BR112017022463B1 - Composição, rações para crustáceos ou peixes e métodos de fabricação das mesmas - Google Patents

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Abstract

tratamento de infecções bacterianas em aquacultura. a presente invenção refere-se a uma composição que compreende bacteriófago covalentemente fixado a uma partícula comestível e é para o uso no tratamento de infecção bacteriana em peixes ou crustáceos. as infecções em peixes ou crustáceos causadas por espécies de bactérias vibrio, aeromonas, yersinia, moritella, rickettsia, piscirickettsia, lactococcus, pseudomonas, flavobacterium ou photobacterium podem ser tratadas. as bactérias infectadas com um bacteriófago lisogênico são usadas para o tratamento de doença de peixes ou crustáceos causada por infecções similares por bactérias portando bacteriófago lisogênico que expressa um gene de toxina.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se ao tratamento de infecções bacterianas em aquacultura, geralmente produção para o cultivo de camarão, camarão grande e peixe. Em particular, a invenção refere-se a composições e métodos para a redução ou prevenção de infecções e/ou para o tratamento de infecções existentes em tal aquacultura.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Bacteriófagos são a forma de vida mais numerosa da Terra. Eles podem ser encontrados em todos os ambientes onde as bactérias crescem. Os bacteriófagos são detectados em águas subterrâneas e superficiais, solo, alimento (por exemplo, chucrute, vinho), esgoto e lodo. Eles também foram isolados de humanos e animais, por exemplo, de fezes, urina, saliva, cuspe, rúmen e soro. Os bacteriófagos são capazes de penetrar diferentes órgãos e tecidos, incluindo o sistema nervoso central, e são uma parte da flora intestinal junto com seus hospedeiros bacterianos. Eles são responsáveis por 10 a 80% da mortalidade bacteriana total em ecossistemas aquáticos e são um fator importante que limita as populações bacterianas.
[003] As aplicações terapêuticas de bacteriófagos são conhecidas. O documento WO 03/093462 revela métodos para a imobilização de vírus, em particular bacteriófagos, enquanto retém sua atividade biológica para uso como agentes bacterianos. Dado que o ambiente natural dos bacteriófagos é aquoso, tem sido amplamente suposto que a estabilidade para desidratação, conforme revelado no documento WO 03/093462, tende à estabilidade natural em meios aquosos.
[004] Oceanos e águas internas são amplamente pescados até seu limite e o fornecimento de peixe selvagem atingiu o pico na década de 1990. Com o fornecimento global de peixe selvagem estagnado e a população humana aumentando, novas pesquisas mostram que produção para o cultivo de peixes e mariscos terá que aumentar em 133 por cento entre 2010 e 2050 a fim de atender demanda projetada de peixe em todo o mundo.
[005] Quase um terço dos frutos do mar do mundo é produzido pela aquacultura industrial e a produção aumentou em 6% por ano de 8,7 milhões de toneladas de peixe em 1990 para 50 milhões de toneladas em 2011 e projetada para alcançar 80 milhões de toneladas até 2030. Plantas piscícolas, entretanto, frequentemente sofrem de perdas financeiras pesadas devido ao desenvolvimento de infecções causadas por patógenos microbianos, incluindo bactérias resistentes a múltiplos fármacos que são facilmente transmitidas através da água e, portanto, capazes de infectar uma grande variedade de espécies de peixe.
[006] Embora as espécies patogênicas tenham sido descritas na maioria dos grupos taxonômicos bacterianos, apenas um número relativamente pequeno é responsável por perdas econômicas significativas. Vibriose e fotobacteriose são principalmente doenças de peixe marinho e estuarino, ambos nos sistemas de produção natural e comercial em todo o mundo, ocorrendo raramente em peixe de água doce. Ambas as doenças podem causar mortalidade significativa no peixe, alcançando valores de até 100% em instalações infectadas. Vibriose e fotobacteriose são causadas por bactérias da família Vibrionaceae. Vibriose é causada por espécies de Vibrio, nomeadamente por Vibrio anguillarum.
[007] Outras espécies de Vibrio, tais como V. alginolitycus, V. carchariae, V. salmonicida, V. damsela, V. ordalii, V. parahemolyticus e V. vulnificus, também causam importantes infecções em várias espécies de peixe. Fotobacteriose é causada por Photobacterium damselae subesp. piscicida que é uma bactéria altamente patogênica que não parece ter especificidade do hospedeiro, infectando uma variedade de peixe diversa. Outras bactérias incluindo Aeromonas salmonicida, agente causador de furunculose, bactérias do tipo Rickettsia, Cytophaga marina, Flavobacterium psychrophilum e Pseudomonas plecoglossicidatambém são importantes grupos de patógenos de peixe.
[008] Doenças tipo EMS (Síndrome da Mortalidade Precoce) de camarões são causadas por infecções bacterianas nas quais a bactéria (Vibrio parahaemolyticus) é em si infectada por um bacteriófago lisogênico que carrega um gene de toxina. Na infecção por bacteriófago, a bactéria incorpora o bacteriófago em seu genoma e expressa a toxina, o que leva à EMS no camarão.
[009] Embora a vacinação seja o método ideal para prevenir muitos tipos diferentes de doenças infecciosas, nem sempre é aplicável nas espécies de peixe.
[0010] Quimioterapia é um método alternativo rápido e eficaz para tratar ou prevenir infecções bacterianas, mas o uso frequente de antibióticos tem resultado em um aumento da resistência a fármacos em bactérias patogênicas na aquacultura, agricultura e áreas médicas e uma vez que poucos fármacos quimioterápicos são licenciados para uso em pescas, tratamentos alternativos são necessários.
[0011] Nakai et al. Diseases of Aquatic Organisms, vol. 37, pp. 33-41, (23 Junho 1999) descrevem o efeito do tratamento de infecção por Lactococcus garvieae em rabo amarelo através do uso de bacteriófago ao qual L. garvieaeé suscetível. Nakai et al. relatam que cada um dos três isolados de bacteriófago que eles testaram para estabilidade em água do mar natural (não esterilizada) persistiu por 3 dias, mas morreu dentro de 1 semana. Nakai et al.também descrevem o uso de alimento para peixe impregnado com 107,9 UFP g-1 de bacteriófago. Dar esse alimento para o peixe que foi subsequentemente desafiado com 108,5 UFC de L. garvieae por intubação anal reduziu a taxa de mortalidade do peixe desafiado.
[0012] O documento WO 2006/047872 revela composições antibacterianas que compreendem bacteriófago que são adsorvidas em uma matriz. A composição pode ser adicionada a um alimento para uso aquático.
[0013] O bacteriófago foi proposto para vários tratamentos de infecção bacteriana. Sabe-se, entretanto, que os bacteriófagos sobrevivem apenas por períodos relativamente curtos em seu ambiente natural, isto é, em água. As taxas médias de decaimento de vírus em amostras naturais de água do mar podem ser calculadas, com base em dados bem-conhecidos, por exemplo, em C H Suttle (Microb. Ecol. (1994) 28: 237-243, em cerca de 0,48 dia-1. A sobrevivência grandemente reduzida dos bacteriófagos em ambientes aquosos naturais é devido a uma combinação de causas, significativamente predação e luz solar.
[0014] Por isso, há uma necessidade para um meio alternativo para tratar ou reduzir infecções bacterianas de crustáceos de viveiro, especialmente crustáceos de viveiro, especialmente camarão e camarões grandes, e peixe.
OBJETIVO DA INVENÇÃO
[0015] Um objetivo da presente invenção é prover composições e usos daquelas composições e métodos que usam aquelas composições que oferecem um tratamento alternativo de infecções bacterianas em crustáceos criados comercialmente, por exemplo, camarões grandes e camarão e/ou peixe. Um objetivo adicional de modalidade particular é prover tais composições, usos e métodos melhorados.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0016] Uma composição compreendendo bacteriófago covalentemente fixado a uma partícula é para uso no tratamento de infecção bacteriana em peixes ou crustáceos. As partículas comestíveis são preferencialmente usadas. A presente invenção é baseada no aprimoramento da estabilidade e viabilidade do bacteriófago em ambientes aquosos, representando possível tratamento de infecções bacterianas em aquacultura.
