CN117305191B - 一株大菱鲆来源的耐药杀鱼爱德华氏菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株大菱鲆来源的耐药杀鱼爱德华氏菌，属于病原微生物筛选技术领域。该耐药杀鱼爱德华氏菌为杀鱼爱德华氏菌HC‑27‑1，对大菱鲆具有致病性，携带耐药基因，耐药基因型为TEM +－ant(3")‑Ⅰ +－tet(A) ‑－mcr‑1 ‑－Sul2 ‑－Sul3 ‑－oqxA ‑。经人工感染，该杀鱼爱德华氏菌HC‑27‑1对大菱鲆具有致病力。应用利福平制备其弱毒活疫苗对大菱鲆进行免疫保护，能有效保护大菱鲆抵抗杀鱼爱德华氏菌感染，对耐药的杀鱼爱德华氏菌具有免疫保护效果，可有效减少抗生素类药物的使用，促进水产绿色健康养殖。
Description
技术领域
本发明涉及一株细菌，具体涉及一株大菱鲆来源的耐药杀鱼爱德华氏菌，属于病原微生物筛选技术领域。
背景技术
大菱鲆Scophthalmus maximus，俗称多宝鱼，是冷水性底栖海水鱼类，是重要的经济养殖鱼类。随着规模化不断发展，养殖集约化程度提高，细菌性疾病频发，影响养殖业健康发展。
杀鱼爱德华氏菌Edwardsiella piscicida是大菱鲆的致病菌，对大菱鲆的感染率和致死率都很高，能引发大菱鲆腹水病、红体病、白便病等疾病。该菌分布范围大、感染范围广、传播速度快、可感染对象多，不仅能导致大菱鲆患病，还能引发罗非鱼、鳗鲡、斑马鱼、大嘴鲈鱼等多种鱼类患腹水病、出血性败血症等。
疫苗免疫接种是鱼类防治细菌性疾病安全、环保、有效的方法。疫苗的使用可提高鱼类特异性免疫水平，使鱼体产生抵抗特定病原微生物感染的免疫力，且注射后无污染、无残留，是鱼类病害防控的主流研究方向。Sun等通过利福平抗生素筛选获得的迟缓爱德华氏菌弱毒疫苗，通过口服和浸泡方式对牙鲆有很好的免疫保护效果，进而表明利用利福平抗生素培养获得的致弱株，因基因突变或缺失，毒性减弱，可用于疫苗候选。
细菌性疾病治疗过程中，由于长期使用抗生素等，造成病原菌产生耐药性，携带耐药基因的病原菌也频频被检测出。对耐药性病原菌的防治难度也越来越大，因此研发疫苗，从源头上预防疾病的发生具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大菱鲆来源的耐药杀鱼爱德华氏菌。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一株大菱鲆来源的耐药杀鱼爱德华氏菌，所述耐药杀鱼爱德华氏菌为杀鱼爱德华氏菌HC-27-1，分类命名为杀鱼爱德华氏菌HC-27-1 Edwardsiella piscicida HC-27-1，是从摄食能力减弱、行动迟缓、腹部膨大、鳍条及鳍基部充血发红、腹腔有淡黄色液体、肝脏出血发红、脾脏肿大、肠壁膨大内有液体的患病大菱鲆中筛选获得的，对大菱鲆具有致病性，携带耐药基因，耐药基因型为TEM +－ant(3")-Ⅰ +－tet(A) -－mcr-1 -－Sul2 -－Sul3 -－oqxA -，所述杀鱼爱德华氏菌HC-27-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏日期为2022年12月23日，保藏编号为CCTCC NO：M 20222064。
本发明的有益之处在于：本发明公开的杀鱼爱德华氏菌HC-27-1，经分析，其全基因组GC含量为35.47%，共有编码蛋白质基因2210个、编码转运RNA基因49个、编码核糖体RNA基因4个。经全基因组测序COG数据库注释，该杀鱼爱德华氏菌HC-27-1基因组中含有信号转导、氨基酸、核糖体、脂类、辅酶等运输、代谢等相关功能基因14种1651个，与已报道的杀鱼爱德华氏菌有明显区别。经人工感染，该杀鱼爱德华氏菌HC-27-1对大菱鲆具有致病力，应用利福平制备其弱毒活疫苗对大菱鲆进行免疫保护，能有效保护大菱鲆抵抗杀鱼爱德华氏菌感染，对耐药的杀鱼爱德华氏菌具有免疫保护效果，可有效减少抗生素类药物的使用，促进水产绿色健康养殖。
