CN110241057A - 一种直投式蛭弧菌发酵剂及其制备方法和使用方法 - Google Patents

Abstract

一种直投式蛭弧菌发酵剂，其特征在于：蛭弧菌冻干菌种团块、宿主菌团块按比例粉碎后，将粉碎后的混合物与蛭弧菌液体发酵营养盐按比例混合，置于玻璃瓶瓶或塑料中抽真空密封保存，即为直投式蛭弧菌发酵剂；本发明制备的直投式蛭弧菌发酵剂及其使用方法具有常温下保质期可以达到两年以上，体积小、重量轻、运输成本低、运输和保存环境对产品活性影响较小等等与冻干粉剂型相同的优点；养殖户用本发明制备的直投式蛭弧菌发酵剂只需在现场使用前经简易发酵，所得的蛭弧菌发酵液，具有活菌数高、单位养殖塘施用蛭弧菌的数量大但投入成本低、起效迅速、使用效果好等等相较于水剂和冻干粉剂更为显著的优点。

Description

一种直投式蛭弧菌发酵剂及其制备方法和使用方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种直投式蛭弧菌发酵剂及其制备方法和使用方法。

背景技术

目前消除养殖水体中致病菌的方法主要以各种消毒剂和抗生素对水体进行消毒净化处理，这种方法能够迅速杀灭水体中的致病菌，但也杀灭了水体中的有益微生物，破坏了水体的微生态系统，导致水产养殖动物产生环境应激和机体的免疫力下降，易被病原微生物感染。长久的使用消毒剂及抗生素也会导致致病菌的耐药性逐年增强，最终不能有效的控制致病菌。

近年来，利用有益微生物控制水产养殖中的病原微生物的技术越来越受到各方关注，尤其是蛭弧菌生物制剂，它具有有效的裂解养殖水体中的副溶血弧菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌等致病性微生物，但却不会影响养殖水体中的微生态系统，不会使病原菌产生耐药性，对人和动物无害等优点而备受人们关注。

目前市场上蛭弧菌生物制剂的剂型主要有两类，一类是水剂剂型，一类是冻干粉剂剂型。由于水剂剂型的蛭弧菌产品生产成本低，使用时直接以活菌投入养殖水塘，单位水塘投入的蛭弧菌数量大、起效迅速等优点，是目前市场上的主要剂型。但其缺点是产品中的蛭弧菌活菌数会随着存放期的变长而迅速下降，因此保质期较短，在常温环境下仅能保存3～4个月。且存在运输成本高、保存和运输环节的条件对产品活性影响较大等缺陷。

而冻干粉剂型的产品保质期长，在常温环境下可以保存两年以上，冷冻环境下保质期可以达到5年以上；且产品具有体积小、重量轻运输成本低，运输和保存环境对产品的活性影响较小等优点。但这类冻干粉剂产品却有生产成本高、单位养殖水塘投入的蛭弧菌数量低、以休眠菌投入水塘后需要一定的恢复期、起效缓慢等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种保存期限长、不易受运输和保存环境影响活性，且投入水塘后恢复快、起效快的直投式蛭弧菌发酵剂。

本发明的第二目的在于提供此直投式蛭弧菌发酵剂的制备方法和使用方法。

为了达成上述目的，本发明的解决方案为：一种直投式蛭弧菌发酵剂，其特征在于：蛭弧菌冻干菌种团块、宿主菌团块按比例粉碎后，将粉碎后的混合物与蛭弧菌液体发酵营养盐按比例混合，抽真空密封保存，即为直投式蛭弧菌发酵剂。