[0017] É provida alimentação para crustáceos ou peixes, compreendendo bacteriófago covalentemente fixado a uma partícula para tratar a infecção bacteriana em peixes ou crustáceos.
[0018] Um método de fabricação de alimento para peixes ou crustáceos compreende a mistura de bacteriófagos covalentemente fixados em partículas em componentes de alimentação, para produzir alimentos que compreendem as ditas partículas.
[0019] As bactérias infectadas com um bacteriófago lisogênico são providas e podem ser usadas no tratamento de doença de peixes ou crustáceos.
DETALHES DA INVENÇÃO
[0020] Uma composição da invenção consequentemente compreende bacteriófago covalentemente fixado a uma partícula para uso no tratamento de infecção bacteriana em peixes ou crustáceos. Após a administração aos peixes ou crustáceos, por exemplo, através de alimentos que contêm as partículas, infecções bacterianas são tratadas.
[0021] A partícula pode ser uma partícula transportadora, feita, por exemplo, de material comestível ou material inerte, caso no qual a partícula transportadora é tipicamente aproximadamente esférica. Pode ter um diâmetro médio de até 1 mm, até 100 mícrons, até 50 mícrons, até 10 mícrons, de 1 nm, de 10nm, de 100nm, de 0,5 mícrons ou quaisquer combinações destes. Nos exemplos específicos abaixo, as partículas na faixa de 1 a 200 mícrons foram usadas. As partículas em geral podem ser aproximadamente redondas ou esferoidais; elas são preferencialmente macias. As partículas ou fragmentos de material comestível também podem ser de formatos e tamanhos irregulares.
[0022] O tamanho de partícula é adequadamente medido usando métodos e aparelhos reconhecidos como padrão na técnica. O dimensionamento da partícula nas dispersões pode ser realizado usando uma variedade de técnicas, incluindo difração a laser, dispersão de luz dinâmica (DLS), centrifugação de disco e microscopia de luz. Todas essas técnicas têm suas vantagens e limitações. A difração a laser depende de uma apresentação bem controlada da amostra para a região de medição e é limitada às amostras com faixa estreita das concentrações de partícula. A diluição é frequentemente requerida e isso pode afetar o tamanho da partícula, particularmente em compostos com alta solubilidade. Exemplos de equipamento de dimensionamento são feitos por Malvern Instruments (UK), usando métodos de difração a laser. Para partículas altamente irregulares, o diâmetro refere-se ao maior diâmetro em qualquer dimensão, mesmo se a partícula for relativamente não esférica.
[0023] Nas modalidades da invenção, são providos os bacteriófagos covalentemente fixados a uma pluralidade de partículas. Esses estão preferencialmente na forma relativamente homogênea, na qual uma grande proporção, preferencialmente substancialmente toda, da pluralidade das partículas tem diâmetros na faixa indicada, mais preferencialmente 80% ou mais, 90% ou mais ou 95% ou mais das partículas com fago covalentemente fixado têm diâmetros na faixa indicada (sendo qualquer faixa conforme estabelecido acima ou em outras partes desse documento).
[0024] Partículas para uso na invenção, para a qual os bacteriófagos são imobilizados por ligação covalente, são geralmente comestíveis ou substancialmente inertes para o animal a ser tratado. Nos exemplos, foram usadas partículas de náilon (esferas). Outro material biocompatível inerte, preferencialmente não tóxico pode ser usado. Além disso, a partícula pode ser feita de um material biodegradável. Os materiais adequados incluem metacrilato de polimetila, polietileno, copolímero de etileno/acrilato, náilon- 12, poliuretano, resina de silicone, sílica e náilon 1010. O documento WO 2003/093462 descreve outros materiais que as partículas podem ser feitas.
[0025] Imobilização ou fixação do bacteriófago ao substrato da partícula pode ser alcançada de várias maneiras. Preferencialmente, os bacteriófagos são imobilizados através de ligações covalentes entre a proteína de revestimento de bacteriófago e o substrato transportador.
[0026] Além disso, os bacteriófagos são preferencialmente imobilizados para o substrato através de seus grupos principais ou nucleocapsídeo pela ativação da partícula de substrato antes da adição e ligação do bacteriófago.
[0027] O termo “ativado/ativando/ativação” significa a ativação do substrato tal como eletricamente, por exemplo, por descarga de corona, ou por reação do dito substrato com vários grupos químicos (deixando uma química de superfície capaz de ligar os vírus, tais como grupos de capsídeo ou principais de bacteriófago).
[0028] A ativação do dito substrato pode ser alcançada, por exemplo, por hidrólise preliminar com um ácido, preferencialmente HCI seguido por uma etapa de lavagem de água e um álcali para neutralizar o ácido. Preferencialmente, o dito álcali é bicarbonato de sódio. É vantajosa a ligação do bacteriófago através de seus grupos principais. No caso do complexo bacteriófago, por exemplo, a ligação através de grupos principais deixa os grupos de cauda, os quais são necessários para reconhecimento específico de bactérias, livre para infectar, isto é, ligar e penetrar uma célula bacteriana do hospedeiro. Uma pluralidade de vários bacteriófagos espécie-específicos podem ser imobilizados a um substrato a qualquer momento.
[0029] O acoplamento do fago a um substrato é como um resultado da formação de ligações covalentes entre a proteína de revestimento viral e o substrato tal como através de um grupo amino em um peptídeo, por exemplo, uma ligação de peptídeo. “Agentes de Acoplamento” que auxiliam esse processo variam e são dependentes do substrato usado. Por exemplo, para acoplar ao náilon ou outros polímeros com grupos de superfície amino ou carbóxi, os agentes de acoplamento carbodiimida ou glutaraldeído podem ser usados.
[0030] Detalhes adicionais de métodos e métodos preferidos para fixação covalente de bacteriófagos em partículas ou péletes ou componentes de alimentação, que retêm a infecciosidade do fago, são descritos em mais detalhes nos documentos WO 2003/093462 e WO 2007/072049.
[0031] Uma opção adicional é usar partículas que compreendem uma ou mais porções de direcionamento, por exemplo, uma proteína ou ligante, para direcionar as partículas aos alvos desejados dentro de peixes e crustáceos.
[0032] Por exemplo, as partículas podem compreender uma ou mais lecitinas para direcioná-las, por exemplo, para as guelras de peixe para tratamento, por exemplo, de infecção por Yersinia.
[0033] Adequadamente, a presente invenção transmite os bacteriófagos através da alimentação e a partícula é feita de material comestível. Por isso, é convenientemente incorporado no alimento para peixes/crustáceos. Os bacteriófagos podem ser fixados às partículas de carboidratos (por exemplo, celulose) ou proteína (incluindo proteína de peixe ou proteína animal) e isso pode ser alcançado usando, por exemplo, métodos de descarga elétrica de aplicação às esferas de náilon.
[0034] A alimentação que compreende as partículas pode compreender carboidrato, proteína, lipídeo, vitamina ou uma mistura de um ou mais de todos.
[0035] A invenção é de uso no tratamento de doenças de peixes ecrustáceos causadas pelas seguintes bactérias:
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[0036] Em uma aplicação preferida da invenção, os bacteriófagos são para uso no tratamento de infecção bacteriana em crustáceos; mais especificamente, para tratar infecção por espécies de bactérias Vibrio.
[0037] V. parahaemolyticusé um habitante comum de ambientes litoral e estuarino ao redor do mundo. Por isso, eles são frequentemente encontrados naturalmente associados com sistemas de aquacultura de camarão. Certas condições ambientais podem ser favoráveis ao estabelecimento, sobrevivência e crescimento do organismo tais como temperatura, salinidade, zooplâncton, nivelamento das marés e oxigênio dissolvido.
