CN102993291A

CN102993291A - 双峰驼角蛋白、编码基因及其获取方法

Info

Publication number: CN102993291A
Application number: CN2012103714362A
Authority: CN
Inventors: 乌仁套迪; 陈国华; 巴拉
Original assignee: WUREN TAO DING
Current assignee: WUREN TAO DING
Priority date: 2012-09-29
Filing date: 2012-09-29
Publication date: 2013-03-27

Abstract

本发明涉及一种在双峰驼角蛋白、编码基因及其获取方法，本发明中的双峰驼角蛋白基因的cDNA序列是通过以双峰驼耳部组织中总RNA为模板，参考人、鼠、牛等物种的角蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼角蛋白基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。将双峰驼角蛋白基因cDNA序列中的编码序列(CDS)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO.2。对包括SEQ ID NO.1在内的9个物种的九条角蛋白基因的CDS序列构建了系统发生树，结果发现：双峰驼角蛋白同牛和猪的进化距离最近，间接证明了所得到的序列确为双峰驼角蛋白基因。

Description

双峰驼角蛋白、编码基因及其获取方法

所属技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及一种在双峰驼角蛋白、编码基因及其获取方法。

背景技术

角蛋白(keratin)系硬蛋白之一，是一类具有结缔和保护功能的结构纤维硬蛋白，存在于脊椎动物皮肤、毛发指甲等部位，富含半胱氨酸残基和大量的二硫键。角蛋白可分为α角蛋白(α-keratin)，主要存在于哺乳动物；和β角蛋白(β-keratin)，主要分布于鸟类和爬行动物。哺乳动物有30种不同的角蛋白，可分为相对酸性和碱性两类多肽。由处于α-螺旋或β-折叠构象的平行的多肽链组成不溶于水的起着保护或结构作用蛋白质。

研究发现，角蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质。角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，包括毛发、指甲、羽毛等。是一种抗机械、抗化学刺激的蛋白质，存在于所有高等脊椎动物体中。角蛋白是一种不能直接为畜禽吸收利用的硬蛋白，主要存在于动物的毛发、羽毛和蹄之中，资源非常丰富，它必须经高温、高压、酸、碱或酶处理，变成短肽或游离氨基酸，才能被畜禽利用。角蛋白具有很强的抗牵伸性能，在动物体内起保护作用。

角蛋白的研究，2009年，张俊珍等人对羊驼皮肤角蛋白基因家族的表达进行了研究，指出：keratin家族有7个家庭成员表达，这些基因的表达对维持羊驼皮肤及其衍生物(毛发)的正常生理起着重要的作用。2010年，邢孟欣等人对辽宁新品系绒山羊角蛋白家族四个基因在皮肤中的表达及分析进行了研究，表明羊毛、羊绒的角蛋白组成和含量与其纤维的品质有密切关系。2011年，石国庆等人对角蛋白HGTP及其对羊毛发育的影响进行了研究，结果表明：HGTP家族成员KAP6、KAP7和KAP8基因表达对羊毛细度和弯曲等特性具有重要影响。

在双峰驼中，角蛋白是骆驼外胚层细胞上的蛋白质，对双峰驼皮肤及其毛发的正常生理起关键的作用。骆驼绒毛中角蛋白的组成和含量与绒毛的品质有密切关系。因此，对骆驼角蛋白的研究将有助于细胞生物学的发展。

发明内容

一种双峰驼角蛋白，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示：

(a)SEQ ID NO.2所示序列；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或／和叠加一个或多个氨基酸衍生得到的，且与(a)编码蛋白质具有相同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。

一种双峰驼角蛋白编码基因，其是与体内外胚细胞密切相关的基因，其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示：

(a)SEQ ID NO.1所示序列；

(b)由碱基简并或／和替代衍生的与(a)所述核苷酸序列90％以上同源性，且与(a)编码相同功能蛋白质的序列。

本发明还提供了一种双峰驼角蛋白基因的克隆和测序方法，该方法包括步骤：(1)组织分离(Isolation)；(2)总RNA的分离(Total RNA isolation)包括①提取RNA的准备工作；②组织总RNA提取；③组织总RNA的鉴定。(3)全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括：①引物设计及合成；②RT-PCR扩增；③克隆和测序，其PCR引物的正向引物为SEQ ID NO.3和反向引物为SEQ ID NO.4，其序列信息如下：

SEQ ID NO.3：5’-ATGGCCACCCAGTTCTGCTCC-3’