进一步，所述蛭弧菌冻干菌种团块、宿主菌团块与蛭弧菌液体发酵营养盐三种物料的重量比为1:0.01～1.0：10～150。

进一步，所得直投式蛭弧菌发酵剂定量填充于西林瓶或输液瓶或塑料袋中，所述的定量填充的重量范围为1～200克，抽真空密封，即为一常规份量的直投式蛭弧菌发酵剂。

进一步，所述蛭弧菌冻干菌种团块为蛭弧菌属的多种或任一种所制成菌种团块。

进一步，所述宿主菌团块为大肠杆菌种、弧菌属、志贺氏菌属、气单胞菌属中任意一种所制的宿主菌团块。

进一步，所述蛭弧菌液体发酵营养盐为氯化钠、氯化钙、氯化镁、氢氧化钠按重量比范围为1:0.001～0.2:0.001～0.4：0.01～0.04混合粉碎干燥后所得。

一种直投式蛭弧菌发酵剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：灭活宿主菌悬液的制备：以常规微生物无菌接种操做，将宿主菌接种于NB液体培养基中，摇床培养24小时后离心去掉发酵液培养基，将获得的宿主菌菌泥以等体积的灭菌蒸馏水稀释，将稀释后的宿主菌菌浓悬液经100℃的水浴灭活处理10min，即为灭活宿主菌悬液；

步骤二：蛭弧菌固体培养物的制备：将一定量的凝固剂加入氯化钠含量为2％的盐水中，煮沸溶解，即为蛭弧菌固体培养基；将蛭弧菌固体培养基灭菌后置于45℃的水浴锅中备用；取保存的蛭弧菌软琼脂菌种一只，加入蒸馏水后摇匀静置2小时，上清液即为蛭弧菌菌种浸出液；无菌操作下将步骤一制备的灭活宿主菌悬液与蛭弧菌菌种浸出液按1:0.1～1.0的比例均匀混合于蛭弧菌固体培养基中，然后倒入平板中25～28℃培养至平板中的固体培养基由浑浊转为透明，即为培养成熟的蛭弧菌固体培养物；

步骤三：蛭弧菌冻干菌种团块的制备：将步骤二制备的蛭弧菌固体培养物按比例加入硅藻土、甘露聚糖、二甲基亚砜等保护剂，混合均匀，真空冷冻干燥至物料含水量为1％～12％时，即得蛭弧菌冻干菌种团块；

步骤四：宿主菌团块的制备：将步骤一制备的灭活宿主菌悬液真空干燥至物料含水量为1％～12％时，即得宿主菌团块；

步骤五：蛭弧菌液体发酵营养盐的制备：将氯化钠、氯化钙、氯化镁、氢氧化钠按比例投入粉碎机中，以0.6～0.8毫米的筛网孔径粉碎过筛后，干燥至含水量为1％～12％，即为蛭弧菌液体发酵营养盐；

步骤六：直投式蛭弧菌发酵剂的制备：将步骤三、步骤四制备的蛭弧菌冻干菌种团块、宿主菌团块按比例投入低温粉碎机粉碎，将粉碎后的混合物与步骤五制备的蛭弧菌液体发酵营养盐按一定比例混合，定量填充于西林瓶或输液瓶或塑料袋中，抽真空密封后，即为直投式蛭弧菌发酵剂。

进一步，所述步骤一中使用的宿主菌为大肠杆菌、弧菌属、志贺氏菌属、气单胞菌属中任意一种。

进一步，所述步骤二中所述的蛭弧菌软琼脂菌种中使用的菌种为蛭弧菌属的一种或多种。

进一步，所述步骤二中制备蛭弧菌固体培养物所使用的盐水与凝固剂的比例为每1000毫升加入5～100克的凝固剂。

进一步，所述步骤三制备蛭弧菌菌种做干燥时，1重量份蛭弧菌固体培养物加入的保护剂重量为硅藻土0.1～1.2份；甘露聚糖0.01～0.08份；二甲基亚砜0.01～0.05份。