[0038] V. parahaemolyticusestá intimamente relacionado às bactérias luminosas patogênicas de camarão tais como V. harveyi, V. campbelli e V. owensii. Essas junto com outra Vibrio spp intimamente relacionada formam um “clado de V. harveyi”. As bactérias dentro desse clado têm um grau muito alto de similaridade em nível fenotípico e genotípico. Certas cepas de V. parahaemolyticus podem causar gastroenterite em humanos e cepas clínicas são caracterizadas pela habilidade de produzir uma hemolisina direta termoestável (TDH) ou uma hemolisina relacionada à TDH (TRH). Os genes que codificam essas hemolisinas (genes tdh e trh) são geralmente usados como marcadores para cepas patogênicas humanas de V. parahaemolyticus. As cepas patogênicas humanas que possuem esses marcadores representam de 1 a 2 por cento de cepas ambientais de V. parahaemolyticus. Todas as cepas (tanto clínicas quanto ambientais) produzem uma hemolisina termolábil (TLH) codificada pelo gene tlh e, isso é geralmente usado como um marcador para V. parahaemolyticus nos testes diagnósticos (48). Os genes tdh e trh que codificam os fatores de virulência estão presentes em “ilhas de patogenicidade”, as quais são unidades genéticas discretas presentes apenas em cepas virulentas; tendo um teor de Guanina + Citosina (G + C) que é diferente do restante do DNA cromossômico e são geralmente adquiridos por transferência de gene horizontal.
[0039] Pelo uso da invenção com bacteriófagos específicos para espécies de Vibrio, essas infecções de, por exemplo, camarão e camarão grande podem ser tratadas agora.
[0040] Em outra aplicação preferida da invenção, os bacteriófagos são para tratar infecção bacteriana em peixe, especialmente para tratar infecção por espécies de bactérias de Vibrio, Aeromonas, Yersinia, Moritella, Rickettsia, Piscirickettsia, Lactococcus, Pseudomonas, Flavobacterium ou Photobacterium. Os bacteriófagos úteis são revelados, por exemplo, do documento US 2013/0323209.
[0041] Ração para peixes e crustáceos, especialmente camarão e camarão grande, é provida pela invenção. Um aspecto dessas modalidades da invenção, consequentemente, provê ração para crustáceos ou peixes, compreendendo bacteriófagos covalentemente fixados às partículas para tratar infecção bacteriana em peixes ou crustáceos.
[0042] Prefere-se que todos os alimentos sejam comestíveis e também é preferido que a partícula seja feita de material comestível, por exemplo, carboidrato ou proteína conforme descrito em alguma parte desse documento. Outros componentes de alimentação são misturados com as partículas que tipicamente incluem carboidrato, proteína, lipídeo, vitamina ou uma mistura de um ou mais de todos.
[0043] Outro aspecto dessas modalidades da invenção consequentemente provê ração para crustáceos ou peixes aos quais o bacteriófago é covalentemente fixado para tratar infecção bacteriana em peixes ou crustáceos. Tipicamente, o alimento contém componentes de alimentação comestíveis aos quais os bacteriófagos são covalentemente fixados. De acordo com as modalidades anteriores, o bacteriófago pode ser covalentemente fixado ao carboidrato ou proteína do alimento.
[0044] Em modalidades particulares da invenção, ilustradas nos exemplos abaixo, são providos péletes de alimentação aos quais os bacteriófagos são covalentemente fixados, geralmente à superfície externa destes pelos métodos nos quais os péletes são ativados e depois o fago é fixado. Os tamanhos de pélete adequados e preferidos são conforme descritos em alguma parte desse documento.
[0045] Os péletes específicos da invenção, com bacteriófago covalentemente fixado são para tratar infecção por espécie de bactérias Vibrio em crustáceos.
[0046] Outros péletes específicos da invenção, com bacteriófago covalentemente fixado, são para tratar infecção por espécies de bactérias Vibrio, Aeromonas, Yersinia, Moritella, Rickettsia, Piscirickettsia, Lactococcus, Pseudomonas, Flavobacterium ou Photobacterium em peixes.
[0047] Bacteriófagos para a invenção incluem bacteriófago, em geral sem limitação, contanto que o bacteriófago seja obtenível e seu hospedeiro ou bactérias alvo possam ser cultivados e infectados em cultura. O bacteriófago pode ser bacteriófago de ssRNA, dsRNA, ssDNA ou dsDNA, com qualquer disposição circular ou linear do material genético. Os bacteriófagos adequados incluem Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Lipothrixviridea, Rudiviridae, Ampullaviridae, Bacilloviridae, Bicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Cystoviridae, Fusseloviridae, Globuloviridae, Guttavirus, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Plasmaviridae e Tectiviridae. O fago adequado para uso nas modalidades mencionadas acima infecta e é lítico para as famílias bacterianas e espécies mencionadas.
[0048] Exemplos de como isolar o fago desejado estão espalhados na literatura, incluindo apenas a título de ilustração: Gill JJ and Hyman P," Phage choice, isolation, and preparation for phage therapy", Curr Pharm Biotechnol., 2010, Jan;11(1): pp2-14, e a mini-revisão anteriormente mencionada “Bacteriophage Therapy” por Sulakvelidze et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Mar. 2001, pp 649-659.
[0049] A invenção estende a viabilidade de ambos os bacteriófagos líticos e lisogênicos em seu ambiente natural, mar, água doce ou outros ambientes aquosos, por imobilização covalente. A viabilidade e estabilidade surpreendentemente aumentadas foram ilustradas nos exemplos abaixo e agora tornam possíveis os tratamentos bacterianos estabelecidos aqui.
[0050] A imobilização foi descoberta nos exemplos estabelecidos abaixo em mais detalhes para tornar a predação mais difícil. A predação pode ocorrer através de digestão enzimática com enzimas extracelulares ou intracelulares de bactérias ou fungos, a partir da ingestão por protozoários e a subsequente digestão ou a partir dos processos digestivos de outros organismos eucarióticos.
[0051] Em geral, as vantagens da invenção provêm da extensão inesperada da viabilidade de fago em águas salgadas, águas doces e outros ambientes predominantemente aquosos; resistência inesperada à degradação por componentes de ambiente natural; resistência inesperada à predação - alcançada pelo uso do bacteriófago covalentemente fixado às partículas nos alimentos conforme descrito aqui.
[0052] Um método da invenção compreende combinar componentes de pélete com partículas aos quais os bacteriófagos são covalentemente fixados, para formar alimentos que compreendem as partículas. Este alimento é então para uso para entregar o bacteriófago aos peixes/crustáceos alvo.
[0053] Em um método particular de fabricação de alimentos para peixes ou crustáceos, as etapas compreendem misturar bacteriófagos covalentemente fixados às partículas nos componentes de alimentação, para produzir alimentos que compreendem as ditas partículas.
[0054] O método pode compreender:• a) combinação de componentes de alimentação para formar uma mistura,• b) tratamento da mistura para (i) aumentar seu teor de umidade ou (ii) aquecer ou cozinhar a mistura ou (iii) ambos (i) e (ii), e• c) adição subsequente das partículas para a mistura tratada e, formação opcional dos péletes de alimentação.
[0055] Calor pode ser usado para alcançar pelo menos esterilização parcial dos péletes. Um método da invenção compreende:• b) tratamento térmico da mistura,• c) resfriamento da mistura tratada, e• d) adição subsequente das partículas para a mistura tratada e resfriada.
[0056] Essa ordem de etapas evita a aplicação de calor e, assim, prejudica o componente bacteriófago da alimentação.
[0057] Em certos métodos, as partículas são adicionadas aos péletes formados. Isso pode ser alcançado pela pulverização dos péletes com uma solução ou suspensão das partículas. Os péletes pulverizados podem então ser secados para aderir às suas partículas.
[0058] Em um exemplo do método, a preparação dos péletes compreende: 1) mistura dos componentes do pélete,2) pulverização dos componentes misturados para reduzir o tamanho da partícula,3) condicionamento da mistura, pela exposição dos componentes pulverizados em água e/ou vapor,4) formação de péletes a partir da mistura condicionada,5) resfriamento dos péletes,6) secagem dos péletes,7) adição do bacteriófago nas partículas aos péletes, e8) transferência dos péletes a um recipiente, tipicamente um saco .
