CN102321628B

CN102321628B - 一种克氏原螯虾c-型凝集素基因及制备方法和应用

Info

Publication number: CN102321628B
Application number: CN2011102179370A
Authority: CN
Inventors: 孟小林; 徐进平; 王健; 张清涛
Original assignee: WUHAN KAITAILAI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: HUBEI TAIYANGHONG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2011-08-01
Filing date: 2011-08-01
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2031-08-01
Also published as: CN102321628A

Abstract

本发明公开了一种克氏原螯虾C-型凝集素基因及制备方法和应用，步骤是：A、总RNA的提取；B、cDNA第一链的合成；C、部分核苷酸序列的获得；D、3’-RACE：3’端核苷酸序列的获得；E、5’-RACE：5’端核苷酸序列的获得；F、基因完整核苷酸序列的获得；G、C-型凝集素基因所编码的蛋白质的氨基酸序列。从克氏原螯虾中克隆到C-型凝集素基因。将该基因克隆入pET-28a载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出重组蛋白mClec，纯化的mClec对多种细菌及兔红细胞表现凝集作用。该蛋白mClec，或将凝集素基因克隆原核表达载体获得的重组凝集素，可用于生产虾类和鱼类抗病毒、抗细菌药物。

Description

一种克氏原螯虾C-型凝集素基因及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，更具体涉及一种克氏原螯虾C-型凝集素基因，同时还涉及一种克氏原螯虾C-型凝集素基的制备方法，还涉及一种克氏原螯虾C-型凝集素基因(Pc-Clec)及其编码的C-型凝集素多肽的用途。该C-型凝集素多肽制备方法具体涉及将C-型凝集素基因克隆入一种原核表达载体pET8a及转化入原核表达宿主BL21(DE3)，通过诱导表达纯化获得具有凝集功能的重组C-型凝集素多肽。本发明还涉及该重组C-型凝集素多肽对多种细菌及兔红细胞表现出凝集作用。

背景技术

无脊椎动物缺乏获得性免疫系统，完全依赖于先天免疫系统抵抗入侵病原体，包括一系列的细胞与体液免疫反应[Loker ES，Adema CM，et al.Invertebrate immune systems-nothomogeneous，not simple，not well understood.Immunol Rev 2004；198：10-24.]。作为无脊椎动物抵抗病原体入侵的一线防御屏障，先天免疫系统由模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)组成。在先天免疫系统中，PRRs介导识别“非己”物质，与入侵病原体表面的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)结合，启动一系列免疫反应，激活宿主防御系统[Lou T，Yang HJ，et al.Purification，characterization and cDNA cloning of anovel lipopolysaccharide-binding lectin from the shrimp Penaeus monodon.Developmental andComparative Immunology，2006；30：607-617.]。PRRs包括凝集素(lectin)、脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide(LPS)-binding proteins)、抗脂多糖因子(anti-LPS factors，ALF)、肽聚糖结合蛋白(peptidoglycan-binding proteins)和β-1，3-葡聚糖结合蛋白(β-1，3-glucan-binding proteins)等等。

其中，凝集素是PRRs的典型代表，为无催化活性、能与细胞表面不同糖类分子特异结合的蛋白或糖蛋白[Marques MRF，Barracco MA.Lectins，as non-self-recognition factors，incrustaceans.Aquaculture，2000，191；23-44.]，普遍存在于各种生物中，在无脊椎动物免疫系统中起关键作用，具体表现在识别“非己”物质与清除入侵物质[Dodd RB，Drickamer K.Lectin-like proteins in model organisms：implications for evolution of carbohydrate-bindingactivity.Glycobiology，2001；11：71R-9R；Vasta GR，Ahmed H，etc.Structural and functionaldiversity of lectin repertoires in invertebrates，protochordates and ectothermic vertebrates.CurrOpin Struct Biol，2004；14：617-30.]。许多凝集素已被鉴定、报道，它们来自各种生物，包括昆虫、软体动物、棘皮动物、放线菌等等。

