BR112016024096B1

BR112016024096B1 - Composição, aditivo alimentar, alimentos, aditivo para água potável, água potável, desinfetante e detergente

Info

Publication number: BR112016024096B1
Application number: BR112016024096-0A
Authority: BR
Inventors: Eun Mi Shin; Bo Kyung Son; Gi Duk Bae; Jae Won Kim
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2014-04-15
Filing date: 2015-04-14
Publication date: 2022-11-16
Also published as: JP6263277B2; PH12016502002A1; US9956256B2; CN106232805B; WO2015160166A1; EP3133153A4; BR112016024096A2; ES2788686T3; PH12016502002B1; CN106232805A; US20170189460A1; KR20150118835A; EP3133153A1; DK3133153T3; JP2017521043A; EP3133153B1; KR101591789B1; PL3133153T3

Abstract

NOVO BACTERIÓFAGO E COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO O MESMO. A presente invenção se refere a um novo bacteriófago denominado FCJ26 (KCCM11464P) e a uma composição compreendendo o mesmo como um ingrediente ativo. Além disso, a presente invenção proporciona um método de prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas causadas por Salmonella através do uso do bacteriófago FCJ26 (KCCM11464P) ou da composição.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção se refere a um novo bacteriófago com uma capacidade específica para matar Salmonella, uma composição que inclui o mesmo, e um método para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas pela Salmonella utilizando o novo bacteriófago ou a composição.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A Salmonella é uma bactéria anaeróbia gram- negativa (anaeróbia facultativa) pertencente à família da Enterobacteriaceae, e é um bacilo com estrutura não endospórica que possui flagelos perítricos que lhe dão mobilidade. A Salmonella é um microrganismo patogênico que causa várias doenças não apenas em vários animais de criação, mas também em seres humanos.

[003] A salmonelose em humanos é provocada principalmente pela ingestão de produtos de origem animal, tais como carne de porco e similares. Sabe-se que várias estirpes de Salmonella apresentam especificidade para aves e, assim, causam infecção em aves de corte, causando enormes prejuízos econômicos aos produtores de aves de corte e aos consumidores, além de causar infecção alimentar em seres humanos que se alimentam com aves infectadas pela Salmonella, como é de conhecimento geral.

[004] Especificamente, de acordo com estatísticas de 2005 do Centers for Disease Control and Prevention (CDC) dos EUA, nove estirpes de Salmonella, dentre as estirpes de Salmonella isoladas de humanos que tiveram intoxicação alimentar causada pela Salmonella, as estirpes de Salmonella encontradas eram derivadas de aves de corte, e confirmou-se que a estirpe de Salmonella predominante isolada a partir de seres humanos que tiveram intoxicação alimentar coincide com a estirpe de Salmonella predominante isolada a partir de galinhas.

[005] O bacteriófago é um tipo especializado de vírus que previne e inibe o crescimento de uma bactéria infectada com um bacteriófago específico. O bacteriófago apresenta forte especificidade hospedeira em comparação com os antibióticos e, recentemente, o aparecimento de uma estirpe resistente a antibióticos tornou-se um grave problema, assim como os antibióticos residuais em animais, de tal modo que o interesse no uso prático de bacteriófagos tem aumentado cada vez mais.

[006] No entanto, a maior parte dos estudos sobre bacteriófagos estão focados em controlar Escherichia coli, Listeria e Chlorstridium. Todavia, a Salmonella, que também é contagiosa tanto em seres humanos quanto em outros animais, continua causando doenças infecciosas, e é capaz de crescer dentro de um fagócito, que aloja a bactéria, tornando-a resistente aos antibióticos. Portanto, existe a necessidade de desenvolver bacteriófagos que possam efetivamente controlar a Salmonella e, particularmente, existe a necessidade de desenvolver bacteriófagos e tecnologias associadas com o propósito de controlar a Salmonella em aves de corte a fim de evitar doenças infecciosas causadas pela Salmonella nestas aves e prevenir a intoxicação alimentar causada pelo consumo destas aves por seres humanos.

DIVULGAÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[007] Como resultado da importante investigação destinada a prevenir efetivamente e tratar doenças infecciosas causadas pela Salmonella, os inventores da presente invenção isolaram o novo bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) que possui uma capacidade específica para matar a Salmonella.

[008] Além disso, a fim de solucionar o aparecimento de bactérias resistentes devido à utilização de antibióticos e para evitar a presença de antibióticos residuais na carne, a presente invenção proporciona antibióticos, aditivos alimentares, aditivos para água potável, alimentos, água potável, desinfetantes ou detergentes, incluindo o bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) como um ingrediente ativo.

[009] Além disso, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção e/ou tratamento não só de doenças infecciosas causadas pela Salmonella em aves de corte, como também pela intoxicação alimentar em seres humanos, incluindo o bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) como um ingrediente ativo, e um método para prevenir ou tratar doenças utilizando o mesmo.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[010] De acordo com um de seus aspectos, a presente invenção proporciona um novo bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) com uma capacidade específica para matar a Salmonella.

[011] De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas pela Salmonella, contendo o bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) como um ingrediente ativo.

[012] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona antibióticos, aditivos alimentares, aditivos para água potável, alimentos, água potável, desinfetantes ou detergentes contendo o bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) como um ingrediente ativo.

[013] Ainda de acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas pela Salmonella, compreendendo a administração do bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) como um ingrediente ativo em animais não humanos.

EFEITOS VANTAJOSOS

[014] O bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) de acordo com a presente invenção tem uma capacidade específica para matar a Salmonella.