进一步，所述步骤五制备蛭弧菌液体发酵营养盐时，氯化钠、氯化钙、氯化镁、氢氧化钠按重量比范围为1:0.001～0.2:0.001～0.4：0.01～0.04。

进一步，所述所述步骤六中蛭弧菌冻干菌种团块、宿主菌团块与蛭弧菌液体发酵营养盐三种物料的重量比例为1:0.01～1.0：10～150。

一种直投式蛭弧菌发酵剂的使用方法，其特征在于：自来水或海水灭菌后投入直投式蛭弧菌发酵剂，其中直投式蛭弧菌发酵剂的使用量为每1升自来水投入0.1～0.5份常规份量的直投式蛭弧菌发酵剂；搅拌使直投式蛭弧菌发酵剂中的蛭弧菌液体发酵营养盐完全溶解后，密封置于30℃以下的阴凉避光环境中静置培养至液体由浑浊转为清澈后，均匀泼洒在养殖水塘中。

采用上述方案后，本发明制备的直投式蛭弧菌发酵剂及其使用方法克服了上述两类产品的所有缺点，具有常温下保质期可以达到两年以上，体积小、重量轻、运输成本低、运输和保存环境对产品活性影响较小等等与冻干粉剂型相同的优点。养殖户用本发明制备的直投式蛭弧菌发酵剂只需在现场使用前经简易发酵，所得的蛭弧菌发酵液，具有活菌数高、单位养殖塘施用蛭弧菌的数量大但投入成本低、起效迅速、使用效果好等等相较于水剂和冻干粉剂具有更为显著的优点。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做详细描述。

实施例：

步骤一：灭活宿主菌悬液的制备：取大肠杆试管菌种一只，无菌操作下在试管中注入5毫升灭菌蒸馏水，充分震荡后洗下菌苔，摇匀后无菌操作下接种于经121℃灭菌处理的装有NB液体培养基的三角瓶中，将接种后的三角瓶置于180r/min、35℃的摇床培养24小时即得大肠杆菌发酵液；将发酵液置于6000r/min离心15分钟，去掉发酵液培养基部分，将余下的大肠杆菌菌泥以等体积的灭菌蒸馏水稀释后，经100℃水浴热灭活处理10min，即为灭活宿主菌悬液；

步骤二：蛭弧菌固体培养物的制备：将7克琼脂加入氯化钠含量为2％的1000毫升的盐水中，加热煮沸至充分溶解，分别装入250毫升的三角瓶中，每瓶装量200毫升，即为蛭弧菌固体培养基。将三角瓶置于121℃灭菌30min后取出，置于45℃的水浴锅中备用；取4℃保存的蛭弧菌软琼脂菌种一只，加入20毫升灭菌蒸馏水，混合均匀后静置2小时，上清液即为蛭弧菌菌种浸出液；无菌操作下在每只装有200毫升琼脂溶液的三角瓶中加入步骤一制备的灭活宿主菌悬液1毫升、蛭弧菌菌种浸出液2毫升，充分混合均匀后，注入直径为15cm的培养皿中，每只培养皿中注入按上述体积调配的蛭弧菌固体培养基、宿主菌悬液、蛭弧菌菌种浸出液的混合液100毫升，待培养皿中的混合液冷却凝固后，将其置于25～28℃的培养箱中平板培养3～5天，平板培养基上出现大量的透明斑，当透明斑融合后，平板上的培养基由浑浊转为完全透明，即为培养成熟的蛭弧菌固体培养物；

步骤三：蛭弧菌冻干菌种团块的制备：将步骤二制备的蛭弧菌固体培养物取出置于2000毫升的烧杯中，按重量比每克蛭弧菌固体培养物加入硅藻土0.4克、甘露聚糖0.05克、二甲基亚砜0.01克置于匀浆器混合均匀，再置于经灭菌处理的真空冷冻干燥机的托盘中进行真空冷冻干燥，投料厚度为10毫米；设置真空冷冻干燥机的预冻温度为-40℃、预冻时间为5小时、升华真空度为0.3毫巴，升华干燥控制时间为48小时，升华温度逐渐回升至常温，最高温度不超过30℃；当物料形成海绵体结构、含水量降低至2％时，取出备用，即得蛭弧菌冻干菌种团块；

