TW482656B - Saccharide composition containing trehalulose, its preparation and uses - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 48265^ A7 ________B7 五、發明説明（1 ) I明之背景 塗明之領域 本發明係關於一種包含海藻露糖之醣組成物，彼之製 備及其用途；更詳細地說，係關於一種包含海藻露糖之醣 組成物’獲得自麥芽糖/海藻糖轉化酵素作用於含蔗糖溶 液來生產海藻露糖，一種製造此醣組成物之方法，包含讓 一麥芽糖/海藻糖轉化酵素作用於蔗糖溶液來生產海藻露 糖之步驟，以及含有此醣組成物之組成物。 先前之枝藝說明 海藻露糖，由葡萄糖及果糖所構成之雙醣類，爲一還 原醣類。其化學式爲1 -0_ a — D -葡萄哌喃糖基一 D -果糖。在自然界裡，蜂蜜僅含微量的海藻露糖。因爲海 藻露糖是一非結晶醣，易溶於水，沒有實質的蛀齒性，以 及具有約蔗糖4 0%之甜度，所以有很大的期望將它用於 食品，特別是高甜味食品如豆醬（bean jams)及甜豆膠 (sweet jellies of beans)。而已知海藻露糖，如披露 於 'Seito-Gijutsu-Kenkyu-Kaishi’ ，Νο·34, pp. 3 7 一 44 (1985)，是用 Prot am i nobac t er rubrum 之具 醣轉移活性之a -葡萄糖苷酶作用於蔗糖而產生。在如此 酵素反應中，海藻露糖係以生產結晶泊雷糖或6 - ◦ - a 一 D —葡萄哌喃糖基- D -果糖爲主時，所產生的副產品 。雖然以使用 Pseudomonasmesoacidophila MX — 4 5 固 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· —*.---訂 -4 - 482656 A7 B7 五、發明説明（2 ) 定化細胞自蔗糖生產海藻露糖的方法已被披露於日本專利 公開公報1^〇.169，190/92或使用固定化八21·-obacterium radiobacter MX — 2 3 2 細胞，披露於曰 本專利公開公報No.130，886/93，實際上還 未使用於工業量產，因爲它們的酵素活性及熱安定性不夠 發明之總結 本發明提供一種從蔗糖生產相當高產量之海藻露糖及 易於工業化生產的方法，及提供一種包含這些由此方法所 製備的醣類之醣組成物及其用途。 發明之詳細說明 本發明人積極地研究用來生產海藻露糖的方法。結果 ，他們無意中發現麥芽糖/海藻糖轉化酵素，如披露於由 本發明人所申請的日本專利公開公報 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

No. 170，977/95,能將麥芽糖轉化爲海藻糖 並自蔗糖生成海藻露糖，且有令人滿意的高產量。因而建 立生產含海藻露糖之醣組成物的方法，其特徵爲包含麥芽 糖/海藻糖轉化酵素作用於含蔗糖之溶液的步驟。以及建 立由此方法所製造的含海藻露糖之醣組成物，及含有該醣 組成物之組成品如食品、化粧品、或藥品。因此，本發明 人完成了本發明。 如披露於日本專利公開公報No. 170，977/ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 一 5 - 482656 A7 _______ 五、發明説明（3 ) 9 5，可用於本發明之麥芽糖/海藻糖轉化酵素係分子內 醣類轉移酵素， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4315 )及 Pseudomonas putida Η2 6 2 ( FERM HP-45 79 )， 以及TheiMnus屬微生物。這些酵素將麥芽糖轉化成海藻糖 或將海藻糖轉化成麥芽糖。例如，這些酵素具有以下物化 特性： (1) 作用：將麥芽糖轉化成海藻糖或將海藻糖轉化 成麥芽糖； (2) 分子量：在硫酸十二烷基鈉聚丙醯胺膠體電泳 (SDS — PAGE)上，大約爲 57，000 — 1 2 0，0 0 0 道耳吞； (3) 等電點（Pi):在使用雙性電解物之聚焦電 泳中，大約爲 3_ 8—5_ 1; (4 )活性之抑制：受1 m M G u ，H g ++及 Tris-HCl緩衝液；以及 (5)來源：來自微生物。 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 麥芽糖/海藻糖轉化酵素反應系統之平衡點主要傾向 於海藻糖之形成，以麥芽糖爲基質生產海藻糖，可增加到 大約 80w/w%的產量，（除非特別另外指明， / w 將被縮寫爲。 除上述微生物之外，其它能夠生產麥芽糖/海藻糖轉 化酵素的微生物種類及突變種係屬於Pimerobacter，Pseudomonas 及 Thermus屬 ，可被選擇性 使用0 微生物 of the genus Thermus such as Thermus aquaticus ATCC 25104 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -6 - 482656 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（4 ) ,Thermus aquaticiis ATCC 27634, Thermus aquaticus ATCC 33923, Thermus filiformis ATCC 43280, Thermus ruber ATCC 35948, Thermus sp. ATCC 43814，及Therm-ussp. ATCC 438 1 5可隨意使用。 任何合成的及天然的培養基均可被用來培養上述微生 物，只要它們在其中生長並生產所要的酵素。可用於本發 明之碳源包括那些可被微生物消化的：例如，醣類如葡萄 糖、果糖、糖蜜、海藻糖、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨 糖醇及澱粉部分水解產物，及有機酸，如檸檬酸及琥珀酸 ，以及它們的鹽類可被使用。依據它們的類型而適當地選 擇這些碳源的濃度。例如，在使用葡萄糖爲碳源的情況下 ，較佳的濃度爲4 Ow/ν%或更低，更特殊情形下， 1 0 w / v %或更低的濃度，在關於微生物之生長及繁 殖上，更是較適宜使用。可用於本發明之氮來源爲，例如 ，無機含氮化合物如銨鹽及硝酸，及有機含氮化合物，如 尿素、玉米浸液、酪蛋白、蛋白膝、酵母抽出物及肉抽出 物。可用於本發明之無機成分有，例如，鈣、鎂、鉀、鈉 、磷酸、錳、鋅、鐵、銅、鉬及鈷之鹽類化合物。 任何培養條件均可用於本發明，只要該微生物在其中 生長並生產本發明有用的麥芽糖/海藻糖轉化酵素。通常 該微生物係有氧培養於4 一 8 0°C之溫度下，以2 0 -75 °C爲佳，及pH值5 - 9間，以6 - 8. 5爲佳。任 何培養時間均可用於本發明，只要該微生物能增殖，以大 約10 — 10 0小時爲佳。雖然培養基之溶氧（DO) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 二\" 線- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 Ί 一 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 482656 A7 ___B7_ 五、發明説明（5 ) 濃度未特別設限，逋常以〇· 5—20ppm爲佳。DO 通常以調節通氣及攪拌率、氧氣供給及增加發酵槽內壓來 控制在所欲之範圍。菌的培養可以是槽式或連續式。 培養完成之後，所要的麥芽糖/海藻糖轉化酵素可從 所得的培養菌液中收集。