[015] Além disso, o bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) de acordo com a presente invenção apresenta excelente resistência ao ácido, ao calor e à secagem, de tal modo que pode ser usado não apenas como um agente para prevenir ou tratar doenças infecciosas causadas pela Salmonella em vários níveis de temperatura, de pH ou de secagem, mas também como antibióticos, aditivos alimentares, aditivos para água potável, alimentos, água potável, desinfetantes, detergentes, ou similares, contendo o bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) como um ingrediente ativo.

[016] Ademais, a presente invenção proporciona o bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) ou antibióticos incluindo o mesmo como um ingrediente ativo, sendo que esses antibióticos têm efeitos específicos contra a Salmonella quando comparados aos antibióticos disponíveis no estado da técnica, e assim, matam seletivamente as bactérias patogênicas específicas sem matar as bactérias benéficas e, além disso, estes antibióticos não induzem resistência aos mesmos, o que resulta na extensão do tempo de vida dos produtos tratados em comparação com os antibióticos disponíveis no estado da técnica.

[017] Ademais, a presente invenção permite prevenir ou tratar doenças infecciosas causadas pela Salmonella através da administração do bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) como um ingrediente ativo para aves de corte.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[018] A Fig. 1 é uma imagem obtida de um microscópio de elétrons do novo bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P), doravante denominado “ΦCJ26”.

[019] A Fig. 2 mostra o resultado de uma eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) do novo bacteriófago ΦCJ26.

[020] A Fig. 3 ilustra o resultado de uma eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) do novo bacteriófago ΦCJ26.

[021] A Fig. 4 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de resistência ao ácido do novo bacteriófago ΦCJ26.

[022] A Fig. 5 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de resistência ao calor do novo bacteriófago ΦCJ26.

[023] A Fig. 6 é um gráfico mostrando o resultado de um teste de resistência à secagem do novo bacteriófago ΦCJ26.

CONFIGURAÇÃO IDEAL

[024] A seguir, as configurações da presente invenção serão descritas em detalhes. Considerações óbvias e facilmente interpretáveis pelos peritos na arte serão omitidas no presente relatório descritivo.

[025] Uma configuração da presente invenção proporciona um novo bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P), doravante denominado “ΦCJ26”, com uma capacidade específica para matar as subespécies de Salmonella (ssp.).

[026] A Salmonella é um microrganismo patogênico que infecta vários animais e causa diversas doenças e, especificamente, pode causar intoxicação alimentar em humanos quando uma galinha infectada pela Salmonella é ingerida, e assim, sabe-se que esta bactéria é a principal causadora de intoxicação alimentar dentre os patógenos causadores de doenças transmitidas por alimentos na Coréia.

[027] Atualmente, estudos indicam que a Salmonella possui mais de 2.500 sorotipos amplamente divididos em estirpes com especificidade hospedeira dependendo dos animais e estirpes sem especificidade hospedeira, e são encontradas como bactérias parasitas em vários animais.

[028] Exemplos de Salmonella de acordo com a classificação sorológica podem incluir Salmonella senftenberg, Salmonella derby, Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi A ou C, Salmonella schottmulleri, Salmonella choleraesuis, Salmonella montevideo, Salmonella Newport, Salmonella enteritidis, Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum, Salmonella mbandaka , Salmonella abortusovi, Salmonella abortusequi, Salmonella dublin, Salmonella sofia, Salmonella Thomson, Salmonella havana, Salmonella bovismorbificans, Salmonella kentucky, Salmonella infantis, Salmonella hadar, Salmonella arizonae e Salmonella anatum, sem se limitar a estes.

[029] Especificamente, a Salmonella de acordo com uma configuração da presente invenção pode se referir a estirpes de Salmonella derivadas de aves de corte, e exemplos destas estirpes de Salmonella podem ser selecionados pelo menos dentre o grupo compreendendo Salmonella senftenberg, Salmonella montevideo, Salmonella newport, Salmonella Kentucky, Salmonella mbandaka, Salmonella infantis, Salmonella hader, Salmonella derby, Salmonella thomson e Salmonella choleraesuis, sem se limitar a estes.

[030] O termo “aves de corte” tal como empregado no presente relatório descritivo é um nome genérico para galinha. As aves de corte não são particularmente limitadas e, podem ser selecionadas pelo menos dentre o grupo compreendendo galinhas, gansos, perus, e similares. Especificamente, a Salmonella de acordo com esta configuração pode ser derivada de galinhas.

[031] De acordo com esta configuração, a Salmonella cresce bem em meio comum, podendo crescer a uma temperatura situada entre cerca de 7°C a 48°C, sendo que a temperatura ideal de crescimento varia entre cerca de 35°C a 37°C. Particularmente, fatores patogênicos são expressos efetivamente a temperaturas de aproximadamente 42°C. Além disso, a Salmonella pode crescer num nível de pH situado entre pH 4,5 e pH 9,0.

[032] Um bacteriófago é um vírus específico da bactéria que infecta bactérias específicas para suprimir e inibir o crescimento da bactéria, e é um vírus que possui ácido desoxirribonucleico (DNA) em cadeia simples ou dupla, ou ácido ribonucleico (RNA) como um material genético.

[033] Especificamente, o bacteriófago ΦCJ26 de acordo com uma configuração da presente invenção é um bacteriófago com especificidade para infectar seletivamente a Salmonella pertence morfologicamente à Siphoviridae e tem uma estrutura de cápside icosaédrica com uma cauda longa não contrátil (ver Fig. 1). A homologia entre a sequência nucleotídica do bacteriófago ΦCJ26 e sequências nucleotídicas decodificadas de outros bacteriófagos é comparada e os resultados são mostrados na Tabela 1. O bacteriófago ΦCJ26 mostra uma resistência estável ao ácido em ambiente de pH 4,0 a pH 5,5 sem perda de atividade (Fig. 4) e, em relação à resistência ao calor, o bacteriófago ΦCJ26 não mostra declínio da atividade quando exposto a 60°C durante 2 horas (Fig. 5). Em relação à resistência à secagem, o bacteriófago ΦCJ26 mostra declínio da atividade de cerca de 1 log após a secagem (Fig. 6). As sequências parciais de nucleotídeos do DNA do bacteriófago ΦCJ26 são apresentadas em SEQ ID NOs: 1 a 3 da listagem de sequências.