附图说明
图1是杀鱼爱德华氏菌HC-27-1的革兰氏染色结果图；
图2是杀鱼爱德华氏菌HC-27-1的耐药基因检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、分离、鉴定菌株以及耐药基因检测
1、分离菌株
患病大菱鲆样品采集自山东烟台大菱鲆养殖场，个体质量152g～463g之间。患病大菱鲆表现为：摄食能力减弱、行动迟缓、腹部膨大、鳍条及鳍基部充血发红。解剖可见：腹腔有淡黄色液体、肝脏出血发红、脾脏肿大、肠壁膨大内有液体。
取典型症状的患病大菱鲆濒死个体，无菌条件下剖取出肝脏、肾脏、脾脏和心脏，用灭菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，充分研磨，得到组织均浆液，用无菌环蘸取组织均浆液于含有2wt%NaCl的营养琼脂平板上划线，28℃倒置培养48h，挑取优势菌落进行纯化培养，用终浓度为20%的甘油保种（菌株编号：HC-27-1），-80℃冰箱保存备用。
鉴定菌株
经过16S rRNA检测及管家基因rpoB和gyrB检测，BLAST比对分析，以及特异性引物PCR检测，结合菌株形态、生长特性、生理生化结果等，鉴定该菌株为杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida），记为杀鱼爱德华氏菌HC-27-1。该杀鱼爱德华氏菌HC-27-1的革兰氏染色结果见图1（革兰氏染色呈红色），杀鱼爱德华氏菌HC-27-1为革兰氏阴性菌。
耐药基因检测
杀鱼爱德华氏菌HC-27-1的耐药基因检测结果如图2所示。由图2可知：杀鱼爱德华氏菌HC-27-1的耐药基因型为TEM +－ant(3")-Ⅰ +－tet(A) -－mcr-1 -－Sul2 -－Sul3 -－oqxA -。
二、验证杀鱼爱德华氏菌HC-27-1的致病力
用0.9%灭菌生理盐水洗脱活化好的杀鱼爱德华氏菌HC-27-1，制成浓度为2.4×1010CFU/mL的菌悬液。
选取与患病大菱鲆规格相近的健康大菱鲆作为试验用鱼。在车间暂养一周后，随机分为2组（试验组、对照组），每组20尾，其中，试验组每尾腹腔注射杀鱼爱德华氏菌HC-27-1菌悬液0.1mL，对照组每尾腹腔注射无菌生理盐水0.1mL。养殖水箱保持充气，温度控制在17±1℃，每天虹吸换水20%，饲养观察14天，每天记录发病和死亡情况。
14天后统计感染情况，发现：杀鱼爱德华氏菌HC-27-1表现出一定的致病力，导致90%以上的实验大菱鲆死亡，且发病死亡个体表现出与患病大菱鲆一致的临床症状，患病大菱鲆可再次分离获得杀鱼爱德华氏菌。这表明：杀鱼爱德华氏菌HC-27-1对大菱鲆具有致病力，可引起大菱鲆死亡。
三、对杀鱼爱德华氏菌HC-27-1进行全基因组测序
为更好了解杀鱼爱德华氏菌HC-27-1的基因组信息，应用试剂盒提取杀鱼爱德华氏菌HC-27-1的全基因组DNA，Illumina HISsq平台完成全基因组测序工作。使用FastQC对样本的测序数据进行统计，剔除低质量序列后，统计结果表明：杀鱼爱德华氏菌HC-27-1的碱基GC比例为36.6%。使用SPAdes对二代测序数据进行拼接组装、校正，拼接序列平均长度为97265.14bp。经分析，杀鱼爱德华氏菌HC-27-1共有编码蛋白的基因2210个，平均长度为864.07bp，编码蛋白基因总长度为1909595bp，基因占比89.24%；转运RNA编码基因49个；核糖体RNA编码基因4个。