既然此酵素活性可同時在有細胞 及無細胞的培養液中發現，粗酵素就能自其中取得。全部 的培養菌液可被當作粗酵素用。常用的固一液態分離方法 可用來分離此培養基及細胞。例如，用離心分離法以直接 分離培養菌液，藉預包覆（precoating)或加入過濾劑於 此培養菌液中之過濾分離法，及使用薄膜過濾器之分離方 法，如平面過濾器或中空纖維皆可選擇性地使用。無細胞 的培養液可被用作粗酵素，最好是應在使用前以常用的方 式濃縮之：例如，使用硫酸銨之鹽析法，使用丙酮及醇類 化合物沈降法，及使用薄膜之濃縮法，如平面過濾器及中 空纖維皆可用來濃縮此無細胞的培養液。 細胞內的酵素可以常用的方法自細胞萃取出來藉以得 到粗酵素：例如，這類粗酵素可使用超音波打破法、使用 玻離球及礬土之機械打破法及其它使用高壓碎裂機（fre-nchpr ess)的打破方法自細胞中萃取出來。該抽出液可以 用離心分離或薄膜過濾得到澄清粗酵素溶液。 無細胞的培養液、其濃縮物及細胞抽出液可用常用的 方法固定化之：例如，用結合法固定到離子交換樹脂、共 價鍵結及吸附法固定到樹脂及薄膜及使用可用來固定化之 高分子量物質之細胞含有物方法。分離自微生物培養液之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-8 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 482656 A7 B7 五、發明説明（6 ) 細胞可當粗酵素用’，該細胞也可被固定化而當成固定化酵 素使用：例如，細胞與褐藻酸鈉混合，然後於該混合物中 滴入氯化鈣溶液以形成膠化顆粒，然後再用聚乙烯亞胺及 戊二醛處理以形成固定化酵素。 該粗酵素可不經進一步處理直接使用，也可在使用前 以常用的方法純化之。例如，可使用硫酸銨鹽析自打破細 胞之抽出液獲得濃縮酵素，然後透析該濃縮酵素，然後連 續用多種管柱層析純化技術；使用’DEAE-TOYOPEARL®' 之陰離子交換管柱層析、使用HJTYL-TOYOPEARL®之疏 水性管柱層析、使用’ MONO Q HR 5 / 5 '樹脂之陰離子 交換管柱層析，以及使用'TOYOPEARL HW5 5 '之膠體過 濾管柱層析而得到電泳分析上爲均質之酵素。 用於本發明測定該麥芽糖/海藻糖轉化酵素活性之方 法如下：加lml酵素溶液到lml含20w/v %麥 芽糖當作基質之10mM磷酸緩衝液（pH7. 0)，該 混合物反應於25，35或60 °C下60分鐘，然後加熱 該反應混合物於10 0°C下1 0分鐘以停止酵素反應。用 5 0mM磷酸緩衝液（pH7. 5)精確稀釋該反應混合 物11 一倍，力卩0 . 1 ml含 1單位/ ml海藻糖酶 之溶液到0. 4m1稀釋液，將所得之混合物溫浴於45 °C 1 2 0分鐘，然後用葡萄糖氧化酶法定量該混合物之葡 萄糖含量。用事先加熱1 0 0°C 1 0分鐘之去活海藻糖酶 及酵素溶液，同上法測定葡萄糖含量當作對照組。以上述 方法，根據葡萄糖含量之增加來決定以麥芽糖/海藻糖轉 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-9 - 482656 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7 五、發明説明（7 ) 化酵素生產海藻糖之含量。1單位之麥芽糖/海藻糖轉化 酵素活性係定義成每分鐘形成1 umole海藻糖之酵素量。 來自 P i m e r 〇 b a c t e r、P s e u d 〇 m ο n a s 及 T h e r m u s 屬微生物 之麥芽糖/海藻糖轉化酵素反應溫度分別爲2 5、3 5及 6 0 °C。 用於本發明之麥芽糖/海藻糖轉化酵素之基質濃度未 特別限定。本酵素甚至以包含0. lw/v%或50w/ v %蔗糖溶液當作基質反應生產海藻露糖。含不完全溶解 的基質之高濃度溶液也可用於本發明。適宜之反應溫度係 在不使酵素失活的範圍，特別是高達約8 0°C之溫度，以 約0-7 0°C爲佳。個別來說，對來自Thermus屬微生物 的麥芽糖/海藻糖轉化酵素，自蔗糖生產較多產量的海藻 露糖，溫度約爲3 0 — 5 0 °C。酵素反應的反應pH通常 設定於pH值5. 5—9. 0，以pH值約6. 0— 8. 5爲佳。酵素之反應時間係視酵素反應狀況來決定。 當使用之麥芽糖/海藻糖轉化酵素量約10 - 1 ，000 單位/g基質，以乾燥固形物爲基礎（d. s . b .)， 約爲0. 1 — 200 小時之間。 如此獲得的反應混合物，海藻露糖含量通常至少爲總 量之1 0%，以3 0%或更高較佳，8 0%或更高則更較 佳。 如此獲得的反應混合物可處理以過濾及離心除去不溶 物、以活性碳除色、Η -及0H -型離子交換樹脂去鹽， 及濃縮成糖漿狀產物。如果有必要，濃縮物可進一步乾燥 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1·1_11 I Μ- I JT— I -I — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

'1T 線 -10 - 482656 A7 B7 五、發明説明（8 ) 成粉狀產物。 如果有必要，這些糖漿狀及粉狀產物可以進一步純化 。例如，這些產物可用如離子交換樹脂、活性碳或矽膠之 管柱層析來劃分以促進富含海藻露糖之產物的生產。管柱 層析分離出來的蔗糖可隨意地再利用，作爲生產海藻露糖 之麥芽糖/海藻糖轉化酵素的基質。 如果有必要，此含海藻露糖之醣組成物可用蔗糖酶水 解之或利用環狀麥芽糊精聚葡萄糖基轉移酶或葡萄糖基轉 移酶進行醣類轉移作用以控制甜味及黏性。該醣組成物可 進一步以酵母菌處理去除可發酵之醣類。所得到的產物可 處理以上述純化方法，如離子交換管柱層析去除葡萄糖及 果糖，然後收集富含海藻露糖之產物，接著純化及濃縮該 產物以獲得糖漿狀產物。如果有必要，該糖漿狀產物可被 進一步乾燥成粉狀產物。 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 離子交換管柱層析之實施例，如披露於日本專利公開 公報Nos. 23，799/83及72，598/83 強酸性陽離子交換樹脂管柱層析可被有利地使用於去除共 存的醣類及收集劃分富含海藻露糖。此情形下，固定層， 移動層，及擬移動層方法可被選擇性使用。 如此獲得的包含海藻露醣之醣組成物具有相當高的水 溶性及高品質和有風味的甜味。由於海藻露糖是藉小腸的 水解酵素水解成葡萄糖及果糖，當食入後它們很容易被活 體所吸收消化及同化，且用作能量的來源。因爲海藻露糖 不會被引起蛀牙的微生物發酵及抑制從蔗糖而來的不溶聚 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -11 - 482656 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（9 ) 葡萄糖之生成，故它們可被用作不會引起蛀牙之甜味料。 如上述，本醣組成物可被滿意地使用爲一種甜味料、 風味改良劑、品質改良劑、或安定劑用於如食品、煙草、 香煙、飼料、寵物飼料、化妝品及藥品等產品。 本醣組成物可直接用來當作一種甜味調味料。如果有 必要，該組成物可與足量之一或多種其它甜味料一起使用 ，例如，粉末糖漿、葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、異構 化蔗糖、蜂蜜、楓糖、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、二 氫查酮、甜菊精、α —醣脂甜菊精、rebaudioside、甘草 素、L 一天冬胺酸基L -苯丙胺酸甲酯、糖精、甘胺酸及 丙胺酸，及/或充填物，如糊精、澱粉及乳糖。 