[034] O bacteriófago ΦCJ26, que é um novo bacteriófago isolado recentemente pelos inventores da presente invenção, e foi depositado no Centro Coreano de Cultura de Microrganismos (KCCM) (361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, República da Coréia) sob o número de acesso KCCM11464P em 25 de outubro de 2013.

[035] Em outra configuração, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas pela Salmonella contendo o bacteriófago ΦCJ26 como um ingrediente ativo.

[036] Como o bacteriófago ΦCJ26 apresenta uma capacidade específica para matar a Salmonella, o bacteriófago ΦCJ26 pode ser utilizado para prevenir ou tratar doenças geradas por infecção pela Salmonella. Como um exemplo de doença infecciosa causada pela Salmonella, podemos citar a salmonelose, mas não se limitando a ela.

[037] O termo “salmonelose” tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a uma doença epidêmica digestiva causada por infecção pela Salmonella, e causa sintomas tais como febre, gastroenterite ou septicemia como sintomas principais, acompanhados de pneumonia, encefalite, artrite, aborto espontâneo, febre, diarreia, cianose e similares. Algumas subespécies podem causar doenças infecciosas em seres humanos e animais, tais como intoxicação alimentar devido à ingestão de carne de animais infectados com Salmonella.

[038] O termo "prevenção" ou "prevenir" tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a todas as ações relativas à administração do bacteriófago ΦCJ26 e/ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ26 como ingrediente ativo para um indivíduo, a fim de inibir ou retardar a ocorrência da doença.

[039] O termo "tratamento" ou "tratar" tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a todas as ações envolvendo a administração do bacteriófago ΦCJ26 e/ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ26 como ingrediente ativo em um indivíduo, a fim de permitir a melhora ou alívio dos sintomas da doença causados pela infecção.

[040] A composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas provocadas pela Salmonella de acordo com esta configuração pode conter o bacteriófago ΦCJ26 numa quantidade preferível de 5x102 a 5x1012 pfu/ml, especificamente, 1x106 pfu/ml a 1x1010 pfu/ml.

[041] A composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas provocadas pela Salmonella de acordo com esta configuração pode conter ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável, e ser formulado em conjunto com o excipiente, para dessa forma ser fornecido como alimento, fármaco, aditivo alimentar, aditivo para água potável, e similares.

[042] O termo "excipiente farmacêutico aceitável", tal como empregado no presente relatório descritivo, significa um veículo ou um diluente que não estimula o organismo vivo e não inibe a atividade biológica e as propriedades de uma composição administrada.

[043] Não há limitações específicas para o tipo de excipiente utilizável de acordo com a presente invenção, e qualquer excipiente pode ser utilizado desde que seja geralmente utilizado na técnica e desde que seja farmaceuticamente aceitável. Exemplos de excipientes podem incluir solução salina, água estéril, solução de Ringer, solução salina tamponada, uma solução injetável de albumina, uma solução de dextrose, uma solução de maltodextrina, glicerol, etanol, e similares, sem se limitar a estes. Tais excipientes podem ser utilizados isoladamente ou combinados entre si.

[044] Além disso, quando necessário, outros aditivos tais como antioxidantes, soluções tampão, e/ou citostáticos, podem ser adicionados à composição de acordo com a presente invenção, e diluentes, dispersantes, surfactantes, aglutinantes e/ou lubrificantes podem ser ainda adicionados à composição de acordo com a presente invenção para preparar formulações injetáveis, tais como solução aquosa, suspensão e emulsão, pílulas, cápsulas, grânulos ou comprimidos, e similares.

[045] Não há limitações específicas para o método de administração da composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas pela Salmonella de acordo com esta configuração, de tal sorte que qualquer método geralmente aceito na arte pode ser empregado. Como exemplo não limitativo do método de administração, a composição pode ser administrada por via oral ou parentérica.

[046] Exemplos de formulação para a administração por via oral podem incluir drágeas, pastilhas, comprimidos, suspensões aquosas, suspensões oleosas, pó preparado, grânulos, emulsões, cápsulas duras, cápsulas moles, xaropes ou elixires, sem se limitar a estes.

[047] A fim de formular a composição na forma de comprimidos ou cápsulas de acordo com esta configuração, a formulação pode conter ainda aglutinantes tais como a lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, amilopectina, celulose e gelatina, excipientes tais como fosfato dicálcico, desintegrantes tais como amido de milho e amido de batata doce, lubrificantes tais como estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearil fumarato de sódio e cera de polietilenoglicol. No caso de formulação em cápsula, a formulação pode conter ainda excipientes líquidos tais como óleos gordurosos, além dos materiais acima mencionados.

[048] Métodos de administração parentérica da composição de acordo com esta configuração podem incluir administração intravenosa, administração abdominal, administração intramuscular, administração subcutânea, administração tópica, bem como um método de aplicação ou pulverização da composição sobre o local afetado de acordo com a presente invenção, mas não se limitando a estes métodos.

[049] A fim de formular uma dosagem para administração parentérica, por exemplo, a composição de acordo com esta configuração pode ser formulada em doses para injeção subcutânea, injeção intravenosa, injeção intramuscular; formulações para supositórios, formulações para pulverização, tais como formulações de aerossol a fim de permitir a inalação através do sistema respiratório, sem se limitar a estas formulações. A fim de formular a composição para injeção, a composição de acordo com esta configuração pode ser misturada com um estabilizador ou uma solução tampão em água para, dessa forma, preparar uma solução ou uma suspensão e, em seguida, a solução preparada ou a suspensão pode ser formulada em uma dose individual para uma ampola ou frasco. No caso da formulação da composição para pulverização, tal como a formulação de aerossol, um propulsor ou similar pode ser misturado juntamente com um aditivo para que a composição condensada em água ou em pó seja dispersa.

