CN107743397B - 水产养殖中细菌感染的治疗 - Google Patents
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Abstract
一种组合物,包括共价连接到可食用颗粒上的噬菌体,并且用于治疗鱼类或甲壳类动物的细菌感染。可以治疗由种引弧菌、气单胞菌、耶尔森氏菌、摩替亚氏菌、立克次氏体、鱼立克次氏体、乳球菌、假单胞菌、黄杆菌或发光杆菌菌起的鱼类或甲壳类动物的感染。溶源性噬菌体感染的细菌可用于治疗由携带表达毒素基因的溶源性噬菌体的细菌引起的同类感染的鱼类或甲壳类动物的病症。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖(通常为养殖虾、对虾和鱼类)中细菌感染的治疗。具体而言,本发明具体涉及用于减少或预防感染和/或治疗此类水产养殖中现有的感染的组合物和方法。
技术背景
噬菌体是地球上最为众多的生命形式。只要有细菌生长的环境即存在噬菌体。在地下水和地表水、土壤、食物(例如泡菜,葡萄酒)、污水和污泥中均可检测到噬菌体。它们也可从人类和动物中分离出来,例如从粪便、尿液、唾液、唾沫、瘤胃和血清中分离出来。噬菌体能够穿透包括中枢神经系统在内的各种器官和组织,并且是肠道菌群连同其细菌宿主的一部分。水生生态系统中细菌总死亡率的10-80%可归因于噬菌体,并且噬菌体是限制细菌种群的重要因素。
噬菌体的治疗应用是众所周知的。WO 03/093462公开了一种用于固定病毒(尤其是噬菌体)的方法,同时保留其用作抗菌剂的生物活性。鉴于噬菌体的天然环境是含水的,人们普遍认为,如WO 03/093462中所公开的脱水稳定性趋同于水性培养基中的天然稳定性。
在二十世纪九十年代,海洋和内陆水域的捕捞量达到了极限,野生捕捞鱼类的供应量达到了顶峰。随着全球野生鱼类供应停滞不前和人口数量的不断增长,最新研究表明,养殖鱼类和贝类的产量在2010年至2050年间必须增加133%,以满足预测的全球鱼类需求。
全世界近三分之一的海鲜是由工业水产养殖生产的,产量每年增长6%,从1990年的870万吨增至2011年的5,000万吨,计划到2030年将达到8,000万吨。然而,鱼类养殖场经常因微生物病原体引起的感染而蒙受巨大的经济损失,这些微生物病原体包括容易通过水传播并因此能够感染各种鱼类的多重耐药性细菌。
尽管大多数细菌分类群中已经发现了致病菌种,但只有相对较少的病原体才会造成重大的经济损失。弧菌病和发光杆菌病主要发生于世界各地的天然和商业化养殖系统中海洋和河口鱼类,很少发生于淡水鱼类。这两种病症都会导致鱼类重大死亡,在受感染的养殖设施中最高可达100%的值。弧菌病和发光杆菌病是由弧菌科家族细菌引起的。弧菌病是由弧菌属(即鳗弧菌)引起的。
其他种类的弧菌,如溶藻弧菌、鲨鱼弧菌、杀鲑弧菌、海鱼弧菌、病海弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌,也会在几种鱼类中造成重要的感染。发光杆菌病是由美人鱼发光杆菌杀鱼亚种引起的,这是一种高致病性细菌,似乎不具有宿主特异性,可感染各种不同鱼类。包括杀鲑气单胞菌、疖病病原体、类立克次体细菌、海洋噬纤维菌、嗜冷黄杆菌和变形假单胞菌等的其他细菌也是重要的鱼类病原体。
虾类早期死亡综合征(EMS)等病症是由细菌感染引起的,其中细菌(副溶血性弧菌)本身由携带毒素基因的溶源性噬菌体感染。噬菌体感染时,细菌将噬菌体加入其基因组,并在虾体内表达导致EMS的毒素。
虽然疫苗接种是预防多种传染病的理想方法,但并非总是适用于鱼类。
化疗是治疗或预防细菌感染的一种快速有效的替代方法,但是,频繁使用抗生素已导致水产养殖、农业和医疗领域病原菌耐药性增加,由于很少有化疗药物被许可用于渔业,所以需要替代治疗。
中井等人(《水生生物病症》第37卷,第33-41页,1999年6月23日)描述了通过使用格氏乳球菌敏感的噬菌体处理黄尾鱼中的格氏乳球菌感染的效果。中井等人报告说,他们对天然(未灭菌)海水进行的稳定性测试的三种噬菌体分离物中的每一种均存活3天,但在1周内全部死亡。中井等人还描述了采用107.9PFU/g的噬菌体浸渍的鱼食的应用。将这种食物喂给随后通过肛门插管用108.5CFU格氏乳球菌攻击的鱼,从而降低了受攻击鱼的死亡率。
WO 2006/047872公开了包含吸附在基质上的噬菌体的抗菌组合物。该组合物可加入到水产饲料中使用。
已有人提出将噬菌体用于各种细菌感染的治疗。然而,众所周知,噬菌体在自然环境中,即在水中只能存活相对较短的时间。基于公知数据,例如C.H.萨特尔(1994年《微生物生态学》杂志第28期第237-243页)的数据,天然海水样本中病毒的平均衰减率可以计算为约每天0.48。天然水环境中噬菌体的存活率大大降低是由于多种原因造成的,主要是由于捕食和日照。
因此,需要一种替代手段来治疗或减少养殖甲壳类动物(特别是虾、对虾以及鱼类)的细菌感染。
发明目的
本发明的一个目的是提供组合物和这些组合物的用途,以及使用这些组合物的方法,这些组合物可为商业养殖甲壳类动物(例如虾、对虾和/或鱼类)的细菌感染提供替代治疗。具体实施例的另一个目的是提供改进的此类组合物、用途和方法。
