CN111073894A - 菲律宾蛤仔ape基因片段、编码蛋白、制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种菲律宾蛤仔APE基因片段、编码蛋白、制备方法及用途，菲律宾蛤仔APE基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。编码蛋白的制备方法按如下步骤进行：提取菲律宾蛤仔总RNA；将总RNA反转录合成cDNA；c.PCR扩增目标基因：以所得到的cDNA为模板、以核苷酸序列如SEQ ID NO：3~SEQ ID NO：4所示的PCR反应引物进行PCR反应；回收纯化DNA片段，进而将纯化DNA片段转入大肠杆菌表达菌株中进行诱导培养得到菌体，而后纯化、复性即可。

Description

菲律宾蛤仔APE基因片段、编码蛋白、制备方法及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种菲律宾蛤仔APE基因片段、编码蛋白、制备方法及用途。

背景技术

微生物表达的特殊分子被称为病原体相关分子模式（PAMPs），如革兰阴性菌中的脂多糖（LPS）、革兰阳性菌中的肽聚糖（PGN）和脂磷壁酸（LTA）、酵母中的甘露聚糖、病毒中双链RNA及细菌中非甲基化CpG基序等，机体先天免疫系统依赖于模式识别蛋白（PRPs）来检测病原体相关分子模式（PAMPs）并与之发生反应。目前在动物体内发现了多种基于不同蛋白质结构域和不同PAMP特性的模式识别蛋白PRPs，包括Toll样受体（TLRs）、NOD样受体（NLRs）、清道夫受体（SRs）、C型凝集素受体（CLRs）、肽聚糖识别蛋白（PGRPs）、革兰氏阴性菌结合蛋白（PGRPs）等。黄广瑞在文昌鱼中发现了一种新型的模式识别蛋白（Apextrin，APE），该蛋白通过一个新的模式识别结构域ApeC与MDP结合。如在青岛文昌鱼（Branchiostomajaponicum）中发现的BjApextrin1 和BjApextrin2 分别作为细胞外效应PRPs和细胞内传感器PRPs识别PGN和MDP。但是，在贝类关于Apextrin基因的研究还比较少，其蛋白功能的研究尚未有报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种菲律宾蛤仔APE基因片段、编码蛋白、制备方法及用途。

本发明的技术解决方案是：一种菲律宾蛤仔APE基因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。

一种上述菲律宾蛤仔APE基因片段编码蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

一种上述菲律宾蛤仔APE基因片段编码蛋白的制备方法，依次按如下步骤进行：

a.提取菲律宾蛤仔RNA并反转录合成cDNA；

b.以所得到的cDNA为模板，进行PCR反应，所述PCR反应上下游引物

的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3 和SEQ ID NO：4所示；所述PCR反应条件是94 ℃变性5min；94 ℃变性30s、58℃退火30s、72 ℃延伸2min、进行35个循环；72 ℃延伸5min；

c.纯化回收长度为bp1600左右的扩增片段并通过连接酶与克隆载体进行

连接，转入TOP10 感受态后筛选阳性克隆，提取质粒；使用NcoI/XhoI酶切质粒，对酶切质粒产生的目的片段纯化回收；

d.将纯化回收的目的片段与经NcoI/XhoI酶切的表达载体pET-28a (+)连接

在含 30 µg/ml 卡那霉素和 34 µg/ml 氯霉素的培养基中培养菌体，当 OD 值达到0.6 时，添加 0.5 mM 诱导剂 IPTG，20℃培养过夜，离心收集细胞菌体；

e. 细胞菌体用缓冲液 C 溶解、超声破碎，离心收集上清粗蛋白；取 5 ml Ni-NTA柱，用5倍柱床体积的 Binding buffer 清洗平衡柱子，流速 5 ml/min；将粗蛋白与平衡后的柱填料孵育 1 h上柱；用 Binding buffer 清洗平衡柱子；用 Washing buffer 洗柱子后再用浓度为20 mM的Imidazole洗脱并收集洗脱液；将洗脱液透析到蛋白保存缓冲液中，所述蛋白保存缓冲液组成为50 mM Tris，300 mM NaCl，0.1% SKL，2 mM DTT，pH 8.0中，透析结束后用 PEG20000浓缩，0.45μm 滤膜过滤后保存。

