CN101985469A - 菲律宾蛤仔大防御素及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了菲律宾蛤仔大防御素及其制备方法和应用，包括从感染病菌的菲律宾蛤仔提取总RNA、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、大防御素基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤得到该大防御素，该大防御素的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；该大防御素属于一类新颖的大防御素，对海洋来源的多种革兰氏阳性和阴性病原微生物均具有很强的抑制活性，具有开发为广谱抗菌类药物、遗传选育和饲料添加剂等方面的应用价值；该菲律宾蛤仔大防御素的制备方法，通过总RNA提取、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、大防御素基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤，能得到纯度较高的重组的菲律宾蛤仔大防御素。

Description

菲律宾蛤仔大防御素及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗菌肽，具体涉及菲律宾蛤仔大防御素及其制备方法和应用。

背景技术

抗菌肽是一类广泛存在于整个生物界的双亲性小分子碱性多肽，是机体先天免疫的关键因子。根据抗菌肽的序列、二级结构和抗菌特性等，将已发现的抗菌肽分为四大类：不含半胱氨酸的线型抗菌肽，如天蚕素、马盖宁等；具有半胱氨酸的环型抗菌肽，如防御素，抗真菌肽等，可作用于革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌；富含某一种或两种氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等，主要作用于革兰氏阴性菌；由前体大分子酶解产生的抗菌肽，如肢口纲中鲎的血蓝蛋白。因此抗菌肽可以作用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，也作用于真菌、原虫、某些病毒和肿瘤细胞，同时还能加速免疫和伤口愈合过程。抗菌肽的作用机理与传统抗生素不同，它的靶位点主要是病原体细胞膜，因此不易产生抗药性，并且抗菌肽对真核细胞几乎没有毒副作用，仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。由于病原菌对抗生素逐步产生抗药性，抗菌肽作为新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景；目前国外已有4种抗菌肽药物进入                                                

期临床，2种进入期临床测试。

贝类抗菌肽的研究始于1996年，到目前为止共发现了十余种贝类抗菌肽，主要集中在贻贝(Mytilus edulis)和紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)上，如贻贝防御素(MGD)、贻贝素(mytilin)、贻贝肽(Myticin)和贻贝霉素(Mytimycin)，均为富含半胱氨酸的小分子抗菌肽，在生理pH下带正电荷。MGD分离自紫贻贝， MGD含有38个氨基酸残基，含有2个半胱氨酸；贻贝素具有8个保守的半胱氨酸残基；贻贝肽具有40个氨基酸残基；贝类霉素分离自贻贝，是一种抗真菌肽，具有12个半胱氨酸。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种菲律宾蛤仔大防御素，该菲律宾蛤仔大防御素对革兰氏阳性菌、阴性菌有效。

本发明还提供了菲律宾蛤仔大防御素的制备方法和应用，该制备方法能得到纯度较高的重组的菲律宾蛤仔大防御素，具体可以在开发抗菌药物中的得到应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：菲律宾蛤仔大防御素，包括从感染病菌的菲律宾蛤仔提取总RNA、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、大防御素基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤得到该大防御素，该大防御素的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

该大防御素具有94个氨基酸，含有6个半胱氨酸；该大防御素与目前报道的贝类大防御素具有不同结构，该大防御素缺少前域结构和GAAAVT(A)AA的N末端的疏水结构，6个半胱氨酸组成为二硫键键桥C-X6-C-X3-C-X13(14)-C-X4-C-C。

所述病菌为鳗弧菌。

菲律宾蛤仔大防御素的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

1）总RNA提取：用Trizol试剂从感染鳗弧菌的菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)的血淋巴中提取总RNA，得到RNA，存于-80℃备用；提取方法依Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行；

2）mRNA纯化：用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述RNA纯化得到mRNA，纯化方法依据QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行； 

3）cDNA模板溶液制备：用cDNA Synthesis Kit试剂盒（购于Stratagene公司）将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作方法依试剂盒说明书进行：包括双链cDNA经末端补平、EcoR I 接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切等，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒（购于QIAGEN公司）对大于100bp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR vector载体（购于Invetrogen公司）连接，得到是cDNA质粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒（购于Stratagene公司）对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定、噬菌体文库扩增，扩增后的噬菌体文库加入体积百分终浓度为7%的二甲基亚砜（DMSO），得到含大防御素基因的cDNA模板溶液，存于-80℃；具体包装、测定和扩增方法依试剂盒说明书进行；