由於本醣組成物具備與其它具有酸味、酸、鹹味、苦 味、澀味，及非常美味的物質在一起調和良好的滋味，及 具有令人滿意的耐酸度及耐熱度，它們可被自由用於一般 食品作爲甜味料、風味改良劑、或品質改良劑。 本醣組成物可當作調味料用於醬油、粉末醬油、、 miso灰、Afunmatsumiso’ （一種粉末 miso) ，、moromi "(一種精製的清酒），’hishio"(—種精製的醬油 )，Murikake 〃（調味之魚粉），蛋黃醬，調味醬，醋 ^ " sanbai-zu"(一種含糖、醬油及醋的調味汁）， funmatsu-sushi-su〃（壽司用粉末醋），、chuka-no -moto# ( —種中國菜用即食混合調料），、tentsuyi^ (一種日本油炸食品用調味醬），>11^以31^11"(—種用 於日本細麵的調味醬），調味醬，番茄醬，’ takuan- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -i 11111·1-^-11i 111n n 11 · -線 - 12 - 482656 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（10 ) zuke-no-moto〃 種日本白蘿蔔用即食混合調料），、 hakusai-zuke-no-moto 〃（一種即食混合調料用於中國大 白菜），^yakiniku-no-tare〃（一種調味醬用於日本烤 肉），加哩麵儒，即食滷肉混合，即食湯料混合，、 dashi-no-moto〃 （一種即食高湯混合），混合調味料， ♦mirin’ （一種甜清酒），、shin-mirin〃（一種合成 的味淋），餐桌用砂糖，及咖啡用糖。 本醣組成物亦可用來增甜及改良’ wagashi"(日本 清酒）之風味及品質，如’ senbei、（一種米果），、 araremochi 〃（一種方塊米糕），’〇koshi 〃（一種小米 及米製成的米糕），’mochi"(—種米麵團），’manju (一種甜麵包與豆醬），’uiro 〃（一種甜米膠凍） ，(—種豆醬），’yokan"(—種甜豆醬），， m i z u - y 〇 k a η ’ （一 種軟質 a d z u k i —豆膠），^ k i n g y 〇 k u ' (一種 yokan)，果凍，pao de Castella 及、amedama^ (一種日本太妃糖）；糖果點心類如甜麵包、餅乾、脆餅 乾、小西餅、派、布丁、鮮奶油、卡士達奶油（custard cream)、奶油泡芙、鬆餅、海綿蛋糕、甜甜圈、巧克力 、口香糖、牛奶糖及硬糖果；冷凍點心類，如冰琪淋及 水果碎冰；糖獎如’kajitsu-no-syrup-zuke〃（一種糖 漬水果）及Λ korimitsu"( —種用於刨冰之糖漿）；醬 如麵粉醬，花生醬，水果醬及塗料；加工水果及蔬菜如果 凍，果皮凍，’糖漿一 zuk，（醃漬水果）及’toka"( 糖漬果實）；醃瓜及鹽酶產品如’fukujin-zvke〃（紅色 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· rv't» -13 - 482656 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（11 ) 醃蘿蔔），> bettha-zuk，（一種整棵新鮮的醃蘿蔔） ，’ senma i-zuke〃 （一種新鮮的切片酸蘿蔔）及> rakkyo_zukeA (醃冬蔥）；肉類產品，如火腿及香腸； 鮮肉產品如醃魚肉，魚香腸，’ kamaboko"(—種蒸的魚 漿），’chikuwa'(—種魚漿）及 ’tenpura"( —種日 本油炸魚漿）；’ chinmi"(作料）像是、 uni-no-shiokara 〃（海參的鹽漬內臟），、 ika_no-shiokara〃（烏賊的鹽漬內臟），、su-konbu〃 (加工海帶），’sakisurume 〃（乾烏賊條）及、 fugu-no-mirin-boshi 〃（一種乾燥味淋調味的河膝）； ’ tsukudan〆（醬油中熬乾的食物），如醬油中熬乾的 紫菜、可食的野生植物、乾烏賊、魚及甲殼類；家常菜， 如’nimamea"(煮熟的豆子），馬鈴薯沙拉及、 konbu-maki"(—種海帶捲）；牛奶產品；罐頭及瓶裝產 品如那些肉，魚肉，水果及蔬菜的罐頭；酒精飮料如清酒 、合成的清酒、葡萄酒及烈酒；清涼飮料，如咖啡、茶、 可可、果汁、碳酸飮料、乳酸飮料，及包含乳酸菌之飮料 ;速食食品，如速食布丁粉、速食蛋糕粉，及★ sokuseki-shiruko 〃（一種含adzuki —豆湯加米糕之速食 混合物）及速食湯粉；及飲料，如嬰兒食品、療養食品、 添加營養份之飮料、胜肽食品，及冷凍食品；以及用來增 進上述之食品之風味及品質。 本醣組成物可被進一步使用於飼料及寵物飼料，供應 如家畜、家禽、蠶及魚類以增進其口味之偏好及增進動物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X 297公釐） ----*- - ii -批衣— I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，訂 線 -14 - 482656 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（12 ) 生長。這些醣組成物可隨意當作一種甜味料、風味改良劑 、掩蓋劑或品質改良劑，以固態、糊或液態形式用於其它 包含煙草、香煙、化妝品及製藥產品，如牙粉、口紅、胭 脂、護唇膏（chapped lips)、內服藥、藥錠、藥片、滴 狀鰭魚肝油、口香片、口服提神劑、漱口水。 加入本包含海藻露糖之醣類組成物到上述產品中的方 法有包括常用的方法，例如，混合、捏和、溶解、融化、 浸泡、滲透、噴灑、塗抹、包裹、噴霧、注射、結晶及固 化。通常加入上述組成物的海藻露糖的量爲0.1 % d. s. b.或更多，以1 %或更多爲較佳。下列試驗 更詳細地解說本發明： 試驗 1 酵素之生產 液體營養培養基包含0. 5w/v%蛋白膝，〇.1 w/v%酵母萃取物，〇. 〇7w/v硝酸鈉，0. 01 w/v%磷酸氫二鈉，0. Olw/ν硫酸鎂及水，調到 p Η 7 . 5。100ml爲一份量之培養基置於500 - m 1之Erlenmeyer三角瓶，以殺菌签於1 2 Ot滅菌2 0 分鐘，冷卻，然後用 Thermus aQuaticus ATCC3 3 9 2 3 之保存菌株接種。於6 0°C下，以2 0 0 r pm攪拌培養 2 4 小時，以得到當作種菌之培養液。 大約2 0 L同上述所用的新鮮製備之液體營養培養基 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X M7公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝- 訂 線- -15 - 482656 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（13 ) 分別置於3 0 - L發酵槽，加熱滅菌，冷卻至6 0°C，然 後以 lv/v%種菌接種，於60°C、pH6. 5 — 8_ 0及攪拌通氣下培養約20小時。 試驗 2 酵素之純化 將在試驗1所製備之培養液離心以獲得約〇 . 2 8