发明内容
一种包括共价连接到颗粒的噬菌体的组合物,用于治疗鱼类或甲壳类动物中的细菌感染。优选使用可食用颗粒。本发明基于噬菌体在水环境中的稳定性和活性的提高,从而为水产养殖中的细菌感染提供可能的治疗。
提供了一种甲壳类动物或鱼类饲料,包括共价连接到颗粒上的噬菌体,用于治疗鱼类或甲壳类动物的细菌感染。
一种用于制备鱼类或甲壳类动物饲料的方法,包括将共价连接到颗粒的噬菌体混入饲料成分中,以生产包括所述颗粒的饲料。提供了一种溶源性噬菌体感染的细菌,用于治疗鱼类或甲壳类动物的病症。
具体实施方式
本发明的组合物相应地包括共价连接到颗粒上的噬菌体,用于治疗鱼类或甲壳类动物的细菌感染。在给鱼类或甲壳类动物给药后(例如通过含有该颗粒的饲料),细菌感染得到治疗。
该颗粒可以是载体颗粒,由可食用原料或惰性原料制成,在这种情况下,载体颗粒通常为近似球形。其平均直径可达到1毫米、可达到100微米、可达到50微米、可达到10微米,从之前的1纳米、10纳米,100纳米、0.5微米或这些的任何组合。在下面的具体实施例中,使用1至200微米范围内的颗粒。该颗粒通常可以是近似圆形或球状的;优选表面平滑的。可食用原料的颗粒或碎片也可以是形状不规则、大小不一的。
使用本领域公认的标准方法和装置适当地测量粒度。可以使用各种技术(包括激光衍射、动态光散射(DLS)、碟式离心和光学显微镜)实现分散体中的粒度测量。所有这些技术各有其优点和局限性。激光衍射依赖于样本对测量区域的良好控制呈现,并且限于颗粒浓度范围较窄的样本。通常需要稀释,这可能会影响粒度,特别是在高溶解度的化合物中。粒度测量设备的实例是由马尔文仪器公司(英国)制造的,采用激光衍射法。对于高度不规则的颗粒,即使相对来说颗粒是非球形的,直径也是指任何尺寸中的最大直径。
在本发明的实施例中,提供了共价连接到多个颗粒的噬菌体。它们优选相对同质的形式,其中多个颗粒中的大部分(优选基本上全部颗粒)具有在所述范围内的直径,更优选为80%以上、90%以上或95%以上的含有共价连接噬菌体的颗粒的直径在所述范围内(如上所述或本文其他地方所述的任何范围)。
通过共价键固定噬菌体的本发明中所使用的颗粒通常是可食用的,或对待治疗动物基本上是惰性的。在实施例中,使用尼龙颗粒(珠粒)。可以使用其它惰性(优选无毒)的生物相容性材料。此外,颗粒可以由可生物降解的材料制成。合适的材料包括聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、乙烯/丙烯酸酯共聚物、尼龙-12、聚氨酯、硅氧烷树脂、二氧化硅和尼龙1010。WO2003/093462进一步描述了可以制成颗粒的材料。
可以采用多种方式实现噬菌体对颗粒底物的固定或连接。优选地,通过噬菌体外壳蛋白和载体底物之间形成的共价键固定噬菌体。
进一步地,噬菌体优选在添加和结合噬菌体之前通过活化底物颗粒而由其头部基团或核衣壳固定到底物上。
术语“活化的/活化/活化”可理解为底物的活化,如通过电晕放电进行电活化,或通过使所述底物与各种化学基团反应(留下能够结合病毒的表面化学物质,如噬菌体头部基团或衣壳基团)。
例如所述底物的活化可以通过采用酸(优选盐酸)初步水解随后用水和碱的洗涤步骤对酸进行中和来实现。所述碱优选为碳酸氢钠。通过它们的头部基团结合噬菌体比较有利。在复杂噬菌体的情况下,例如通过头部基团的结合留下细菌特异性识别所必需的尾部基团,免于感染,即结合并穿透宿主细菌细胞。多个不同的菌株特异性噬菌体可以在任何一个时间固定在底物上。
噬菌体与底物的偶联是由于病毒外壳蛋白和底物之间形成共价键的结果,例如通过肽键等肽上的氨基。有助于这一过程的“偶联剂”可变化,并且取决于所用的底物。例如,为了与尼龙或带有氨基或羧基表面基团的其它聚合物偶联,可以使用偶联剂碳二亚胺或戊二醛。
WO 2003/093462和WO 2007/072049中进一步详尽描述了噬菌体共价连接到颗粒或球团或饲料成分、保留噬菌体感染性的方法和优选方法。
进一步选择是使用包括一个或多个靶向部分(例如一种蛋白质或配体)的颗粒,将颗粒引到鱼类或甲壳类动物的所需目标中。例如,颗粒可以包括一种或多种凝集素来靶向鱼鳃等,例如,用于治疗耶尔森氏菌感染等病症。
本发明适当地通过饲料递送噬菌体,并且颗粒由可食用材料制成。因此,它可以很方便地掺入到鱼类/甲壳类动物的饲料中。噬菌体可以连接在碳水化合物(例如纤维素)或蛋白质(包括鱼蛋白质或动物蛋白质)的颗粒上,这可以通过使用,例如在尼龙珠中应用的放电方法来实现。
包括颗粒的饲料可以包括碳水化合物、蛋白质、脂质、维生素或其中一种或多种的混合物。
本发明可用于治疗由下列细菌引起的鱼类和甲壳类动物的病症:
在本发明的一个优选应用中,噬菌体用于治疗甲壳类动物的细菌感染;更具体地说,用于治疗弧菌属菌种引起的感染。
副溶血弧菌是世界各地沿海和河口环境的常见细菌。因此,它们通常被发现与虾养殖系统天然相关。某些环境条件可能更有利于生物体的建立、生存和生长,如温度、盐度、浮游动物、潮汐冲刷和溶解氧。