SEQ ID NO.4：Oligo dT；

上述从双峰驼耳部组织中分离提取总RNA为：将双峰驼耳部组织放入装有Trizol的匀浆器管中匀浆，离心分离，吸取上清液，在15-30℃温育5分钟，加氯仿，剧烈震荡，继续在15-30℃温育2-3分钟，再次离心分离，吸取上清液，加异丙醇混合均匀，然后15-30℃温育10分钟，离心分离，所得沉淀物加75％乙醇洗涤，离心分离后自然干燥或真空干燥得到总RNA。分离提取后的总RNA用分光光度计测定RNA含量和用琼脂糖电泳分析RNA的质量。

上述反转录PCR按照大连宝生物反转录试剂盒的要求进行反转录。

上述克隆和测序，包括PCR扩增片段的回收、回收片段同T载体的连接、质粒的转化、转化菌落的PCR鉴定与培养、质粒的回收、质粒的酶切鉴定和重组质粒的测序。

上述PCR扩增片段的回收按照上海华舜小量胶回收试剂盒的要求进行。

上述回收片段同T载体的连接用TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒。

上述质粒的转化为：将感受态细胞加入到回收片段同T载体的连接产物中，冰浴30分钟，然后在42℃水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟，加液体LB培养基，37℃复活50分钟，后涂布于含有氨苄青霉的LB平板上，37℃恒温培养10-15小时。

上述转化菌落的PCR鉴定与培养为挑选转化培养的单菌落，放入到加有PCR反应液的EP管中晃动，使单菌落充当模板；用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker(和样品一起电泳的参照物，通过对比来确定样品的大小)一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段；若得到目的片段，可挑取在LB平板上的与之对应的单菌落，放入含有的青霉素钠LB液体培养基中，37℃过夜摇菌培养，用于质粒回收。

上述质粒的回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒实现。

上述质粒的酶切鉴定采用双酶切法鉴定，选择内切酶Bam H I和Hin d Ⅲ。

本发明在提供了双峰驼角蛋白基因的cDNA序列和蛋白编码序列基础上；将人、鼠、牛等不同物种角蛋白基因的CDS序列和氨基酸序列进行同源性比较；对包括双峰驼在内的9个物种的九个角蛋白基因的CDS序列构建了系统发生树。

本发明中的双峰驼角蛋白基因的cDNA序列是通过以双峰驼组织中总RNA为模板，参考人、鼠、牛等物种的角蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼角蛋白基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。将双峰驼角蛋白基因cDNA序列中的编码序列(CDS)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO.2。

在SEQ ID NO.1中，RT-PCR产物长度为1662bp，电泳结果见附图1，其中49-51位为起始密码子ATG，1444-1446位为终止密码子TAA，49-1446位为编码蛋白质区域(CDS)。在SEQ ID NO.1，双峰驼角蛋白基因编码465个氨基酸。双峰驼与牛(NP_001179454)和猪(XP_003131480)的角蛋白核酸序列具有92％的相似性。双峰驼和人、鼠、牛等动物用Clustal X中对齐的角蛋白基因编码氨基酸序列同源性比较结果见附图2。

对包括SEQ ID NO.1在内的9个物种的九条角蛋白基因的CDS序列构建了系统发生树，结果发现：双峰驼角蛋白同牛和猪的进化距离最近，间接证明了所得到的序列确为双峰驼角蛋白基因。

本发明所得到的角蛋白的基因序列和该蛋白结构的数据可用于研究其在绒毛纤维发育中的重要作用，为阐明双峰驼绒毛形成机理和提高绒毛质量提供理论基础和依据，并能够为其它哺乳动物的绒毛组分研究奠定一定的生物学基础。

附图说明

图1为双峰驼角蛋白基因RT-PCR产物电泳图；

图2为构建系统发生树所用角蛋白氨基酸同源性比较；

图3为不同物种角蛋白氨基酸序列系统进化树。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1：双峰驼角蛋白基因cDNA序列的克隆

1、组织分离(Isolation)

从内蒙古阿拉善盟双峰驼，快速采得样品，将耳部组织样迅速放入液氮中冷冻后于-70℃保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。

2、总RNA的分离(Total RNA isolation)

(1)提取RNA的准备工作

玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍，180℃烘烤4小时。

匀浆器、电泳槽用3％的双氧水浸泡20-30分钟，再用0.1％的DEPC水冲洗.由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0.5％的SDS处理。