k g溼重之細胞。將該細胞懸浮於1 OmM磷酸緩衝液（ P Η 7 . 〇 )中。大約1 . 9 L的細胞懸浮液以’ MODEL US300灰一種由 Nihonseiki Kaisha Ltd.，Tokyo,Japan所 商品化的超音波震碎機處理以打破細胞。將所得之混合物 於15，OOOG離心30分鐘以獲得一大約1. 8L的 上清液。將硫酸銨加到並溶於該上清液中以得到0 . 7飽 和度，然後讓該溶液靜置於4 °C過夜以形成沈澱物，然後 離心收集此沈澱物。 將該沈澱物溶於1 OmM磷酸緩衝液（pH7. 0) ，對相同之新鮮製備緩衝液透析2 4小時，離心去除不溶 物質β將如此獲得的上清液1，560ml分成三份，分 別通入陰離子交換管柱層析，使用5 30ml之’ DEAE-TOYOPEARL650’ 膠體（來自 MitsubishiChemical Industries Ltd· , Tokyo, Japan ) ° 麥芽糖/海藻糖轉化酵素被該膠體所吸附，然後以一 新鮮製備之含鹽同樣緩衝液自管柱溶離之。收集該具酵素 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 訂 -16 - 482656 A 7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（14 ) 活性之溶離液並和在一起，再將該溶液通入疏水性管柱層 析，使用填入 3 8 0 m 1 之、BUTYL-TOYOPEARL®650，膠 體之管柱（來自 Tosoh Corporation, Tokyo, Japan)。 該吸附於膠體之麥芽糖/海藻糖轉化酵素，以包含1 M到 0 Μ硫酸銨之直線梯度溶液自管柱溶離出來，然後收集有 酵素活性之劃分。 將該溶離之酵素活性劃分收集在一起，並通入膠體過 濾層析，使用380ml之a TOYOPEARL ®HW-55S 〃膠體 (來自 Tosoh Corporation, Tokyo, Japan)，然後收集 有酵素活性之劃分。 將該劃分和在一起並通入陰離子交換管柱層析，使用 1 0 m 1 之 ’MONO Q HR5/5"膠體（來自 Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden)，然後將一 含鹽0. 1到0. 3 5M之直線梯度溶液通入該管柱，並 收集有酵素活性之劃分。因此而得到電泳分析上爲單一蛋 白質帶之麥芽糖/海藻糖轉化酵素。該酵素之比活性爲 1 3 5單位/mg蛋白質。 試驗 3 對醣類之作用 用50單位/g醣類d. s. b·之麥芽糖/海藻糖 轉化酵素作用於醣類以檢查是否該醣類可作爲酵素使用之 基質。爲此目的，葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 -線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ^ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 482656 A7 B7 五、發明説明（15 ) 、海藻糖、新海藻糖、曲二糖、異麥芽糖、麥芽糖醇、纖 維二糖、苦杏仁糖、蔗糖、海藻露糖、松二糖、麥芽露糖 (maltulose)、泊雷糖或乳糖被製備成最終濃度爲5 w / v %之溶液。 在每一溶液中加入50單位/g基質d.s. b.之 以試驗2方法所獲得之麥芽糖/海藻糖轉化酵素，然後該 混合物於50°C及ρΗ7· 0進行酵素反應48小時。酵 素反應前及反應後，從反應混合物中取樣，點在薄層層析 (以下簡稱爲L ）平板，使用>KIESEL GEL60〃 ’ 一* 種銘製 TLC 板 ’ 20x20 cm (來自 Merck & Co. , Inc. , N. J.，USA)，來檢測該酵素是否作用於受測醣 類。該TL C所使用之溶劑系統爲1 一丁醇、吡啶及水（ =6 : 4 : 1體積比），每一個樣品展開一次。噴灑含 2 0 v/v%硫酸之甲醇溶液到平板上，然後於1 1 〇°C 加熱平板1 0分鐘以呈色之。測到有酵素產物之反應混合 物則以氣相層析法（以下簡稱爲>GL C")分析其醣組 成物。從反應混合物中取樣，乾燥，溶解於吡啶，然後在 形成肟類化合物後將之三甲基矽化，然後分析所得產物。 用於此試驗之氣相層析設備及條件爲 >GC - 16A" (Shimadzu Corporation，Tokyo，Japan);不鏽鋼管柱 ，直徑 3mm 及 2m 長，填入 2% ’ 0V-17/CHR0M0S0L VE W〃（來自 GLSciences Inc.，Tokyo, Japan);用氮氣當 作攜帶氣體，流速40 ml/分鐘；管柱烘箱溫度爲 160 — 320C;溫度上升速度爲7. 5C/分鐘；及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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r P 五、發明説明（ΐβ ) 偵測器爲氫氣火焰離子偵測器。結果列於第i表。 第1表 基質 酵素作用 基質 酵素作用 葡萄糖 - 麥芽糖醇 麥芽糖 + + + 纖維二糖 一 麥芽三糖 一 苦杏仁糖 — 麥芽四糖 - 蔗糖 + + 海藻糖 + + 海藻露糖 + 新海藻糖 + 松二糖 + 曲二糖 - 麥芽露糖（maltul ose) + 烏糖（Nigerose) - 泊雷糖 + 異麥芽糖 一 乳糖 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 註·在a酵素作用♦行中，、一"符號表示酵素反應 前後沒有改變；表示基質之減少及產物之生成量少 於25%; A++"表示基質之減少及產物之生成量至少 25%但少於75%; >+++'表示基質之減少及產物 之生成量至少7 5%. 如第1表中的結果明白顯示，用於本發明之麥芽糖/ 海藻糖轉化酵素可作用於麥芽糖及海藻糖，以及新海藻糖 、蔗糖、海藻露糖、松二糖、麥芽露糖（maltu lose) 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -19 - 482656 A7 B7 五、發明説明（17 ) 及泊雷糖，特別是所測試中的醣類-蔗糖無意中被發現。 試驗4 酵素反應之產物_ 試驗4 一 1 來自蔗糖的產物 將100單位/g基質d· s. b.之以試驗2方法 所獲得之麥芽糖/海藻糖轉化酵素加到最終濃度1〇w/ v%蔗糖水溶液中。然後該混合物於5 0°C及pH6. 5 進行酵素反應4 8小時。以類似試驗3 G L C方法分析該 反應混合物之組成。爲確認實物本體，未形成肟化合物之 三甲基矽化衍生物也被用來當樣品分析。結果列於第2表 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 一 20 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 482656 A7 B7 五、發明説明（18 ) 表2 醣類 GLC滯留時間（分鐘） Saccharide 醣組成（％) 二甲基矽化 衍生物 形成肟化合物之三 甲基矽化衍生物 果糖 2. 9及3· 9 4.2 5. 7 葡萄糖 4.0及4. 8 4.8 6. 0 A 蔗糖 11.6 11.6 12.3 X 12.5 及 12.7 13. 7 73.4 其它醣類 — — 2. 6 B 海藻露糖 12.5 及 12.7 13. 7 — 註： 表中、A， 及〃符號分別指 ''反應混合物# 及a標準醣類 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂 -線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）_ 21 - 482656 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（19 ) 如第 2 表中的結果明白顯示，一未知物大量 地生成自蔗糖，而該物質形成肟化合物前或後之三 甲基矽化衍生物滯留時間與海藻露糖的結果相同。