4）基因克隆：对上述含大防御素基因的cDNA模板溶液进行PCR扩增得到PCR产物，PCR扩增的上游引物的核苷酸序列为：3’-ACCTCTACCA CTAAGGCATC G-5’，下游引物的核苷酸序列为：3’-CAAATAGCGA ATGAGTTAGG AA-5’，PCR产物用胶回收试剂盒（购于上海中科开瑞生物芯片公司）进行回收和纯化得到PCR纯化产物，将所述PCR纯化产物与pMD-18T载体（购于大连宝生生物工程有限公司）连接得到克隆质粒，克隆质粒转入大肠杆菌TOP10F感受态细胞（购于北京全氏金生物技术有限公司）中，挑选阳性克隆质粒提取，得到大防御素基因的克隆质粒； 

3’端PCR扩增的反应体系和反应条件为：10 × PCR 反应缓冲液（buffer溶液）2.5 μl、摩尔浓度为25 mM的 MgCl₂ 溶液1.0 μl、摩尔浓度为2.5 mM的dNTP溶液 2.0 μl、摩尔浓度为10 μM 的所述下游引物溶液1 μl、摩尔浓度为10 μM 的通用引物T7溶液1 μl、浓度为5 U/μl的Taq DNA聚合酶（ polymerase） 0.2 μl，所述cDNA 模板溶液1 μl，用PCR 水定容到25 μl（16.3 μl of PCR-grade water）；反应在ABI Veriti^TM（购于ABI公司）中进行，反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒， 60 ℃退火30秒, 72℃延伸60秒，共进行34个循环，最后72℃延伸10分钟；

5’端PCR扩增反应体系和反应条件为：10 × PCR反应缓冲液（buffer溶液） 2.5 μl、摩尔浓度为25 mM的 MgCl₂ 溶液1.0 μl、摩尔浓度为2.5 mM的dNTP溶液 2.0 μl、摩尔浓度为10μM 的所述上游引物溶液1 μl、摩尔浓度为10μM的通用引物T3溶液1 μl、浓度为5 U/μl的Taq DNA 聚合酶（polymerase） 0.2 μl，所述cDNA 模板溶液1 μl，用PCR 水定容到25 μl， 反应在BI Veriti^TM PCR仪中进行，反应条件为首先94℃ 预变性5 分钟，然后进入下列循环：94℃变性 30 秒, 60 ℃ 退火30 秒, 72℃延伸60秒，共进行34个循环，最后72℃延伸10分钟；

上述PCR buffer溶液、dNTP、PCR水、Taq DNA 聚合酶 均购自Promega公司，通用引物T7、通用引物T3购自上海生工科技有限公司；

5）重组质粒构建：对大防御素基因的克隆质粒进行扩增反应，扩增反应正向引物为含有Nde I酶切位点的核苷酸序列：3’-CATATGCTGT GTCTGGACCA AAAGCC-5’，其中划线上的序列表示Nde I酶切位点，反向引物为含Xho I酶切位点和 6个His纯化标签的3’-CTCGAGTTAT GGTGGTGGT GGTGGTGGTG ACGTCCTGTA ATGTG-5’ 核苷酸序列，其中前划线上的序列表示Nde I酶切位点，后划线上的序列表示6个His（TGG）纯化标签；将扩增片段纯化回收，导入pMD18-T simple（购于大连宝生生物工程有限公司）载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌TOP10感受态细胞（购于北京全式金生物技术有限公司）中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nde I和Xho I （均购于NEB公司）双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒（大连宝生生物工程有限公司）对酶切产生的目的片段纯化回收，得到编码重组蛋白的大防御素重组基因，测序该大防御素重组基因，该大防御素重组基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，将该大防御素重组基因导入经同样双酶切的表达载体pET-21a（购于Novagen公司），得到重组质粒；重组质粒构建具体依《分子克隆第三版》操作方法：扩增反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟； 

7）大防御素重组基因表达：将上述重组质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)-plysS（购于北京全式金生物技术有限公司），筛选阳性重组质粒，测序确认，挑取单克隆重组质粒，将单克隆重组质粒接种于200ml Super Optimal Broth（SOB，购于上海生工科技有限公司）培养基中，接种浓度为220rpm，37℃培养至OD600=0.5-0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使终浓度达到1mmol/ml，继续培养3 h，4℃，5000rpm，离心10min，收集菌液； 