Tip头、EP管用0.1％的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。

双蒸水和溶液用DEPC处理，即每100ml水或溶液加0.1mlDEPC液，室温放置过夜，高压灭菌30分钟DEPC失活。

(2)组织总RNA提取

取100mg在液氮中冻存的组织样放入有1ml Trizol(trizal reagent，invitrogenBRL，USA)的匀浆器管中匀浆。4℃ 12000rpm离心10分钟。吸取上清液，15-30℃温育5分钟。加0.2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒。15-30℃温育2-3分钟。4℃ 12000rpm离心15分钟。吸取上清液，加0.8ml异丙醇，混合均匀。15-30℃温育10分钟，4℃ 12000rpm离心10分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清，加1ml75％乙醇洗涤RNA，4℃ 7500rpm离心10分钟。自然干燥或真空干燥RNA溶于水(RNase free)中分装，-70℃保存。

(3)组织总RNA的鉴定

通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖凝胶电泳分析RNA的质量，具体方法如下：电泳槽用RNA清洗液(100mM NaOH，1mM EDTA)浸泡4-5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入1×TBE待用。琼脂糖凝胶用1×TBE配制。在10ul上样缓冲液(2×TBE，13％菲可，0.1％溴酚兰，7M尿素)中加入1ul以上组织总RNA，65℃变性10分钟后立即放入冰水中2-3分钟。点样于琼脂糖凝胶中电泳。

3、全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)

(1)引物设计及合成

根据GenBanK发表的人(NP_003762)、鼠(NP_001167570)等物种的角蛋白基因mRNA序列ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼角蛋白cDNA为模版的PCR扩增，以获得双峰驼角蛋白基因cDNA序列。引物用Primer Premier5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3(正向)和SEQ ID NO.4(反向)，序列信息如下：

SEQ ID NO.3：5’-ATGGCCACCCAGTTCTGCTCC-3’

SEQ ID NO.4：Oligo dT。

(2)RT-PCR扩增

按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求进行反转录。反转录反应液组成：10ul 2×Bca 1st Buffer，4ul 25Mm MgSO4，1ul dNTPMixture，0.5ul Rnase Inhibitor(40U/ul)，1ul BcaBEST Polymerase(22U/ul)，1ul OligodT Primer，1ul RNA Sample，1.5ul Rnase Free dH2O，总体系为20ul。反转录反应条件：65℃1分钟，30℃5分钟(15分钟-30分钟内匀速升温)，65℃25分钟，98℃5分钟，5℃5分钟。PCR扩增条件：97℃变性5分钟；95℃30秒→55℃30秒→72℃1分钟，如此进行30次循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。

(3)克隆和测序

PCR扩增片段的回收。片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下：尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1.5mlEP管中。按每100mg琼脂糖加入300ulS1液的比例加S1液，50℃水浴10分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，10000rpm离心1分钟，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul W1液，10000rpm离心15秒，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul W1液，静置1分钟后，10000rpm离心15秒，倒掉管中液体。离心1分钟。将吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulT1液，静置1分钟后，10000rpm离心1分钟，EP管中液体即为回收的DNA。

回收片段同T载体的连接。连接用TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒，操作过程如下：在EP管中制备下列连接反应液：pMD18-T Vector(50ng/ul)0.5ul，DNA20-40ng，Solution 1 5ul，加dH2O至10ul。将上述反应液在16℃反应30分钟(过夜也可以)，产物用于转化感受态细胞。

质粒的转化。从—70℃冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。100ul感受态细胞加入10ul连接产物，冰浴30分钟。42℃水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加400ul液体LB培养基，37℃复活50分钟。取100ul铺于LB平板上，平板含0.1％(V/V)的氨苄青霉Amp(100mg/ml)。37℃恒温培养10-15小时。

转化菌落的PCR鉴定与培养。用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液(不含模板，是指引物、DNA聚合酶、dNTP、缓冲液及水加上刚才的单菌落就成了PCR反应体系)的EP管中晃动，使单菌落充当模板。用获得该片段的PCR条件进行扩增。PCR产物同Marker一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段。若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40ml LB液体培养基中，先在液体中加入0.1％(V/V)的青霉素钠(100mg/ml)，37℃过夜摇菌培养，用于质粒回收。

质粒的回收。质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下：将转化培养的菌液加入1.5mlEP管中，4000rpm离心，倒掉液体获细菌沉淀。细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心。在细菌沉淀中加入250ulP1液，振荡悬浮。加入250ulP2液，温和摇匀，室温静置4分钟。加入350ulP3液，温和摇匀。离心10分钟，将上清液小心移入吸附柱，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulW1，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulW1，静置1分钟，离心15秒，倒掉液体。离心1分钟。将吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulT1液，静置1分钟后，离心1分钟，EP管中液体即为回收的质粒。