步骤四：宿主菌团块的制备：将步骤一制备的灭活宿主菌悬液置于真空干燥箱的托盘中，投料厚度不超过10毫米，温度控制在60℃、真空度控制在0.3毫巴、干燥时间为8小时，当灭活宿主菌含水量降低至2％时，取出备用，即得宿主菌团块；

步骤五：蛭弧菌液体培养营养盐的制备：将氯化钠、氯化钙、氯化镁、氢氧化钠按重量比为1:0.04:0.02：0.02的比例投入普通粉碎机中，以0.8毫米的筛网孔径粉碎过筛后，置于干燥箱中110℃干燥4小时，含水量降至1％时，取出备用，即为蛭弧菌液体发酵营养盐；

步骤六：直投式蛭弧菌发酵剂的制备：将步骤三、步骤四制备的蛭弧菌冻干菌种海绵状团块、宿主菌海绵状团块按重量比1:0.1的比例投入低温粉碎机粉碎至120目粒度，然后与步骤五制备的蛭弧菌液体培养营养盐以重量比计1:66.6的比例混合均匀，将混合均匀后的物料投入定量真空装瓶压盖机中，以150毫升容量的玻璃瓶每瓶填装混合物的剂量为100克，抽真空压盖后，即为一常规份量的直投式蛭弧菌发酵剂；

步骤七：直投式蛭弧菌发酵剂的使用方法：取普通自来水5000毫升置于不锈钢锅中煮沸至100℃，倒入干净的5升容量的无色玻璃瓶中，加盖自然冷凉至30℃以下，然后将步骤六制备的一常规份量的直投式蛭弧菌发酵剂投入其中，搅拌均匀以八层纱布封口，置于30℃以下的阴凉避光环境中静置培养自然发酵72小时，液体由浑浊转为清澈后，即得实施例的样品，为蛭弧菌发酵液。

上述步骤七中，投放使用前的发酵过程，不需要完全按照实施例的顺序进行使用，可将步骤三、步骤四所得的蛭弧菌冻干菌种团块、宿主菌团块按比例分别粉碎，以及步骤五制备蛭弧菌液体发酵营养盐的氯化钠、氯化钙、氯化镁、氢氧化钠按照比例分别粉碎，再分别直接投入相应比例的煮沸冷凉的自来水或煮沸冷凉的海水中进行蛭弧菌在液体中的发酵；

也可先将将步骤三、步骤四所得的蛭弧菌冻干菌种团块、宿主菌团块按比例混合后粉碎；再将步骤五制备蛭弧菌液体发酵营养盐的氯化钠、氯化钙、氯化镁、氢氧化钠按照比例分别粉碎；再分别直接投入相应比例的煮沸冷凉的自来水或煮沸冷凉的海水中进行蛭弧菌在液体中的发酵；

上述步骤七所得蛭弧菌发酵液，其使用时均匀泼洒在养殖水塘的用量为每亩200～1500毫升。

所使用的凝固剂可为琼脂、卡拉胶、黄原胶、阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶和无机硅胶中的一种或多种混合。