8）重组蛋白纯化：对上述菌液超声破碎、离心、提取、GE的HisTrap螯合柱层析纯化、洗脱，得到重组蛋白，即本发明的菲律宾蛤仔大防御素，经测序，该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，具体纯化方法依蛋白纯化试剂盒的说明书操作。     

本发明的引物由上海生工科技有限公司合成。

菲律宾蛤仔大防御素在制备抗菌药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于菲律宾蛤仔大防御素，包括从感染病菌的菲律宾蛤仔提取总RNA、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、大防御素基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤得到该大防御素，该大防御素的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；该大防御素属于一类新颖的大防御素，对海洋来源的多种革兰氏阳性和阴性病原微生物均具有很强的抑制活性，具有开发为广谱抗菌类药物、遗传选育和饲料添加剂等方面的应用价值；该菲律宾蛤仔大防御素的制备方法，通过总RNA提取、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、大防御素基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤，能得到纯度较高的重组的菲律宾蛤仔大防御素。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例

菲律宾蛤仔大防御素的制备：

一、用Trizol试剂从感染鳗弧菌的菲律宾蛤仔的血淋巴中提取总RNA，得到总RNA，提取方法依Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行：取菲律宾蛤仔血细胞50ml，2000g离心10min，弃上清，向沉淀细胞中加入20ml 的TRIZOL（Invitrogen）中，用高速分散器将细胞分散，室温下剧烈震荡10秒；加入4ml氯仿，剧烈震荡30秒；4℃ 10,000g高速离心10min；吸取上清液于一个新离心管中，加入冰浴过的等体积异丙醇（约15ml），置于-20℃静置1小时以上；4℃ 10,000g高速离心10分钟；小心弃去上清液；用5ml 70%的乙醇清洗沉淀；4℃ 10,000g 高速离心10分钟，小心弃去上清液；真空干燥5分钟，用约600μl RNase-free water溶解RNA，待完全溶解后储存于-80℃备用。

二、用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA，具体纯化方法依QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行：包括在37℃水浴加热Oligotex Suspension, 震荡混匀，室温放置；70℃水浴加热OEB Buffe；向500μl总RNA溶液（RNA含量约为2mg）中加入：650 μl of OBB buffer，135 μl of Oligotex Suspension，650 μl of RNase-free water，70℃加热体系3分钟；取出反应体系后，室温下放置10分钟，15,000g 离心2分钟，小心吸走上清液，用600μl OW2重悬Oligotex-mRNA沉淀，剧烈震荡。然后将悬浊液移入放在1.5ml离心管中的spin column内，15,000g离心1分钟，将spin column 转移到一个新的1.5ml离心管中，加入600μl OW2，15,000g离心1分钟，将进入离心管的液体丢弃，将spin column转移到另一新的1.5ml离心管中；向spin column中加入50μl已经加热到70℃的OEB buffer，轻轻混匀，15,000g离心1分钟；向spin column再加入50μl OEB buffer，混匀后15,000g离心1分钟；回收离心管中的mRNA溶液约100μl。

三、用cDNA Synthesis Kit试剂盒将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作依试剂盒说明书进行：包括双链cDNA经末端补平、EcoR I 接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切等，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒对大于100bp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR vector载体连接，得到cDNA质粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定和噬菌体文库扩增，具体方法参照说明书进行，扩增后的文库加入终浓度为7%的DMSO溶液，得到cDNA模板溶液，存于-80℃备用。