根据凝集素结构与功能，可分为钙联结蛋白、C-、L-、P-、I-、R-和S-型凝集素这几种[Janeway Jr CA，Medzhitov R.Innate immune recognition.Annu Rev Immunol，2002，20：197-216]。C-型凝集素(C-type lectins，CTLs)，即钙依赖型凝集素(calcium-dependentlectins)，是被深入研究的主要凝集素之一，均具有相同的结构特点，如糖类识别域(carbohydrate recognition domain，CRD)、二硫键位置和钙结合位点[Weis WL，Taylor ME，Drickamer K.The C-type lectin superfamily in the immune system.Immunol Rev，1998，163：19-34.]，为无脊椎动物免疫系统的重要组成部分，不仅介导识别病原体，而且参与多种生物反应，包括结节形成[Koizumi N，Imamura M，etc.The lipopolysaccharide-bindingprotein participating in hemocyte nodule formation in the silkworm Bombyx mori is a novelmember of the C-type lectin superfamily with two different tandem carbohydrate-recognitiondomains.FEBS Lett 1999；443：139-143.]、胶囊化、黑化[Yu XQ，Gan H，Kanost MR.Immulectin，an inducible C-type lectin from an insect，Manduca sexta，stimulates activation of plasmaprophenol oxidase.Insect Biochem Mol Biol 1999；29：585-97]、促进吞噬[Jomori T，Natori S.Function of the lipopolysaccharide-binding protein of Periplaneta americana as an opsonin.FEBSLett.1992；296：283-286]、激活酚氧化酶原系统(prophenoloxidase system)[Yu XQ，Gan H，Kanost MR.Immulectin，an inducible C-type lectin from an insect，Manduca sexta，stimulatesactivation of plasma prophenol oxidase.Insect Biochem Mol Biol 1999；29：585-97.]、细胞粘附与聚集[Olafsen JA，Fletcher TC，etc.Agglutinin activity in Pacific oyster(Crassostrea gigas)hemolymph following in vivo Vibrio anguillarum challenge.Dev Comp Immunol，1992，16：123-138：Odintsova NA，Belogortseva NI，etc.Effect of lectin from the ascidian on the growthand the adhesion of Hela cells.Mol Cell Biochem，2001，221：133-138]。此外，还有利于各种免疫反应，包括清除细菌[Wang XW，Zhang XW，etc.A novel C-type lectin(FcLec4)facilitates theclearance of Vibrio anguillarum in vivo in Chinese white shrimp.Dev Comp Immunol2009；33：1039-1047]、抗菌活性Sun YD，Fu LD，etc.A hepatopancreas specific C-type lectinfrom the Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis exhibits antimicrobial activity.Mol Immunol2008；45：348-361.]、抗病毒感染[Zhao ZY，Yin ZX，etc.A novel C-type lectin from the shrimpLitopenaeus vannamei possesses anti-white spot syndrome virus activity.J Virol.2009；83(1)：347-56.]与抗真菌[Willment JA，Brown GD.C-type lectin receptors in antifungalimmunity.Trends Microbiol 2008；16：27-32.]。已从十足类甲壳纲动物中分离得到许多凝集素，它们均与疾病反应相关[Pereyra A，Zenteno R，etc.Characterization of lectin aggregates in thehemolymph of freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii.Biochim.Biophys.Acta 2004，67：122-130.]。尤其在对虾中，多种CTLs已被成功克隆并开展了广泛、深入的功能研究，结果表明：它们能与N-乙酰葡萄糖胺、脂多糖特异结合，凝集红细胞，呈现出多种多样的生物活性。虽然CTLs在先天免疫系统中扮演着抵御病原体入侵的角色，但来自不同对虾的CTLs在结构、组织特异性表达、生物活性各方面却千差万别，如分离自斑节对虾(Penaeus monodon)的PmLT、PmAV及脂多糖结合凝集素，PmLT与PmAV只有一个CRD，脂多糖结合凝集素特异表达于肝胰腺中[Ma TH，Benzie JA，etc.PmLT，a C-type lectin specific to hepatopancreas isinvolved in the innate defense of the shrimp Penaeus Monodon.J Invertebr Pathol，2008，99：332-341；Luo T，Zhang X，Shao Z，et al.PmAV，a novel gene involved in virus resistanceof shrimp Penaeus monodon.FEBS Lett.，2003，551：53-57]。在日本对虾(Penaeus japonicus)中，分离出N-乙酰糖胺特异凝集素(N-acetyglucosamin(GlcNAc)-specific lectin)、PjLec两种[Kondo M，Matsuyama H，Yano T.The opsonic effect of lectin on phagocytosis by hemocytes ofKuruma Prawn，Penaeus japonicus.Fish Pathol，1992，27：217-222；Yang HJ，Luo T，Li F，et al.Purification and characterization of a calcium-independent lectin(PjLec)from the haemolymph ofthe shrimp Penaeus japonicus.Fish Shellfish Immunol.，2007，22：88-97.]。凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中分离出LvCTL、LvLec、LvCTL1三种，LvCTL只存在肝胰腺中，具有2个CRD，LvLec是血清中的一种天然凝集素，LvCTL1在抗病毒对虾中呈大量表达，能凝集细菌，结合白斑综合症病毒(WSSV)的囊膜蛋白VP95、VP28、VP26等，提高对虾血细胞及对虾抗WSSV能力[Ma THT，Tiu SHK，et al.Molecular cloning of a C-type lectin(LvCTL)from the shrimp Litopenaeus vannamei：early gene down-regulation after WSSVinfection.Fish Shellfish Immunol.2007；23：430-437.；Sun J，Wan L，et al.Purification andcharacterization of a natural lectin from the serum of the shrimp Litopenaeus vannamei.FishShellfish Immunol.，2007，23(2)：292-299；Zhao ZY，Yin ZX，et al.A novel C-type lectin from theshrimp Litopenaeus vannamei possesses anti-white spot syndrome virus activity.J Virol，2009，83(1)：347-6-356.]。中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)含丰富的CTLs，现已分离鉴定出6种，依次是Fclectin(FcCLec-1)、Fc-hsL(FcCLec-2)、FC-L、FcLec-3、FcLec-4、FcLec-5，FcCLec-1具有双CRD，在血淋巴细胞中表达[Liu YC，Li FH，Dong B，et al.Molecular cloning，characterization and expression analysis of a putative C-type lectin(Fclectin)gene in Chineseshrimp Fenneropenaeus chinensis.Mol.Immunol.，2007，44：598-607.]；FcCLec-2只含一个CRD，在肝胰腺中表达[Sun YD，Fu LD，Jia YP，et al.A hepatopancreas-specific C-type lectin fromthe Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis exhibits antimicrobial activity Mol.Immunol.，2008，45：348-361.]；FC-L，一种对虾血浆天然凝集素，能与对虾致病性G一菌结合[Sun J，Wang L，Wang B，et al.Purification and characterization of a natural lectin from the plasma of theshrimp Fenneropenaeus chinensis.Fish Shellfish Immunol，2008，25(3)：290-297]；Fclec-3含有N端信号肽和一个CRD，能与WSSV病毒的囊膜蛋白VP28相互作用[Wang XW，Xu WT，et al.A C-type lectin is involved in the innate immune response of Chinese white shrimp.Fish ShellfishImmunol 2009；27(4)：556-562.]；Fclec-4能与鳗弧菌(Vibrio anguillarum)紧密结合，易化体内细菌清除[Wang XW，Zhang XW，XuWT，Zhao XF，Wang JX.A novel C-type lectin(FcLec4)facilitates the clearance of Vibrio anguillarum in vivo in Chinese white shrimp.Dev CompImmunol 2009；33(9)：1039e47]；Fclec-5是最近报道的一种CTLs，含信号肽与2个CRD，能直接与细菌细胞壁的肽聚糖、脂多糖与脂磷壁酸结合，在先天免疫系统中起重要作用[Xu WT，Wang XW，Zhang XW，et al.A new C-type lectin(FcLec5)from the Chinese white shrimpFenneropenaeus chinensis.Amino Acids，2010，39(5)：1227-1239.]。在日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)中，用WSSV囊膜蛋白筛选噬菌体呈现文库(phage display library)，发现MjLecA、MjLecB、MjLecC三种凝集素可与WSSV相互作用，阻断WSSV对日本囊对虾血细胞的结合作用，具有广泛、独特的糖类结合谱，能凝集多种G一与G+菌[Song KK，Li DF，Zhang MC，et al.Cloning and characterization of three novel WSSV recognizing lectins from shrimpMarsupenaeus japonicus.Fish Shellfish Immunol.，2010，28(4)：596-603.]。前不久，在墨吉明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)中，从肝胰腺克隆出CTLs基因FmLC，其含有2个CRD，一个CRD由一个QPD模序与一个钙离子结合位点构成，QPD模序与半乳糖特异结合，另一个CRD由一个EPN模序构成，EPN模序是甘露糖特异结合位点；FmLC特异表达于肝胰腺中，其他组织中无表达，哈氏弧菌(Vibrio harveyi)能上调其表达[Rattanaporn O，UtarabhandP.Molecular cloning of a C-type lectin with two CRD domains from the banana shrimp：earlygene up-regulation after Vibrio harveyi infection.J Invertebr Pathol，2011，106(2)：196-204.]。

而且，许多编码凝集素的表达序列标签(expressed-sequence tags，ESTs)已从日本对虾、白滨对虾(Litopenaeus setiferus)、凡纳滨对虾健康虾的cDNA文库中鉴定出来，它们是重要免疫器官肝胰腺中最大的免疫相关ESTs[Gross PS，Bartlett TC，et al.Immune gene discoveryby expressed sequence tag analysis of hemocytes and hepatopancreas in the Pacific White Shrimp，Litopenaeus vannamei，and the Atlantic White Shrimp，L.setiferus.Dev.Comp.Immunol.2001，25：565-577；Astrofsky KM，Roux MM，et al.Isolation of differentially expressed genesfrom white spot virus(WSV)infected Pacific blue shrimp(Penaeus stylirostris).Arch.Virol.2002，147：1799-1812.]，同时，部分编码CTLs的cDNA也从感染WSSV与健康的凡纳滨对虾中获得，筛选出1000多个合格的ESTs，与病毒易感虾相比较，病毒抵抗虾中编码CTLs的ESTs明显地被上调[Zhao ZY，Yin ZX，et al.Profiling of differentially expressed genes inhepatopancreas of white spot syndrome virus-resistant shrimp(Litopenaeus vannamei)bysuppression subtractive hybridization.Fish Shellfish Immunol.，2007，22：520-534.]。对于克氏原螯虾(Procambarus clakii)，已建立了WSSV感染虾的cDNA文库，鉴定出多个编码CTLs的ESTs[Shi XZ，Li XC，et al..Transcriptome analysis of hemocytes and hepatopancreas in redswamp crayfish，Procambarus clarkii，challenged with white spot syndrome virus.InvertebrateSurvival Journal，2010，7：119-131；Zeng Y，Lu CP.Identification of differentially expressed genesin haemocytes of the crayfish(Procambarus clarkii)infected with white spot syndrome virus bysuppression subtractive hybridization and cDNA microarrays.Fish Shellfish Immunol.2009，26(4)：646-650.]。目前，关于克氏原螯虾CTLs(Pc-CTLs)的研究报道很少，总的来说，只有2种Pc-CTLs被鉴定、研究，它们是Pc-Lec1与WJX，关于Pc-Lec1的研究已被报道，在各种正常虾组织中，尤其是肝胰腺与鳃中，Pc-Lec1为构成性表达，被当受到鳗弧菌、金葡菌或WSSV攻击时，肝胰腺与鳃中的Pc-Lec1表达可被上调，Pc-Lec1能与肽聚糖、脂膜酸与脂多糖结合，但不能凝集细菌，可促进体内清除鳗弧菌，起调理功能[Zhang XW，WangXW，Sun C，Zhao XF，Wang JX.C-type lectin from red swamp crayfish Procambarus clarkiiparticipates in cellular immune response.Arch Insect Biochem Physiol.2011，76(3)：168-84]；另一Pc-CTLs，即WJX，其cDNA序列被注册(GenBank Accession NO.HM005300.1)，但无相关研究报道。

