo O2α) y CECT 5033 (serotipo O2, subgrupo O2B) de este microorganismo.
3.- Procedimiento para la preparación de la vacuna de la reivindicación 2, caracterizado por el cultivo de las cepas bacterianas en medio líquido caldo triptona de soja suplementado con cloruro sódico, por la inactivación de las células bacterianas y sus productos extracelulares por tratamiento de los cultivos con formol a una concentración final del 0,35 % durante tres horas a 25 °C y porque los cultivos inactivados de las cepas se ajustan a una densidad óptica de 1 (Absorbanciasso).
4.- Procedimiento, según la reivindicación 3, para la preparación de la vacuna anti- Vibrio αnguillαrum, caracterizado porque la proporción final de mezcla de las tres cepas y sus productos extracelulares en la vacuna es 50 : 25 : 25 % (CECT 5031 : CECT 5032: CECT 5033).
5.- Procedimiento, según la reivindicacón 3, para la preparación de la vacuna anti- Vibrio αnguillαrum, caracterizado porque la concentración de células bacterianas en la preparación vacunal es de 1010 células/mL y la concentración proteica de los productos extracelulares es de 160 μg/mL.
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