[050] Quantidades adequadas para aplicar, pulverizar ou administrar a composição para a prevenção ou tratamento de doenças infecciosas causadas pela Salmonella de acordo com esta configuração, podem ser diferentemente determinadas dependendo de fatores tais como a idade, peso e sexo dos animais, grau dos sintomas da doença, tipo de alimento ingerido, taxa de excreção, e similares, bem como um método de formulação da composição, um método de administração, o tempo de administração e/ou via de administração, e geralmente podem ser facilmente determinados e prescritos em doses eficazes para o tratamento por um veterinário perito na arte.

[051] Em outra configuração, a presente invenção proporciona um antibiótico contendo o bacteriófago ΦCJ26 como um ingrediente ativo.

[052] O termo "antibiótico", tal como empregado no presente relatório descritivo, se refere a uma preparação administrada em animais, incluindo seres humanos, em forma de medicamento com eficácia para esterilizar bactérias, e é utilizado como agente antisséptico, germicida e antibacteriano.

[053] A fim de prevenir ou tratar a Salmonella, muitos estudos sobre vacinas e imunidade contra infecções foram ativamente realizados, porém mais de 2.500 sorotipos de subespécies de Salmonella relatados até agora não possuem regiões hospedeiras específicas e, assim, pelo menos um animal será infectado ou contaminado com estes sorotipos, sendo praticamente impossível erradicar a Salmonella.

[054] Além disso, a Salmonella é capaz de crescer dentro de fagócitos que alojam bactérias, o que impede o tratamento com antibióticos e, ainda que um animal não tenha Salmonella com o uso de antibióticos, ele apresenta um aumento da suscetibilidade de reinfecção pela Salmonella quando cessa a administração dos antibióticos e, desta forma, existe uma necessidade para o desenvolvimento de antibióticos capazes de atuar especificamente contra a Salmonella.

[055] Antibióticos contendo o bacteriófago ΦCJ26 como ingrediente ativo de acordo com esta configuração, apresentam elevada especificidade contra a Salmonella se comparados aos antibióticos convencionais, e por isso não matam bactérias benéficas, mas apenas bactérias patogênicas específicas, não induzindo resistência ao medicamento e proporcionando um tempo de vida maior aos produtos tratados quando comparado aos antibióticos tradicionais.

[056] Ainda de acordo com outra configuração, a presente invenção proporciona um aditivo alimentar ou um aditivo para água potável contendo o bacteriófago ΦCJ26 como um ingrediente ativo.

[057] Aditivos alimentares ou aditivos para água potável podem ser utilizados de tal forma que o bacteriófago ΦCJ26 ou a composição contendo o mesmo sejam preparados separadamente como um aditivo alimentar ou aditivo para água e em seguida misturado a um alimento ou água potável, ou de tal forma que o bacteriófago ΦCJ26 ou a composição contendo o mesmo seja diretamente adicionada no processo de preparação do alimento ou da água potável.

[058] O bacteriófago ΦCJ26 ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ26 como aditivo alimentar ou para água potável de acordo com esta configuração pode ser usado na forma líquida ou seca como, por exemplo, em forma de pó seco.

[059] O bacteriófago ΦCJ26 de acordo com a presente invenção é misturado em forma de pó nas quantidades de 0,05% por peso (wt%) a 10 wt%, especificamente 0,1 wt% a 2 wt%, com base no peso dos aditivos alimentares.

[060] Métodos de secagem para a preparação do aditivo alimentar e do aditivo para água potável sob a forma de pó seco de acordo com esta configuração não apresentam limitações, de maneira que outros métodos comumente utilizados pelos peritos na arte podem ser empregados. Como exemplos de métodos de secagem, podemos usar um método de secagem natural com ar, secagem natural, secagem por pulverização, secagem por liofilização, sem se limitar a estes. Estes métodos podem ser utilizados isoladamente ou de forma combinada.

[061] O aditivo alimentar ou aditivo para água potável, de acordo com esta configuração, podem incluir ainda microrganismos não patogênicos. Os microrganismos podem ser selecionados dentre um grupo compreendendo Bacillus sp., tal como Bacillus Subtilis, capaz de produzir proteases, lipases e/ou enzima de conversão de açúcar, uma bactéria de ácido lático tal como Lactobacillus sp. com atividade fisiológica e atividade de degradação para um material orgânico em condições anaeróbicas, tal como o estômago bovino, bactérias filamentosas tal como Aspergillus oryzae com capacidade de aumentar o peso de um animal, produção de leite, e digestão de alimentos, e leveduras como Saccharomyces cerevisiae, ou similares. Estes microrganismos podem ser usados isoladamente ou de forma combinada.

[062] Os aditivos alimentares ou aditivos para água potável contendo o bacteriófago ΦCJ26 como ingrediente ativo de acordo com esta configuração, pode ainda conter outros aditivos, conforme a necessidade.

[063] Exemplos de aditivos apropriados incluem aglutinantes, emulsificantes, e conservantes, os quais são adicionados para evitar a deterioração do alimento ou da água, aminoácidos, vitaminas, enzimas, probióticos, agentes aromatizantes, composições nitrogenadas não proteicas, silicatos, soluções tampão, agentes corantes, agentes extratantes, ou oligossacarídeos, que são adicionados de modo a aumentar a utilidade do alimento ou da água potável, e outros suplementos alimentares, sem se limitar a estes. Estes aditivos podem ser usados isoladamente ou de forma combinada.