[0059] Tipicamente, os componentes de pélete compreendem uma mistura de uma ou mais ou todas as proteínas, gorduras, carboidratos, minerais, vitaminas e água (por exemplo, carne ou peixe, farinha de trigo, farelo de arroz, farinha de arroz, ervilhas partidas, milho, farinha de soja, mistura de moagem, óleo de peixe, vitamina e pré-mistura mineral, etc.). As misturas similares são usadas tanto para crustáceos quanto para peixes, embora misturas específicas personalizadas também sejam usadas.
[0060] A etapa de condicionamento pode ser usada para aumentar o teor e água e/ou para cozinhar parcial ou completamente os componentes de pélete. Vapor é geralmente usado, o qual assa efetivamente os componentes e aumenta o teor de umidade ao mesmo tempo. Dependendo do calor do vapor e duração da etapa, algum grau de esterilização também pode ocorrer nesse momento.
[0061] Os péletes são geralmente formados ao passar o material condicionado através de um moinho de peletização. O tamanho do pélete varia e a etapa de pulverização pode ser de duração mais longa ou mais vigorosa se os péletes de extremidade forem de tamanhos menores. Dependendo do tamanho dos peixes/crustáceos, os diâmetros dos péletes estão tipicamente na faixa de 0,1 a 30 mm, mais geralmente 0,5 mm ou mais, também mais geralmente até 25 mm, até 20 mm, até 15 mm, até 10 mm ou até 8 mm. Os tamanhos dos péletes abaixo de 2 mm normalmente requerem pulverização bastante extensa para ser executada. Os péletes de camarão estão mais comumente na faixa de aproximadamente até 5 mm ou 8 mm, e podem ser menores, até 2 mm ou 3 mm. Os péletes de peixe são maiores e mais comumente de diâmetro de 3 mm para cima.
[0062] Os componentes de pélete usualmente incluem amido. Entretanto, na água, os péletes desintegram devido ao inchaço de amido. O condicionamento em temperaturas inferiores mostrou reduzir a expansão de amido e provê uma maneira de manter a integridade do pélete enquanto molhado. Uma etapa opcional é adicionar uma segunda etapa de aquecimento após a etapa de peletização.
[0063] Aquecimento após moagem, onde pode ocorrer convencionalmente o processo de resfriamento, há dois efeitos principais:• ) Amido é convertido para forma digerível,• ) Glúten de trigo que se liga ao pélete se torna substancialmente insolúvel (outros glútens mostraram ser malsucedidos).
[0064] O uso dessa etapa de condicionamento pós-moagem melhora dramaticamente a estabilidade do pélete em água. O custo de formulação é salvo porque é necessário adicionar menos aglutinante e isso ajuda tremendamente a digestibilidade para vida marinha.
[0065] A flutuação do pélete pode ser alterada dependendo de se a vida marinha visada for os alimentadores superiores ou inferiores. Péletes ocos permitem tempos de flutuação significativamente mais longos.
[0066] Os métodos de fabricação de alimentos para peixe ou crustáceos ainda são providos pela invenção compreendendo bacteriófagocovalentemente fixados aos péletes de alimentação.
[0067] De acordo com as modalidades nos exemplos abaixo, os quais contêm maiores detalhes, tal método compreende a formação de componentes de alimentação nos péletes e tratamento dos péletes para fixar covalentemente o bacteriófago a isso. O tratamento de pélete é adequadamente descrito em alguma parte do documento, para ativação dos péletes então para ligação covalente do fago. A base elétrica é especialmente adequada. Em um exemplo a descarga de corona foi usada com sucesso. Os péletes ativados podem então ser combinados com fago, por exemplo, ao colocar os péletes em contato com uma solução ou suspensão de fago.
[0068] Em um aspecto separado da invenção, é possível tirar vantagem de fatores celulares que previnem superinfecção de bactérias já infectadas com um bacteriófago lisogênico por um segundo bacteriófago do mesmo tipo. Consequentemente, a invenção provê bactérias infectadas com um bacteriófago lisogênico para isso no tratamento de doença de peixes ou crustáceos. Um método de prevenção de doença em peixes e crustáceos compreende infecção dos mesmos com essas bactérias.
[0069] Em uso, peixes ou crustáceos são, por isso, deliberadamente infectados com essas bactérias, conhecidas por serem relativamente predominante, porém relativamente inócuo (conforme o bacteriófago, com o qual é infectado, é lisogênico e não causa doença). Essa etapa, entretanto, previne doença causada por bactérias que são subsequentemente infectadas com bacteriófago que carregam um gene de toxina. A presença da primeira infecção por bacteriófago significa que a superinfecção por bacteriófago mais patogênico é reduzida.
[0070] As bactérias são, por exemplo, bactérias Vibrio para uso no tratamento de doença de crustáceos.
[0071] As bactérias são, por exemplo, uma espécie de bactérias Vibrio, Aeromonas, Yersinia, Moritella, Rickettsia, Piscirickettsia, Lactococcus, Pseudomonas, Flavobacterium ou Photobacterium para uso no tratamento de doença de peixe.
[0072] Alimentação para crustáceos ou peixes, compreendendo essas bactérias, forma modalidades adicionais da invenção.
EXEMPLOS
[0073] A invenção é agora ilustrada nas modalidades específicas a seguir com referência aos desenhos anexos, nos quais: A Figura 1 mostra a sobrevivência do bacteriófago Φlin 24 em vários ambientes aquosos; A Figura 2 mostra bacteriófagos imobilizados que são mais resistentes à exposição a UV; A Figura 3 mostra a estabilidade ao armazenamento de fago simples de Peptobacterium imobilizados na celulose; A Figura 4 mostra estabilidade ao armazenamento de fago simples de Peptobacterium imobilizado nas esferas de copolímero; A Figura 5 mostra sobrevivência de bacteriófago livre e imobilizado quando exposto a condições de estresse (úmido, seco, UV e temperatura elevada); A Figura 6 mostra sobrevivência de bacteriófago livre e imobilizado na presença do agente antifúngico de planta de batata Neozil; A Figura 7 mostra sobrevivência de bacteriófago livre e imobilizado nas tiras de celulose no solo; A Figura 8 mostra sobrevivência de bacteriófago livre e imobilizado nas tiras de náilon no solo; A Figura 9 mostra sobrevivência de pó de celulose tratado com fago de Peptobacteriumapós incubação no solo não estéril; A Figura 10 mostra atividade infecciosa de pó de celulose tratado com fago de Peptobacteriumapós incubação no solo não estéril; A Figura 11 mostra atividade antibacteriana exibida quando múltiplos tipos de bacteriófago são imobilizados no náilon na presença de bactérias hospedeiras suscetíveis e não suscetíveis; A Figura 12 mostra atividade infecciosa de bacteriófago de Salmonella imobilizado nas folhas de alginato; A Figura 13 mostra zonas de compensação em torno dos péletes da invenção; e A Figura 14 mostra a sobrevivência de camarão desafiado com Vibrio parahaemolyticusapós eles serem alimentados com péletes com bacteriófago covalentemente fixado neles ou péletes de controle.
EXEMPLO 1
[0074] Foi testado bacteriófago covalentemente fixado às partículas de plástico (náilon) e carboidrato (celulose) para provar a viabilidade de uso das composições da invenção em aplicações de aquacultura.
[0075] Foi primeiro determinado se os bacteriófagos imobilizados no pó de celulose sobrevivem por mais tempo do que bacteriófagos livres tanto em água salgada quanto em água doce. A Figura 1 mostra a sobrevivência de Bacteriófago imobilizado e não imobilizado Φlin 24 na água do mar. Bacteriófago Φlin 24 imobilizado no pó de celulose sobreviveu significativamente por mais tempo do que os bacteriófagos não imobilizados em água do mar (P <0,001).ProcedimentosMeios e métodos Tabela 1 - Todos os meios foram preparados e os métodos foram realizados de acordo com o procedimento operacional padrão apropriado (POP). Tabela 1
Figure img0003
[0076] POP de "Agar 50" • Pesar a quantidade desejada de pó. • Adicionar pó à garrafa vazia de tamanho adequado. • Adicionar água destilada até o volume desejado. • Tampar frouxamente e vedar com fita para autoclave sobre a tampa. • Submeter à autoclave a 121 °C por 15 minutos de acordo com o manual. • Deixar o meio resfriar.