爲確認 該物質，使用製備於試驗8之高純度含海藻露糖粉 末進行以下確認測試： (1 )醣組成 以GLC分析〇. 5Ν硫酸水解物質所形成之 產物，除了完整的物質外，測得葡萄糖及果糖之莫 耳數比爲1 : 〇. 83。考慮己醣及酮醣變成酸之穩定性 ，可判斷該物質由等莫耳數之葡萄糖及果糖組成。 (2 )酵素水解 不會被來自酵母菌之蔗糖酶所水解。會被來自酵母菌 之α-葡萄糖苷酶水解成莫耳數比爲1: i之葡萄糖及果 (3 )分子量 以FD— MS分析，分子量爲342。 (4 )旋光率 〔αΠ0 + 57·7〇 (H20，c = 5) 海藻露糖標準物：〔a〕f + 57. 1°C(H20， c = 5 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） - 22 - 482656 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（2〇 ) 根據以上事實該物質〃係一由葡萄糖及果糖所 組成之雙醣，並且其他的性質與海藻露糖相同，可判斷該 物質〃爲海藻露糖’ 1一〇 - α — D -葡萄呢喃糖基 一 D —果糖。比較G L C所分析之標準物之滯留時間，顯 示其他經麥芽糖/海藻糖轉化酵素水解後形成自蔗糖之次 要成分爲泊雷糖及松二糖。 這些結果明白顯示，麥芽糖/海藻糖轉化酵素將麥芽 糖轉化成海藻糖及海藻糖轉化成麥芽糖，以及將蔗糖轉化 成海藻露糖。該酵素實質上不能將海藻露糖轉化成蔗糖。 試驗4 — 2 來自蔗糖產物之糖組成 將大約3 3 0單位/g以試驗2方法獲得之純化麥芽 糖/海藻糖轉化酵素加到一最終濃度爲1Ow/v%之蔗 糖水溶液，並讓該混合物於40 - 70 °C及pH6. 5進 行酵素反應3 0分鐘。然後，類似試驗3以G L C分析該 反應混合物之糖組成。結果列於第3表。 ϋϋ*> ·ϋϋ ·1·ϋ m-— 1__11 I 1^1 士 mu I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 一 23 - 482656

7 B 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（21) 表3 溫度 (°C) 糖組成（％) 果糖 葡萄糖 蔗糖 海藻露糖 松二糖 泊雷糖 40 3. 4 3. 9 7. 8 81. 0 1.3 2. 6 45 5. 5 5. 7 5.2 78. 8 1. 6 3. 2 50 8. 2 8. 9 3. 7 73. 7 1. 8 3. 7 55 11. 7 12.4 3. 0 67. 6 1. 7 3. 6 60 15. 3 16.2 2.9 59. 6 2. 0 4. 0 65 19. 6 19. 3 3.8 51. 8 1.8 3. 7 70 21. 3 21.1 7. 7 45. 7 1.4 2. 8 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）_ 24 - 482656 A7 B7 五發月3(表i的結果明白顯示’用於本發明之麥芽糖/ 海藻糖轉化酵素形成一醣組成物含大約45一80% d s b•之海藻露糖。海藻露糖之產量隨溫度降低而 增加，而該產量隨溫度增加而降低。該酵素的特徵爲其使 得海藻糖對泊雷糖之比例較高’意即海藻露糖/泊雷糖之 比例爲1 4或更高’及其& 且％牧1胃’ 泊雷糖含量僅爲4 % d _ s . b _或更低。以本酵素生產 含海藻露糖之醣組成物’與傳統酵素生產含海藻露糖之醣 組成物，在海藻露糖/、泊雷糖比例及彳白雷糖含胃有日月顯差 異。 試驗5 酵素量對海蕹霡糠形成之影響 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· .·訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在1 0%蔗糖溶液中加入2、5、1 〇、2 0、5 0 、100或200單位/g蔗糖d· s. b.之以試驗2 方法獲得之純化麥芽糖/海藻糖轉化酵素，讓該混合物於 40°C及pH6_ 5進行酵素反應，於指定的間隔時間取 樣自該反應混合物。於1 0 0°C加熱樣品1 〇分鐘以除去 殘留酵素，然後以類似試驗3之G L C分析之。每一反應 時間使用之酵素量及該反應混合物中海藻露糖之含量列於 第 4 表。 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -25 - 482656 A7 B7 五、發明説明（63 ) 表4 反應時間 海藻露糖產量（％) (分鐘) _ 酵素量（單位/g蔗糖） 2 5 10 20 50 100 200 24 0.3 1.5 6.2 14.3 40.3 58.0 72.3 48 0.6 3.0 11.1 23.5 56.5 72.3 80.9 72 0.9 4.4 15.4 30.7 65.2 78.8 79.2 96 1.1 5.8 19.2 36.2 70.5 81.0 78.6 裝· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26 - 482656 A7 ____ _ _ B7 _五、發明説明（24 ) 如第4表中的結果明白顯示，10單位蔗糖 d_ s. b.之酵素被發現生產海藻露糖之產量爲1〇% 或更高，而1 〇 〇單位/g蔗糖或更多的酵素更可生產海 藻露糖達產量8 0%或更高。可估計即使是1 〇單位/g 蔗糖d· s. b.之酵素也可生產海藻露糖達產量3〇% 或更高，只要讓酵素作用於基質時間較長。 試驗fi — MMM度對海藻露糖形成之影響 100單位/g蔗糖d. s. b.之以試驗2方法 獲得之純化麥芽糖/海藻糖轉化酵素，始之作用於含 2. 5%、5%、10%、20%或40%蔗糖的溶液 ，讓該混合物於4 0°C及pH6. 5進行酵素反應9 6小 時，然後於1 0 0°C加熱1 0分鐘以除去殘留酵素。以類 似試驗3之G L C分析每一反應混合物之醣組成物。結果 列於第5表。 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 f請先閱讀背面之注意事項再填、寫本耳j

本纸队尺度適用中國國家標準（〇奶）八4規格（210、乂297公釐） 一 27 - 482656 A7 B7 五、發明説明（25 ) 表5 蔗糖濃度 (%) 醣組成（％) 單醣 蔗糖 海藻露糖 其它 2.5 4.5 18.7 74.5 2.3 5.0 4.9 14.8 77.7 2.6 10.0 5.8 11.4 79.5 3.3 20.0 6.5 9.8 79.5 4.2 40.0 8.0 7.3 79.3 5.4 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -22- 482656 A7 ______ΒΊ 五、發明説明^ 如第5表中的結果明白顯示，產自蔗糖之海藻露糖產 量爲7 0%或更高’即使是對2._ 5%之蔗糖溶液。蔗糖 濃度愈高’酵素反應進行的也愈多。海藻露糖產量大約爲 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 8 0%當酵素作用於1 0%或更高之鹿糖溶液。 試驗7 溉度對海藻露糖形成之影響 將1 0%蔗糖溶液調到ρΗβ . 5，與1 0 0單位/ g蔗糖d.s. b.之以試驗2方法獲得之純化的麥芽糖 /海藻糖轉化酵素混合，然後讓該混合物於20。、 30° 、40° 、50° 、或60 °C進行酵素反應，於指 定的間隔時間取樣自該反應混合物。於1 〇 〇 °c加熱樣品 1 0分鐘以除去殘留酵素’然後以類似試驗3之G L C分 析之。在不同反應時間及溫度下，每一反應混合物中海藻 露糖之含量列於第6表。