上述研究表明，CTLs是先天性免疫系统的重要组成部分，在免疫反应、疾病反应及生物反应方面具有重要作用，能清除入侵病原体与病毒、激活酚氧化酶原系统、促进吞噬、结节形成、胶囊化、黑化、细胞粘附与聚集，调理各种生物反应。甲壳类动物，尤其是对虾，是水产业重要的经济物种，具有重大的商业价值，严重影响着水生生物的生态平衡。由于缺乏获得性免疫系统，只能完全依赖于先天性免疫系统抵御病原体入侵，CTLs的作用尤显重要。近年来，由于WSSV的流行感染，水产业严重受创，损失巨大，使WSSV的研究刻不容缓，但无对虾细胞系，且对虾价格昂贵，不易饲养，相关研究难以开展。克氏原螯虾，与对虾的亲缘关系很近，都是开放性的体内系统，体内存在一些非致病菌或条件致病菌，在疾病状态下都存在并发感染和继发感染的可能性，是对虾病毒、药物筛选和免疫反应研究的理想模式动物[朱建中，陆承平.对虾白斑综合征病毒在螯虾动物模型的感染特性[J].水产学报，2001，25(1)：47-51；朱建中，陆承平.用动物模型检验消毒剂对对虾白斑综合征病毒的灭活效果[J].中国兽药杂志，2001，35(2)：6-7].。

开展克氏原螯虾CTLs的研究，有助于深入了解甲壳类动物先天免疫功能及其调节机制，对免疫学研究的完整性和学科发展具有重要意义，同时可更系统、更全面地掌握各种疾病病情，为经济水产动物养殖中的的病害防治提供切实可行、有效的方法与措施。因此，进行克氏原螯虾CTLs的研究具有重要的理论和实际应用意义。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种克氏原螯虾C-型凝集素基因，该基因有利于各种免疫反应，包括清除细菌、抗菌活性、抗病毒感染、与抗真菌。

本发明的另一个目的是在于提供了一种克氏原螯虾C-型凝集素基因的制备方法，通过该方法可在知道基因部分核苷酸序列的情况下，快速而有效获得该基因的完整核苷酸序列。一种克氏原螯虾C-型凝集素基因的克隆方法及一种能表达该C-型凝集素的原核表达菌株，同时提供该菌株所表达的重组C-型凝集素蛋白的纯化与凝集素的凝集功能的鉴定。本发明所得到的重组C-型凝集素蛋白对多种细菌及兔红细胞均表现出凝集作用。

本发明的再一个目的是在于所提供了一种克氏原螯虾C-型凝集素基因在制备治疗或预防虾类、鱼类养殖病虫害药物中的应用。C型凝集素作为无脊椎动物免疫系统的重要组成部分，不仅介导识别病原体，而且参与多种生物反应，包括结节形成、胶囊化、黑化、促进吞噬、激活酚氧化酶原系统、细胞粘附与聚集，还有利于各种免疫反应，包括清除细菌、抗菌活性、抗病毒感染、与抗真菌。除了本发明中的原核表达系统BL21(DE3)，该克氏原螯虾C-型凝集素基因还可用于其他原核表达系统或真核表达系统及基因转移系统，为水产养殖中病害防治和进一步开发可用于生产虾类和鱼类抗病毒、抗细菌药物奠定基础。

本发明从克氏原螯虾中克隆到了一种C-型凝集素基因(Pc-Clec)，其具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列及SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。

本发明获得的重组克氏原螯虾C-型凝集素蛋白对多种细菌及兔红细胞具有凝集作用。

C型凝集素为无脊椎动物免疫系统的重要组成部分，不仅介导识别病原体，而且参与多种生物反应，包括结节形成、胶囊化、黑化、促进吞噬、激活酚氧化酶原系统、细胞粘附与聚集，还有利于各种免疫反应，包括清除细菌、抗菌活性、抗病毒感染、与抗真菌。可在原核表达载体如大肠杆菌表达系统、乳酸杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统或真核表达载体如酵母表达系统、昆虫病毒表达系统、动物细胞表达系统等常规且无需创造性劳动的表达系统表达凝集素重组蛋白，生产虾类和鱼类抗病毒、抗细菌药物。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种克氏原螯虾C-型凝集素基因的制备方法，其步骤是：

总RNA的提取：取克氏原螯虾肝胰腺100ug，加入1ml TRIzol Reagent RNA提取试剂(Invitrogen)，用研磨棒充分研磨，其余具体操作根据Invitrogen公司的TRIzol ReagentRNA提取试剂说明书进行。

cDNA第一链的合成：取上述步骤1中的总RNA 5ug，以1ul Oligo(dT)20为引物，2uldNTP(10mM)，4ul 5×RT buffer，1ul Rnase Inhibitor，1ul ReverTra Ace反转录酶，加ddH2O至终体积为20ul(根据TOYOBO公司的反转录试剂盒(ReverTra Ace-α-cDNA kit)说明书要求)，反转录程序为(42℃ 60min，99℃ 5min，4℃ 5min)，得到cDNA。

C-型凝集素基因(Pc-Clec)部分核苷酸序列的获得：根据文献(X-Z Shi，X-C Li，S Wang，X-F Zhao，J-X Wang.Transcriptome analysis of hemocytes and hepatopancreas in red swampcrayfish，Procambarus clarkii，challenged with white spot syndrome virus.J InvertebrateSurviv，2010，7(1)：119-131)设计一对引物ClecF及ClecR，取上述步骤2中的cDNA 2ul，加入引物ClecF(15pmol/ul)及ClecR(15pmol/ul)各1ul，2ul dNTP(2mM)，2ul MgSO4，5ul 10×KOD buffer，1ul KOD-Plus，36ul ddH2O(总体系50ul，根据TOYOBO公司的PCR试剂盒(KOD-Plus kit)说明书进行)，PCR程序为(94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，68℃ 30s，30cycles；68℃ 10min；4℃ 5min)。

ClecF：5’-GTTATTGACGACTCCACCTT-3’(正向)

ClecR：5’-GTCTTCCCATTGACCCACTT-3’(反向)；

PCR产物用TIANGEN Gel Extraction Kit纯化后用引物ClecF及ClecR进行双向测序(上海生工生物有限公司)，得到Pc-Clec基因部分核苷酸序列。

3’-RACE：C-型凝集素基因(Pc-Clec)3’端核苷酸序列的获得，

根据步骤2中得到的Pc-Clec基因部分核苷酸序列信息设计2条特异性正向引物：

Clec-3：5’-TGACGACTCCACCTTCATGGAGGCTCT-3’(用于3’-First round PCR)

Clec-n3：5’-TGGAGGCTCTTACGGACTACATCTTGGA-3’(用于3’-NET PCR)

3’-RACE-Ready cDNA的获得：取步骤1中的总RNA 3ug，以3’-RACE CDSPrimerA(3’-CDS：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN-3’，SMARTTM RACEcDNA Amplification Kit(Clontech)试剂盒提供)为反转录引物，反转录所需其他试剂及反转录程序按SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)试剂盒说明书进行，得到3’-RACE-Ready cDNA。

3’-First round PCR：取1ul 3’-RACE-Ready cDNA为模板，用特异性引物Clec-3及10×UPM引物(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)试剂盒提供)进行3’-Firstround PCR扩增，得到3’-First round PCR产物。

3’-NET PCR：取1ul 3’-First round PCR产物为模板，用特异性引物Clec-n3与NUP引物(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)试剂盒提供)进行5’-NET-PCR扩增，PCR反应条件为：94℃ 2分钟；94℃ 30秒，60℃ 30秒，68℃ 30秒，30cycles；68℃ 5分钟；25℃ 5分钟，得到3’-NETPCR产物。

3’端核苷酸序列的获得：将3’-NET-PCR扩增产物用TIANGEN Gel Extraction Kit纯化后用引物Clec-n3及NUP进行双向测序(上海生工生物有限公司)，获得克氏原螯虾C-型凝集素基因(Pc-Cec)的3’端序列。

5’-RACE：C-型凝集素基因(Pc-Clec)5’端核苷酸序列的获得，

根据步骤3中得到的Pc-Clec片段核苷酸序列信息设计2条特异性反向引物，

Clec-5：5’-GTCTTCCCATTGACCCACTTCCACACC-3’(用于5’-First round PCR)

Clec-n5：5’-CTTCCACACCCCTTCCGTCACCTCGT-3’(用于5’-NET PCR)

5’-RACE-Readyc DNA的获得：取步骤1中的肝胰腺总RNA 5ug，以SMART II AOligonucleotide引物(SMART A：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)试剂盒提供)及5’-RACE CDS PrimerA引物(5’-CDS：5’-(T)25VN-3’，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)试剂盒提供)进行反转录，反转录所需其他试剂及反转录程序按SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)试剂盒说明书进行，得到5’-RACE-Ready cDNA。