所述步骤七中，密封置于30℃以下的阴凉避光环境中静置培养至液体由浑浊转为清澈的发酵时间范围为24～168小时。

步骤三、步骤四、步骤五所使用的干燥方法为真空冷冻干燥、真空加热干燥、低温冷风干燥、高温热风干燥、喷雾干燥其中任一种皆可。

用本发明制备的直投式蛭弧菌发酵剂经步骤七中的简易发酵方法发酵后的蛭弧菌发酵液做如下检测比对：

1、随机选取市场上不同公司生产的蛭弧菌生物制剂3份，分别编号为样1、样2、样3，将实施例的样品——蛭弧菌发酵液编号为样4；将副溶血弧菌接种于NB试管斜面，培养24小时后，在斜面试管中注入5毫升灭菌生理盐水洗下菌苔，充分摇匀即为实验用副溶血弧菌悬液；取四只1000毫升容量的烧杯分别加入1000毫升灭菌海水，4只烧杯上分别标记为样1、样2、样3、样4；吸取0.1毫升副溶血弧菌悬液分别加入4只烧杯中混合均匀，由4只烧杯中分别吸取0.1毫升混合液涂布4个TCBS平板，置于35℃恒温箱中培养24小时，分别数取4个TCBS平板中副溶血弧菌菌落数，并作记录；分别吸取样1、样2、样3、样4中制剂各0.1毫升加入对应标记的烧杯中，将4只烧杯置于28℃的恒温箱中培养72小时。分别吸取1、样2、样3、样4烧杯中的液体0.1毫升，分别接种于4只TCBS平板中，涂布均匀后置于35℃恒温箱中培养24小时，数取4只平板中的菌落数并作记录；培养完成后计算出每个样品在接种前后每个烧杯中每毫升液体中的副溶血弧菌含量，以接种后各产品样品对副溶血弧菌的清除率来判定产品实际应用效果；各样品接种各制剂培养前后液体中副溶血弧菌菌数的变化如下表一所示：

表一

项目	样1	样2	样3	样4
					接种前(cfu/mL)	6680	7250	6810	6800
接种72h后(cfu/mL)	2210	3680	4950	390
					接种后细菌清除率(％)	66.9	49.2	27.3	94.3

上表效果验证数据显示，在同样条件下接种各样品后，以该专利制备的蛭弧菌发酵液对副溶血弧菌的清除率最高。

2、随机选取市场上不同公司生产的蛭弧菌生物制剂3份，分别编号为样1、样2、样3，将实施例的样品——蛭弧菌发酵液编号为样4；以霍乱弧菌接种于NB试管斜面，培养24小时后，在斜面试管中注入5毫升灭菌生理盐水洗下菌苔，充分摇匀即为实验用霍乱弧菌悬液；取四只1000毫升容量的烧杯分别加入1000毫升灭菌海水，4只烧杯上分别标记为样1、样2、样3、样4；吸取0.1毫升霍乱弧菌悬液分别加入4只烧杯中混合均匀，由4只烧杯中分别吸取0.1毫升混合液涂布4个TCBS平板，置于35℃恒温箱中培养24小时，分别数取4个TCBS平板中霍乱弧菌菌落数，并作记录；分别吸取样1、样2、样3、样4中制剂各0.1毫升加入对应标记的烧杯中，将4只烧杯置于28℃的恒温箱中培养72小时。分别吸取1、样2、样3、样4烧杯中的液体0.1毫升，分别接种于4只TCBS平板中，涂布均匀后置于35℃恒温箱中培养24小时，数取4只平板中的菌落数并作记录；培养完成后计算出每个样品在接种前后每个烧杯中每毫升液体中的霍乱弧菌含量，以接种后各产品样品对霍乱弧菌的清除率来判定产品实际应用效果，接种各产品样品培养前后液体中霍乱弧菌菌数的变化如下表二所示：

表二

项目	样1	样2	样3	样4
					接种前(cfu/mL)	5860	5780	6120	5830
接种72h后(cfu/mL)	4100	4900	1230	680
					接种后细菌清除率(％)	30.0	15.2％	79.9	89.2