在原核生物COG（Clusters of Orthologous Group of proteins）数据库比对，有1651个基因在该数据库注释成功，占基因总数的77.73%。经统计，氨基酸运输代谢基因111个、碳水化合物运输代谢基因164个、翻译、核糖体结构和发生基因151个、转录功能基因126个、复制重组修复基因116个、无机离子转运代谢基因 92，还有能量产生与转换、脂类运输代谢、辅酶、核苷酸、细胞周期控制、细胞分裂、染色体划分、细胞壁、膜、包膜生物发生、翻译修饰等明确的功能基因14类1136个，及未知功能基因515个。
四、制备利福平弱毒活疫苗
将-80℃保存备用的杀鱼爱德华氏菌HC-27-1活化，用添加2wt%NaCl的LB肉汤液体培养基调整菌液浓度为OD600=0.6，取100μL接种于含有15μL/mL利福平的LB固体培养平板中，在28℃下培养5d。随机挑取单菌落用含有30μL/mL利福平的LB液体培养基调整菌液浓度为OD600=0.6，取100μL接种于含有45μL/mL利福平的LB固体培养平板中，继代培养。在逐渐增加利福平浓度的培养基中重复传达，直至利福平浓度达到100μL/mL。
用0.9%灭菌生理盐水洗脱生长在含有100μL/mL利福平的LB固体培养平板中的菌落，制成弱毒活疫苗，备用。
五、检测上述弱毒活疫苗的免疫效果
将上述弱毒活疫苗的浓度调整至108CFU/mL，腹腔注射免疫大菱鲆，每尾注射0.1mL，对照组注射同等剂量的灭菌生理盐水。每组40尾，设置3个重复。
养殖水温17±1℃，全天充气，日换水20%，免疫28天后用杀鱼爱德华氏菌HC-27-1进行人工感染，每尾腹腔注射浓度为1.2×1010CFU/mL的杀鱼爱德华氏菌HC-27-1菌液0.1mL。每天观察并记录各实验组死亡数量，计算弱毒活疫苗的免疫保护率。
经统计，对照组平均死亡率93.26%，而经过弱毒活疫苗免疫的实验组死亡率仅为27.53%。
六、菌种保藏
由前面的研究可知，当杀鱼爱德华氏菌HC-27-1经利福平致弱后获得的弱毒活疫苗，可有效防控大菱鲆杀鱼爱德华氏菌病，并且对耐药杀鱼爱德华氏菌有免疫保护作用，对于减少抗生素类药物使用，预防耐药菌感染具有积极作用。
该杀鱼爱德华氏菌HC-27-1（Edwardsiella piscicida HC-27-1）保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏日期为2022年12月23日，保藏编号为CCTCCNO：M 20222064。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (1)
1.一株大菱鲆来源的耐药杀鱼爱德华氏菌，其特征在于，所述耐药杀鱼爱德华氏菌为杀鱼爱德华氏菌HC-27-1，分类命名为Edwardsiella piscicida，是从摄食能力减弱、行动迟缓、腹部膨大、鳍条及鳍基部充血发红、腹腔有淡黄色液体、肝脏出血发红、脾脏肿大、肠壁膨大内有液体的患病大菱鲆中筛选获得的，对大菱鲆具有致病性，携带耐药基因，耐药基因型为TEM +－ant(3")-Ⅰ +－tet(A) -－mcr-1 -－Sul2 -－Sul3 -－oqxA -，所述杀鱼爱德华氏菌HC-27-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏日期为2022年12月23日，保藏编号为CCTCC NO：M 20222064。
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