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）-29 - 482656 A7 B7 五、發明説明（27 ) 表6 反應時間 海藻露糖產量（％) (小時）一- 20°C 30°C 40°C 50°C 60°C 8 10.8 21.7 33.4 41.4 43.4 24 23.6 42.4 57.9 64.1 59.3 48 35.0 56.0 72.4 73.4 63.2 72 49.3 67.0 78.7 74.6 62.4 96 60.3 73.2 81.0 73.7 59· 6 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝----^--訂--- -線· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ A 0 482656 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（28 ) 如第6表中的'結果明白顯示，當反應於大約3 0 — 5 0°C時，酵素生產海藻露糖之產量很高，大約爲7 〇% 或更多，· 試驗8 自蔗糖製備海藻露糖 1 0份重量之蔗糖溶解於4 0份重量的水，然後與 100單位/g蔗糖d. s. b.以試驗2方法獲得之純 化麥芽糖/海藻糖轉化酵素混合，接著於4 0°C及p Η 6. 5進行酵素反應90小時。之後，100 °C加熱該反 應混合物1 0分鐘以除去殘留酵素，然後冷卻至4 0°C。 爲分解殘留蔗糖，將該反應混合物調到pH4. 0，混以 20單位/ g醣d· s· b.之酵母菌蔗糖酶，於40°C 進行酵素反應 2 4小時，然後於10 0 °C加熱10分鐘以 除去殘留酵素。如此獲得之混合物含大約8 0% d.s. b.之海藻露糖。該反應混合物被以常用的方式 用活性碳脫色、以Η -及OH -型離子交換樹脂去鹽及純 化，並濃縮成大約爲5 0%醣溶液之原料醣溶液。爲增加 海藻露糖含量，該醣溶液被導入離子交換層析管柱，使用 4隻有外加溫層之不鏽鋼管柱，直徑5 . 4 cm，串連在 一起而得總膠床長2 0 m，填入’ DOWEX 50WX4 ( C a + + 一型）#，一種強酸性陽離子交換樹脂（Dow Chemical Company,Midland, Mich.，USA) 0 -裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -線_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'〆297公釐） - 31 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 482656 A7 B7__ 五、發明説明（29 )

將5 v/v%之醣溶液加入樹脂中，並保持管柱內溫 度於40C，接著以SV (空間速度）0· 2灌入40C 熱水到管柱內，劃分該醣溶液以除去如果糖及葡萄糖之共 存醣類，然後收集高海藻露糖含量之劃分。將劃分收在一 起、純化、濃縮、真空乾燥及粉碎，以獲得一富含海藻露 糖之醣粉末，純度爲9 8%，產量大約爲7 0% d . s . b . 試驗9 以來自其他微生物之麥芽糖/海藻糖轉化酵素自蔗糖製備 海藻露糖 根據試驗1及2之方法，來自Pimerobacter sp. R48 ( FERM BP-4315 ) 、Pseudomonas putida H262 (FERM BP-4579 )，及那些來自 Thermus aquaticus ATCC 27634 、 Thermus ruber ATCC35948 、 Thermus sp. ATCC 438 1 5 及 Thermus aquaticus ATCC33923 之麥芽糖 / 海藻糖 轉化酵素以使用a DEAET0Y0PEARL 650〃管柱層析部分 純化。於第7表的狀況下，讓每一種酵素作用於2 0% 蔗糖溶液9 6小時，以G L C分析反應混合物之醣組成物 。每一種酵素自蔗糖得到海藻露糖的產量列於第7表。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝·

-IT -32 - 482656 五、發明説明（巧0 ) 表7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 微生物 酵素量 反應溫度 反應 海藻露糖產量 (單位/g鹿糖） (°C) pH (%) Pimerobacter sp. R48 30 15 7.0 75.2 Pseudoraenas putida H262 30 25 7.0 70.2 Therraus aquaticus ATCC 27634 50 50 6.5 71.6 Thermus ruber ATCC 35948 50 40 6.5 72.3 Thermus sp. ATCC 43815 50 50 6.5 70.2 Thermus qauaticus ATCC 33923 50 50 6.5 73.4 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· ir 線_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 482656 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _B7_ 五、發明説明（31 ) 來自上述微生物之所有酵素自蔗糖生產海藻露糖的產 量超過7 0 %。 試驗1 0 體內利用試驗 根據 H. Atsuji 等人於 > Journal of Clinical Nutrition' ,Vol.41 ， No. 2 ， ρρ· 200—208 (1972)所發表的方法，將30g試驗8中純度98 %d. s. b.富含海藻露糖之醣粉末配成20w/v% 水溶液，以口服方式施與三位2 5、2 7及3 0歲之健康 男性志願者，然後於指定的間隔時間取其血液樣品，分析 血糖及胰島素含量。葡萄糖被用來當作對照組。結果，給 予海藻露糖之志願者之血糖及胰島素含量大約爲那些給予 蔔萄糖者之一半，並顯示在服用大約0. 5—1小時後達 到最高值。基於海藻露糖係由莫耳數1:1之葡萄糖及果 糖組成之事實來判斷，所測試的醣類已被同化、吸收並被 當作一種能源利用。 試驗 1 1 急性毒性試驗 將試驗8中純度98%d. s. b.富含海藻露糖之 醣粉末以口服方式餵給7 -週大之d d -種小老鼠作急性 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 钉 _線_ -34 - 482656 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（32 ) 毒性試驗。結果顯示劑量高達1 5 g/k g，沒有老鼠死 亡，而該試驗不可能用更高的劑量。因此該醣組成物的毒 性相當低。 參考實施例、實施例A及實施例B敘述可用於本發明 之麥芽糖/海藻糖轉化酵素、以酵素製備含海藻露糖之本 醣組成物，以及包含本醣組成物之組成物之製備： 參考實施例 1 將 Pimerobacter sp. R48(FERM BP-4315)種菌接 種到一由4. Ow/ν%葡萄糖，〇. 5w/v%聚蛋白 腺，0· lw/v%酵母萃取物，〇. lw/v %磷酸 氫二鉀，0 · 06w/v%磷酸氫二鈉，〇. 〇5w/v %硫酸鎂七水合物，0 · 5w/v%碳酸鈣及水所組成 之液體營養培養基，然後類似試驗1的方法，除了溫度爲 27 °〇：外，在攪拌通氣下培養於發酵槽約60小時。