[064] Os aditivos alimentares de acordo com a presente invenção podem ser adicionados em quantidades de 0,05 a 10 partes por peso, especificamente de 0,1 a 2 partes por peso com base em 100 partes por peso do alimento. O aditivo para água potável de acordo com a presente invenção pode estar presente em quantidades de 0,0001 a 0,01 partes por peso, especificamente de 0,001 a 0,005 partes por peso com base em 100 partes por peso de água potável. Dentro destes parâmetros, os aditivos permitem que a atividade do bacteriófago ΦCJ26 contra a Salmonella seja suficientemente exposta.

[065] Em outra configuração, a presente invenção proporciona um alimento ou água potável preparada através da adição de um aditivo alimentar ou de água potável contendo o bacteriófago ΦCJ26 como ingrediente ativo, ou pela adição direta do bacteriófago ΦCJ26.

[066] Não há limitações para os alimentos utilizados nesta configuração, de tal sorte que quaisquer alimentos comumente usados na arte podem ser utilizados. Exemplos de alimentos podem incluir vegetais, grãos, raízes, subprodutos de processamento de alimentos, algas, fibras, subprodutos farmacêuticos, óleos e gorduras, amidos, resíduos ou subprodutos de grãos, e similares, e alimentos para animais, tais como proteínas, materiais inorgânicos, óleos e gorduras, minerais, proteínas de células individuais, plânctons animais ou alimentos. Estes alimentos podem ser usados isoladamente ou de forma combinada.

[067] A água potável usada nesta configuração não apresenta limitações, de tal sorte que qualquer água potável pode ser usada.

[068] Além disso, os alimentos de acordo com esta configuração podem ser adicionados e misturados com a água potável, e a água potável resultante pode diminuir de forma consistente a quantidade de bactérias de Salmonella intestinal, permitindo assim a produção de animais de corte isentos de Salmonella.

[069] Ainda de acordo com outra configuração, a presente invenção proporciona desinfetantes ou detergentes contendo o bacteriófago ΦCJ26 como ingrediente ativo. A dosagem do desinfetante ou detergente não apresenta limitações, de tal sorte que a dosagem do desinfetante ou do detergente pode obedecer a qualquer formulação conhecida na arte.

[070] A fim de eliminar a Salmonella, o desinfetante pode ser pulverizado em áreas onde vivem os animais, em locais de abate, em áreas inabitadas, em cozinhas ou mesmo em equipamentos de cozinha, sem que sua aplicação seja limitada a estes exemplos.

[071] Os detergentes podem ser utilizados para lavar uma superfície da derme ou partes do corpo de aves expostas ou que podem ser expostas à Salmonella, sem se limitar a estes exemplos.

[072] Ainda de acordo com outra configuração, a presente invenção proporciona um método de prevenção e/ou tratamento de doenças infecciosas causadas pela Salmonella, utilizando o bacteriófago ΦCJ26 ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ26 como um ingrediente ativo.

[073] Especificamente, o método de prevenção ou tratamento de acordo com esta configuração inclui a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz do bacteriófago ΦCJ26 ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ26 como ingrediente ativo em aves de corte expostas ou que podem ser expostas à Salmonella. As quantidades diárias totais adequadas do bacteriófago ΦCJ26 ou da composição incluindo o mesmo podem ser determinadas por um veterinário de acordo com a sua avaliação, como seria de fácil compreensão aos peritos na arte.

[074] Uma dose específica farmaceuticamente eficaz do bacteriófago ΦCJ26 ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ26 como ingrediente ativo para aves de corte, pode ser determinada considerando-se o tipo e ao grau de resposta desejada, a idade, peso, estado geral de saúde, sexo, ou dieta dos indivíduos, o tempo de administração e a via de administração do bacteriófago ΦCJ26 ou da composição contendo o mesmo, e a taxa de secreção da composição, o período de duração do tratamento, ou fatores similares, de tal sorte que a dosagem farmaceuticamente eficaz pode ser alterada de acordo com diversos fatores bem conhecidos no campo da medicina, incluindo os ingredientes dos medicamentos a serem usados simultaneamente ou em diferentes ocasiões.

[075] O bacteriófago ΦCJ26 ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ26 como ingrediente ativo pode ser administrado em aves na forma de preparação farmacêutica aplicada como spray nasal ou adicionada diretamente em um alimento das aves ou na água potável em forma de aditivo alimentar ou aditivo para água potável, e então administrado ao animal.

[076] A via de administração e o método de administração do bacteriófago ΦCJ26 ou da composição contendo o bacteriófago ΦCJ26 como ingrediente ativo não são especificamente limitadas, de tal forma que qualquer via de administração e método de administração podem ser utilizados, desde que o bacteriófago ΦCJ26 ou a composição contendo o mesmo possam chegar ao tecido desejado.

[077] Isto é, o bacteriófago ΦCJ26 ou a composição contendo o bacteriófago ΦCJ26 como o ingrediente ativo pode ser administrado através de várias vias, oral ou parentérica. Como um exemplo não restritivo da via de administração, é possível utilizar a via oral, retal, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, subcutânea e administração nasal ou inalação.

[078] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes através de exemplos. No entanto, os referidos exemplos visam apenas ilustrar os aspectos relevantes da presente invenção sem o propósito de limitar o escopo da presente invenção aos exemplos apresentados.

[Exemplo 1] Isolamento do bacteriófago que infecta a SALMONELLA <Exemplos 1-1> Seleção do bacteriófago e isolamento de um único bacteriófago

[079] Foi obtida uma amostra de 50 ml de fezes de galinha colhida em uma granja em Gwangcheon, Hongsung-gun, na província de Chungcheong, República da Coréia, e as amostras foram centrifugadas a 4.000 rpm por 10 minutos, e o sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,45μm para preparar uma solução de amostra, e depois um método de sobreposição de ágar macio foi realizado utilizando a solução de amostra preparada. O método de sobreposição de ágar macio é um método de observação de uma ação de lise do bacteriófago utilizando células hospedeiras crescendo em ágar de superfície (sobre um meio sólido com 0,7% de ágar).