5’-First round PCR：取1ul 5’-RACE-Ready cDNA为模板，用特异性引物Clec-5及10×UPM引物(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)试剂盒提供)进行5’-Firstround PCR扩增，得到5’-First round PCR产物。

5’-NET PCR：取1ul 5’-First round PCR产物为模板，用特异性引物Clec-n5与NUP引物(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)试剂盒提供)进行5’-NET-PCR扩增，PCR反应条件为：94℃ 2分钟；94℃ 30秒，60℃ 30秒，68℃ 30秒，30cycles；68℃ 5分钟；25℃ 5分钟，得到5’-NETPCR产物。

5’端核苷酸序列的获得：将5’-NET-PCR产物用TIANGEN Gel Extraction Kit纯化后用引物Clec-n5及NUP进行双向测序(上海生工生物有限公司)，获得克氏原螯虾C-型凝集素基因(Pc-Cec)的5’端序列。

C-型凝集素基因(Pc-Clec)完整核苷酸序列的获得：将3’-RACE获得的克氏原螯虾C-型凝集素(Pc-Cec)的3’端序列及5’-RACE获得的克氏原螯虾C-型凝集素(Pc-Cec)的5’端序列用DNAssist Version 2.0进行拼接，得到完整的C-型凝集素基因(Pc-Clec)核苷酸序列。

C-型凝集素基因(Pc-Clec)所编码的蛋白质的氨基酸序列：用生物学软件DNAssistVersion 2.0对(5)中获得的C-型凝集素基因(Pc-Clec)核苷酸序列进行ORF Finding分析，发现其含有的完整ORF长为510bp，编码169个氨基酸的多肽，该多肽理论蛋白质分子量为19KD，该多肽蛋白等电点IP(Isoelectric Point)为4.1。.

一种分离的克氏原螯虾C-型凝集素基因(Pc-Clec)，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，是在步骤1-(5)中由软件拼接获得。

一种分离的克氏原螯虾C-型凝集素蛋白，其序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，是在步骤1-(6)中由软件分析获得。

该克氏原螯虾C-型凝集素Pc-Clec基因的蛋白质活性功能鉴定数据在下述“克氏原螯虾C-型凝集素”凝集功能的鉴定中实施例4“细菌凝集功能鉴定”和实施例5“兔红细胞凝集功能鉴定”所示。

一种能表达该克氏原螯虾C-型凝集素的原核表达菌株(Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-mClec)的获得，其步骤是：

引物设计：

用生物学软件SignalP(SignalP 3.0)分析所获得的C-型凝集素基因(Pc-Clec)完整的开放阅读框ORF所编码的蛋白质序列发现，克氏原螯虾C-型凝集素(Pc-Clec)所编码的蛋白质在其N端具有一个长17个氨基酸的信号肽，因此根据克氏原螯虾C-型凝集素基因(Pc-Clec)的序列，设计引物扩增其成熟肽核苷酸编码序列：

mClecF：5’-ATAGCTAGCGATTCTCCAATAAACAAGGCCAGAT-3’ (Nhe I)

mClecR：5’-GCTGGATCCTAAAGTACTGTGTATTCACAAATGG-3’ (BamHI)

本发明选择将凝集素基因插入到pET28a(+)载体的Nhe I和BamH I位点之间。

基因扩增、克隆与重组质粒鉴定：

取5’RACE中的5’-RACE-Ready cDNA 1ul为模板，加入引物mClecF(15pmol/ul)及mClecR(15pmol/ul)各1ul，2ul dNTP(2mM)，2ul MgSO4，5ul 10×KOD buffer，1ul KOD-Plus，37ul ddH2O(总体系50ul，根据TOYOBO公司的PCR试剂盒(KOD-Plus kit)说明书进行)，PCR程序为(94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，68℃ 30s，30cycles；68℃ 10min；4℃ 5min)。

PCR产物经过凝胶电泳检测后用TIANGEN Gel Extraction Kit进行回收、纯化，再用Nhe I和BamH I对纯化的PCR产物及表达载体pET28a(+)进行双酶切，电泳回收目的条带，用T4 ligase连接，转化JM109感受态细胞，涂布LB+Kan(30ug/ml)琼脂平板。PCR鉴定的阳性克隆提取质粒用Nhe I和BamH I双酶切及测序鉴定，正确者即为所需的重组表达载体pET28a-mClec，酶切鉴定如图1(Fig 1)。接着将重组表达载体转化BL21感受态，PCR鉴定正确者即为基因工程表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-mClec。通过上述方法获得了一种克氏原螯虾C-型凝集素基因Pc-Clec和表达该凝集素蛋白的菌株Escherichiacoli BL21(DE3)pET-28a-mClec。所述的重组大肠杆菌菌株基因工程表达菌株Escherichia coliBL21(DE3)pET-28a-mClec是具有质粒pET-28a-mClec的大肠杆菌菌株，保藏编号：CCTCC，NO：M2011205，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2011年6月22日，分类命名：Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-mClec，F- ompT hsdSB(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)。

3、重组克氏原螯虾C-型凝集素蛋白mClec的表达及纯化，其步骤是：

重组C-型凝集素蛋白(mClec)的诱导表达及SDS-PAGE鉴定：

接种鉴定正确的Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-mClec于含15ug/ml卡那霉素的20ml LB培养基的三角瓶中，37℃震荡培养过夜。次日取1ml培养物接种于含相同抗性的20ml LB培养基的三角瓶中，37℃震荡培养至OD600＝0.6，加入终浓度为1.0mmol/L IPTG，37℃诱导4h后，离心12000g，4℃，10min收集菌体，用10ml lysis Buffer(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，150mM NaCl，PH8.0)重悬超声波破碎，离心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

重组C-型凝集素蛋白(mClec)的纯化：

①样品的制备

按照上述诱导的方法发酵1L工程菌Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-mClec，于室温(20-25℃以下相同)4000rpm离心10分钟，收集并称量湿菌体。取1g湿菌体加入30ml lysisBuffer(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，150mM NaCl，PH8.0)，-20℃反复冻融3次，再进行超声波破碎(4℃，工作3秒，间歇3秒)，待菌液破碎至清亮。将破碎后的菌液于4℃，10000rpm离心20分钟，收集上清及沉淀并用SDS-PAGE电泳检测。

②包涵体稀释复性

SDS-PAGE电泳检测证实，重组C-型凝集素蛋白(mClec)以包涵体形式表达。包涵体经2M尿素洗涤后，加入适量包涵体裂解液(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿素，0.15MNaCl，pH8.0)于冰上裂解过夜。裂解液经12000rpm 10min离心后弃沉淀，上清液适量稀释于蛋白复性液中(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，2M尿素，0.15M NaCl，pH8.0)，4度复性过夜。次日将复性液装入透析袋于透析液(50mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0)透析24h，期间更换透析液2次。蛋白经PEG20000浓缩后，12000rpm 10min离心，上清即为复性好的重组C-型凝集素蛋白(mClec)。用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果。

③Bradford法测定纯化的重组C-型凝集素蛋白(mClec)浓度，操作按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)说明书进行。

4、重组C-型凝集素蛋白(mClec)细菌凝集活性测定，其步骤是：

①微生物的接种：

分别取保种的大肠杆菌E.coli JM109(在INVITROGEN公司购置)，嗜水气单胞菌A.hydrophila(本实验室保藏)，金黄色葡萄球S.aureu(本实验室保藏)甘油菌10ul，接种于含20ml LB的三角瓶中，37℃ 200rpm振荡培养过夜。

②微生物悬液的制备

将过夜培养的大肠杆菌E.coli JM109，嗜水气单胞菌A.hydrophila，金黄色葡萄球S.aureu，分别吸取100ul转接入含20ml LB的三角瓶中，37℃ 200rpm振荡培养2h，得到对数生长期菌液。分别吸取对数生长期的大肠杆菌E.coli JM109，嗜水气单胞菌A.hydrophila，金黄色葡萄球S.aureu各1ml，5000rpm离心10min，菌体用TBS溶液(50mM Tris-HCl，150mMNaCl，pH7.5)重悬洗涤，5000rpm离心10min弃上清，连续洗涤3次，最后用1mlTBS重悬菌体。各取10ul重悬的菌液用ddH2O稀释至100ul后，取10ul稀释液进行细胞计数板计数。根据计数结果，最后用TBS将TBS重悬的菌液稀释至每毫升2×108个菌。