上表效果验证数据显示，在同样条件下接种各样品后，本专利技术制备的蛭弧菌发酵液对霍乱弧菌的清除率最高。

3、随机选取市场上不同公司的蛭弧菌生物制剂3份，分别编号为样1、样2、样3，将实施例的样品——蛭弧菌发酵液编号为样4；在夏季高温时，对虾养殖池塘致病菌多发季节里，选取已有致病菌滋生的、水面面积相同的对虾养殖池塘4个检测水体，分别编号为A组、B组、C组、D组；以TCBS、AHM、麦康凯琼脂三种选择性培养基按常规操作分别检测4组对虾养殖池塘检测水体中副溶血弧菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌的含量，并做记录；将样1、样2、样3、样4产品样品对应加入A、B、C、D四个养殖池塘检测水体中，使各样品的终浓度在池塘检测水体中达到1ppm，72小时后以TCBS、AHM、麦康凯琼脂三种选择性培养基按常规操作分别检测4组对虾养殖池塘检测水体中副溶血弧菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌的含量，并做记录；按常规细菌计数方法计算出各组池塘水施用蛭弧菌制剂前后，每毫升中4种致病菌的含菌数量；根据各池塘水体施用蛭弧菌生物制剂后4种致病菌被清除的数量百分率，判定4种生物制剂样品的使用效果，施用各蛭弧菌生物制剂样品前后4种致病菌菌数变化如下表三：

表三

上表验证效果数据显示：在病原菌已经滋生的虾塘中，本发明生产的蛭弧菌发酵液实际应用效果都明显好于其他3个产品，对养殖水体中常见的四种病原菌均有较好的清除效果。

以上表一至表三中的实际效果验证数据可以说明，利用本发明的方法制备的直投式蛭弧菌发酵剂发酵的蛭弧菌发酵液，针对各种养殖水体中主要致病菌具有强烈的裂解作用，能产生较好的抑菌效果。

以上所述仅为本发明的实施例，并非对本案设计的限制，凡依本案的设计关键所做的等同变化，均落入本案的保护范围。

Claims (14)

1.一种直投式蛭弧菌发酵剂，其特征在于：蛭弧菌冻干菌种团块、宿主菌团块按比例粉碎后，将粉碎后的混合物与蛭弧菌液体发酵营养盐按比例混合，抽真空密封保存，即为直投式蛭弧菌发酵剂。

2.如权利要求1所述的一种直投式蛭弧菌发酵剂，其特征在于：蛭弧菌冻干菌种团块、宿主菌团块与蛭弧菌液体发酵营养盐三种物料的重量比为1:0.01～1.0：10～150。

3.如权利要求1所述的一种直投式蛭弧菌发酵剂，其特征在于：所得直投式蛭弧菌发酵剂定量填充于西林瓶或输液瓶或塑料袋中，所述的定量填充的重量范围为1～200克，抽真空密封，即为一常规份量的直投式蛭弧菌发酵剂。

4.如权利要求1所述的一种直投式蛭弧菌发酵剂，其特征在于：所述蛭弧菌冻干菌种团块为蛭弧菌属的多种或任一种制成的菌种团块。

5.如权利要求1所述的一种直投式蛭弧菌发酵剂，其特征在于：所述宿主菌团块为大肠杆菌种、弧菌属、志贺氏菌属、气单胞菌属中任意一种所制成的宿主菌团块。

6.如权利要求1所述的一种直投式蛭弧菌发酵剂，其特征在于：所述蛭弧菌液体发酵营养盐为氯化钠、氯化钙、氯化镁、氢氧化钠按重量比范围为1:0.001～0.2:0.001～0.4：0.01～0.04混合粉碎干燥后所得。

7.一种直投式蛭弧菌发酵剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：灭活宿主菌悬液的制备：以常规微生物无菌接种操做，将宿主菌接种于NB液体培养基中，摇床培养24小时后离心去掉发酵液培养基，将获得的宿主菌菌泥以等体积的灭菌蒸馏水稀释，将稀释后的宿主菌菌浓悬液经100℃的水浴灭活处理10min，即为灭活宿主菌悬液；