[080] Especificamente, 150 μl de uma solução agitada da cultura (OD600 = 2) de Salmonella senftenberg (SS) obtida pelo Departamento de Medicina Veterinária da Universidade de Konkuk, e 2 ml de meio 10x”Luria Bertani” (LB) (10 g/l de triptofano; 5 g/l de extrato de levedura e 10 g/l de NaCl) foram misturados com 18ml de amostra filtrada e cultivada a 37OC por 18 horas. Em seguida, a solução da cultura foi centrifugada a 4.000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante resultante foi filtrado com filtro de 0,45 μm. Em seguida, uma mistura de solução contendo 3ml de ágar a 0,7% (w/v) e 150 μl da solução agitada da cultura (OD600 = 2) de SS foram vertidas e endurecidas numa placa com meio LB, à qual foram adicionados 10 μl da solução de amostra seguida de cultura a 37C por 18 horas, resultando na formação de placas.

[081] Considerando que um tipo de bacteriófago estava presente em cada placa, os inventores tentaram isolar bacteriófagos a partir das placas formadas. Especificamente, 400 μl de solução SM [5,8 g/l de NaCl; 2g/l de MgSO47H2O; 50ml de 1M Tris-HCl (pH 7,5)] foi adicionada às placas e deixada em temperatura ambiente durante 4 horas, obtendo assim a solução do bacteriófago.

[082] Em seguida, 100 μl da solução do bacteriófago foi misturada com 12 ml de ágar a 0,7%(w/v) e 500 μl da solução agitada da cultura (OD600 = 2) de SS, que foi usada para executar o método de sobreposição em ágar macio usando um meio LB em placa com um diâmetro de 150 mm onde a cultura foi realizada até que o bacteriófago fosse completamente lisado. Após o término da cultura, 15ml da solução SM foram adicionados ao meio LB e deixados em temperatura ambiente por um período de 4 horas, obtendo assim a solução do bacteriófago.

[083] À solução obtida foram adicionados 1% (v/v) de clorofórmio e a solução foi misturada durante 10 minutos, seguida por centrifugação a 4.000 rpm por 10 minutos, obtendo assim o sobrenadante. O sobrenadante obtido foi filtrado com um filtro de 0,45 μm, obtendo assim uma amostra final.

<Exemplos 1-2> Cultura em grande escala e purificação do bacteriófago

[084] O bacteriófago obtido no Exemplo 1-1 foi cultivado em grande escala utilizando Salmonella senftenberg (SS) e, em seguida, o bacteriófago foi purificado.

[085] Especificamente, a cultura de SS foi agitada e inoculada a 1,5x1010 cfu, centrifugada a 4.000 rpm durante 10 minutos e em seguida ressuspensa em 4ml de solução SM. A esta solução foi adicionado o bacteriófago a 1,5x108 pfu com multiplicidade de infecção (MOI) = 0,0001, e então deixado em temperatura ambiente durante 20 minutos.

[086] Em seguida, 150 ml de meio LB foi inoculado e a solução foi cultivada a 37°C durante 6 horas. Após a conclusão da cultura, foi adicionado clorofórmio a um volume de 1% (v/v) do volume final, e o material foi mexido durante 20 minutos, ao qual foram adicionadas enzimas de restrição DNase I e RNase A em uma concentração final de 1 μg/ml, respectivamente, e a solução foi deixada a 30°C durante 30 minutos. A seguir, foram adicionados cloreto de sódio e glicol polietileno a uma concentração final de 1M e 10% (w/v), respectivamente, e em seguida a solução foi deixada a 4°C durante 3 horas, seguida de centrifugação a 4°C e 12.000 rpm por um período de 20 minutos, obtendo assim um precipitado.

[087] O precipitado obtido foi suspenso em 5ml da solução SM e então deixado em temperatura ambiente durante 20 minutos, sendo adicionados 4ml de clorofórmio e a solução mexida, seguida de centrifugação a 4°C e 4.000 rpm durante 20 minutos, obtendo assim o sobrenadante. O sobrenadante foi filtrado com um filtro de 0,45 μm e seguido de ultracentrifugação (35.000 rpm, 1 hora, 4 °C) através do método de gradiente de densidade em glicerol (densidade: 40%, 5% de glicerol), purificando assim o bacteriófago.

[088] Os inventores da presente invenção isolaram um bacteriófago obtido através da amostra de fezes de galinhas com capacidade específica para matar a Salmonella que foi denominado "Bacteriófago ΦCJ26", e depositaram o bacteriófago no Centro Coreano de Cultura de Microrganismos (KCCM) (361221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, República da Coréia) sob o número de acesso KCCM11464P em 25 de outubro de 2013.

<Exemplo 2> Exame morfológico do ΦCJ26

[089] O bacteriófago ΦCJ26 purificado no Exemplo 1 foi diluído em 0,01% de solução de gelatina e em seguida fixado com 2,5% de solução de glutaraldeído. O bacteriófago fixado foi derramado sobre uma placa de mica revestida com carbono (cerca de 2,5 mm x 2,5 mm), aclimatado por 10 minutos e a seguir lavado com água destilada estéril.

[090] Em seguida, a película de carbono foi disposta sobre uma grelha de cobre, tingida com 4% de acetato de uranilo por 60 segundos, seca, e observada através de um microscópio de transmissão de elétrons (JEM-1011, 80 kV, ampliação: x200.000) (ver Fig. 1).