[0077] Preparação de placas de ágar nutriente • Colocar o meio ajustado no micro-ondas. • Submeter à autoclave por 5 minutos. • Verificar se o meio fundiu completamente. Se não, colocar no microondas por um adicional de 1 minuto. • Colocar a garrafa de meio em banho-maria (50°C) e deixar resfriar. • Verter o meio em placas de petri com aproximadamente 15 ml de meio por placa. • Deixar secar.
[0078] POP de "Caldo 51" • Pesar a quantidade desejada de pó. • Colocar água destilada até o volume desejado em um béquer com um agitador magnético. • Adicionar pó à água e deixar dissolver. • Adicionar a quantidade desejada a uma garrafa limpa. • Tampar frouxamente e vedar com fita para autoclave sobre a tampa.
[0079] Autoclavagem do meio • Colocar a garrafa de meio em autoclave. • Ligar a autoclave a 121 °C por 15 minutos de acordo com o manual. • Deixar o meio resfriar. • Uma vez resfriado, rotular apropriadamente. • Deixar na prateleira até outro uso.
[0080] POP de "Imobilização"
[0081] Bacteriófagos aplicáveis • Φ K • Φ Gamma • Φ PLS27 HER200 • Φ 7 LINDBERG HER4 • Φ 24 LINDBERG HER4 • Φ FC3-9 HER 111 • Φ K13 HER173 • Φ 68 HER49 • Φ MINCE • Φ 235 • Φ CLYDE • Φ 11575 • Φ 1173 • Φ T4 10360 • Φ T7 10380 • Φ Psp1
[0082] Materiais necessários • Cultura do Bacteriófago • Bico de Bunsen • Pipetar para a medição de 0-100 μl • Ponteiras chanfradas estéreis de 0-200 μl • Espalhador de plástico estéril • 30 ml de recipiente de plástico Universal • Controlador de pipeta • Pipetas estéreis de 10 ml
[0083] Uso de máquina de descarga de corona (mesa plana) • Assegurar que a máquina de corona esteja DESLIGADA antes da limpeza/esterilização. • Prender a tampa transparente para abrir. • Limpar a mesa de corona com álcool 70% para esterilizar. O eletrodo acima também deve ser limpo. • Deixar o álcool secar por 2 minutos. A seguir, fechar o exaustor. • Iniciar o extrator de ozônio. • Ligar a mesa. • Ligar a máquina de corona. • Colocar o material no meio da mesa de corona. • Fechar a tampa. • Iniciar o tratamento da corona pressionando "iniciar" nos controles da mesa. • A superfície da película será tratada. • Assim que o tratamento estiver completo, desligar a máquina de corona. • Abrir a tampa. • Revestir o material em solução de bacteriófago e espalhar usando um espalhador estéril. • Colocar o material em uma placa estéril. • Colocar todos os interruptores na posição "desligado”. • Limpar a mesa e eletrodo com álcool70%.
[0084] Material de Lavagem • O material deve ser lavado 3 vezes em PBS. • Deixar o material secar ao ar em um exaustor laminar por 2 horas.
[0085] Ensaio de Atividade Antibacteriana • Preparar sobreposições de ágar. • Um quadrado do material tratado é colocado cuidadosamente no topo da camada de ágar ajustada. • A placa é incubada com a face para cima. • Após a incubação, uma zona de clareamento em torno do material pode ser quantificada.
[0086] POP de "Cultura"
[0087] Bactérias Apropriadas • Staphylococcus aureus • Escherichia coli • Klebsiella sp. • Enterobacter sp. • Pseudomonas aeruginosa • Bacillus cereus • Acinetobacter baumannii
[0088] Equipamento e Materiais exigidos • Caldo nutriente • Alça de cultura estéril. • Cultura bacteriana cultivada em ágar nutriente. • Marcador preto. • Incubadora giratória a 37°C. • Bico de Bunsen. • Recipiente estéril de 30 ml Universal
[0089] Preparação de Bactérias • Rotular o lado do recipiente Universal de 30 ml com o nome do operador, data e micro-organismo cultivado. • Virar o Bico de Bunsen sobre a chama alta. • Remover a tampa do recipiente Universal de 30 ml. • Adicionar 15 ml de caldo nutriente estéril ao recipiente estéril de 30 ml Universal. • Fechar a tampa do recipiente Universal de 30 ml. • Remover a alça estéril da embalagem de plástico. • Remover a tampa da placa de petri contendo ágar nutriente e cultura bacteriana. • Remover gentilmente uma colônia única pela aplicação da alça estéril à colônia. • Colocar a tampa sobre a placa de petri. • Remover a tampa do recipiente Universal de 30 ml contendo caldo nutriente. • Adicionar a alça de cultura contendo a colônia bacteriana ao caldo nutriente por 2 segundos. • Remover e descartar a alça de cultura em caixa para risco biológico. • Fechar a tampa do recipiente Universal de 30 ml.
[0090] Armazenamento de Bactérias • Inserir o recipiente Universal de 30 ml na incubadora orbital compacta Stuart a 37°C. • Ajustar a incubadora a 150 RPM. • Armazenar a cultura por 16 horas. • Remover o recipiente Universal de 30 ml da incubadora. • O crescimento bacteriano é indicado pela solução de caldo nutriente que se torna turva comparada ao caldo nutriente estéril. • Se a solução de caldo ainda estiver clara, descartar e não usar. • Culturas de caldo não podem ser armazenadas e devem ser descartadas após o uso.
Bactérias e Bacteriófagos
[0091] Bactérias e bacteriófagos foram adquiridos de estoques internos. Todas as bactérias e bacteriófagos usados neste estudo são detalhados na Tabela 2. Todas as bactérias foram cultivadas de acordo com as instruções contidas no POP relevante.Tabela 2 - Bactérias e bacteriófagos usados neste estudo.
Figure img0004
Fonte de amostras de água
[0092] A amostra de água do mar foi extraída de Troon beach e a amostra de água fresca foi extraída de Drumpellier Lochs, Scotland, UK.
Preparação de Celulose
[0093] Pó de celulose com tamanho médio de partícula de 50 μm foi utilizado neste estudo. Pó de celulose a ser tratado com descarga de coroa foi manipulado assepticamente.
Imobilização de bacteriófagos sobre celulose
[0094] Pó de celulose foi colocado sobre a descarga de mesa de corona como detalhado no POP de imobilização. Uma solução de bacteriófago de concentração de 1 x 107 UFP/ml foi preparada para imobilização. A celulose foi tratada por tratamentos de descarga de coroa por 2x a 7,5 kV e uma solução de bacteriófago de 10 ml foi assepticamente aplicada ao material. Pó de celulose foi filtrado a vácuo para remover qualquer excesso de bacteriófagos em solução.
Preparação de placas com 96 cavidades com bacteriófago imobilizado & não imobilizado em ambientes de água do mar e fresca.
[0095] Cada cavidade da placa foi preenchida com 200 μl de volume final com volume/peso equivalente de bacteriófagos livres/bacteriófagos imobilizados de 0,2 g.
Armazenamento de amostras
[0096] Cada placa com 96 cavidades foi incubada a 40°C pela duração do estudo para indicar um curso de tempo acelerado. As placas com 96 cavidades foram somente removidas antes da amostragem.