一种上述菲律宾蛤仔APE基因片段编码蛋白在制备抑制革兰氏阳性菌药物中的应用。

本发明在菲律宾蛤仔基因组中获得了Apextrin（APE）基因，并通过原核重组表达和亲和层析的方法纯化出对革兰氏阳性菌具有抑制作用的菲律宾蛤仔APE原核表达蛋白（Rpape）。

附图说明

图1是本发明实施例融合蛋白镍琼脂糖亲和层析纯SDS-PAGE图。

图2是本发明实施例目的蛋白 SDS-PAGE图。

图3是本发明实施例目的蛋白Western Blot图。

图4是本发明实施例目的蛋白对枯草芽孢杆菌抑菌效果图。

图5是本发明实施例目的蛋白对金黄色葡萄球菌抑菌效果图。

图6是本发明实施例目的蛋白对鳗弧菌抑菌效果图。

图7是本发明实施例目的蛋白对革兰氏阳性菌和阴性菌生长抑制曲线图。

图8是本发明实施例不同浓度的目的蛋白对革兰氏阳性菌和阴性菌生长抑制曲线图。

具体实施方式

本发明的菲律宾蛤仔APE基因片段编码蛋白的制备方法，依次按如下步骤进行：

a.提取菲律宾蛤仔RNA并反转录合成cDNA；

b.以所得到的cDNA为模板，进行PCR反应，所述PCR反应上下游引物

的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3 和SEQ ID NO：4所示；所述PCR反应条件是94 ℃变性5min；94 ℃变性30s、58℃退火30s、72 ℃延伸2min、进行35个循环；72 ℃延伸5min；

c.纯化回收长度为bp1600左右的扩增片段并通过连接酶与克隆载体进行

连接，转入TOP10 感受态后筛选阳性克隆，提取质粒；使用NcoI/XhoI酶切质粒，对酶切质粒产生的目的片段纯化回收；

d.将纯化回收的目的片段与经NcoI/XhoI酶切的表达载体pET-28a (+)连接

在含 30 µg/ml 卡那霉素和 34 µg/ml 氯霉素的培养基中培养菌体，当 OD 值达到0.6 时，添加 0.5 mM 诱导剂 IPTG，20℃培养过夜，离心收集细胞菌体；

e. 细胞菌体用缓冲液 C 溶解、超声破碎，离心收集上清粗蛋白；取 5 ml Ni-NTA柱，用5倍柱床体积的 Binding buffer 清洗平衡柱子，流速 5 ml/min；将粗蛋白与平衡后的柱填料孵育 1 h上柱；用 Binding buffer 清洗平衡柱子；用 Washing buffer 洗柱子后再用浓度为20 mM的Imidazole洗脱并收集洗脱液；将洗脱液透析到蛋白保存缓冲液中，所述蛋白保存缓冲液组成为50 mM Tris，300 mM NaCl，0.1% SKL，2 mM DTT，pH 8.0中，透析结束后用 PEG20000浓缩，0.45μm 滤膜过滤后保存。

经测序，所得目的蛋白Rpape基因片段的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。

实验：

1.对粗蛋白、两次流出液的合并液（流出）、洗脱液分别处理、制样，SDS-PAGE检测结果如图1所示。

图1中M：Protein marker；1：上样；2：流出；3：20 mM Imidazole 洗脱组分；4：50mM Imidazole 洗脱组分；5：500 mM Imidazole 洗脱组分。