[091] A Fig. 1 mostra uma imagem do bacteriófago ΦCJ26 feita pelo microscópio de elétrons, onde o bacteriófago ΦCJ26 apresenta características morfológicas de uma cápside icosaédrica com uma cauda longa não contrátil, indicando que o bacteriófago ΦCJ26 pertence ao morfotipo Siphoviridae.

<Exemplo 3> A análise do tamanho total do DNA genômico do ΦCJ26

[092] O DNA genômico foi extraído a partir do bacteriófago ΦCJ26 purificado no Exemplo 1.

[093] Especificamente, 20mM do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 50 μg/ml de proteinase K e 0,5% (w/v) de dodecilsulfato de sódio (SDS) foram adicionados a uma solução da cultura do bacteriófago ΦCJ26 purificado e foram deixados a 50°C durante 1 hora, à qual foi adicionada e mexida uma quantidade igual de fenol (pH 8,0), seguida de centrifugação em temperatura ambiente e 12.000 rpm durante 10 minutos, obtendo-se assim um sobrenadante.

[094] O sobrenadante foi misturado com uma quantidade igual de PC (fenol: clorofórmio = 1:1) e centrifugado em temperatura ambiente e 12.000 rpm durante 10 minutos, obtendo-se assim um sobrenadante. O sobrenadante foi misturado com uma quantidade igual de clorofórmio e centrifugado em temperatura ambiente e 12.000 rpm por 10 minutos, obtendo-se assim um sobrenadante. O sobrenadante obtido foi misturado com 10% (v/v) de acetato de sódio 3M com base no volume total, seguido da adição de 2 volumes de etanol frio a 95%, mexido, e deixado a -20C durante 1 hora.

[095] Em seguida, a substância resultante foi centrifugada a 0°C e 12.000 rpm por 10 minutos, da qual o sobrenadante foi removido para a obtenção do precipitado que foi dissolvido em 50 μl de Tris-EDTA (TE) solução tampão (pH 8,0). O DNA extraído foi diluído 10 vezes e a concentração de DNA foi determinada medindo-se a absorção em OD260.

[096] Em seguida, 1 μg de DNA foi carregado em 1% de PFGE (eletroforese em gel de campo pulsado) em gel de agarose, e desenvolvido com o uso de BIORAD PFGE SYSTEM NO.7 (tamanho variando entre 25 kb a 100 kb; comutador tempo de rampa 0,4 segundos para 2,0 segundos, forma linear; tensão 180 V; tensão inversa 120 V) em temperatura ambiente durante 20 horas (FIG 2).

[097] A Fig. 2 é uma fotografia da eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) do DNA genômico do bacteriófago ΦCJ26, onde pode ser confirmado que o DNA genômico do bacteriófago ΦCJ26 tem um tamanho aproximado de 90kbp.

<Exemplo 4> Análise do padrão da proteína do ΦCJ26

[098] 15 μl da solução do bacteriófago ΦCJ26 purificado (título 1011 pfu/ml) foi misturada com 3 μl de uma solução de amostra 5*SDS, e então fervida durante 5 minutos para obter 12% de SDS-PAGE (Fig. 3).

[099] A Fig. 3 é uma fotografia da eletroforese mostrando o resultado da SDS-PAGE realizada no bacteriófago ΦCJ26, onde proteínas principais com tamanhos de cerca de 12,1kDa, cerca de 16,4kDa, cerca de 44kDa e cerca de 54kDa foram observadas.

<Exemplo 5> Análise das propriedades genéticas do ΦCJ26

[100] A fim de confirmar as características genéticas do bacteriófago ΦCJ26 purificado no Exemplo 1, o DNA do bacteriófago ΦCJ26 foi analisado utilizando um sequenciador de titânio FLX (Roche), que é um aparelho de análise do gene. Genes foram recombinados utilizando GS e o novo software (Roche) da Macrogen Inc. A análise da sequência do quadro aberto de leitura foi realizada utilizando GeneMArk.hmm, Glimmer v3.02, e software FGENESB. A identificação do quadro aberto de leitura foi realizada usando BLASTP e InterProScan.

[101] A sequência nucleotídica do bacteriófago ΦCJ26 apresentou semelhanças com a sequência nucleotídica dos bacteriófagos previamente reportados (fago de Salmonella SPT- fago de Escherichia EC6, fago de Staphylococcus SA1), mas foi confirmado que não há nenhum outro bacteriófago com 100% de coincidência dos fragmentos. Deste modo, ficou confirmado que um novo bacteriófago de acordo com a presente invenção foi isolado.

[102] A Tabela 1 representada abaixo mostra os resultados obtidos pela comparação da sequência nucleotídica do bacteriófago ΦCJ26 e sequências nucleotídicas decodificadas de outros bacteriófagos conhecidos no estado da técnica. [Tabela 1]

[103] O DNA do bacteriófago ΦCJ26 preparado foi analisado utilizando um sequenciador de DNA e a sequência total de nucleotídeos é apresentada em SEQ ID NOs: 1 a 3.

<Exemplo 6> Estabilidade do pH do ΦCJ26

[104] A fim de confirmar a estabilidade do bacteriófago ΦCJ26 em um ambiente de baixo pH como no estômago, foi realizado o teste de estabilidade do bacteriófago ΦCJ26 sobre uma larga gama de pH (pH 3,0 / 4,0 / 5,0 e 5,5).

[105] Para o experimento, várias soluções de pH [solução tampão de acetato de sódio (pH4,0, pH4,5, pH5,0 e pH5,5) e solução tampão de citrato de sódio (pH3,0), foram preparadas a uma concentração de 0,2 M.