副溶血性弧菌与虾致病发光细菌(如哈维氏弧菌、坎氏弧菌和欧文斯氏弧菌)密切相关。这些细菌连同其他紧密相关的弧菌属形成“哈维氏弧菌进化枝”。这一进化枝内的细菌在表型和基因型水平上具有非常高的相似度。副溶血性弧菌的某些菌株可引起人类肠胃炎,临床菌株的特征在于产生耐热性直接溶血素(TDH)或TDH相关溶血素(TRH)的能力。编码这些溶血素的基因(tdh和trh基因)通常用作副溶血弧菌的人类致病菌株的标记物。具有这些标记物的人类致病菌株占副溶血弧菌的环境菌株的1-2%。所有菌株(临床和环境)都产生由tlh基因编码的耐热溶血素(TLH),耐热溶血素通常用作诊断测试中副溶血弧菌的标记物(48)。编码致病因子的tdh和trh基因存在于“致病岛”中,其是仅存在于强毒菌株中的离散遗传单元;tdh和trh基因具有与染色体DNA的其余部分不同的鸟嘌呤+胞嘧啶(G+C)含量,并且一般通过水平基因转移获得。
通过使用具有针对弧菌属的噬菌体的本发明,现在就可以对虾和对虾的这些感染进行治疗。
在本发明的另一个优选应用中,噬菌体用于治疗鱼类的细菌感染,特别是用于治疗由弧菌、气单胞菌、耶尔森氏菌、摩替亚氏菌、立克次氏体、鱼立克次氏体、乳球菌、假单胞菌、黄杆菌或发光杆菌菌种引起的感染。例如在美国2013/0323209中公开了有用的噬菌体。
本发明提供一种用于鱼类和甲壳类动物特别是虾和对虾的饲料。因此,本发明的这些实施例一方面提供了一种甲壳类动物或鱼类饲料,包含共价连接到颗粒上的噬菌体,用于治疗鱼类或甲壳类动物的细菌感染。
优选所有的饲料都是可食用的,因此优选颗粒由可食用材料制成,例如本文别处所述的碳水化合物或蛋白质。与颗粒混合的其它饲料成分通常包括碳水化合物、蛋白质、脂质、维生素或其中一种或多种的混合物。
因此,本发明的这些实施例另一方面提供了一种与噬菌体共价连接的甲壳类动物或鱼类饲料,用于治疗鱼类或甲壳类动物的细菌感染。通常,该饲料含有与噬菌体共价连接的可食用饲料成分。根据先前的实施例,噬菌体可以共价连接到饲料的碳水化合物或蛋白质上。
在以下实施例中说明的本发明的具体实施例中,提供了通过球团被活化并连接噬菌体的方法将噬菌体共价连接到其外表面上的饲料球团。合适和优选的球团粒度如本文别处所述。
带有共价连接噬菌体的本发明的特定球团用于治疗由弧菌属引起的甲壳类动物的感染。
带有共价连接噬菌体的本发明的其他特定球团用于治疗由弧菌、气单胞菌、耶尔森氏菌、摩替亚氏菌、立克次氏体、鱼立克次氏体、乳球菌、假单胞菌、黄杆菌或发光杆菌菌种引起的鱼类的感染。
如果噬菌体是可获得的并且其宿主或靶细菌可以在培养基中进行培养和感染,本发明所用的噬菌体包括的噬菌体通常没有限制。噬菌体可以是具有遗传物质的圆形或线性排列的ssRNA、dsRNA、ssDNA或dsDNA噬菌体。合适的噬菌体包括:肌尾噬菌体科、长尾病毒科、短尾病毒科、脂毛噬菌体科、古噬菌体科、瓶状病毒科、杆状病毒科、双尾病毒科、棒状噬菌体科、覆盖噬菌体科、囊状噬菌体科、微小纺锤形噬菌体科、球状病毒科、微滴形病毒科、丝杆状病毒科、光滑病毒科、微病毒科、原质噬菌体科和复层噬菌体科。用于上述实施例的合适的噬菌体感染并溶解所提及的细菌家族和物种。
如何分离所需噬菌体的实施例在文献中非常普遍,包括仅仅是通过说明的方式:J.J.吉尔和P.海曼的《用于噬菌体疗法的噬菌体选择、分离和制备》(《当前药物生物技术》杂志,2010年一月第11(1)卷第2–14页)和前面提到的苏拉克韦利泽等人撰写的《噬菌体疗法》(《抗菌剂与化疗》杂志,2001年3月第649–659页)
本发明通过共价固定化来扩展其天然环境、海水、淡水或其它水环境中溶解和溶源性噬菌体的活性。活性和稳定性惊人的增加已经在下面的实施例中进行了说明,现在使得本文所述的细菌治疗成为可能。
在下文更详细的实施例中已经含有固定化技术,以使捕食更加困难。通过细菌或真菌胞外酶或胞内酶的酶消化、通过原生动物摄入和随后的消化或从其它真核生物的消化过程,可发生捕食。
一般来说,本发明的优点源于盐水、淡水和其他主要水环境中噬菌体活性的意外延伸;自然环境成分对降解的意外抗性;对捕食的意外抗性——通过使用如本文所述共价连接到饲料中颗粒的噬菌体来获得。
本发明的一种方法包括将球团成分与噬菌体共价连接的颗粒成分混合,以形成包含颗粒的饲料。然后将该饲料用于将噬菌体递送至目标鱼类/甲壳类动物。
在制备鱼类或甲壳类动物饲料的具体方法中,步骤包括将与颗粒共价连接的噬菌体混合到饲料成分中,以生产包含所述颗粒的饲料。
该方法可以包括:
(a)将饲料成分混合以形成混合物,
(b)处理所述混合物以(i)增加其含水量,或(ii)加热和烹饪所述混合物,或(iii)同时实现(i)和(ii),以及
(c)随后将颗粒添加到处理过的混合物中,并且可任选地形成饲料球团。
可以使用加热来实现球团的至少部分灭菌。本发明的一种方法包括:
(b)加热处理所述混合物,
(c)将处理过的混合物进行冷却,以及
(d)随后将颗粒添加到处理过并冷却的混合物中。
这个步骤顺序避免了由于加热而损伤饲料的噬菌体成分。
在某些方法中,将颗粒加入到形成的球团中。这一方法可以通过向所述球团喷洒所述颗粒的溶液或悬浮液来实现。然后可以将喷涂的球团进行干燥,使得颗粒黏附其上。