结果表明：20 mM Imidazole 洗脱组分可得到纯化的目的蛋白（65kDa左右）。

2. 目的蛋白SDS-PAGE检测结果如图2所示。

图2中M：Protein marker (Cat. No.: C600525)；1：目的蛋白。

结果表明在理论分子量±5 kDa 相应位置出现明显条带，可初步确定融合蛋白成功得到了纯化。

3. 对蛋白样品进行处理、制样，用 TMB 显色试剂盒显色，使用 His 标签抗体进行Western Blot 验证，结果如图3所示。

图3中M：Protein marker (Cat. No.: C610013)；1：目的蛋白。

结果显示在相应位置出现明显条带，表明该蛋白为目的蛋白。

4. 目的蛋白Rpape的对不同微生物的抑菌活性测试：

4.1测定目的蛋白Rpape对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）和革兰氏阴性菌（鳗弧菌，副溶血弧菌，灿烂弧菌和大肠杆菌）的抑菌活性。所述菌的来源如下：

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CICC 10275

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ) CICC 21600

鳗弧菌（Vibrio anguillarum）CICC 10475

副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）CICC 21617

灿烂弧菌 （Vibrio splendidus）BNCC165178

大肠杆菌 （Escherichia coli）CICC 10662

实验采用预加菌液倾注平板法：往已冷却至40℃左右的固体LB培养基（15 ml）中加入3µl对数生长期的菌液，混合均匀，倾注平板，水平静置凝固后，在培养皿上用打孔器均匀打出4个直径为6 mm孔。分别加入30µl稀释后的蛋白Rpape（2.5 µg/ml和1 µg/ml），阴性对照（rTRX（1µg/ml），PBS）及氨苄青霉素阳性对照。37℃培养16小时，孔周围的透明环直径表示抗菌活性。对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及鳗弧菌的抑制结果分别如图4、5、6所示。

在相应的氨苄青霉素阳性对照孔周围观察到较大的区域，这些区域是抑菌圈，阴性对照中并无此区域，且在金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌培养基中均观察到两种浓度Rpape孔周围有透明的圆形区域且低浓度孔直径小于高浓度孔。但是在鳗弧菌中ape蛋白孔周围没有明显抑菌圈。结果表明目的蛋白Rpape对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌（均为革兰氏阳性菌）具有抑制作用，且对枯草芽孢杆菌抑制作用强于金黄色葡萄球菌，对革兰氏阴性菌无明显抑制作用。

4.2目的蛋白Rpape对（金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）和革兰氏阴性菌（鳗弧菌，副溶血弧菌，灿烂弧菌和大肠杆菌）的生长抑制活性。取对数生长期的菌液1µl，稀释10倍后加入1µl至新的LB培养液（1ml）中，加入终浓度分别为0，5，20，100 μg /ml的目的蛋白Rpape。在37°C，200 rpm下培养，然后每1 h测定OD ₆₀₀，分3个样品进行分析独立实验。

目的蛋白Rpape相同浓度（20 μg/ml）对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）和革兰氏阴性菌（鳗弧菌，副溶血弧菌，灿烂弧菌和大肠杆菌）生长抑制曲线分别如图7所示。图7分别为副溶血弧菌，大肠杆菌，灿烂弧菌，枯草芽孢杆菌，鳗弧菌，金黄色葡萄球菌的抑制曲线图。

结果表明目的蛋白Rpape（20μg/ml）对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌（革兰氏阳性菌）具有明显抑制作用，而对鳗弧菌，副溶血弧菌，灿烂弧菌和大肠杆菌（革兰氏阳性菌）均无明显抑制作用。

目的蛋白Rpape不同浓度下（0，5，20和100 μg/ml），对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和鳗弧菌生长抑制曲线分别如图8所示。图8中A、B、C分别为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、鳗弧菌的抑制曲线图。