用 ♦Μ I N I — RA B 0灰，一種超壓細胞破碎機（Daini-ppon Pharmaceutical Co. , Ltd. , Tokyo, Japan)處理 大約1 8 L的培養液來打破細胞。將細胞懸浮液離心以獲 得上清液，然後，用UF薄膜將該上清液濃縮至3 0 0 m 1之含3 0單位/m 1麥芽糖/海藻糖轉化酵素濃縮物 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 、^τ 一線 參考實施例2 將Pseudomonas putida H262 ( F E R Μ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 一 35 - 482656 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（33 ) BP4579)種菌接種到由2_ 0 w/v %葡萄糖， 1. Ow/ν%硫酸銨，〇. lw/v%磷酸氫二鉀， 0. lw/v%磷酸氫二鉀，〇· 06w/v%磷酸二氫 鈉，0. 05w/v%硫酸鎂七水合物，〇. 3w/v% 碳酸鈣及水所組成的液體營養培養基，然後類似試驗1的 方法，除了溫度爲 27 °<：外，在攪拌通氣下培養於發酵 槽約2 0小時。將大約1 8 L的培養液離心獲得大約 0. 4kg溼重之細胞，然後懸浮於4L之10mM磷酸 緩衝液，以超音波碎解機處理來打破細胞細胞。將該細胞 懸浮液離心以獲得上清液。然後，用U F薄膜將該上清液 濃縮至1 0 Om 1之含1 5單位/m 1麥芽糖/海藻糖轉 化酵素濃縮物。 參考實施例 3 根據試驗 1 之方法，Thermus aquaticus ATCC 3 3 9 2 3在攪拌通氣下培養於發酵槽約2 0小時。自大 約18L的培養液獲得大約〇.18kg溼重之細胞然後 懸浮於10mM磷酸緩衝液（pH7. 0)以超音波碎解 機處理來打破細胞細胞。將所得之混合液離心以獲得上清 液。然後，用U F薄膜將該上清液濃縮至1 〇 〇 m 1之含 5 0單位/m 1麥芽糖/海藻糖轉化酵素濃縮物。 實施例A — 1 將蔗糖配成最終蔗糖濃度爲3 Ow/ν%之溶液，然 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _ I 裝-------•訂-----線 -36 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 482656 A7 ___ B7 五、發明説明（34 ) 後加入2 5單位/、g乾燥固形物之以參考實施例1方法獲 得之麥芽糖/海藻糖轉化酵素，接著於1 〇°C及p Η 7· 0溫育該混合物15 0小時。該反應混合物加熱於 9 5 °C 1 0分鐘，收集並以傳統方式用活性碳過濾及除色 '以Η -及OH-型離子交換樹脂去鹽及純化、濃縮成約 75%之海藻露糖糖漿，產量約爲95%d. s. b.。 該糖漿含約75%d. s. b·海藻露糖。因爲該糖漿具 有高品質之甜味、適當黏度，以及令人滿意之保溼性，它 可用來當做甜味料、品質改良劑或安定劑用於食品、化粧 品、藥品。該糖漿可在將海藻露糖及其它醣類氫化還原成 其相對之糖醇類化合物之後使用。 實施例A - 2 製備一最終濃度爲20w/v%d. s. b.之蔗糖 溶液’加20單位/g乾燥固形物d.s. b.之以參考 實施例2方法獲得之麥芽糖/海藻糖轉化酵素，接著於 2 5°(：及口1^7. 0溫育該混合物12 0小時。將該反應 混合物加熱於9 5 °C 1 〇分鐘，收集並以傳統方式除色及 用活性碳過濾、以Η -及OH -型離子交換樹脂去鹽及純 化、濃縮、真空乾燥及粉碎，以獲得一產量90% d. s. b·之海藻露糖糖漿。該糖漿約含7〇% d * s. b •之海藻露糖。s因爲該糖漿具有高品質之甜 味，它可當做甜味料、品質改良劑、安定劑、填充劑或 e X c i p i e n t用於食品、化粧品、藥品。 本紙張尺度適用中國國家標準（€奶）八^格（21〇^97公釐） -- 一 37 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 線- 482656 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（35 ) 實施例A _ 3 以利用製備自實施例A - 1方法之麥芽糖/海藻糖轉 化酵素之酵素反應所獲得的反應混合物，調到PH4. 5 ，然後與5單位/g乾燥固形物之蔗糖酶混合，接著於4 0°C酵素反應2 4小時。將如此所獲得的反應混合物溫育 於9 5 °C 1 0分鐘，冷卻，以傳統方式用活性碳除色及過 濾、以Η -及0H -型離子交換樹脂去鹽及純化、濃縮成 約55 %之醣溶液。當作一原料醣溶液，類似試驗8將 該醣溶液加入使用、DOWEX 99 (Ca+ + -型，6% 聚合度）"，一種強酸性陽離子交換樹脂（Dow Chemical Company, Midland, Mich., USA,)之管柱層析，收集富 含海藻露糖之劃分。將這些劃分合在一起、純化及濃縮以 得到含高量之海藻露糖糖漿，於60%d. s. b.之產 量中’約含7 5%海藻露糖。因爲該糖漿約含9 5% d. s. b.之海藻露糖，並具有因爲該糖漿具有高品質 之甜味、適當黏度，以及令人滿意之保溼性，它可任意用 來當做甜味料、品質改良劑或安定劑用於食品、化粧品、 藥品。 實施例A - 4 製備一最終濃度爲40w/v%d_ s. b.之蔗糖 溶'液。將該蔗糖溶液與5 0單位/ g乾燥固形物之以參考 實施例3方法獲得之麥芽糖/海藻糖轉化酵素混合，著於 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·

、-1T _線_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） _ 38 - 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製 482656 A7 —___ B7 五、發明説明（36 ) _ 4 0 °C p Η 6 . 5下進行酵素反應96小時。將該反應混 合物調到ΡΗ4. 5，混以5單位/g乾燥固形物之蔗糖 酶，著於4 0 °C酵素反應2 4小時。將該反應混合物溫育 於9 5 °C 1 0分鐘後，冷卻，用活性碳除色及過濾、以Η -及OH -型離子交換樹脂去鹽及純化，然後濃縮成約 5 5%之醣溶液。當作一原料醣溶液，類似試驗8將該醣 溶液加入使用''DOWEX 99 (Ca+ +—型，6%聚 合度）〃，一種強酸性陽離子交換樹脂（Dow Chemical Company，Midland, Mich·, USA,)之管柱層析，收集富含 海藻露糖之劃分。將這些劃分合在一起、純化、濃縮及噴 霧乾燥以得到60%d. s. b_產量之含高量之海藻露 糖粉末。因爲該糖漿約含95%d. s. b.之海藻露糖 ，並具有因爲該糖漿具有高品質之甜味、適當黏度，以及 令人滿意之保溼性，它可任意用來當做甜味料、品質改良 劑或安定劑用於食品、化粧品、藥品。 實施例B - 1 甜味料 1份重量之以實施例A - 4方法所獲得之含高量海藻 露糖粉末與0. 05 份重量之— G SWEET"， α-糖脂甜菊精（來自 Toyo Sugar Refining Co., Ltd.， Tokyo，Japan)均勻混合，將該混合物投入造粒機，以獲 得顆粒狀甜味料。該產物具有一種高品質的甜味，調甜能 ^氏張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）—39 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 482656 A7 B7 五、發明説明（37 ) 力比蔗糖高2倍，且就相同調甜能力而言，其卡路里值大 約爲蔗糖的一半。