③重组mClec对细菌的凝集作用

取96孔细胞培养板一块，用微量移液器向各孔加入菌液(2×108个/ml)25ul，再分别加入25ul的BSA(50ug/ml，含20mM Ca2+)，重组mClec(50ug/ml)，重组mClec(50ug/ml，含20mM Ca2+)，在轻微振摇30s，室温(20-25℃以下相同)下静置1h，将96孔板置于倒置显微镜下观察细菌凝集结果。

5、重组C-型凝集素蛋白(mClec)兔红细胞凝集活性测定，其步骤是：

①兔红细胞悬液的制备

用5ml一次性无菌注射器，吸取2ml灭菌阿氏液(Elsevier’s溶液：100mM葡萄糖，20mMNaCI，30mM柠檬酸钠，pH7.2)，耳缘静脉无菌采取兔子的静脉血2ml，上下颠倒数次后随即注入装有4ml阿氏液的10ml离心管中，800g离心5min弃上清，8ml 0.9％生理盐水洗3次，每次800g离心5min，最后一次800g离心10min离心，弃上清液，沉淀即为可供配制红细胞悬液的血球泥，取100ul血球泥用900ul 0.9％生理盐水重悬配置成10％(v/v)的红细胞悬液用于实验。其余血球泥用阿氏液配制成10％(v/v)的红细胞悬液，置于4℃保存。

②重组mClec对兔红细胞的凝集作用

取30ul 10％(v/v)的红细胞悬液，用970ul 0.9％生理盐水配制成0.33％(v/v)的红细胞悬液。分别取25ul 0.33％(v/v)的红细胞悬液滴于无菌载玻片3处不同位置上，再分别吸取25ul的BSA(50ug/ml，含20mM Ca2+)，重组mClec(50ug/ml)，重组mClec(50ug/ml，含20mM Ca2+)分别滴入载玻片三个相应的红血球悬浮液滴中，轻微混匀，4℃保湿静置1h后，将载玻片置于倒置显微镜下观察凝集结果。

通过以上技术措施获得了克氏原螯虾C-型凝集素基因Pc-Clec和表达该凝集素蛋白的菌株Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-mClec，该凝集素基因及凝集素蛋白可在水产养殖中用于病害防治。应用的基本过程为，表达的有活性的凝集素蛋白，与水产饲料如虾饲料、鱼饲料以粘合剂粘合后投喂虾和鱼，凝集素介导识别病原体，参与机体的免疫反应，帮助清除细菌、真菌及病毒。

C-型凝集素为无脊椎动物免疫系统的重要组成部分，不仅介导识别病原体，而且参与多种生物反应，包括结节形成、胶囊化、黑化、促进吞噬、激活酚氧化酶原系统、细胞粘附与聚集，还有利于各种免疫反应，包括清除细菌、抗菌活性、抗病毒感染、与抗真菌。

本发明的克氏原螯虾C-型凝集素基因在制备具有凝集作用的重组蛋白中的应用，所述应用的方法是通过基因重组技术使所述克氏原螯虾C-型凝集素基因Pc-Clec在原核表达载体如大肠杆菌表达系统、乳酸杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统或真核表达载体如酵母表达系统、昆虫病毒表达系统、动物细胞表达系统等常规且无需创造性劳动的表达系统表达，获得具有凝集活性的重组克氏原螯虾C-型凝集素蛋白。

在本发明中，将获得的克氏原螯虾C-型凝集素基因克隆到pET28a(+)原核表达载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，进行诱导表达、纯化，获得了具有凝集活性的重组克氏原螯虾C-型凝集素蛋白，并利用获得的重组蛋白进行了细菌凝集实验及红细胞凝集实验。

利用本发明获得的重组的克氏原螯虾C-型凝集素，对多种细菌及兔红细胞具有凝集作用，重组的凝集素蛋白可用于饲料添加剂，用于生产虾类和鱼类抗病毒、抗细菌药物。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明获得了克氏原螯虾C-型凝集素基因Pc-Clec及表达该凝集素蛋白的大肠杆菌基因工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-mClec。本发明采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、聚合酶链式反应(PCR)、3’-端cDNA快速扩增(3’RACE)以及Smart cDNA的方法，从克氏原螯虾中克隆到C-型凝集素基因，优点是：通过该方法可在知道基因部分核苷酸序列的情况下，快速而有效获得该基因的完整核苷酸序列。

本发明获得了表达重组克氏原螯虾C-型凝集素蛋白mClec的大肠杆菌基因工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-mClec，该工程菌株通过简单的发酵、诱导表达、包涵体稀释复性，即可得到大量的具有凝集活性的基因工程重组克氏原螯虾C-型凝集素蛋白mClec，该重组凝集素蛋白对多种细菌及兔红细胞表现出明显的凝集作用。

本发明获得的重组凝集素蛋白可作为饲料添加剂，用于生产虾类和鱼类抗病毒、抗细菌药物。

附图说明

图1为一种重组表达载体pET28a-mClec的构建流程。

图2为重组表达载体pET28a-mClec的双酶切鉴定图。

M：DNA Marker IV(7000，5500，2000，1000，500bp)。

1：重组表达载体pET28a-mClec Nhe I&BamH I双酶切鉴定(箭头所指为酶切目的片段)。

图3为工程菌pET28a-mClec/BL21(DE3)的PCR鉴定图。

+：阳性对照。

-：阴性对照。

1-3：PCR阳性克隆。

图4为一重组凝集素蛋白mClec的表达及纯化图。

M：蛋白marker(91.0，66.2，43.0，35.0，23.4，14.4KD)。

1：工程菌pET28a-mClec/BL21(DE3)诱导前。

2：工程菌pET28a-mClec/BL21(DE3)诱导后。

3：纯化的重组凝集素蛋白mClec(箭头所示，19KD)。

图5为重组凝集素蛋白mClec的凝集作用图。

A：重组凝集素蛋白mClec对细菌的凝集作用(大肠杆菌E.coli JM109，金黄色葡萄球菌S.aureus，嗜水汽单胞菌A.hydrophila)。

B：重组凝集素蛋白mClec对兔红细胞的凝集作用。

图6为蛋白标准曲线。

图7为不同稀释度的WSSV病毒液感染原克氏螯虾累计死亡率曲线。

图8为mClec处理WSSV后感染的克氏螯虾累计死亡率曲线。

具体实施方式

实施例1：

一种克氏原螯虾C-型凝集素基因的制备方法，其步骤是：

总RNA的提取：取克氏原螯虾肝胰腺100ug，加入1ml TRIzol Reagent RNA提取试剂(Invitrogen)，用研磨棒充分研磨，其余具体操作根据Invitrogen公司的TRIzol Reagent RNA提取试剂说明书进行。

cDNA第一链的合成：取上述(1)中的总RNA 5ug，以1ul Oligo(dT)20为引物，2uldNTP(10mM)，4ul 5×RT buffer，1ul Rnase Inhibitor，1ul ReverTra Ace反转录酶，加ddH2O至终体积为20ul(根据TOYOBO公司的反转录试剂盒(ReverTra Ace-α-cDNA kit)说明书要求)，反转录程序为(42℃ 60min，99℃ 5min，4℃ 5min)，得到cDNA。

C-型凝集素基因(Pc-Clec)部分核苷酸序列的获得：根据文献( )设计一对引物ClecF及ClecR，取上述(2)中的cDNA2ul，加入引物ClecF(15pmol/ul)及ClecR(15pmol/ul)各1ul，2ul dNTP(2mM)，2ul MgSO4，5ul 10×KOD buffer，1ul KOD-Plus，36ul ddH2O(总体系50ul，根据TOYOBO公司的PCR试剂盒(KOD-Plus kit)说明书进行)，PCR程序为(94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，68℃ 30s，30cycles；68℃ 10min；4℃5 min)。

ClecF：5’-GTTATTGACGACTCCACCTT-3’(正向)