在该方法的一个实施例中,球团的制备包括:
1)混合球团成分,
2)粉碎混合成分以减小粒径,
3)通过将粉碎的成分暴露于水和/或蒸汽来调理混合物,
4)由调理过的混合物形成球团,
5)将球团进行冷却,
6)将球团进行干燥,
7)将颗粒上的噬菌体添加到球团中,以及
8)将球团转移到容器(通常为袋子)。
通常,球团成分包括蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质,维生素和水中的一种或多种或全部的混合物(例如肉或鱼粉、小麦粉、米糠、米糠、裂荚豌豆、玉米、豆粕、碾磨混料、鱼油、维生素和矿物质预混料等)。尽管也使用了特定的定制混合物,类似的混合物可用于甲壳类动物和鱼类。
调节步骤可用于增加含水量和/或部分或完全地烹饪球团成分。通常使用蒸汽,可有效地烹饪成分同时增加水分含量。根据蒸汽热量和步骤的持续时间,此时也可能形成一定程度的灭菌。
球团通常是使调理过的料通过造粒机而形成。粒径可变化,并且如果末端球团粒径较小,则粉碎步骤可以具有更长的持续时间或更强烈。根据鱼类/甲壳类动物的大小,球团直径范围通常在0.1至30毫米,更普遍的是0.5毫米或更大,还更普遍的是达到25毫米、20毫米、15毫米、10毫米或8毫米。2毫米以下的球团尺寸通常需要进行相当大量的粉碎。虾球团通常在大约5毫米或8毫米的范围内,并且可以更小,例如达到2毫米或3毫米。鱼类球团较大,更常用的是向上地达到3毫米的直径。
球团成分通常包括淀粉。然而,在水中,球团由于淀粉溶胀而分解。已证实在较低温度下调理可降低淀粉溶胀,并提供在湿润时保持球团完整性的方式。一个可选步骤是在造粒步骤之后增加一个第二加热步骤。
研磨后加热,通常可以发生冷却过程,有两个主要作用:
1)将淀粉转化为可消化的形式,
2)结合球团的小麦麸质变得基本上不溶(其他麸质已证实不可用)。
使用这种后研磨调理步骤显著提高了球团在水中的稳定性。由于只需添加较少的粘合剂,节省了配方成本,这极大促进了海洋生物的消化率。
球团浮力可以根据目标海洋生物是顶部还是底部觅食而改变。空心球团具有明显延长的漂浮时间。
本发明还进一步提供了制造鱼类或甲壳类动物饲料的方法,包括将噬菌体共价连接到饲料球团上。
根据下面实施例中含有更多细节的实施例,一种这样的方法包括将饲料成分成型为球团,并且处理球团以使噬菌体共价连接到其上。在本文其他地方适当地描述了球团处理,用于活化球团,然后共价连接噬菌体。基于电是特别合适的。在一个实施例中,已成功应用了电晕放电。然后将活化的球团与噬菌体结合,例如通过使球团与噬菌体的溶液或悬浮液接触。
在本发明的另一方面,可以利用细胞因子的优点,通过相同类型的第二噬菌体预防已用溶源性噬菌体感染的细菌引起的超感染。因此,本发明提供了一种溶源性噬菌体感染的细菌,用于治疗鱼类或甲壳类动物的病症。一种预防鱼类或甲壳类动物的病症的方法包括用这种细菌感染鱼类或甲壳类动物。
因此,在使用中,鱼类或甲壳类动物被故意感染上这种已知相对普遍且相对无害的细菌(因为其被感染的噬菌体是溶源性的并且不引发病症)。然而,这一步骤可防止由随后被携带毒素基因的噬菌体感染的细菌引起的病症。第一噬菌体感染的存在意味着通过更具致病性噬菌体引起的超感染减少。
例如,所述细菌是弧菌细菌,用于治疗甲壳类动物的病症。
例如,所述细菌是弧菌、气单胞菌、耶尔森氏菌、摩替亚氏菌、立克次氏体、鱼立克次氏体、乳球菌、假单胞菌、黄杆菌或发光杆菌菌种,用于治疗鱼类的病症。
包含这些细菌的甲壳类动物或鱼类饲料形成本发明的进一步的实施例。
实施例
在以下参照附图的具体实施例中对本发明做出说明,其中:
图1示出了噬菌体(Φlin 24)在各种水环境中的存活率,
图2示出了固定化的噬菌体更耐紫外线照射,
图3示出了固定在纤维素上的果胶杆菌属单噬菌体的储存稳定性,
图4示出了固定在共聚物珠粒上的果胶杆菌属单噬菌体的储存稳定性,
图5示出了暴露于应激条件(潮湿、干燥、紫外线和高温)时游离化和固定化的噬菌体的存活率,
图6示出了在马铃薯植株抗真菌剂Neozil存在下游离化和固定化的噬菌体的存活率,
图7示出了游离和固定在土壤纤维素条上的噬菌体的存活率,
图8示出了游离和固定在土壤中尼龙条上的噬菌体的存活率,
图9示出了在非无菌土壤中孵育后经果胶杆菌属噬菌体处理过的纤维素粉末的存活率,
图10示出了在非无菌土壤中孵育后经果胶杆菌属噬菌体处理过的纤维素粉末的感染活性,
图11示出了在易感和非易感宿主细菌存在下将多种噬菌体类型固定在尼龙上时所示出的抗菌活性,
图12示出了固定在藻酸盐片上的沙门氏菌属噬菌体的感染活性,
图13示出了本发明的球团周围的清除区域,以及
图14示出了在用噬菌体共价连接的球团或对照球团饲喂后,受到副溶血性弧菌攻击的虾的存活率。
实施例1
我们测试了共价连接到塑料(尼龙)和碳水化合物(纤维素)颗粒上的噬菌体,以证明在水产养殖应用中应用本发明组合物的可行性。
首先确定固定在纤维素粉末上的噬菌体是否比海水和淡水中游离噬菌体的存活时间更长。图1示出了固定化和非固定化的噬菌体(Φlin24)在海水中的存活率。固定在纤维素粉末上的噬菌体(Φlin24)比海水中非固定化噬菌体的存活时间明显更长(P≤0.001)。