质粒的酶切鉴定。为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒，采用双酶切法鉴定.本研究具体操作如下：根据TaKaRa pMD18-T Vector图，选择内切酶Bam H I和Hin d III.保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系：Bam H I 1ul，Hin d Ⅲ 1ul，10×K Buffer 2ul，DNA≤1ul，加dH₂O至20ul。30℃反应3小时。琼脂糖凝胶电泳检测。

重组质粒的测序。取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。

实施例2：双峰驼角蛋白基因编码序列同源性比较和系统发生树构建

1、双峰驼角蛋白基因编码序列同源性比较

在GenBank上搜索并获得人、鼠、牛等八种动物的角蛋白基因编码蛋白序列，将其同克隆测序获得的本发明获得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物学软件MEGA4上进行序列同源性比较(见附图2)。比较结果显示：SEQ ID NO.2序列与牛和猪的角蛋白氨基酸序列同源性为92.00％。

2、角蛋白基因编码序列系统发生树构建

在GenBank上搜索并获得人、鼠、牛等八种物种的8条角蛋白基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID NO.2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树(见附图3)。结果显示：双峰驼角蛋白基因同牛和猪的亲缘关系最近；间接证明了所得到的序列确为双峰驼角蛋白基因。

序列表

<110>内蒙古农业大学

<120>双峰驼角蛋白的蛋白编码序列

<160>4

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>1662

<212>DNA

<213>阿拉善盟双峰驼

<400>1

gccagaacct gagcttcttg ctaagctgca accttctctg ctagcatcat ggccacccag 60

ttctgctccc cgatcttctc ctctgggtct gtcaggggtc tctgtggcac agcaggcggc 120

atctctcggg tgtcctctgt ccgctctgtg ggctcctgca gggtccccgg tctggctggt 180

gtctcggggt cagcctcttc cgtcaggctg ggcctctctg gctttgggag ctgcttgccg 240

ggttcctatc tgtcctctgg gtaccactcc tctggctttg ctgggagcgg gggctggttc 300

tgcgagggct ccttcaatgg caacgagaag gagaccatgc agttcctgca cgaccgcctg 360

gccaactacc tggagaaggt gcggcagctg gagcgggaca atgcggagct ggagagccgc 420

atccgggagt ggtacgaggc tcagatcccg tacatctgcc cggactacca gtcctacttc 480

aagaccattg aggagctcca gcagaagatc ctgctgacta aggctgagaa ctccaggctg 540

gtcctgcaaa ttgacaacgc caagttggcg gctgacgact tccgaaccaa gtacgagacg 600

gagctgggca tgcggcagct ggtggaggct gacaccaaca gcctgcgcag aaccctggat 660

gagctcaccc tgtgcaaggc tgacctggag atgcaggtgg agtccttgaa ggaggagctg 720

atatgcctca agaagaacca cgaggaggaa gtcaacacacttcgatgcca acttggggac7 80

aggttgaatg tggaggtgga tgctgcccca ccagtggatc tcaacaagat cctggatgag 840

atgagatgcc agtatgaggc cctggtggag aataaccgta gagacgtgga ggcctggttc 900

aacacccaga ctgaggagct gaaccagcag gtggtgtcca gctcggagca gctgcagtgc 960

tgccagacag agctcatcga gctgagacgc aatgtcaacg ccctggagat cgagctgcag 1020

gcccagcaca gcatgcggaa ttctctggaa tccaccctgg tggagacaga ggcccgctac 1080

agctcccagc tggcccagat gcagtgcctg atcaccaacg tggagtccca gctggccgag 1140

atccgctgtg acctggagcg gcagaaccag gagtaccagg tgctgctgga cgtcaaggcc 1200

cgcctggagt cggagatcgc cacctaccgc cgcctgctgg agggagaaga ctgcaggctg 1260

cctgcccacc cttgtgccgc ggagtgcaag cctgccatta gagttcctca tgtctcaagc 1320

gtgccctgtg ccccgactgt gccctgcgcc ccagctgccc agctcagcac ccagatccgc 1380

accatcacgg aggagatcag agatgggaaa gtcatttcct ccagggagcg tgtgcagccg 1440