ClecR：5’-GTCTTCCCATTGACCCACTT-3’(反向)；

3’-RACE：C-型凝集素基因(Pc-Clec)3’端核苷酸序列的获得，

根据(3)中得到的Pc-Clec基因部分核苷酸序列信息设计2条特异性正向引物：

Clec-3：5’-TGACGACTCCACCTTCATGGAGGCTCT-3’(用于3’-First round PCR)

Clec-n3：5’-TGGAGGCTCTTACGGACTACATCTTGGA-3’(用于3’-NET PCR)

3’-RACE-Readyc DNA的获得：取(1)中的总RNA 3ug，以3’-RACE CDSPrimerA(3’-CDS：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN-3’，SMARTTM RACEcDNA Amplification Kit(Clontech)试剂盒提供)为反转录引物，反转录所需其他试剂及反转录程序按SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)试剂盒说明书进行，得到3’-RACE-Ready cDNA。

3’-NET PCR：取1ul 3’-First round PCR产物为模板，用特异性引物Clec-n3与NUP引物(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)试剂盒提供)进行5’-NET-PCR扩增，PCR反应条件为：94℃ 2分钟；94℃ 30秒，60℃ 30秒，68℃ 30秒，30cycles；68℃ 5分钟；25℃ 5分钟，得到3’-NET PCR产物。

5’-RACE：C-型凝集素基因(Pc-Clec)5’端核苷酸序列的获得，

根据(3)中得到的Pc-Clec片段核苷酸序列信息设计2条特异性反向引物，

Clec-5：5’-GTCTTCCCATTGACCCACTTCCACACC-3’(用于5’-First round PCR)

Clec-n5：5’-CTTCCACACCCCTTCCGTCACCTCGT-3’(用于5’-NET PCR)

5’-RACE-Ready cDNA的获得：取(1)中的肝胰腺总RNA 5ug，以SMART II AOligonucleotide引物(SMART A：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)试剂盒提供)及5’-RACE CDS PrimerA引物(5’-CDS：5’-(T)25VN-3’，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)试剂盒提供)进行反转录，反转录所需其他试剂及反转录程序按SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)试剂盒说明书进行，得到5’-RACE-Ready cDNA。

C-型凝集素基因(Pc-Clec)所编码的蛋白质分析：通过NCBI BLAST同源性检索分析，提示所克隆的克氏原螯虾凝集素(Pc-Clec)为C型凝集素。

实施例2：

一种能表达该克氏原螯虾C-型凝集素的原核表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-mClec的获得，整个构建流程如图Fig 1所示，其步骤是：

引物设计：

mClecF：5’-ATAGCTAGCGATTCTCCAATAAACAAGGCCAGAT-3’(Nhe I)

mClecR：5’-GCTGGATCCTAAAGTACTGTGTATTCACAAATGG-3’(BamH I)

基因扩增、克隆与重组质粒鉴定

PCR产物经过凝胶电泳检测后用TIANGEN Gel Extraction Kit进行回收、纯化，再用Nhe I和BamH I对纯化的PCR产物及表达载体pET28a(+)进行双酶切，电泳回收目的条带，用T4 ligase连接，转化JM109感受态细胞，涂布LB+Kan(30ug/ml)琼脂平板。PCR鉴定的阳性克隆提取质粒用Nhe I和BamH I双酶切及测序鉴定，正确者即为所需的重组表达载体pET28a-mClec，酶切鉴定如图2(Fig 2)。接着将重组表达载体转化BL21感受态，PCR鉴定正确者即为基因工程表达菌株E.coli BL21(DE3)pET-28a-mClec，PCR鉴定结果如图3(Fig 3)所示。

实施例3：

重组克氏原螯虾C-型凝集素蛋白mClec的表达及纯化，其步骤是：

重组C-型凝集素蛋白(mClec)的诱导表达及SDS-PAGE鉴定：

接种鉴定正确的pET28a-mClec/BL21(DE3)于含15ug/ml卡那霉素的20ml LB培养基的三角瓶中，37℃震荡培养过夜。次日取1ml培养物接种于含相同抗性的20ml LB培养基的三角瓶中，37℃震荡培养至OD600＝0.6，加入终浓度为1.0mmol/L IPTG，37℃诱导4h后，离心12 000g，4℃，10min收集菌体，用10ml lysis Buffer(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，150mM NaCl，PH8.0)重悬超声波破碎，离心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。SDA-PAGE结果如图4(Fig 4)所示。

重组克氏原螯虾C-型凝集素蛋白(mClec)的纯化：

①样品的制备

按照上述诱导的方法发酵1L工程菌pET28a-mClec/BL21(DE3)，于室温4000rpm离心10分钟，收集并称量湿菌体。取1g湿菌体加入30ml lysis Buffer(50mM Tris-HCl，5mMEDTA，150mM NaCl，PH8.0)，-20℃反复冻融3次，再进行超声波破碎(4℃，工作3秒，间歇3秒)，待菌液破碎至清亮。将破碎后的菌液于4℃，10000rpm离心20分钟，收集上清及沉淀并用SDS-PAGE电泳检测。

②包涵体稀释复性

SDS-PAGE电泳检测证实，重组C-型凝集素蛋白(mClec)以包涵体形式表达。包涵体经2M尿素洗涤后，加入适量包涵体裂解液(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿素，0.15MNaCl，pH8.0)于冰上裂解过夜。裂解液经12000rpm 10min离心后弃沉淀，上清液适量稀释于蛋白复性液中(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，2M尿素，0.15M NaCl，pH8.0)，4度复性过夜。次日将复性液装入透析袋于透析液(50mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0)透析24h，期间更换透析液2次。蛋白经PEG20000浓缩后，12000rpm 10min离心，上清即为复性好的重组C-型凝集素蛋白(mClec)。用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果。纯化结果如图4(Fig 4)所示。

实施例4：

重组C-型凝集素蛋白(mClec)细菌凝集活性测定，其步骤是：

①微生物的接种：

分别取保种的大肠杆菌E.coli JM109，嗜水气单胞菌A.hydrophila，金黄色葡萄球S.aureu甘油菌10ul，接种于含20ml LB的三角瓶中，37℃ 200rpm振荡培养过夜。

②微生物悬液的制备

③重组mClec对细菌的凝集作用

取96孔细胞培养板一块，用微量移液器向各孔加入菌液(2×108个/ml)25ul，再分别加入25ul的BSA(50ug/ml，含20mM Ca2+)，重组mClec(50ug/ml)，重组mClec(50ug/ml，含20mM Ca2+)，在轻微振摇30s，室温下静置1h，将96孔板置于倒置显微镜下观察细菌凝集结果。凝集结果如图5(Fig 5A)所示。

实施例5：

重组C-型凝集素蛋白(mClec)对兔红细胞凝集活性测定，其步骤是：

①兔红细胞悬液的制备

②重组mClec对兔红细胞的凝集作用

取30ul 10％(v/v)的红细胞悬液，用970ul 0.9％生理盐水配制成0.33％(v/v)的红细胞悬液。分别取25ul 0.33％(v/v)的红细胞悬液滴于无菌载玻片3处不同位置上，再分别吸取25ul的BSA(50ug/ml，含20mM Ca2+)，重组mClec(50ug/ml)，重组mClec(50ug/ml，含20mM Ca2+)分别滴入载玻片三个相应的红血球悬浮液滴中，轻微混匀，4℃保湿静置1h后，将载玻片置于倒置显微镜下观察凝集结果。凝集结果如图5(Fig 5B)所示。

实施例6：

重组C-型凝集素蛋白(mClec)抗WSSV活性测定，其步骤是：

1.重组蛋白MClec在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的表达

(1)从过夜培养的固体LB平板(Kan+，终浓度30μg/ml)上挑取携带有质粒pET-28a-Lec的E.coli BL21(DE3)单菌落，接种于含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的20ml LB液体培养基中，于37℃恒温摇床中300rpm过夜培养。

(2)次日以1％的比例接种到含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的20ml新鲜的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床中300rpm培养2.5～3h左右。

(3)加入IPTG至终浓度为0.6mmol/L，于37℃恒温摇床中诱导表达5h。

(4)常温下4000rpm离心30min，弃上清，保留菌体沉淀。取部分菌体沉淀用适量细胞裂解液重悬，并400W超声破碎，4℃，工作3秒，间歇3秒，破碎至菌液清亮即可。