工序
培养基和方法
表1——制备所有培养基,并且方法按照适当的标准操作工序(SOP)进行。
表1
“琼脂50”SOP
●称量所需量的粉末
●将粉末加入足够容积的空瓶中
●加入蒸馏水到所需体积
●松开盖子,盖子上用高压灭菌胶带密封。
●按照手册在121℃下高压灭菌15分钟
●把培养基放在一边冷却
营养琼脂平板的制备
●将设置的培养基放在微波炉中。
●高压灭菌5分钟
●检查培养基是否已完全溶化。如未完全溶化则再微波1分钟。
●将一瓶培养基放在水浴(50℃)中并放在一边冷却。
●将培养基倒入培养皿中,每个培养皿约15毫升培养基。
●将其进行干燥
“肉羹51”SOP
●称量所需量的粉末
●将蒸馏水放入装有磁力搅拌器的烧杯中到所需体积
●将粉末加入水中并使其溶解
●将所需的量加入到干净的瓶子中
●松开盖子,盖子上用高压灭菌胶带密封。
高压灭菌所述培养基
●将一瓶培养基放入高压釜中
●按照手册,在121℃高压灭菌15分钟
●把培养基放在一边冷却
●一旦冷却即适当地贴上标签
●放在架子上,留待备用。
“固定化技术”SOP
适用的噬菌体
●ΦK
●φGamma
●φPLS27HER200
●φ7LINDBERG HER4
●φ24LINDBERG HER4
●ΦFC3-9HER 111
●φK13HER173
●φ68HER49
●φMINCE
●Φ235
●ΦCLYDE
●Φ11575
●Φ1173
●ΦT4 10360
●ΦT7 10380
●ΦPsp1
所需原料
●噬菌体培养物
●本生灯
●量度为0-100微升的移液管
●无菌0-200微升斜角滴管
●无菌塑料撒布器
●30毫升通用塑料容器
●移液管控制器
●无菌10毫升移液管
电晕放电机(平板)的使用
●清洁/消毒前确保电晕机处于关闭状态。
●将清洁罩子钩住以保持打开状态。
●用70%的酒精擦拭电晕台,进行消毒。上面的电极也应擦拭干净。
●使酒精挥发干燥2分钟。然后关上罩子。
●启动臭氧提取器。
●打开电晕台
●打开电晕机
●将材料放在电晕台的中间。
●关闭盖子
●按下电晕台控件上的“开始”按钮,开始进行电晕处理。
●将对薄膜表面进行处理。
●处理完成后尽快关闭电晕机
●打开盖子
●在噬菌体溶液中涂覆材料,并使用无菌撒布器铺撒。
●将料放在无菌盘中
●将所有开关置于“关闭”位置
●用70%酒精清洁电晕台和电极。
清洗材料
●该材料应在PBS缓冲液中洗涤3次
●使材料在层流罩中风干2小时。
抗菌活性测定
●制备琼脂覆盖层
●将一块处理过的方形料小心放置在设定的琼脂层的顶部
●将培养盘正面朝上进行孵育。
●孵育后,料周围的清除区可以量化。
“培养物”SOP
合适的细菌
●金黄色葡萄球菌
●大肠杆菌
●克雷伯氏杆菌属
●肠杆菌属
●铜绿假单胞菌
●蜡状芽孢杆菌
●鲍氏不动杆菌
所需设备和材料
●营养肉羹
●无菌培养环。
●在营养琼脂上培养的细菌培养物
●黑色标记笔。
●37℃旋转培养箱。
●本生灯。
●无菌30毫升通用型容器
细菌的制备
●在30毫升通用型容器一侧进行标记,并附上操作员名称、日期和所培养的微生物。
●本生灯调至高火。
●取下30毫升通用型容器的盖子。
●将15毫升无菌营养肉羹加入30毫升无菌通用型容器中。
●盖上30毫升通用型容器的盖子。
●从保鲜膜中去除无菌环。
●取下装有营养琼脂和细菌培养物的培养皿的盖子。
●应用无菌环轻轻刮除菌落,去除单菌落。
●将盖子放在培养皿上。
●取下装有营养肉羹的30毫升通用型容器的盖子。
●将含有细菌菌落的培养环浸入到营养肉羹中2秒钟。
●去除并扔弃生化危机盒中的培养环。
●盖上30毫升通用型容器的盖子。
细菌的储存
●将30毫升通用型容器插入37℃Stuart紧凑型轨道培养箱中
●将培养箱设置为150RPM。
●将培养物存放16小时。
●从培养箱中取出30毫升通用型容器。
●与无菌营养肉羹相比,变得浑浊的营养肉羹溶液,表明细菌生长。
●如果肉羹溶液仍然清澈,则应扔弃并不再使用。
●肉羹培养物不能储存,使用后必须进行处理掉。
细菌和噬菌体
从内部储存获取细菌和噬菌体。本研究中使用的所有细菌和噬菌体详见表2。所有细菌均按照标准微生物工序进行培养。
表2——本研究中使用的细菌和噬菌体。
水样来源
海水样本来自Troon海滩,淡水样本来自英国苏格兰的Drumpellier海湾。
纤维素的制备
本研究采用平均粒径为50微米的纤维素粉末。对待进行电晕放电处理的纤维素粉进行无菌处理。
将噬菌体固定在纤维素上
将纤维素粉末放在如固定化技术SOP中所述的电晕放电台上。制备用于固定化技术的浓度为1×107PFU/毫升的噬菌体溶液。纤维素通过7.5千伏的2倍电晕放电处理,并将10毫升噬菌体溶液无菌应用于所述材料。真空过滤纤维素粉末以除去溶液中的任何过量噬菌体。在海水和淡水环境中制备具有固定化和非固定化噬菌体的96孔板。
每孔充满200微升终体积,带有0.2克同等体积/重量的游离化噬菌体/固定化噬菌体。样本储存
每个96孔板在40℃下孵育持续研究,以期加速时间进程。在取样前仅取下96孔板。噬菌体存活的取样