结果表明5，20和100 μg/ml的目的蛋白Rpape对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均具有较明显抑制作用，其中100 μg/ml蛋白对菌的抑制效果最为明显，在0~10h内OD600始终保持在0.01以下，20 μg/ml蛋白浓度下0~9h金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌OD600均小于0.01，而在9~10h OD600稍有增长；在蛋白浓度在5μg/ml 时0~8h内金黄色葡萄球菌OD600基本没有变化，在8~12h OD600开始增长，在蛋白浓度在5 μg/ml 时，枯草芽孢杆菌在0~5hOD600无明显变化，在5h后开始增长。结果表明：低浓度目的蛋白Rpape对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用明显低于高浓度目的蛋白Rpape，且在100 μg/ml时抑制效果最好。

序列表

<110> 大连海洋大学

<120> 菲律宾蛤仔APE基因片段、编码蛋白、制备方法及用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2128

<212> DNA

<213> 菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)

<400> 1

atgcggtcgg ttagtatatg tgcgtgtgta tgtttacaca ttgctgtcag ctatgccgct 60

tcactgccgg aagcccttca ctacattggc gtcggatata acatgcttcg aggaaatccc 120

gacggtgact tttgggcatc tggcggagat gacccaggct tgttgagtac caggaagatt 180

ctgtccctgt caagttatga ccaagtgcca gccgaacttg tttacgagca ccatgatcaa 240

tgcagaaatg cgcacgaatt ctcattcttc agcgatcaaa aatcatacca gaacaaactc 300

cttgaaagag tacagtcatc aggcactaac aatgatgttc tccttgacaa agcatttacc 360

atgagtaacg gatataaagc aattgatcaa cagacacgcc gagactttta cgtattccaa 420

gatgatcaga atacatgcac atccggaagc gctcgttaca agcttggact cgcacagggc 480

aaccattaca aactctccga cgagttcgtc gctgccgtat gcaaactccc tatcacatat 540

gatcaagcca tcttcaagca attcttagat acatggggca ctcatgtcac aacagcagtt 600

gagactggaa gtaagacagt caatcgttac atgtgcccac tcaaggactt tgtagaacaa 660

gttatgaaca cctcttcgag agacgtcact ttgggcggaa cttggatgaa ccacgcttct 720

tcattggtcg ttgatattaa cgcctaccga tacagacaac aatacagaaa tacatgtgga 780

tctattcaag ataccctttc tcttggaagt gagcagttcc ctgaaccaat tggttattca 840

atggtcgtaa tctctgacat gcttgactct gctcaatggc agaacatgga tgattacaag 900

aagagaggtc tttgtccacc aagtgaggag gccgcgttga cataccaaag aaagaatctt 960

gaaaaagcta taactgaata ccctggtctc ctcggtgcta aatcccctat ctcaaaccca 1020

gtagccattc cagtaacctg gccaatggga acttactccc tgcctaagcc aaagaacggg 1080

tgcccagccg gtgacttcac atggtatgag ggatggagaa tgcaggacac tgaaacccaa 1140

tcaccagaca acgcctggtc catcaacaac cactttgcag gaaaacttga agtaggcgca 1200

ttccagttgg aatactgcac aaagggagag aaaagcccaa cagactttga cagacattgg 1260

ccaaacggag attattgtat ctttaaatat ggcgactgtc cagctgactt tgctgaagga 1320

tacgttaagt gggatgatga agacagtgta aacagaaatg actggcaggg acttcttcca 1380

gacggtgttt atgatgaaga cactctacag agattctgtt gcagatccga tggccttcca 1440

actgagccaa taattttacc aacagacaga cctttctact tattccaata caagagagac 1500

gtttgccaga aggtcgcaaa catgaaggta tccgaagaat ggcttcgatt cgatgatgaa 1560

gatttcaaaa ctccaagcaa ctctgaactc ggagctgtac atcccggaat ggaattctgg 1620

aacgaggcta ctggcgctag tggaagcgaa gtgtactact gctactacga accacaaaca 1680

aagaaataaa tctcaattat tttaggatct tatcacagtt atttcatata gaacttttta 1740

caatcattta tttgtcattt tctgtatgag aagccatatt tacaaaacaa aatgtttcac 1800

ctttatagtg ggtttgcaag gtcacattta atatatgtaa ttagcacata caatcattgg 1860

acaaattcat ttcgatttca aaaataaaag gtcaattaac ttattctgta tctctgtgta 1920

tttcatgtaa gtagtttaaa agtgtagccg tctgttcgat aagcaatttc gatggcggaa 1980

gtgaaagaga tttacaagca tctacaggaa gcgcgtggat ctctttgact tccgttaacc 2040

gtaatgtacg tgtatgtcat gtttacacac gtcttttgtg tgtctacctt agttatattt 2100

gtgatttaca ataaaaaggt taatacac 2128

<210> 2

<211> 553

<212> PRT

<213> 菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)

<400> 2

Met Gly Ala Ser Leu Pro Glu Ala Leu His Tyr Ile Gly Val Gly Tyr

1 5 10 15

Asn Met Leu Arg Gly Asn Pro Asp Gly Asp Phe Trp Ala Ser Gly Gly

20 25 30

Asp Asp Pro Gly Leu Leu Ser Thr Arg Lys Ile Leu Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Tyr Asp Gln Val Pro Ala Glu Leu Val Tyr Glu His His Asp Gln Cys