Amostragem de Sobrevivência de Bacteriófago
[0097] Cada amostra foi testada em triplicata pela adição dos conteúdos de uma única cavidade a 9 ml de caldo nutriente e 1 ml de cultura líquida da bactéria hospedeira Pseudomonas aeruginosa NCO2000. As amostras foram incubadas a 37 °C por duas horas em uma incubadora orbital. Após a incubação, as amostras foram filtradas usando filtros de 0,2 μm e diluídos em série 1/10 usando PBS para a diluição até concentrações de 1 x 10-1 - 1 x 10-8. Um ensaio de placa foi realizado usando o método de sobreposição de ágar macio, 200 μl de cada concentração incluindo a concentração 'pura' foram plaqueados sobre placas de ágar nutriente antes de serem inoculados. As placas foram incubadas a 37 °C durante a noite em incubadora compacta LEEC. Após a incubação, as placas visíveis foram contadas e UFP/ml foi determinada.
EXEMPLO 2
[0098] Os dados mostrados na Figura 2 demonstram que os bacteriófagos imobilizados eram mais resistentes à exposição de UV do que os bacteriófagos livres.
EXEMPLO 3
[0099] As figuras 3 a 6 mostram estabilidade sob condições de armazenamento de preparações compreendendo bacteriófago covalentemente fixado sob várias condições.
[00100] A figura 3 mostra a estabilidade ao armazenamento de fago único Peptobacterium imobilizado sobre celulose. Neste exemplo, a preparação foi armazenada em líquido (PBS), a 4 °C em alíquotas de uso único.
[00101] A figura 4 mostra a estabilidade ao armazenamento de fago único Peptobacterium imobilizado sobre esferas de copolímero. Em contraste com a figura 3, acima, as esferas de copolímero foram armazenadas a 4 °C em alíquotas de uso único, mas foram armazenadas sob condições secas.
[00102] A figura 5 mostra o grau relativo de sobrevivência (isto é, estabilidade) de bacteriófago livre e imobilizado quando exposto a condições de estresse. As condições de estresse usadas são definidas abaixo: i. úmida - 4 semanas a 4°C ii. seca - 4 semanas a 4°C iii. 30 segundos de exposição a UV iv. 1 minuto a 85°C.
[00103] A figura 6 mostra a estabilidade ao armazenamento de bacteriófago livre e imobilizado armazenado em batata na presença do agente antifúngico vegetal Neozil. O armazenamento foi em PBS com Neozil a 4 °C durante a noite.
[00104] A Tabela 3 mostra a atividade de bacteriófago covalentemente fixado a vários substratos após períodos de armazenamento - atividade significativa foi mantida em todos os casos. Tabela 3
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EXEMPLO 4
[00105] As figuras 7 a 11 mostram estabilidade de preparaçõescompreendendo bacteriófago covalentemente fixado no solo.
[00106] As figuras 7 e 8 mostram a sobrevivência de bacteriófago livre e imobilizado sobre a celulose e tiras de náilon, respectivamente, incubados em amostras de solo estéreis e não estéreis. Os testes foram conduzidos à temperatura ambiente usando celulose de uso único ou tiras de náilon.
[00107] A figura 9 mostra a sobrevivência de pó de celulose tratado com fago de Peptobacteriumapós a incubação em solo não estéril. A figura 10 mostra a atividade antibacteriana e, consequentemente, a eficiência/eficácia do fago sobrevivente. Estes testes foram conduzidos à temperatura ambiente usando Peptobacterium como um hospedeiro.
[00108] A figura 11 mostra o grau de atividade antibacteriana exibida quando múltiplos tipos de bacteriófago são imobilizados sobre náilon na presença de bactérias hospedeiras suscetíveis e não suscetíveis, isto é, ambas bactérias hospedeiras e não hospedeiras são expostas ao bacteriófago.
[00109] A figura 12 mostra a atividade antibacteriana de bacteriófago Salmonella imobilizado sobre folhas de alginato. Os testes foram realizados usando folhas de alginato que foram armazenadas sob condições secas a 4°C.
EXEMPLO 5 - RAÇÃO DE CAMARÃO
[00110] Os péletes de ração para camarão foram feitos como a seguir:
[00111] Uma formulação de proteínas, carboidratos, gorduras, minerais e vitaminas compreendendo 182 g/kg de farinha de peixe, 200 g/kg de farinha de arroz, 300 g/kg de mistura de moagem, 118 g/kg de farinha de trigo, 185 g/kg de farinha de coco e 15 g/kg de vitamina e pré-mistura mineral foi completamente misturada em um misturador de duplo eixo.
[00112] Um pulverizador foi usado para moer a mistura em um pó fino.
[00113] Um condicionador foi então usado para expor o pó fino a um vapor de alta pressão (150 psi (1,03MPa)) por 30 minutos. Isto aumentou o teor de umidade do pó, assim como começou a converter o amido em uma forma prontamente digestível.
[00114] O pó condicionado então entrou em um moinho de pélete ajustado para produzir péletes de 1,5 mm de diâmetro.
[00115] Os péletes foram então submetidos a uma segunda etapa de condicionamento a fim de facilitar a ligação do amido e/ou glúten no pélete. Esta etapa aumentou dramaticamente a estabilidade do pélete em água.
[00116] Os péletes foram então resfriados e secos. Os péletes secos foram subsequentemente pulverizados com uma suspensão aquosa de bacteriófago covalentemente fixado a partículas de náilon de diâmetro médio de 100 mícrons em uma concentração de 109UFC ml-1, deixados secar e então processados em recipientes.
EXEMPLO 6 - RAÇÃO PARA PEIXE
[00117] Os péletes de ração para peixe foram feitos como a seguir:
[00118] Uma formulação de proteínas, carboidratos, gorduras, minerais e vitaminas compreendendo 201 g/kg de farinha de peixe, 11 g/kg de óleo de peixe, 251 g/kg de farelo de arroz, 254 g/kg de mistura de moagem, 150 g/kg de farinha de copra, 118 g/kg de trinca de arroz, 10 g/kg de farinha de trigo e 5 g/kg de vitamina e pré-mistura mineral foi completamente misturada em um misturador de duplo eixo.
[00119] Um pulverizador foi usado para moer a mistura em um pó fino.
[00120] Um condicionador foi então usado para expor o pó fino a um vapor de alta pressão (150 psi (1,3 MPa)) por 30 minutos.
[00121] O pó condicionado então entrou em um moinho de pélete ajustado para produzir péletes de 5 mm de diâmetro.
[00122] Os péletes foram então resfriados e secos. Os péletes secos foram subsequentemente pulverizados com uma suspensão aquosa de bacteriófago covalentemente fixado a partículas de celulose de diâmetro médio de 50 mícrons em uma concentração de 109UFC ml-1, deixados secar e então processados em recipientes.
EXEMPLO 7 - PÉLETESDE PEIXE COM BACTERIÓFAGO COVALENTEMENTE FIXADO
[00123] Péletesde alimento para peixe à base de germe de trigo (composição: germe de trigo, derivados de origem vegetal, farinha de peixe e derivados de peixe, leveduras, extratos de proteína vegetal, moluscos e crustáceos, vitaminas e minerais) foram submetidos a duas passagens através de uma máquina de corona plana a 7,5 KV. Os péletesforam imediatamente pulverizados com solução de bacteriófago (1 x 107UFP/mL de Lin24) e secos ao ar e armazenados por duas semanas à temperatura ambiente.
[00124] Um gramado de Camplyobacter jejuni (ATCC12851) foi preparado sobre placas de Petri e péletesde peixe fragmentados recuperados do armazenamento e colocados na superfície. Estes foram incubados a 37°C por 36 horas.
[00125] O exame das placas mostrou zonas de clareamento em torno dos fragmentos de pélete, ilustradas na figura 13. Os péletestratados similarmente sem tratamento de corona foram inativos (não mostrados) com nenhuma zona visível de clareamento.
[00126] O experimento foi repetido com péletes à base de milho (derivados de milho de origem vegetal, farinha de peixe e derivados de peixe, leveduras, vitaminas e minerais e espirulina), com resultados similares (não mostrados).
EXEMPLO 8 - TRATAMENTO DE INFECÇÃO DE CAMARÃO POR VIBRIO
[00127] Os protocolos a seguir foram desenvolvidos para o tratamento de infecções de camarão por Vibrio.