逆转录方法包括一链cDNA合成：在RNase-free的200μl离心管中依次需用试剂混匀，然后加入30 μl poly(A)+ RNA (5μg)，混匀，室温下放置10分钟，使引物与模板充分退火，向体系中加入1.5μl的一链合成酶StrataScript RT(50U/μl)，终体积达到50μl，轻轻混匀反应体系，离心数秒，42℃温育1小时。二链合成：在冰上依次向含有一链cDNA的离心管中加入需用反应物反应，再向反应体系中加入2μl RNase H(1.5U/μl)，11μl DNA polymerase I(9.0U/μl)，轻轻混匀反应体系，离心数秒，16℃ 放置2.5小时后立即将反应体系置于冰上。补平cDNA末端：向二链合成体系中加入需用反应物，快速震荡反应体系离心后，于72℃反应30分钟；加入200μl 酚－氯仿[1:1 (v/v)]，震荡混匀体系，室温下高速离心2分钟，转移上清至新的离心管中；加入等体积的氯仿，震荡混匀，室温下高速离心2分钟，然后转移上清至新管中；加入下列试剂使cDNA沉淀，并震荡体系：20μl 3M sodium acetate，400μl 100% (v/v) ethanol，–20℃ 沉淀过夜；4℃高速离心60分钟，小心弃去上清，保留沉淀；加入500μl 的70%乙醇轻轻洗涤沉淀，室温高速离心2分钟；轻轻吸去乙醇，在真空离心机中干燥沉淀；用9μl 含有 EcoR I adapters 的溶液溶解沉淀并于4℃放置至少30分钟。EcoR I 接头的连接：向体系中加入下列成分：1μl 10× ligase buffer，1μl 10mM rATP，1μl T4 DNA ligase(4U/μl)，离心后8℃放置过夜；70℃ 30分钟灭活连接酶。磷酸化EcoR I末端：离心反应物2秒，室温放置5分钟冷却，加入下列反应物用于磷酸化接头：1μl 10×ligase buffer，2μl 10mM rATP，5μl sterile water，2μl T4 polynucleotide kinase(5U/μl)，37℃温育30分钟，70℃ 30分钟灭活激酶，离心2秒后室温放置5分钟冷却。Xho I内切酶酶切：向体系中加入下列成分：28μl Xho I buffer supplement，3μl Xho I(40U/μl)，37℃温育1.5小时，加入125μl 的100% (v/v)乙醇，-20℃放置过夜，4℃离心60分钟，弃去上清，完全干燥沉淀，用50μl ddH2O溶解沉淀。

cDNA片段回收方法：从浓度为1.0%的琼脂糖凝胶上将DNA带切下，将大约250mg的胶块放入1.5ml离心管中，加入相当于3倍胶块体积的Buffer QX1，将QIAEX II 剧烈震荡30秒，充分混匀，向含有胶块的Buffer QX1中加入60μl QIAEX II，50℃ 加热10分钟，溶解胶块；每2分钟震荡一次，保持溶液始终为黄色；13,000rpm离心30秒，小心吸去上清液；用500μl Buffer QX1清洗沉淀，重悬沉淀， 13,000rpm离心30秒并小心吸去上清液；用500μl PE Buffer清洗沉淀2次，重悬沉淀，13,000rpm离心30秒，弃上清液，真空干燥15分钟至沉淀变白，加入20μl pH8.5 的10mM Tris-Cl溶液室温下溶解5分钟。

cDNA与载体（Uni-ZAP XR vector，Invetrogen）连接： 在另一干净的200μl离心管中依次加入下列试剂：2.5μl resuspended cDNA(>100ng)，0.5μl 10×ligase buffer，0.5μl 10mM rATP(pH7.5)，1.0μl Uni-ZAP XR vector(1 μg)，0.5μl T4 DNA ligase (4U/μl)。12℃放置过夜。

噬菌体文库的包装：从–80℃冰箱中取出包装蛋白，迅速用手握住融化，立即加入4μl重组cDNA，用微量移液器吸头混匀体系（不要产生气泡），离心5秒，室温（22℃）温育2小时，加入500μl 的 SM buffer和20μl氯仿，轻轻混匀反应体系。快速离心数秒，沉淀蛋白碎片，转移上清至新管中。

包装反应的滴度测定：在含有氨苄青霉素的LB固体培养基（1升培养基含有氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g ，琼脂粉15g，pH7.5）上将菌株XL1-Blue MRF’划线培养，37℃过夜培养；用LB液体培养基（1升培养基含有氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，pH7.5）培养单克隆菌落，30℃，200rpm摇床培养过夜；4℃，1000g下离心10分钟沉淀细菌。用25ml 10mM MgSO4 重悬细菌；用10 mM MgSO₄ 重悬XL1-Blue MRF’ 细胞，使浓度达到OD600＝0.5；将包装产物按下列比例与宿主菌混合：（1）1μl 包装产物 + 200μl XL1-Blue MRF’ （OD₆₀₀＝0.5）；（2）0.1μl 包装产物 + 200μl XL1-Blue MRF’（OD₆₀₀＝0.5）；将混合体系置于37℃温育15分钟使噬菌体充分附着在宿主细胞表面；加入3ml融化状态下约48℃的NYZ上层培养基（1升培养基含有氯化钠5g，MgSO₄·7H₂O 2g，NZ胺10g，酵母提取物5g ，琼脂糖7g，pH7.5）；迅速铺在干燥预热过的NYZ琼脂培养基（1升培养基含有氯化钠5g，MgSO₄·7H₂O 2g，NZ胺10g，酵母提取物5g ，琼脂粉15g，pH7.5）上，静置10分钟后，倒置于37℃ 过夜培养；8小时后可见噬菌斑；分别计数两个平板的噬菌斑数目，计算其滴度（每毫升生长的噬菌斑数目，pfu/ml）。