50 55 60

Arg Asn Ala His Glu Phe Ser Phe Phe Ser Asp Gln Lys Ser Tyr Gln

65 70 75 80

Asn Lys Leu Leu Glu Arg Val Gln Ser Ser Gly Thr Asn Asn Asp Val

85 90 95

Leu Leu Asp Lys Ala Phe Thr Met Ser Asn Gly Tyr Lys Ala Ile Asp

100 105 110

Gln Gln Thr Arg Arg Asp Phe Tyr Val Phe Gln Asp Asp Gln Asn Thr

115 120 125

Cys Thr Ser Gly Ser Ala Arg Tyr Lys Leu Gly Leu Ser Gln Gly Asn

130 135 140

His Tyr Lys Leu Ser Asp Glu Phe Val Ala Ala Val Cys Lys Leu Pro

145 150 155 160

Ile Thr Tyr Asp Gln Ala Ile Phe Lys Gln Phe Leu Asp Thr Trp Gly

165 170 175

Thr His Val Thr Thr Ala Val Glu Thr Gly Ser Lys Thr Val Asn Arg

180 185 190

Tyr Met Cys Pro Leu Lys Asp Phe Val Glu Gln Val Met Asn Thr Ser

195 200 205

Ser Arg Asp Val Thr Leu Gly Gly Ala Trp Met Asn His Ala Ala Ser

210 215 220

Leu Val Val Asp Ile Asn Ala Tyr Arg Tyr Arg Gln Gln Tyr Arg Asn

225 230 235 240

Thr Cys Gly Ser Ile Gln Asp Thr Leu Ser Leu Gly Ser Glu Gln Phe

245 250 255

Pro Glu Pro Ile Gly Tyr Ser Met Val Val Ile Ser Asp Met Leu Asp

260 265 270

Ser Ala Gln Trp Gln Asn Met Asp Asp Tyr Lys Lys Arg Gly Leu Cys

275 280 285

Pro Pro Ser Glu Glu Ala Ala Leu Thr Tyr Gln Arg Lys Asn Leu Glu

290 295 300

Lys Ala Ile Thr Glu Tyr Pro Gly Leu Leu Gly Ala Lys Ser Pro Ile

305 310 315 320

Ser Asn Pro Val Ala Ile Pro Val Thr Trp Pro Met Gly Thr Tyr Ser

325 330 335

Leu Pro Lys Pro Lys Asn Gly Cys Pro Ala Gly Asp Phe Thr Trp Tyr

340 345 350

Glu Gly Trp Arg Met Gln Asp Thr Glu Thr Gln Ser Pro Asp Asn Ala

355 360 365

Trp Ser Ile Asn Asn His Phe Ala Gly Lys Leu Glu Val Gly Ala Phe

370 375 380

Gln Leu Glu Tyr Cys Thr Lys Gly Glu Lys Ser Pro Thr Asp Phe Asp

385 390 395 400

Arg His Trp Pro Asn Gly Asp Tyr Cys Ile Phe Lys Tyr Gly Asp Cys

405 410 415

Pro Ala Asp Phe Ala Glu Gly Tyr Val Lys Trp Asp Asp Glu Asp Ser

420 425 430

Val Asn Arg Asn Asp Trp Gln Gly Leu Leu Pro Asp Gly Val Tyr Asp