Isolamento de bacteriófagos exibindo atividade lítica contra Vibrio parahaemolyticus
[00128] O isolamento de bacteriófagos exibindo atividade lítica contra V. parahaemolyticusé efetuado usando 3 métodos. As amostras ambientais são adicionadas diretamente a uma sobreposição de ágar V. parahaemolyticus e também incubadas a 37°C por 9h com uma cultura de V. parahaemolyticus. As amostras de V. parahaemolyticussão também submetidas a 1 mg/mL de mitomicina C para induzir a replicação do bacteriófago.
[00129] A presença de bacteriófagos líticos é confirmada pela formação de placas claras em uma sobreposição de ágar V. parahaemolyticus.
Caracterização de Bacteriófagos
[00130] Cada bacteriófago lítico isolado é caracterizado pela determinação da variedade do hospedeiro, eficiência de plaqueamento (EOP) burst size, curva de crescimento, caracterização molecular e análise da restrição.
Variedade do hospedeiro e Eficiência de Plaqueamento
[00131] Cada bacteriófago é adicionado a sobreposições de ágar de cada V. parahaemolyticus isolado para determinar a variedade do hospedeiro. A EOP é determinada pela adição de amostras de uma série de fatores de diluição a sobreposições de ágar de cada V. parahaemolyticus isolado.
Medição da Dimensão dada lise e Curvas de Crescimento
[00132] O burst size de cada bacteriófago é determinada para cada V. parahaemolyticus isolada por incubação de uma co-cultura de bactérias e bacteriófago. As amostras são tiradas em diferentes pontos de tempo para estabelecer o número de bactérias e o número de bacteriófagos que permanecem na solução. O burst size é calculada usando o seguinte cálculo:
[00133] Burst size = (Número de bacteriófagos durante o período estacionário)/(Número de bacteriófagos durante a fase lag)
Análise de Restrição
[00134] O DNA do bacteriófago é submetido à digestão por enzimas de restrição para assegurar que bacteriófagos geneticamente idênticos sejam usados no coquetel de bacteriófagos.
Teste da Atividade Antimicrobiana
[00135] Os tanques de teste são usados para medir a atividade de bacteriófago imobilizado sobre V. parahaemolyticus. Este sistema consiste em água salgada estéril inoculada com uma concentração bacteriana conhecida e um tanque contendo suplementos para replicar as condições de tanque. As bactérias são adicionadas à água salgada contendo uma concentração conhecida de bacteriófagos imobilizados.
[00136] A multiplicidade de infecção (MOI) é variada para determinar o impacto de concentrações diferentes (Tabela 4). Tabela 4: MOI do Teste de Tanque
Figure img0006
Resultados e Critérios de Sucesso
[00137] O que vem a seguir são os resultados identificados: • Um banco de cultura bacteriana contendo 3 cepas patogênicas de V. parahaemolyticus • Dois bacteriófagos totalmente caracterizados que exibem atividade lítica a ambas as cepas de V. parahaemolyticus. • Cada bacteriófago e um coquetel de bacteriófagos imobilizados sobre celulose e ração de camarão e testados quanto à atividade antimicrobiana em uma sobreposição de ágar e testes de tanque. • Um mínimo de uma redução de 2 logs em bactérias observada pelo bacteriófago imobilizado em cada teste de tanque.
Teste de Laboratório e de Tanque
[00138] O objetivo deste estágio é exemplificar adicionalmente a eficácia do coquetel de bacteriófago imobilizado no tratamento de V. parahaemolyticus ao empreender teste de laboratorial adicional e ao empreender um teste de tanque contendo camarão vivo.
Teste de Vida Útil
[00139] A vida útil a longo prazo da fórmula de bacteriófago imobilizado é avaliada em diferentes temperaturas de armazenamento usando métodos padrão. Isto determina as condições de armazenamento recomendadas e a vida útil de um produto final.
Modelo de Infecção com Camarão Vivo
[00140] Os camarões são adicionados a tanques separados e submetidos a 3 diferentes concentrações de V. parahaemolyticus. Isto determina a concentração necessária para provocar a patologia de EMS. Os camarões são avaliados quanto à infecção dos hepatopâncreas por V. parahaemolyticus pela observação de diferenças no tamanho do hepatopâncreas, peso total vs controles e mortalidade total.
Teste de Tanque com Camarão Vivo
[00141] Para avaliar a eficácia das opções de tratamento, os camarões são alimentados com uma concentração específica de ração contendo bacteriófago imobilizado e uma concentração específica de celulose contendo bacteriófago imobilizado. Os camarões tratados são expostos a uma dose infecciosa de V. parahaemolyticus. Os camarões são avaliados quanto à infecção do hepatopâncreas por V. parahaemolyticus, diferenças no tamanho do hepatopâncreas e peso total vs controles e mortalidade total.
Procedimentos Teste da Vida Útil
[00142] O material imobilizado é armazenado a 4°C, temperatura ambiente e a 30°C para representar um clima tropical. A vida útil da solução de bacteriófago livre armazenada em cada temperatura também é comparada. Cada material e solução são adicionados a sobreposições de ágar de todos os isolados de V. parahaemolyticus. A atividade antimicrobiana é confirmada pela presença de uma zona de inibição de crescimento bacteriano em torno do material. O material é amostrado em diferentes pontos no tempo até cessar a atividade antimicrobiana.
Modelo de Infecção com Camarão Vivo
[00143] Um total de 20 camarões L. vannamei são usados para o modelo de infecção. Um total de 5 camarões são expostos a diferentes concentrações de V. parahaemolyticus. Cada camarão é mantido em um tanque individual. As concentrações são 1 x 104UFC, 1 x 102UFC e 10 UFC representando doses subletais. V. parahaemolyticus é introduzida usando ingestão de partículas de alimento para camarão, gavagem reversa ou injeção direta.
Teste de Tanque
[00144] Um total de 5 réplicas contendo 10 camarões L. vannamei em estágio pós-larval são expostas à ração de camarão com bacteriófago imobilizado e celulose com bacteriófago imobilizado. Um total de 5 réplicas contendo 10 camarões L. vannamei em estágio pós-larval também são expostas ao bacteriófago livre adicionado à ração de camarão e bacteriófago livre adicionado à celulose. Todos os tratamentos são secos e incubados por 7 dias à temperatura ambiente antes do tratamento.
[00145] Após uma dose do tratamento, os camarões são a seguir expostos a uma dose infecciosa de V. parahaemolyticus como determinado no modelo de infecção. V. parahaemolyticus é distribuída por ingestão de partículas de alimento para camarão, gavagem reversa ou através de injeção direta. A mortalidade dos camarões é registrada diariamente e, mediante a mortalidade, o hepatopâncreas de cada camarão é medido e amostrado quanto a contagens bacterianas e a presença de nódulos hemocíticos e necrose hialina do tecido. Os camarões tratados são comparados aos grupos de controle consistindo em camarões expostos a V. parahaemolyticus sozinha e camarões expostos a cada tratamento com bacteriófago sozinho. O estudo é conduzido por 30 dias ou com base nos resultados do modelo de infecção.
Resultados e Critérios de Sucesso
[00146] O que vem a seguir são os resultados identificados: • O protocolo de imobilização é otimizado. • A vida útil de bacteriófago imobilizado em temperatura elevada, temperatura ambiente e a 4°C é iniciada e determinada ao longo do estudo. • A eficácia de bacteriófago imobilizado como um biocontrole é confirmada com camarão vivo. • O sucesso é definido como uma redução estatisticamente significativa em diferenças no tamanho do hepatopâncreas e peso total vs controles e mortalidade do camarão ou patologia do hepatopâncreas quando exposto ao tratamento com bacteriófago imobilizado.
EXEMPLO 9
[00147] Os camarões de água salgada foram expostos ao Vibrio parahaemolyticus, o agente causador de AHPND (distúrbio agudo de necrose do hepatopâncreas). Esta infecção foi a seguir tratada ao dar ao camarão uma ração compreendendo bacteriófagos imobilizados ativos contra V. parahaemolyticus.