通过将单个孔的内容物加入9毫升营养肉羹和1毫升宿主细菌绿脓假单胞菌NCO2000的液体培养物中,一式三份对每个样本进行测试。样本在37℃下在轨道培养箱中孵育2小时。孵育后,使用0.2微米过滤器对样本进行过滤并用PBS缓冲液系列稀释1/10,稀释至浓度为1*10-1-1*10-8。使用软琼脂覆盖法进行噬菌斑测定,在接种之前,将包含“纯”浓度的每种浓度200微升稀释液覆盖在营养琼脂板上。将板在37℃时在LEEC紧凑型培养箱中过夜孵育。孵育后,计数可见斑块,测定PFU/毫升的值。
实施例2
图2所示的数据表明,固定化噬菌体比游离化噬菌体更耐紫外线照射。
实施例3
图3至图6示出了在各种条件下包括共价连接噬菌体的制备物的储存条件下的稳定性。
图3示出了固定在纤维素上的果胶杆菌属单噬菌体的储存稳定性。在本实施例中,制备物在4℃时以一次性等分试样储存在液体(PBS缓冲液)中。
图4示出了固定在共聚物珠粒上的果胶杆菌属单噬菌体的储存稳定性。与上述图3对比,共聚物珠粒在4℃时以一次性等分试样储存,不过是在干燥条件下进行储存。
图5示出了当暴露于应激条件时游离化和固定化的噬菌体相对存活度(即稳定性)。所使用的应激条件如下:
1、潮湿——4℃,4周
2、干燥——4℃,4周
3、紫外线照射,30秒
4、85℃,1分钟
图6示出了在植物抗真菌剂Neozil存在下储存的游离化和固定化噬菌体的储存稳定性。过夜储存于4℃的Neozil PBS缓冲液中。
表3示出了在储存期后共价连接到各种底物的噬菌体的活性——在所有情况下都保持显著活性。
表3
实施例4
图7至11示出了包括在土壤中共价连接噬菌体的制备物的稳定性。
图7和8分别示出了在无菌和非无菌土壤样本中孵育的游离化和分别固定在纤维素和尼龙条上的噬菌体的存活率。试验使用一次性纤维素或尼龙条在室温下进行。
图9示出了在非无菌土壤中孵育后经果胶杆菌属噬菌体处理的纤维素粉末的存活率。图10示出了存活噬菌体的抗菌活性和由此产生的效率/效益。这些试验是在室温下使用果胶杆菌属作为宿主进行的。
图11示出了在易感和非易感宿主细菌的存在下将多种噬菌体类型固定在尼龙上时所示出的抗菌活性程度,即宿主细菌和非宿主细菌均暴露于噬菌体。
图12示出了固定在藻酸盐片上的沙门氏菌属噬菌体的抗菌活性。使用在4℃干燥条件下储存的藻酸盐片进行试验。
实施例5——虾饲料
虾的饲料球团由如下原料制成:
包括182克/千克鱼粉、200克/千克米糠、300克/千克碾磨混合物、118克/千克小麦粉、185克/千克椰子粕和15克/千克维生素和矿物质预混物的蛋白质、碳水化合物、脂肪、矿物质和维生素的制剂在双轴混合器中充分混合。
使用粉碎机将混合物研磨成细粉末。
然后使用调理器将细粉末暴露于高压(150磅/平方英寸)蒸汽中30分钟。这一步骤增加了粉末的水分含量,以及开始将淀粉转化成易消化形式。
然后将调理过的粉末放进一个造粒机组,以生产直径为1.5毫米的球团。
然后将球团进行第二调理步骤,以促进球团中淀粉和/或麸质的结合。这一步骤大大提高了球团在水中的稳定性。
然后将球团冷却并干燥。随后将已干燥的球团喷涂浓度为109CFU/毫升、共价连接到平均直径为100微米的尼龙颗粒的噬菌体的水悬浮液,使其干燥,然后加工放入容器。
实施例6——鱼类饲料
鱼类饲料球团由如下原料制成:
包括201克/千克鱼粉、11克/千克鱼油、251克/千克米糠、254克/千克碾磨混合物、150克/千克椰子粕、118克/千克碎米、10克/千克小麦粉和5克/千克维生素和矿物质预混物的蛋白质、碳水化合物、脂肪、矿物质和维生素的制剂在双轴混合器中充分混合。
使用粉碎机将混合物研磨成细粉末。
然后使用调理器将细粉末暴露于高压(150磅/平方英寸)蒸汽中30分钟。
然后将调理过的粉末放进一个造粒机组,以产生直径为5毫米的球团。
然后将颗粒冷却并干燥。随后将已干燥球团喷涂浓度为109PFU/毫升、共价连接到平均直径为50微米的纤维素颗粒的噬菌体的水悬浮液,使其干燥,然后加工放入容器。
实施例7——带有共价连接噬菌体的鱼球团
基于小麦胚芽的鱼食球团(成分:小麦胚芽、植物源衍生物、鱼粉和鱼衍生物、酵母、植物蛋白提取物、软体动物和甲壳类动物、维生素和矿物质)经7.5千伏平板电晕机两次穿过。立即用噬菌体溶液(1×107PFU/毫升,Lin24)喷涂球团并风干,并在室温下储存两周。
在培养皿上制备空肠弯曲杆菌(ATCC12851)的基底,从储存器取出碎片鱼球团并放置在表面上。将其在37℃下孵育36小时。
如图13所示,对培养皿的检查示出了球团碎片周围的清除区。如果不进行电晕处理则类似处理的球团是无活性的(未示出),没有可见的清除区。
用玉米基球团(植物源玉米衍生物、鱼粉和鱼衍生物、酵母、维生素和矿物质和螺旋藻属)进行了重复实验,结果相似(未示出)。
实施例8——虾类的弧菌感染的治疗
我们开发了以下用于治疗虾类的弧菌感染的方案。
表现出抗副溶血性弧菌裂解活性的噬菌体的分离
表现出抗副溶血性弧菌裂解活性的噬菌体的分离是采用3种方法进行的。将环境样品直接加入副溶血性弧菌琼脂覆盖物中,并在37℃下孵育9小时,同时培养副溶血性弧菌。副溶血性弧菌样本还应加入到1毫克/毫升浓度的丝裂霉素C,用来诱导噬菌体复制。