435 440 445

Glu Asp Thr Leu Gln Arg Phe Cys Cys Arg Ser Asp Gly Leu Pro Thr

450 455 460

Glu Pro Ile Ile Leu Pro Thr Asp Arg Pro Phe Tyr Leu Phe Gln Tyr

465 470 475 480

Lys Arg Asp Val Cys Gln Lys Val Ala Asn Met Lys Val Ser Glu Glu

485 490 495

Trp Leu Arg Phe Asp Asp Glu Asp Phe Lys Thr Pro Ser Asn Ser Glu

500 505 510

Leu Gly Ala Val His Pro Gly Met Glu Phe Trp Asn Glu Pro Thr Gly

515 520 525

Ala Ser Gly Ser Glu Val Tyr Tyr Cys Tyr Tyr Glu Pro Gln Thr Lys

530 535 540

Lys Leu Glu His His His His His His

545 550

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> exon

<222> (1 )..(32)

<223> 引物

<400> 3

catgccatgg catggcttca ctgccggaag cc 32

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<221> exon

<222> (1 )..(31)

<223> 引物

<400> 4

ccctcgaggg tttctttgtt tgtggttcgt a 31

Claims (4)

1. 一种菲律宾蛤仔APE基因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。

2.一种如权利要求1所述菲律宾蛤仔APE基因片段编码蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种如权利要求2所述菲律宾蛤仔APE基因片段编码蛋白的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

提取菲律宾蛤仔RNA并反转录合成cDNA；

以所得到的cDNA为模板，进行PCR反应，所述PCR反应上下游引物

的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3 和SEQ ID NO：4所示；所述PCR反应条件是94 ℃ 变性5min；94 ℃变性30s、58℃退火30s、72 ℃延伸2min、进行35个循环；72 ℃延伸5min；

纯化回收长度为bp1600左右的扩增片段并通过连接酶与克隆载体进行

连接，转入TOP10 感受态后筛选阳性克隆，提取质粒；使用NcoI/XhoI酶切质粒，对酶切质粒产生的目的片段纯化回收；

将纯化回收的目的片段与经NcoI/XhoI酶切的表达载体pET-28a (+)连接

在含 30 µg/ml 卡那霉素和 34 µg/ml 氯霉素的培养基中培养菌体，当 OD 值达到0.6 时，添加 0.5 mM 诱导剂 IPTG，20℃培养过夜，离心收集细胞菌体；

e. 细胞菌体用缓冲液 C 溶解、超声破碎，离心收集上清粗蛋白；取 5 ml Ni-NTA柱，用5倍柱床体积的 Binding buffer 清洗平衡柱子，流速 5 ml/min；将粗蛋白与平衡后的柱填料孵育 1 h上柱；用 Binding buffer 清洗平衡柱子；用 Washing buffer 洗柱子后再用浓度为20 mM的Imidazole洗脱并收集洗脱液；将洗脱液透析到蛋白保存缓冲液中，所述蛋白保存缓冲液组成为50 mM Tris，300 mM NaCl，0.1% SKL，2 mM DTT，pH 8.0中，透析结束后用 PEG20000浓缩，0.45μm 滤膜过滤后保存。

4.一种如权利要求1所述菲律宾蛤仔APE基因片段编码蛋白在制备抑制革兰氏阳性菌药物中的应用。

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