30℃ 200rpm条件下，用LB液体培养基过夜培养XL1-Blue MRF’细胞50ml；1000g离心宿主细胞10分钟；用25ml 10 mM MgSO4 重悬细胞，测定600纳米可见光下菌液吸光度，然后用10 mM MgSO4 将菌液稀释至浓度为 OD600＝0.5；将含有大约 5×10⁴ pfu 噬菌体颗粒的悬浊液与600μl 浓度为OD600＝0.5的XL1-Blue MRF’ 细胞混合，置于Falcon  2059 聚丙烯管中，37℃温育混合液15分钟，使噬菌体充分附着在宿主菌表面；将混合液加入约48℃ 的6.5ml液态NZY上层培养基中，混匀后倒入新鲜的150mmNZY琼脂糖培养基平板上，静置平板十分钟，倒转平板置于37℃ 约8小时（噬菌斑直径不超过2mm）；在每块平板上倒入大约10ml SM 缓冲液（1升缓冲液中含有5.8g NaCl，2.0g MgSO4·7H2O，50.0ml 1M Tris-HCl[pH 7.5]，5.0 ml 2%[w/v]白明胶），4℃放置过夜；将所有平板上的SM缓冲液回收入新的聚丙烯管中，每块平板再用2ml SM缓冲液清洗一次并回收上清液；向回收液中加入终浓度为5% (v/v)的氯仿，室温下放置15分钟，混匀，500g离心10分钟去除细胞碎片，将上清液转移至新聚丙烯管中，并重复步骤8、9至上清液澄清，加入终浓度为7% (v/v) DMSO，储存于–80℃。测定扩增文库滴度（方法同前）。

四、cDNA模板溶液中大防御素基因的确认：用Exassist Helper Phage和SOLR 菌株均购于Stratagene公司）从Uni-ZAP XR Vector上体外切割pBluescript噬菌粒（进行体外切割；然后质粒cDNA的大规模提取和测序分析获得目的EST序列，对上述EST测序结果，用BLASTn和BLASTx程序分析，根据相似性分析结果寻找出大防御素基因片段。

五、对上述含大防御素基因的cDNA模板溶液进行PCR扩增得到PCR产物，PCR扩增的上游引物的核苷酸序列为：3’-ACCTCTACCA CTAAGGCATC G-5’，下游引物的核苷酸序列为：3’-CAAATAGCGA ATGAGTTAGG AA-5’，PCR产物用胶回收试剂盒进行回收和纯化得到PCR纯化产物，将所述PCR纯化产物与pMD-18T载体连接得到克隆质粒，克隆质粒转入大肠杆菌TOP10F感受态细胞中，挑选阳性克隆质粒提取，得到大防御素基因的克隆质粒； 3’端PCR扩增的反应体系和反应条件为：10 × PCR buffer溶液 2.5 μl、摩尔浓度为25 mM的 MgCl₂ 溶液1.0 μl、摩尔浓度为2.5 mM的dNTP溶液 2.0 μl、摩尔浓度为10 μM的下游引物溶液1 μl、摩尔浓度为10μM的通用引物T7溶液1 μl、浓度为5 U/μl的Taq DNA polymerase 0.2 μl， cDNA 模板（文库）溶液1 μl，用PCR 水定容到25 μl；反应在ABI Veriti^TM PCR仪中进行，反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒， 60 ℃退火30秒, 72℃延伸60秒，共进行34个循环，最后72℃延伸10分钟；5’端PCR扩增反应体系和反应条件为：10 × PCR buffer溶液 2.5 μl、摩尔浓度为25 mM的 MgCl₂ 溶液1.0 μl、摩尔浓度为2.5 mM的dNTP溶液 2.0 μl、摩尔浓度为10 pmol/μl的上游引物溶液1 μl、摩尔浓度为10 pmol/μl的通用引物T3溶液1 μl、浓度为1 U/μl的Taq DNA polymerase  0.2 μl，所述cDNA 模板溶液1 μl，用PCR 水定容到25 μl， 反应在ABI Veriti^TMPCR仪中进行，反应条件为首先94℃ 预变性5 分钟，然后进入下列循环：94℃变性 30 秒, 60 ℃ 退火30 秒, 72℃延伸60秒，共进行34个循环，最后72℃延伸10分钟；