ctgtaactgg gcaggccctg gcccacagga tggagaacac ccctgtgggt cccggctcta 1500

aatgaccccc acttctcctt ccctagaggg actccccgct cagcagattt ttctaccaaa 1560

aaacttctta gattgtgttt ctggctttga cttcttttac gccgtgtaaa actaagcttc 1620

cctggaaatt tacccaataa agtgtgttct cttggcatag aa 1662

<210>2

<211>465

<212>PRT

<213>阿拉善盟双峰驼

<400>2

MATQFCSPIF SSGSVRGLCG TAGGISRVSS VRSVGSCRVP GLAGVSGSAS SVRLGLSGFG 60

SCLPGSYLSS GYHSSGFAGS GGWFCEGSFN GNEKETMQFL HDRLANYLEK VRQLERDNAE 120

LESRIREWYE AQIPYICPDY QSYFKTIEEL QQKILLTKAE NSRLVLQIDN AKLAADDFRT 180

KYETELGMRQ LVEADTNSLR RTLDELTLCK ADLEMQVESL KEELICLKKN HEEEVNTLRC 240

QLGDRLNVEV DAAPPVDLNK ILDEMRCQYE ALVENNRRDV EAWFNTQTEE LNQQVVSSSE 300

QLQCCQTELI ELRRNVNALE IELQAQHSMR NSLESTLVET EARYSSQLAQ MQCLITNVES 360

QLAEIRCDLE RQNQEYQVLL DVKARLESEI ATYRRLLEGE DCRLPAHPCA AECKPAIRVP 420

HVSSVPCAPT VPCAPAAQLS TQIRTITEEI RDGKVISSRE RVQPL 465

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<400>3

ATGGCCACCCAGTTCTGCTCC 21

<210>4

<211>

<212>DNA

<213>人工

<400>4

Oligo dT

Claims

1.一种双峰驼角蛋白，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示：

(a)SEQ ID NO.2所示序列；

2.一种双峰驼角蛋白编码基因，其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示：

(a)SEQ ID NO.1所示序列；

3.一种双峰驼角蛋白编码基因的获取方法，该方法包括如下步骤：

(1)从双峰驼耳部组织中分离提取总RNA；

(2)根据人、鼠及牛不同物种的角蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR，其中

引物的正向引物为SEQ ID NO.3：5’-ATGGCCACCCAGTTCTGCTCC-3’

反向引物为SEQ ID NO.4：Oligo dT；

(3)克隆和测序。

4.按照权利要求3所述的双峰驼角蛋白编码基因的获取方法，其特征在于从双峰驼耳部组织中分离提取总RNA为：将双峰驼耳部组织放入装有Trizol的匀浆器管中匀浆，离心分离，吸取上清液，在15-30℃温育5分钟，加氯仿，剧烈震荡，继续在15-30℃温育2-3分钟，再次离心分离，吸取上清液，加异丙醇混合均匀，然后15-30℃温育10分钟，离心分离，所得沉淀物加75％乙醇洗涤，离心分离后自然干燥或真空干燥得到总RNA。

5.按照权利要求3所述的双峰驼角蛋白编码基因的获取方法，其特征在于分离提取后的总RNA用分光光度计测定RNA含量和用琼脂糖电泳分析RNA的质量。

6.按照权利要求3所述的双峰驼角蛋白编码基因的获取方法，其特征在于上述反转录PCR按照大连宝生物反转录试剂盒的要求进行反转录。

7.按照权利要求3所述的双峰驼角蛋白编码基因的获取方法，其特征在于上述克隆和测序，包括PCR扩增片段的回收、回收片段同T载体的连接、质粒的转化、转化菌落的PCR鉴定与培养、质粒的回收、质粒的酶切鉴定和重组质粒的测序。

8.按照权利要求7所述的双峰驼角蛋白编码基因的获取方法，其特征在于上述PCR扩增片段的回收按照上海华舜小量胶回收试剂盒的要求进行。

9.按照权利要求7所述的双峰驼角蛋白编码基因的获取方法，其特征在于上述回收片段同T载体的连接用TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒。

10.按照权利要求7所述的双峰驼角蛋白编码基因的获取方法，其特征在于上述质粒的转化为：将感受态细胞加入到回收片段同T载体的连接产物中，冰浴30分钟，然后在42℃水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟，加液体LB培养基，37℃复活50分钟，后涂布于含有氨苄青霉的LB平板上，37℃恒温培养10-15小时。

11.按照权利要求7所述的双峰驼角蛋白编码基因的获取方法，其特征在于上述转化菌落的PCR鉴定与培养为挑选转化培养的单菌落，放入到加有PCR反应液的EP管中晃动，使单菌落充当模板；用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段；若得到目的片段，可挑取在LB平板上的与之对应的单菌落，放入含有的青霉素钠LB液体培养基中，37℃过夜摇菌培养，用于质粒回收。

12.按照权利要求7所述的双峰驼角蛋白编码基因的获取方法，其特征在于上述质粒的回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒实现。

13.按照权利要求7所述的双峰驼角蛋白编码基因的获取方法，其特征在于上述质粒的酶切鉴定采用双酶切法鉴定，选择内切酶Bam HI和Hin d III。