[106] 180 μl de cada uma das soluções de pH foram misturadas com 20 μl de solução do bacteriófago com um título de 108 pfu/ml de modo a permitir que cada solução de pH tivesse uma concentração de 0,2 M, e então a solução resultante foi deixada em temperatura ambiente durante 2 horas. Para um grupo de controle, 20 μl da solução do bacteriófago com um título de 108 pfu/ml foi misturada com 180 μl da solução SM pelo mesmo método e a solução resultante deixada em temperatura ambiente durante 2 horas. Em seguida, as soluções foram diluídas em série, 10 μl de cada solução em cada etapa da diluição foram cultivadas a 37OC durante 18 horas através do método de sobreposição em ágar macio para determinar o título do bacteriófago, quando submetido ou não ao processo de lise (Fig. 4).

[107] A Fig. 4 mostra os resultados experimentais da resistência do bacteriófago ΦCJ26 a ácidos. Conforme ilustrado na Fig. 4, foi confirmado que o bacteriófago ΦCJ26 não perdeu sua atividade e permaneceu estável em um ambiente de pH 4,0 a pH 5,5 quando comparado ao grupo de controle.

<Exemplo 7> Estabilidade e resistência do ΦCJ26 ao calor

[108] Foram realizados testes para confirmar a estabilidade e resistência do bacteriófago ao calor gerado durante o processo de formulação do bacteriófago no caso de se usar o bacteriófago na formulação de aditivos alimentares, dentre outras formulações de bacteriófagos.

[109] Especificamente, 200 μl da solução do bacteriófago ΦCJ26 com uma concentração de 108 pfu/ml foi deixada a 60°C durante 10 minutos, 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos, respectivamente. Então as soluções acima foram diluídas em série, e 10 μl de cada uma das soluções foram diluídas em cada etapa e cultivadas a 37OC durante 18 horas através de um método de sobreposição em ágar macio para determinar o título do bacteriófago, quando submetido ou não ao processo de lise (Fig. 5).

[110] A Fig. 5 mostra os resultados do teste de resistência ao calor do bacteriófago ΦCJ26. Conforme ilustrado na Fig. 5, o bacteriófago ΦCJ26 não teve sua atividade reduzida quando exposto a 60°C por 120 minutos.

<Exemplo 8> Estabilidade do bacteriófago ΦCJ24 à secagem

[111] Foram realizados testes para confirmar a estabilidade do bacteriófago sob condições de secagem gerada durante o processo de formulação do bacteriófago no caso de usar o bacteriófago como uma formulação de aditivo alimentar, dentre outras formulações do bacteriófago.

[112] Baseado nos resultados do teste de resistência ao calor, o teste de secagem foi realizado usando um concentrador SpeedVac. Assim, 200 μl da solução do bacteriófago ΦCJ26 com uma concentração de 108 pfu/ml foi seca a 60°C em condições de vácuo por 2 horas, e os sedimentos resultantes foram introduzidos em 200 μl de solução SM, e a seguir foi completamente ressuspensa a 4°C por um dia, e então os títulos foram medidos (Fig. 6).

[113] Conforme demonstrado na Fig. 6, o bacteriófago ΦCJ26 teve sua atividade reduzida em cerca de 1 log após ser seco a 60°C por 2 horas.

<Exemplo 9> Exame de espectro de infecção do bacteriófago ΦCJ26 em estirpe isolada do tipo selvagem de Salmonella

[114] A atividade lítica do bacteriófago ΦCJ26 foi testada para 9 estirpes selvagens de Salmonella sentfenberg, 14 estirpes de Salmonella montevideo, 12 estirpes de Salmonella Newport, 10 estirpes de Salmonella Kentucky, 13 estirpes de Salmonella mbandaka, 11 estirpes de Salmonella infantis, 4 estirpes de Salmonella handar, 5 estirpes de Salmonella derby, 4 estirpes de Salmonella choleraesuis e 13 estirpes de Salmonella Thomson, as quais foram isoladas em uma fazenda pela Escola de Medicina Veterinária da Universidade de Konkuk (KU), além da Salmonella senftenberg usada no presente experimento.

[115] Especificamente, 150 μl de solução de cultura agitada de cada estirpe (OD600 = 2) foram misturadas, e 10 μl da solução do bacteriófago ΦCJ26 com um título de 109pfu/ml foram derramados e cultivados a 37OC durante 18 horas, através de um método de sobreposição em ágar macio, e então a formação de placas foi examinada (Tabelas 2 e 3).

[116] Os resultados estão ilustrados na Tabela 2 e 3. [Tabela 2]

[Tabela 3]

[117] Conforme demonstrado nas Tabela 2 e 3, o bacteriófago ΦCJ26 demonstra capacidade de infectar Salmonella sentfenberg, Salmonella montevideo, Salmonella Newport, Salmonella Kentucky, Salmonella mbandaka, Salmonella infantis, Salmonella handar, Salmonella derby, Salmonella choleraesuis, Salmonella Thomson, e similares, que representam as principais bactérias causadoras de doenças infecciosas causadas pela Salmonella nas granjas de aves de corte.

Claims

1. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender o bacteriófago ΦCJ26 (KCCM11464P) como ingrediente ativo.

2. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer a reivindicação 1, caracterizada por ser para administração em aves de corte.

3. ADITIVO ALIMENTAR, caracterizado por compreender a composição, conforme definida na reivindicação 1, como um ingrediente ativo.

4. ALIMENTOS, caracterizados por compreender o aditivo alimentar, conforme definido na reivindicação 3.

5. ADITIVO PARA ÁGUA POTÁVEL, caracterizado por compreender a composição, conforme definida na reivindicação 1, como um ingrediente ativo.

6. ÁGUA POTÁVEL, caracterizada por compreender o aditivo para água potável, conforme definido na reivindicação 5.

7. DESINFETANTE, caracterizado por compreender a composição, conforme definida na reivindicação 1, como um ingrediente ativo.

8. DETERGENTE, caracterizado por compreender a composição, conforme definida na reivindicação 1, como um ingrediente ativo.