Aquisição e Cultura de Micro-organismos e Bacteriófagos
[00148] A designação 0004 da cepa de V. parahaemolyticus exibiu mortalidade em camarão e está disponível para trabalho imediato. V. parahaemolyticus 0004 será cultivada rotineiramente usando os métodos detalhados acima. O bacteriófago DRGS mostrou ter atividade lítica contra V. parahaemolyticus 0004 e será usado para o estudo.
Configuração do Tanque de Camarões
[00149] Dois tanques de água salgada de 17 litros foram configurados com um filtro biológico maduro e o movimento da água provido por uma bomba de circulação. A água salgada com uma salinidade de 34 ppm purificada usando osmose reversa e mantida em uma temperatura de 26°C foi usada para o estudo.
Sobrevivência de Camarões de Água Salgada e Ingestão de Alimento
[00150] Um total de 20 camarões de água salgada Thor amboinensis foram adquiridos e 10 espécimes foram adicionados a 2 tanques separados. A ração de camarão medindo 1 mm em diâmetro fabricada por alimentos CP foi usada neste estudo e a ingestão da ração por camarões foi avaliada por 3 dias.
Imobilização de Bacteriófago
[00151] O material da ração CP foi desinfetado pela exposição à luz UV por 30 min antes de ser exposto duas vezes aos tratamentos de coroa a 7,5 kV. Um total de 10 ml de um estoque de 1 x 108UFP de bacteriófago foi aplicado a 20 gramas de material de ração. Cada material foi a seguir lavado 3 vezes em água destilada estéril e seco em uma câmara de fluxo laminar. A atividade antimicrobiana foi avaliada usando uma sobreposição de ágar e usando o teste de cultura para determinar a atividade antimicrobiana.
Programação de Cuidado e Alimentação de Thor amboinensis
[00152] Os camarões foram alimentados regularmente duas vezes ao dia com ração equivalente a 5% do seu peso corporal estimado. Um tanque foi alimentado com ração CP não tratada e, o outro tanque foi alimentado com ração compreendendo bacteriófago imobilizado. A alimentação ocorreu por 3 dias antes da inoculação dos tanques V. parahaemolyticus e foi mantida durante a inoculação.
Inoculação e Avaliação da Saúde do Camarão
[00153] Cada tanque foi dosado com uma cultura de V. parahaemolyticus para fazer um volume final de 1 x 108UFC/mL no tanque. A saúde do camarão foi avaliada após 6 horas de exposição e cada camarão recebeu um índice usando os critérios descritos na Tabela 5. A saúde foi a seguir avaliada diariamente. Uma amostra de água do tanque foi tirada diariamente para prover contagens de bactérias em cada tanque. Para as contagens bacterianas, uma amostra de água do tanque foi submetida a 8 x 1/10 diluições em série e uma amostra plaqueada sobre TCBS ágar. Para as contagens de bacteriófago, uma amostra da água do tanque foi passada através de um filtro de 0,2 μM e submetida a 8 x 1/10 diluições em série e uma amostra de 100 μl foi adicionada a uma sobreposição de ágar nutriente macia de NaCl 3% de V. parahaemolyticus 0004. Tabela 5 - Índices de Avaliação da Saúde do Camarão
Figure img0007
Resultados
[00154] Todo material contendo bacteriófago imobilizado exibiu atividadeantimicrobiana e resultou em uma redução de 2 logs quando diretamente exposto às bactérias em solução. Nenhuma perda de camarões foi observada antes da inoculação com V. parahaemolyticus em ambos os tanques (Tabela 6; Figura 14). Um total de 8 perdas de camarão foram observadas no controle sem tratamento e um total de 1 perda de camarão foi observada no tanque de tratamento (Tabela 6; Figura 14). Observou-se que os camarões sobreviventes no tanque de controle sem tratamento têm morbidade aumentada em comparação com os camarões sobreviventes no tanque de tratamento (Tabela 6; Figura 14). Nenhuma diferença significativa foi observada no número de bactérias em cada tanque e significativamente mais bacteriófago foi isolado do tanque de tratamento (Tabela 7). Tabela 6 - Avaliações da saúde de Thor amboinensis usado no estudo
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Tabela 7 - Número de bactérias e bacteriófagos recuperados de cada tanque.
Figure img0010
Conclusões
[00155] O bacteriófago imobilizado na ração de camarão confere um efeito protetor sobre o camarão Thor amboinensis exposto a uma grande dose infecciosa de uma cepa patogênica de V. parahaemolyticus que é conhecida por causar AHPND em camarão cultivado na aquacultura. Nenhuma diferença significativa foi verificada em quantidades de V. parahaemolyticus na água do tanque o que indica que o efeito protetor está acontecendo localmente no local da infecção. Ao final do teste, 3 camarões foram sacrificados e a presença de bacteriófagos no intestino confirmada.
[00156] A invenção, consequentemente, provê composições e métodos para o tratamento de infecções bacterianas em aquacultura, geralmente, de camarão, camarão grande e peixe.

Claims (15)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende bacteriófago covalentemente fixado a uma partícula ou pélete para uso no tratamento de infecção bacteriana em peixes ou crustáceos, em que a partícula ou pélete compreende carboidrato ou proteína a qual o bacteriófago é covalentemente fixado.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a partícula ou pélete é feita de material comestível.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de infecção em crustáceos por espécies de bactérias Vibrio.
4. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de infecção em peixes por espécies de bactérias Vibrio, Aeromonas, Yersinia, Moritella, Rickettsia, Piscirickettsia, Lactococcus, Pseudomonas, Flavobacterium ou Photobacterium.
5. Ração para crustáceos ou peixes, caracterizada pelo fato de que compreende bacteriófago covalentemente fixado a uma partícula para o tratamento de infecção bacteriana em peixes ou crustáceos, em que a partícula compreende carboidrato ou proteína a qual o bacteriófago é covalentemente fixado.
6. Ração de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a partícula é feita de material comestível.
7. Ração de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de infecção por espécies de bactérias Vibrio em crustáceos.
8. Ração de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de infecção por espécies de bactérias Vibrio, Aeromonas, Yersinia, Moritella, Rickettsia, Piscirickettsia, Lactococcus, Pseudomonas, Flavobacterium ou Photobacterium em peixes.
9. Método de fabricação de ração para peixes ou crustáceos, caracterizado pelo fato de que compreende misturar os bacteriófagos covalentemente fixados a partículas com componentes de ração, para produzir ração compreendendo as referidas partículas, em que as partículas compreendem carboidrato ou proteína a qual o bacteriófago é covalentemente fixado.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) combinar componentes de ração para a formação de uma mistura;(b) tratar termicamente a mistura para (i) aumentar seu teor de umidade, ou (ii) aquecer e assar a mistura ou (iii) ambos (i) e (ii);(c) resfriar a mistura tratada; e(d) subsequentemente, adicionar as partículas à mistura tratada e resfriada e, opcionalmente, formar péletes de ração compreendendo bacteriófagos covalentemente fixados a partículas.
11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que compreende a adição das partículas aos péletes de ração formados, opcionalmente, por pulverização dos péletes com uma solução ou suspensão das partículas.
12. Ração para crustáceos ou peixes, caracterizada pelo fato de que compreende componentes de ração comestíveis aos quais o bacteriófago é covalentemente fixado, para o tratamento de infecção bacteriana em peixes ou crustáceos, em que os componentes de ração comestíveis compreendem carboidrato ou proteína a qual o bacteriófago é covalentemente fixado.
13. Ração de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de estar na forma de péletes, opcionalmente de diâmetro de até 25 mm.
14. Método de fabricação de ração para peixes ou crustáceos, caracterizado pelo fato de que compreende a fixação covalente de bacteriófago a péletes de ração, em que o pélete compreende carboidrato ou proteína a qual o bacteriófago é covalentemente fixado.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende a formação de péletes a partir dos componentes de ração, ativação dos péletes e combinação de péletes ativados com uma solução ou suspensão de bacteriófago.
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