步骤二：蛭弧菌固体培养物的制备：将一定量的凝固剂加入氯化钠含量为2％的盐水中，煮沸溶解，即为蛭弧菌固体培养基；将蛭弧菌固体培养基灭菌后置于45℃的水浴锅中备用；取保存的蛭弧菌软琼脂菌种一只，加入蒸馏水后摇匀静置2小时，上清液即为蛭弧菌菌种浸出液；无菌操作下将步骤一制备的灭活宿主菌悬液与蛭弧菌菌种浸出液按1:0.1～1.0的比例均匀混合于蛭弧菌固体培养基中，然后倒入平板中25～28℃培养至平板中的固体培养基由浑浊转为透明，即为培养成熟的蛭弧菌固体培养物；

步骤三：蛭弧菌冻干菌种团块的制备：将步骤二制备的蛭弧菌固体培养物按比例加入硅藻土、甘露聚糖、二甲基亚砜等保护剂，混合均匀，真空冷冻干燥至物料含水量为1％～12％时，即得蛭弧菌冻干菌种团块；

步骤四：宿主菌团块的制备：将步骤一制备的灭活宿主菌悬液真空干燥至物料含水量为1％～12％时，即得宿主菌团块；

步骤五：蛭弧菌液体发酵营养盐的制备：将氯化钠、氯化钙、氯化镁、氢氧化钠按比例投入粉碎机中，以0.6～0.8毫米的筛网孔径粉碎过筛后，干燥至含水量为1％～12％，即为蛭弧菌液体发酵营养盐；

步骤六：直投式蛭弧菌发酵剂的制备：将步骤三、步骤四制备的蛭弧菌冻干菌种团块、宿主菌团块按比例投入低温粉碎机粉碎，将粉碎后的混合物与步骤五制备的蛭弧菌液体发酵营养盐按一定比例混合，定量填充于西林瓶或输液瓶或塑料袋中，抽真空密封后，即为直投式蛭弧菌发酵剂。

8.根据权利要求7所述的一种直投式蛭弧菌发酵剂的制备方法，其特征在于，步骤一中使用的宿主菌为大肠杆菌、弧菌属、志贺氏菌属、气单胞菌属中任意一种。

9.根据权利要求7所述的一种直投式蛭弧菌发酵剂的制备方法，其特征在于：步骤二中所述的蛭弧菌软琼脂菌种中使用的菌种为蛭弧菌属的一种或多种。

10.根据权利要求7所述的一种直投式蛭弧菌发酵剂的制备方法，其特征在于：步骤二中制备蛭弧菌固体培养物所使用的盐水与凝固剂的比例为每1000毫升加入5～100克的凝固剂。

11.根据权利要求7所述的一种直投式蛭弧菌发酵剂的制备方法，其特征在于，步骤三制备蛭弧菌菌种做干燥时，1重量份蛭弧菌固体培养物加入的保护剂重量为硅藻土0.1～1.2份；甘露聚糖0.01～0.08份；二甲基亚砜0.01～0.05份。

12.根据权利要求7所述的一种直投式蛭弧菌发酵剂的制备方法，其特征在于：步骤五制备蛭弧菌液体发酵营养盐时，氯化钠、氯化钙、氯化镁、氢氧化钠按重量比范围为1:0.001～0.2:0.001～0.4：0.01～0.04。

13.根据权利要求7所述的一种直投式蛭弧菌发酵剂的制备方法，其特征在于：所述步骤六中蛭弧菌冻干菌种团块、宿主菌团块与蛭弧菌液体发酵营养盐三种物料的重量比例为1:0.01～1.0：10～150。

14.一种直投式蛭弧菌发酵剂的使用方法，其特征在于：自来水或海水灭菌后投入直投式蛭弧菌发酵剂，其中直投式蛭弧菌发酵剂的使用量为每1升自来水投入0.1～0.5份常规份量的直投式蛭弧菌发酵剂；搅拌使直投式蛭弧菌发酵剂中的蛭弧菌液体发酵营养盐完全溶解后，密封置于30℃以下的阴凉避光环境中静置培养至液体由浑浊转为清澈后，均匀泼洒在养殖水塘中。