六、对大防御素基因的克隆质粒再进行扩增反应，扩增反应正向引物为含有Nde I酶切位点的核苷酸序列：3’-CATATGCTGT GTCTGGACCA AAAGCC-5’，反向引物为含Xho I酶切位点和6个His纯化标签的核苷酸序列：3’-CTCGAGTTAT GGTGGTGGTG GTGGTGGTG ACGTCCTGTA ATGTG-5’；将扩增片段纯化回收，导入pMD18-T simple载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌TOP10感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nde I和Xho I双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒对酶切产生的目的片段纯化回收，得到编码重组蛋白的大防御素重组基因，测序该大防御素重组基因，该大防御素重组基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，将该大防御素重组基因导入经同样双酶切的表达载体pET-21a，得到重组质粒；重组质粒构建具体依《分子克隆第三版》操作方法：扩增反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟； 

七、将上述重组质粒转入表达宿主菌BL21-plysS中，筛选阳性重组质粒，测序确认，挑取单克隆重组质粒，将单克隆重组质粒接种于200ml Super Optimal Broth培养基中，接种浓度为220rpm，37℃培养至OD600=0.5-0.7，加入IPTG，使终浓度达到1mmol/ml，继续培养3 h，4℃，5000rpm，离心10min，收集菌液；

八、对上述菌液超声破碎、离心、提取、GE的HisTrap螯合柱层析纯化、洗脱，得到重组蛋白，即本发明的菲律宾蛤仔大防御素，经测序，该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；在收集的菌体沉淀，加入适量的菌体裂解液（0.5M NaCl, 5mM 咪唑, 10mM Tris.HCl pH8.0, 1mg/ml溶菌酶）重悬沉淀，向体系中加入1mg/ml的溶菌酶，室温放置半小时；超声波处理，条件为：20W，处理60次，每次2秒，间隔14秒；用15％的SDS-PAGE 分离胶电泳分析（Laemmli, 1970）上清和沉淀，Coomassie brilliant blue R-250后用凝胶成像系统照相。

应用例

将菲律宾蛤仔大防御素加入试管中制成浓度为2μg/ml抗菌肽液共9管，分别接种金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、芽孢杆菌、鳗弧菌、牙鲆肠弧菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、胆固醇氧化酶产生菌和沟肠杆菌各5ul，使每管最终菌液浓度约为5×10⁵CFU/ml，培养24小时后，利用酶标仪测定600nm的光吸收值，确定MIC值，得到如表1所示的结果，从表1中可以看出，菲律宾蛤仔大防御素对上述三种革兰氏阳性菌和上述6种革兰氏阴性菌都有效，说明本发明的菲律宾蛤仔大防御素是一种广谱抗菌肽，且疗效较好。

表1：菲律宾蛤仔大防御素抗菌素疗效表

受试菌	MIC值
		金黄色葡萄球菌	3.3μM
藤黄微球菌	>26.3μM
		芽孢杆菌	26.3μM
鳗弧菌	26.3μM
		牙鲆肠弧菌	6.6μM
恶臭假单胞菌	3.3μM
		奇异变形杆菌	>26.3μM
胆固醇氧化酶产生菌	26.3μM
		沟肠杆菌	>26.3μM

Claims (5)

1.菲律宾蛤仔大防御素，包括从感染病菌的菲律宾蛤仔提取总RNA、mRNA纯化、cDNA模板溶液制备、大防御素基因筛选、基因克隆、重组质粒构建、重组基因表达和重组蛋白纯化步骤得到该大防御素，其特征在于该大防御素的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的菲律宾蛤仔大防御素，其特征在于该菲律宾蛤仔大防御素具有94个氨基酸，含有6个半胱氨酸。