裂解噬菌体的存在是通过在副溶血性弧菌琼脂覆盖层中形成清晰的噬斑证实的。
噬菌体表征
每个分离的裂解噬菌体特征在于:确定宿主范围、成斑效率(EOP)、裂解量、生长曲线、分子表征和限制性内切酶酶切分析。
宿主范围和成斑效率
将每个噬菌体加入到每个分离的副溶血性弧菌琼脂覆盖物中以确定宿主范围。通过将一系列稀释因子的样本添加到每个分离的副溶血性弧菌的琼脂覆盖物中来确定EOP。
裂解量和生长曲线的测量
通过孵育细菌和噬菌体的共培养物分离的每个副溶血性弧菌来确定每个噬菌体的裂解量。在不同的时间点取样,以确定溶液中残留的细菌数量和噬菌体数量。使用以下公式计算裂解量:
裂解量=(稳定期的噬菌体数量)/(滞后期的噬菌体数量)
限制性内切酶酶切分析
通过限制性酶对噬菌体DNA进行酶切,以确保在噬菌体混合物中使用基因相同的噬菌体。
抗菌活性测试
培养罐测试用于测定副溶血性弧菌上固定化噬菌体的活性。本系统由无菌盐水(接种了已知细菌浓度)和培养罐(含有复制池塘环境的补充剂)组成。将细菌加入含有已知浓度的固定化噬菌体的盐水中。
改变多重性感染(MOI)以测定不同浓度的影响(表4)。
表4:培养罐测试MOI
效果与成功标准
以下是确定的效果:
·含有3种致病性副溶血性弧菌菌株的细菌培养罐
·两个充分表征的噬菌体对副溶血性弧菌菌株表现出裂解活性
·每个噬菌体和噬菌体混合物固定在纤维素和虾饲料上,并在琼脂覆盖物和培养罐测试中测试抗菌活性。
·在每个培养罐实验中,通过固定化噬菌体观察到的细菌中的至少2log衰减。
实验室和培养罐测试
本阶段的目的是通过进行额外的实验室测试和进行含有活虾的培养罐测试来进一步举例说明固定化噬菌体混合物治疗副溶血性弧菌的效果。
保质期测试
使用标准方法在不同的储存温度下评估固定化噬菌体配方的长期保质期。这决定了最终产品的推荐储存条件和保质期。
活虾感染模型
将虾加入单独的培养罐中,并经受3种不同浓度的副溶血性弧菌。这就测定了引起EMS病理学所需的浓度。通过观察肝胰脏大小、总体重量与对照组对比的差异和总体死亡率,评估用副溶血性弧菌感染肝胰腺的虾。
活虾培养罐测试
为了评估治疗方案的疗效,用特定浓度的含有固定化噬菌体的饲料和特定浓度的含有固定化噬菌体的纤维素饲喂虾。经治疗的虾暴露于感染计量的副溶血性弧菌。评估用副溶血性弧菌感染肝胰腺的虾,其肝胰腺大小和总体重量与对照组对比的差异以及总体死亡率。
工序
保质期测试
固定化材料在室温4℃下储存,在30℃下代表热带气候。还比较了在各个温度下储存的游离噬菌体溶液的保质期。将每种材料和溶液加入到所有副溶血性弧菌分离株的琼脂覆盖物中。抗菌活性是通过在材料周围存在细菌生长抑制区来证实的。材料在不同时间点取样,直到抗菌活性停止。
活虾感染模型
感染模型中共使用二十只凡纳滨对虾。总共5只虾暴露于不同浓度的副溶血性弧菌中。每只虾都放在一个培养罐中。浓度为1×104CFU、1×102CFU和10CFU,代表亚致死剂量。副溶血性弧菌是通过摄入虾食物颗粒、逆灌胃或直接注射引入的。
培养罐测试
共有5个重复载有10个仔虾期的凡纳滨对虾被暴露于具有固定化噬菌体的虾饲料和具有固定化噬菌体的纤维素中。还有5个重复载有10个仔虾期的凡纳滨对虾被暴露于添加到虾饲料的游离化噬菌体和添加到纤维素中的游离化噬菌体中。治疗前,将所有治疗组干燥并在室温下孵育7天。
在治疗剂量后,将虾暴露于感染模型中测定的感染剂量的副溶血性弧菌。副溶血性弧菌是通过摄入虾食物颗粒、逆灌胃或直接注射来递送的。每天记录虾的死亡率,并且在记录死亡率时,测量每个虾的肝胰脏并进行细菌计数取样并且确定血细胞结节和组织透明坏死的存在。将经治疗的虾与单独暴露于副溶血性弧菌的虾和单独暴露于各个噬菌体治疗的虾组成的对照组进行比较。该研究进行了30天,或根据感染模型的结果进行。
效果与成功标准
以下是确定的效果:
·优化了固定化方案。
·在整个研究中开始并确定了在高温、室温和4℃下固定化噬菌体的保质期。
·用活虾证实固定化噬菌体作为生物防治的有效性。
·成功定义为:暴露于固定化噬菌体治疗时,肝胰腺大小和总体重量与对照组之间的差异以及虾死亡率或肝胰腺病理在统计学意义上显著减少。
实施例9
盐水虾暴露于急性肝胰腺坏死症(AHPND)的致病因子副溶血性弧菌。然后通过给虾提供含有抗副溶血性弧菌活性的固定化噬菌体的饲料来治疗感染。
微生物和噬菌体的采集和培养
副溶血性弧菌菌株0004在虾中可导致死亡率,并且可立即起作用。将使用上述方法常规培养副溶血性弧菌0004。已经示出噬菌体DRGS具有抗副溶血性弧菌0004的裂解活性,并将用于研究。
虾罐设置
设置了两个17升盐水罐,其中有一个成熟的生物过滤器和由循环泵提供的水分运动。本研究使用盐度为34ppm的盐水,采用反渗透纯化并保持在26℃的温度。
盐水虾存活和食物摄取
共收集了20只海葵虾盐水虾,将10个标本加入2个独立的罐中。在本研究中使用了由CP食品生产的直径为1毫米的虾饲料,并且为期三天评估虾的饲料摄取量。
噬菌体的固定化