(5)取1ml细菌破碎液，12000rpm离心1min，取50μl上清并于其中加入50μL等体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液，充分混匀。将其余上清弃掉，用1ml无菌水重悬破碎液沉淀，并取50μl重悬液加入到50μl 2×SDS-PAGE样品缓冲液，充分混匀。

(6)将上述两个样品做好标记并于沸水中煮10min后，用于SDS-PAGE检测。以检测目的蛋白是否表达并检测其表达形式是包涵体还是可溶的。同时以未加入IPTG诱导的重组菌作为对照组样品。

2.包涵体的纯化

(1)从固体LB(Kan+，终浓度30μg/ml)平板上挑取携带有质粒pET-28a-Lec的E.coliBL21(DE3)单菌落，接种于含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的20ml LB液体培养基中，于37℃摇床中，200rpm振摇活化培养过夜。

(2)第二日，按1％的比例接种到200ml新鲜的2-YT(16g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g氯化钠)液体培养基中，于37℃恒温摇床中200rpm培养大概3h左右，至OD600达到约0.6-0.8。

(3)加入诱导物IPTG(1M)至终浓度为0.6mM，于37℃摇床中诱导表达5h。

(4)经过SDS-PAGE电泳检测证实，重组蛋白MClec以包涵体形式表达。4000rpm离心30min，收集菌体，用30ml细胞裂解液(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，50mM NaCl，PH8.0)重悬，400W超声破碎，4℃，工作3秒，间歇3秒，破碎至菌液清亮即可，然后将破碎液4℃ 12000rpm离心15min，弃上清。

(5)沉淀经包涵体洗涤液(2M urea，50mM Tris-Hcl，5mM EDTA，0.15M Nacl，PH 8.0)重悬并洗涤2次后，加入10ml包涵体裂解液溶液重悬并变澄清，4℃裂解过夜。

(6)将包涵体裂解液4℃ 8000rpm离心10min后弃去沉淀，将上清液稀释于40ml蛋白复性液中，4℃复性过夜。

(7)用透析袋处理液(2％的NaHCO3，1mM的EDTA)将透析袋(3.5kDa)煮沸10min，用无菌水洗净，备用。

(7)将复性液用0.45μm滤膜过滤后装入透析袋，于透析液(50mM Tris-HCl，0.15MNaCl，pH8.0)中透析24h，期间更换透析液1次。用PEG20000将透析袋中的蛋白浓缩3倍后，4℃ 8000rpm离心5min，上清即为复性好的重组蛋白。用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果。

3 Bradford法测定纯化的mClec的蛋白浓度

(1)将Bradford试剂工作液平衡至室温并颠倒混匀，将酶标仪预热。

(2)取50μl牛血清蛋白(BSA)标准液(1mg/ml)加入到50μl10mM PBS中充分混匀，此时BSA浓度为500μg/ml。

(3)将0、2、4、6、8、12μl上述稀释好的BSA溶液依次加入酶标微孔板中，用10mMPBS补足至20μl，对应BSA的终浓度分别为0、50、100、150、200、250、300μg/ml。

(3)向每孔中加入200μl Bradford试剂工作液(0.1％考马斯亮蓝G250，5％乙醇，8.5％磷酸)振荡混匀后室温放置2分钟。

(4)用酶标仪测BSA蛋白各浓度的OD570值。以BSA蛋白浓度为横坐标，BSA蛋白各浓度的OD570值为纵坐标制作标准曲线，标准曲线如图6

(5)用同样的方法测定样品的OD570值，从标准曲线中确定样品的浓度。

在excel中得到该标准曲线的公式为y＝0.0024x，相关系数R2＝0.9925。将测定的纯化的重组mClec蛋白溶液的吸光度值代入此公式中即可计算出这种蛋白的蛋白浓度。最后得到mClec蛋白的浓度为220μg/ml。

4.病毒活化与提取

将螯虾分装，10尾每盒，总共两盒。取出-20℃冰箱中储存的WSSV解冻，第一盒每只虾注射100μl解冻的WSSV病毒，另一盒注射100μl TN buffer(0.02M Tris-HCl，0.4M NaCl，PH7.4)作为对照。室温培养，3天后取感染病毒的濒死的螯虾取腮丝和肝胰腺，称重，加入10倍体积TN buffer，冰上充分研磨，4000rpm离心10分钟，取上清再8000rpm离心20min，最后将所得上清液过0.45μm滤膜，每管200μl分装，-20℃保存备用。

5.病毒滴度测定

将螯虾分为9个组，每组15尾。将提取的病毒用TN buffer稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8的稀释度。按稀释度从低到高的顺序依次腹节肌肉注射各组螯虾，每尾100μl，同时设置注射TN buffer的为对照组，方法和剂量都和病毒注射组相同。每组螯虾在相同的环境下饲养，并每天记录死亡情况。最后选用能使螯虾的累计死亡率能达到99％的最低稀释度的病毒液作为实验用病毒液，结果表明，应该选用10-6的稀释度的病毒液来进行实验。螯虾累计死亡率统计如图7。

6.WSSV病毒攻击

选取能使螯虾死亡率达到99.9％的最低稀释度的WSSV病毒来进行病毒攻击。将螯虾总共分为6个组，每组30尾，每组分装为两盒来饲养。准备六组要注射的样品，分别是TNbuffer，等体积混合的WSSV和TN buffer，等体积混合的BSA和WSSV(含终浓度10mM的Ca2+)，等体积混合BSA和WSSV(不含Ca2+)，等体积混合的MClec和WSSV(含终浓度10mM的Ca2+)，等体积混合的MClec和WSSV(不含Ca2+)，其中BSA和mClec的终浓度均为100μg/ml。将充分混匀的样品放到4℃温育20min，然后分别注射各组螯虾，每只100μl。螯虾放到25℃环境下培养，每天早晚换水并投喂饲料一次并记录螯虾死亡情况。螯虾累计死亡率统计数据如图8。图8显示的是病毒攻击螯虾后，各组实验螯虾的死亡情况。由此图可知，加BSA与WSSV孵育时，不管有没有钙离子的存在，BSA对WSSV的相对保护性都为0。而mClec与WSSV孵育时，钙离子的存在对其影响比较重要。其中有钙离子存在时mCmClec对WSSV的保护率远远高于没有钙离子存在时mClec对WSSV的保护率。当有钙离子存在时，MClec对WSSV的相对保护率达到了60％。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉凯肽来生物科技有限公司

<120> 一种克氏原螯虾C-型凝集素基因及制备方法和应用

<130> 一种克氏原螯虾C-型凝集素基因及制备方法和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 695

<212> DNA

<213> 克氏原螯虾

<400> 1

acgacatcat cgtcaacaca aaactgcaac aggaggaaaa aaacttacag caagatgaat 60

gtggaagctt ttcttctgtt gttaggttcc gtcttggtct atggcgattc tccaataaac 120

aaggccagat atcctgctgc ggatataacc tgccctttgc cgtacaaagc agttggaggt 180

cgctgcattc tgttcgcggt ggccgaggct ggcgcctggc acgacatggg atacttctgc 240

gagacactcg ggggcaaact ggtcgttatt gacgactcca ccttcatgga ggctcttacg 300

gactacatct tggatggtga gttctcaacc acggaattct ggattggagc gacggacgag 360

gtgacggaag gggtgtggaa gtgggtcaat gggaagacgg tgaggatgcg catgcctctc 420

tggctcacgt gttcggacga ccaggaaccc aacggtggca gcgccgagaa ctgtctggcc 480

atcacgagcg accataacta ctacttcgtc gacgccgatt gcgctctagc aatgaatccc 540

atttgtgaat acacagtact ttagatttta ttttttagaa aataatgtat acaatatgga 600

tttcatgcct ggtatataat atacaacaac ttggatatat gccttgaata taatagatgt 660

tgatttacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 695

<210> 2

<211> 169

<212> PRT

<213> 克氏原螯虾

<400> 2

Met Asn Val Glu Ala Phe Leu Leu Leu Leu Gly Ser Val Leu Val Tyr

1 5 10 15

Gly Asp Ser Pro Ile Asn Lys Ala Arg Tyr Pro Ala Ala Asp Ile Thr

20 25 30

Cys Pro Leu Pro Tyr Lys Ala Val Gly Gly Arg Cys Ile Leu Phe Ala

35 40 45

Val Ala Glu Ala Gly Ala Trp His Asp Met Gly Tyr Phe Cys Glu Thr

50 55 60

Leu Gly Gly Lys Leu Val Val Ile Asp Asp Ser Thr Phe Met Glu Ala

65 70 75 80

Leu Thr Asp Tyr Ile Leu Asp Gly Glu Phe Ser Thr Thr Glu Phe Trp

85 90 95

Ile Gly Ala Thr Asp Glu Val Thr Glu Gly Val Trp Lys Trp Val Asn

100 105 110

Gly Lys Thr Val Arg Met Arg Met Pro Leu Trp Leu Thr Cys Ser Asp

115 120 125

Asp Gln Glu Pro Asn Gly Gly Ser Ala Glu Asn Cys Leu Ala Ile Thr

130 135 140

Ser Asp His Asn Tyr Tyr Phe Val Asp Ala Asp Cys Ala Leu Ala Met

145 150 155 160

Asn Pro Ile Cys Glu Tyr Thr Val Leu

165

Claims

1.一种分离的克氏原螯虾C-型凝集素基因，其序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.一种分离的克氏原螯虾C-型凝集素蛋白，其序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