3.如权利要求1所述的菲律宾蛤仔大防御素，其特征在于所述病菌为鳗弧菌。

4.权利要求1所述的菲律宾蛤仔大防御素的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

1）总RNA提取：用Trizol试剂从感染鳗弧菌的菲律宾蛤仔的血淋巴中提取总RNA，得到总RNA，存于-80℃备用；

2）mRNA纯化：用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA； 

3）cDNA模板溶液制备：用cDNA Synthesis Kit试剂盒将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒对大于100bp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR vector载体连接，得到cDNA质粒，cDNA质粒用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit试剂盒进行噬菌体文库包装、滴度测定、噬菌体文库扩增，扩增后的噬菌体文库加入二甲基亚砜，加入的二甲基亚砜体积百分终浓度为7%，得到含大防御素基因的cDNA模板溶液，存于-80℃备用；

4）基因克隆：对上述含大防御素基因的cDNA模板溶液进行PCR扩增得到PCR产物，PCR扩增的上游引物的核苷酸序列为：3’-ACCTCTACCA CTAAGGCATC G-5’，下游引物的核苷酸序列为：3’-CAAATAGCGA ATGAGTTAGG AA-5’，PCR产物用胶回收试剂盒进行回收和纯化得到PCR纯化产物，将所述PCR纯化产物与pMD-18T载体连接得到克隆质粒，克隆质粒转入大肠杆菌TOP10F感受态细胞中，挑选阳性克隆质粒提取，得到大防御素基因的克隆质粒； 3’端PCR扩增的反应体系和反应条件为：10 × PCR 反应缓冲液 2.5 μl、摩尔浓度为25 mM的 MgCl₂ 溶液1.0 μl、摩尔浓度为2.5 mM的dNTP溶液 2.0 μl、摩尔浓度为10 μM 的所述下游引物溶液1 μl、摩尔浓度为10 μM 的通用引物T7溶液1 μl、浓度为5 U/μl的Taq DNA 聚合酶 0.2 μl，所述cDNA 模板溶液1 μl，用PCR 水定容到25 μl；反应在ABI Veriti^TM中进行，反应条件为首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒， 60 ℃退火30秒, 72℃延伸60秒，共进行34个循环，最后72℃延伸10分钟；5’端PCR扩增反应体系和反应条件为：10 × PCR 反应缓冲液 2.5 μl、摩尔浓度为25 mM的 MgCl₂ 溶液1.0 μl、摩尔浓度为2.5 mM的dNTP溶液 2.0 μl、摩尔浓度为10μM 的所述上游引物溶液1 μl、摩尔浓度为10μM的通用引物T3溶液1 μl、浓度为5 U/μl的Taq DNA 聚合酶 0.2 μl，所述cDNA 模板溶液1 μl，用PCR 水定容到25 μl， 反应在BI Veriti^TM中进行，反应条件为首先94℃ 预变性5 分钟，然后进入下列循环：94℃变性 30 秒, 60 ℃ 退火30 秒, 72℃延伸60秒，共进行34个循环，最后72℃延伸10分钟；

5）重组质粒构建：对大防御素基因的克隆质粒进行扩增反应，扩增正向引物为含有Nde I酶切位点的的核苷酸序列：3’-CATATGCTGT GTCTGGACCA AAAGCC-5’，反向引物为含有Xho I酶切位点的的核苷酸序列：3’-CTCGAGTTAT GGTGGTGGTG GTGGTGGTG ACGTCCTGTA ATGTG-5’，所述反向引物含有6个His纯化标签：TGG，将扩增片段纯化回收，导入pMD18-T simple载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌TOP10感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nde I和Xho I双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒对酶切产生的目的片段纯化回收，得到编码重组蛋白的大防御素重组基因，测序该大防御素重组基因，该大防御素重组基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，将该大防御素重组基因导入经同样双酶切的表达载体pET-21a，得到重组质粒； 

6）大防御素重组基因表达：将上述重组质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)-plysS中，筛选阳性重组质粒，测序确认，挑取单克隆重组质粒，将单克隆重组质粒接种于200ml Super Optimal Broth培养基中，接种浓度为220rpm，37℃培养至OD600=0.5-0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使终浓度达到1mmol/ml，继续培养3 h，4℃，5000rpm，离心10min，收集菌液； 

7）重组蛋白纯化：对上述菌液超声破碎、离心、提取、GE的HisTrap螯合柱层析纯化、洗脱，得到重组蛋白，即本发明的菲律宾蛤仔大防御素，经测序，该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

5.权利要求1所述的菲律宾蛤仔大防御素在制备抗菌药物中的应用。