两次暴露于7.5千伏下进行电晕处理之前,CP饲料通过暴露于紫外光下消毒30分钟。将总共10毫升的1×108PFU储存的噬菌体应用于20克饲料中。然后将每种材料在无菌蒸馏水中洗涤3次,并在层流柜中干燥。使用琼脂覆盖物评估抗菌活性,并使用培养试验测定抗菌活性。
海葵虾护理和喂养计划
虾一天定期喂养两次,饲料量相当于其估计体重的5%。一个虾罐用未处理CP饲料饲喂,另一个虾罐用含有固定化噬菌体的饲料饲喂。在虾罐接种副溶血弧菌前3天饲喂,并在接种期间保持饲喂。
接种并对虾健康评估
每个虾罐都配有副溶血弧菌的培养物,使虾罐中的最终容积浓度为1×108CFU/毫升。6小时暴露后对虾的健康状况进行了评估,并使用表5所述的标准对每只虾进行了评估。然后每天对健康进行评估。每天抽取虾罐水样本,以提供每个虾罐中的细菌计数。对于细菌计数,将虾罐水样本进行8×1/10系列稀释,并将样本覆盖在TCBS琼脂上。对于噬菌体计数,将虾罐水样本通过0.2微米过滤器并进行8×1/10系列稀释,并将100微升样本加入到副溶血弧菌0004 3%氯化钠软营养琼脂覆盖物中。
表5——虾健康评估评分
结果
含有固定化噬菌体的所有材料都示出出抗菌活性,并且当直接暴露于溶液中的细菌时,导致2log降低。在两个虾罐中接种副溶血弧菌之前未观察到虾伤亡(表6;图14)。在未治疗对照组中共观察到8例虾伤亡,治疗虾罐中共观察到1例虾伤亡(表6;图14)。与治疗虾罐中存活的虾相比,观察到未治疗对照组虾罐中存活虾的发病率增加(表6;图14)。在每个虾罐中的细菌计数中没有观察到显著差异,并且从治疗虾罐中分离出明显更多的噬菌体(表7)。
表6——本研究中使用的海葵虾的健康评估
表7——从每个虾罐回收的细菌和噬菌体的数量。
结论
虾饲料上的固定化噬菌体对暴露于已知可在水产养殖虾中引起AHPND的感染性大剂量副溶血性弧菌致病菌株的海葵虾具有保护作用。在培养罐水中的副溶血性弧菌数量中没有发现明显差异,这表明保护作用局部发生于感染部位。在试验结束时,死了3只虾,确认其肠道内存在噬菌体。
因此,本发明提供了用于治疗水产养殖中的细菌感染的组合物和方法,一般用于虾、对虾和鱼类。
Claims (15)
1.共价连接到颗粒或球团上的噬菌体在制备用于治疗鱼类或甲壳类动物的细菌感染的组合物中的用途,其中所述颗粒或球团包括碳水化合物或蛋白质,噬菌体通过共价键固定连接到所述碳水化合物或蛋白质。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述颗粒或球团由可食用材料制成。
3.根据前述权利要求中任一项所述的用途,其中所述甲壳类动物的细菌感染为由弧菌菌种引起的甲壳类动物的感染。
4.根据权利要求1或2所述的用途,所述鱼类的细菌感染为由弧菌、气单胞菌、耶尔森氏菌、摩替亚氏菌、立克次氏体、鱼立克次氏体、乳球菌、假单胞菌、黄杆菌或发光杆菌菌种引起的鱼类的感染。
5.一种甲壳类动物或鱼类饲料,包括共价连接到颗粒上的噬菌体,用于治疗鱼类或甲壳类动物的细菌感染,其中所述颗粒包括碳水化合物或蛋白质,噬菌体通过共价键固定连接到所述碳水化合物或蛋白质。
6.根据权利要求5所述的饲料,其中所述颗粒由可食用材料制成。
7.根据权利要求5或6所述的饲料,用于治疗弧菌菌种引起的甲壳类动物的感染。
8.根据权利要求5或6所述的饲料,用于治疗由弧菌、气单胞菌、耶尔森氏菌、摩替亚氏菌、立克次氏体、鱼立克次氏体、乳球菌、假单胞菌、黄杆菌或发光杆菌菌种引起的鱼类的感染。
9.一种用于制备鱼类或甲壳类动物饲料的方法,包括将共价连接到颗粒的噬菌体混入饲料成分中,以生产包括所述颗粒的饲料,其中所述颗粒包括碳水化合物或蛋白质,噬菌体通过共价键固定连接到所述碳水化合物或蛋白质。
10.根据权利要求9所述的方法,包括:
(a)将饲料成分混合以形成混合物,
(b)将所述混合物进行热处理,从而(i)增加所述混合物的含水量,或(ii)加热和烹饪所述混合物,或(iii)同时实现(i)和(ii),
(c)将所述处理过的混合物进行冷却,以及
(d)随后将所述颗粒加入到所述处理过并冷却的混合物中,并且可任选地,形成饲料球团,所述饲料球团包括共价连接到颗粒的噬菌体。
11.根据权利要求9或10所述的方法,包括将所述颗粒添加到成形的饲料球团中,可任选地,通过向所述球团喷洒所述颗粒的溶液或悬浮液。
12.一种甲壳类动物或鱼类用饲料,包括可食用饲料成分,噬菌体共价连接到所述可食用饲料成分,所述饲料用于治疗鱼类或甲壳类动物的细菌感染,其中所述可食用饲料成分包括碳水化合物或蛋白质,噬菌体通过共价键固定连接到所述碳水化合物或蛋白质。
13.根据权利要求12所述的饲料,为球团形式,可任选地,其直径可达到25毫米。
14.一种用于制备鱼类或甲壳类动物饲料的方法,包括将噬菌体共价连接到饲料球团,其中所述球团包括碳水化合物或蛋白质,噬菌体通过共价键固定连接到所述碳水化合物或蛋白质。
15.根据权利要求14所述的方法,包括由饲料成分形成球团,活化所述球团,并将活化的球团与噬菌体的溶液或悬浮液结合。
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