3.权利要求2所述的一种克氏原螯虾C-型凝集素蛋白，其制备步骤是：

A、总RNA的提取：取克氏原螯虾肝胰腺100ug，加入1ml TRIzol Reagent RNA提取试剂，用研磨棒研磨；

B、cDNA第一链的合成：取步骤（A）中的总RNA 5ug，以1ul Oligo(dT)₂₀为引物，2ul dNTP，4ul 5×RT buffer，1ul Rnase Inhibitor，1ul ReverTra Ace反转录酶，加ddH2O至终体积为20ul，反转录程序为42℃60min，99℃5min,4℃5min，得到cDNA；

C-型凝集素基因部分核苷酸序列的获得：设计一对引物ClecF及ClecR，取步骤（B）中的cDNA 2ul，加入引物ClecF及ClecR各1ul，2ul dNTP，2ul MgSO4，5ul 10×KOD buffer，1ul KOD-Plus，36ul ddH2O，PCR程序为94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，68℃30s，30cycles；68℃ 10min；4℃ 5min；

ClecF：5’-GTTATTGACGACTCCACCTT-3’正向

ClecR：5’-GTCTTCCCATTGACCCACTT-3’反向；

PCR产物用TIANGEN Gel Extraction Kit纯化后用引物ClecF及ClecR进行双向测序，得到Pc-Clec基因部分核苷酸序列；

C、3’-RACE：C-型凝集素基因3’端核苷酸序列的获得：

根据步骤（B）中得到的Pc-Clec基因部分核苷酸序列信息设计二条特异性正向引物：

Clec-3:5’-TGACGACTCCACCTTCATGGAGGCTCT-3’

Clec-n3:5’-TGGAGGCTCTTACGGACTACATCTTGGA-3’；

3’-RACE-Ready cDNA的获得：取步骤（A）中的总RNA 3ug，以3’-RACE CDS PrimerA’为反转录引物，反转录所需其他试剂及反转录程序按SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit，得到3’-RACE-Ready cDNA；

3’-First round PCR：取1ul 3’-RACE-Ready cDNA为模板，用特异性引物Clec-3及10×UPM引物进行3’-First round PCR扩增，得到3’-First round PCR产物；

3’-NET PCR：取1ul 3’-First round PCR产物为模板，用特异性引物Clec-n3与NUP引物进行5’-NET-PCR扩增，PCR反应条件为：94℃ 2分钟；94℃ 30秒，60℃ 30秒，68℃30秒,30cycles；68℃ 5分钟；25℃ 5分钟，得到3’-NET PCR产物；

3’端核苷酸序列的获得：将3’-NET-PCR扩增产物用TIANGEN Gel Extraction Kit纯化后用引物Clec-n3及NUP进行双向测序，获得克氏原螯虾C-型凝集素基因的3’端序列；

所述的3’-RACE CDS PrimerA’为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)₃₀VN-3’，由SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒提供；

D、5’-RACE：C-型凝集素基因5’端核苷酸序列的获得：

根据步骤（B）中得到的Pc-Clec片段核苷酸序列信息设计二条特异性反向引物：

Clec-5:5’-GTCTTCCCATTGACCCACTTCCACACC-3’；

Clec-n5:5’-CTTCCACACCCCTTCCGTCACCTCGT-3’；

5’-RACE-Ready cDNA的获得：取步骤（A）中的肝胰腺总RNA 5ug，以SMART IIA Oligonucleotide引物及5’-RACE CDS PrimerA引物进行反转录，反转录程序按SMART^T ^M RACE cDNA Amplification Kit试剂盒进行，得到5’-RACE-Ready cDNA；

5’-First round PCR：取1ul 5’-RACE-Ready cDNA为模板，用特异性引物Clec-5及10×UPM引物进行5’-First round PCR扩增，得到5’-First round PCR产物；

5’-NET PCR：取1ul 5’-First round PCR产物为模板，用特异性引物Clec-n5与NUP引物进行5’-NET-PCR扩增，PCR反应条件为：94℃ 2分钟；94℃ 30秒，60℃ 30秒，68℃30秒,30cycles；68℃ 5分钟；25℃ 5分钟，得到5’-NET PCR产物；

5’端核苷酸序列的获得：将5’-NET-PCR产物用TIANGEN Gel Extraction Kit纯化后用引物Clec-n5及NUP进行双向测序，获得克氏原螯虾C-型凝集素基因的5’端序列；

E、C-型凝集素基因完整核苷酸序列的获得：将3’-RACE获得的克氏原螯虾C-型凝集素的3’端序列及5’-RACE获得的克氏原螯虾C-型凝集素的5’端序列用DNAssist Version 2.0进行拼接，得到完整的C-型凝集素基因核苷酸序列；

F、C-型凝集素基因所编码的蛋白质的氨基酸序列：用生物学软件对（E）中获得的C-型凝集素基因核苷酸序列进行ORF Finding分析，含有的完整ORF长为510bp，编码169个氨基酸的多肽，该多肽理论蛋白质分子量为19KD。

4.一种能表达克氏原螯虾C-型凝集素的原核表达菌株，其特征在于，该菌株为重组菌株Escherichia coli BL21（DE3）pET-28a-mClec，F^- ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)；CCTCC NO:M2011205。

5.权利要求4所述的一种克氏原螯虾C-型凝集素的原核表达菌株的制备方法，其步骤是：

(1)引物设计：

用生物学软件SignalP获得的C-型凝集素基因完整的开放阅读框ORF所编码的蛋白质，克氏原螯虾C-型凝集素所编码的蛋白质在其N端有一个长17个氨基酸的信号肽，根据权利要求1所述克氏原螯虾C-型凝集素基因的序列，设计引物扩增其成熟肽核苷酸编码序列：

mClecF:5’-ATAGCTAGCGATTCTCCAATAAACAAGGCCAGAT-3’

mClecR:5’-GCTGGATCCTAAAGTACTGTGTATTCACAAATGG-3’

将凝集素基因插入到pET28a(+)载体的Nhe I和BamH I位点之间；

(2)基因扩增、克隆与重组质粒鉴定：

取权利要求3中制备的5’RACE中的5’-RACE-Ready cDNA 1ul为模板，加入引物mClecF及mClecR各1ul，2ul dNTP，2ul MgSO4，5ul 10×KOD buffer，1ulKOD-Plus，37ul ddH2O，PCR程序为94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，68℃ 30s，30cycles；68℃ 10min；4℃ 5min；

PCR产物经过凝胶电泳检测后用TIANGEN Gel Extraction Kit进行回收、纯化，再用Nhe I和BamH I对纯化的PCR产物及表达载体pET28a(+)进行双酶切，电泳回收目的条带，用T4 ligase连接，转化JM109感受态细胞，涂布LB+Kan琼脂平板，PCR鉴定的阳性克隆提取质粒用Nhe I和BamH I双酶切及测序鉴定，为重组表达载体pET28a-mClec，将重组表达载体转化BL21感受态，PCR鉴定正确者即为基因工程表达菌株。

6.权利要求2所述的一种克氏原螯虾C-型凝集素蛋白在制备治疗或预防水产养殖病害药物中的应用。