該產物可有利地當作低卡路里甜味料， 使用於增加低卡路里食物之甜味，以提供給那些需限制卡 路里攝取之過胖的人及糖尿病患。由於該產物被引起蛀牙 的微生物所同化時，較少變成酸及不溶聚葡萄糖，因此可 滿意地使用於增加食品之甜味以預防蛀牙。 實施例B — 2 硬糖 一面加熱1 0 0份重量之5 5%蔗糖溶液一面與3 0 份重量之以實施例A-1方法所獲得之海藻露糖糖漿混合 ，然後以減壓加熱將該溶液濃縮至水份含量低於2%。將 該濃縮物與1份重量之檸檬酸及足量之檸檬風味及色素混 合，然後以常用的方式將該混合物成型成所欲之產品。該 產品爲高品質、無實質之蔗糖結晶且有令人滿意的咬感及 滋味的硬糖。 實施例B - 3 -tfr Itfr 草每醬 於一平底鍋煮沸1 5 0份重量之新鮮草莓，2 0份重 量之麥芽糖，4 0份重量之以實施例Α - 1方法所獲得之 海藻露糖糖漿，5份重量之果膠，及1份重量之檸檬酸’ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 一 40 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝·

、'1T 482656 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（38 ) 然後裝瓶以獲得所款之產品’意即一有良好滋味及顏色的 果醬。 實施例B - I 乳酸飲料 10份重量之脫脂奶，80 它加熱滅菌20分鐘， 冷卻至40 °C，接種以0· 3份重量之接種菌，然後發 酵於約3 7 °(：達10小時。將發酵過的混合物均質化， 與4份重量之以實施例A - 2方法所獲得之含海藻露糖醣 類粉末，1份重量之蔗糖及2份重量之異構化糖獎混合， 然後7 0 °C加熱滅菌。將所得之混合物冷卻、與足量風味 物混合，然後裝瓶以獲得所欲之產品，即一高品質的乳酸 飮料，可與甜味與酸味在一起良好地調和。 實施例B — 5 加糖濃縮奶 於1 0 0份重量之鮮奶中加入3份重量之以實施例A - 3方法所獲得之含高量海藻露糖糖漿及1份重量之蔗糖 。用層板加熱器將該溶液加熱滅菌及濃縮成大約7 〇%溶 液，然後無菌裝瓶成所欲之產品。因該產品具有一種溫和 甜味及滋味，它可任意使用於嬰兒及幼兒食品、水果、咖 啡、可可及茶之調味。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -41 一 482656 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（39 ) 實施例B - 6 口香糖 3份重量之膠底物（gUm base )加熱融化直到軟化， 與6份重量之蔗糖，1份重量之以實施例A - 4方法所獲 得之富含海藻露糖醣類粉末混合，然後進一步與足量之調 味劑及色素混合。將所得之混合物以慣常方式以輥子捏和 並成型包裝成所欲之產品，即具有令人滿意的質地及滋味 的口香糖。 實施例Η - 7 卡士達奶油 將1 0 0份重量之玉米粉，1 0 0份重量之以實施例 Α - 3方法所獲得之以實施例Α - 3方法所獲得之含高量 海藻露糖糖漿，8 0份重量之麥芽糖，2 0份重量之蔗糖 ，及1份重量的鹽充分捏合。加2 8 0份重量之新鮮雞蛋 到該混合物中，然後攪拌該混合物，逐漸地與1 0 0 0份 重量之沸騰的牛奶混合，並一面攪拌一面加熱，直到所有 內含物完全膠化並顯現半透明狀時便停止加熱。冷卻該膠 化混合物，與適量的香草調味劑混合、秤重、注射及裝填 以獲得所欲之產品，具有平滑光澤和溫和的甜味及令人滿 意的滋味。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 42 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· 釘 ►線 482656 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ____B7_ ___五、發明説明（4〇 ) 實施例B - 8 Uironpioto (甜米膠凍預拌粉） 混合9 0份重量之米粉末，2 0份重量之玉米粉， 1 2 0份重量之以實施例A - 4方法所獲得之富含海藻露 糖醣類粉末及4份重量之pullulan。該產物與適量的mat-cha (粉末茶）及水捏和後，將該混合物置於一容器中然 後蒸煮超過6 0分鐘以獲得Uir0。該產品具有良好咬感及 令人滿意的風味，以及具有相當長的保存期，因爲澱粉的 回凝被有效遏止。 實施例B - 9 插管餵食之固體紹成物 製備一由5 0 0份重量之以實施例A - 4方法所獲得 之富含海藻露糖醣類粉末，2 7 0份重量之蛋黃粉末， 2 0 9份重量之脫脂奶，4. 4份重量之氯化鈉， 1. 85份重量之氯化鉀，4份重量之硫酸鎂，0. 01 份重量之硫胺素，0.1份重量之抗壞血酸鈉，0. 6份 重量之維他命E乙酯，及〇. 04份重量之菸鹼醯胺所構 成之固體組成物。將每2 5 g —份之該組成物注入防潮之 小多層袋，加熱封口。使用前將一袋該組成物溶於大約 1 5 0 — 3 0 〇m 1的水，以口服方式給病人服用或以插 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝·

、1T i# 線 482656 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（41 ) 管方式送入其鼻腔·、胃或腸內等。 實施例B - 1 〇 治創傷的軟膏 5 0 0份重量之以實施例A — 4方法所獲得之富含海 藻露糖醣類粉末與已溶於5 0份重量甲醇之3份重量碘混 合，進一步與2 00份重量之1 0% pul lulan水溶液混合 以獲得具有令人滿意的塗抹性及附著性之治療皮膚創傷的 軟膏。該軟膏縮短傷癒時間及完全治癒受傷表面。 〔本發明之作用〕 從上述例子明顯看出，以麥芽糖/海藻糖轉化酵素作 用於蔗糖水溶液而獲得之含海藻露糖之糖組成物，可容易 地大量生產、分離及純化。海藻露糖係還原雙醣類，由葡 萄糖及果糖所構成，具有溫和的及高品質的甜味。該糖組 成物可以口服及非口服方式使用，也容易被活體代謝，不 必擔心毒性及造成副作用。 本發明之含海藻露糖之糖組成物，無論是液體或粉末 形式都容易使用，具有下列特性：控制水分能力、使具有 填充的能力（filler-imparting ability)、使產生光澤 的能力（gloss-imparting ability)、保溼能力、使具 有黏度的能力（黏度- imparting ability)、防結晶能力 及非實質發酵性。這些性質可被有利地實用於甜味料、風 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 、^τ L# 線 -44 - 482656 A7 B7 五、發明説明（42 ) 味改良劑、品質改良劑，或安定劑之組成物。因此，本發 明所達成之糖組成物、其製備及其用途之確立，對於食品 、化粧品及製藥工業有極大的重要性。 目前被認爲是本發明之較佳體系已被敘述，但於其中 可以有各種修飾是可被理解的。因此在申請專利範圍中則 希望將基於本發明之實際精神及範疇之此類修飾包括進去 -^^—1- m m.— ϋϋ —ϋ ϋ I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、·ΐτ 如 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 一 45 - 紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

1. 482656 A8 B8 C8 D8 夂、申請專利範圍 附件（A ): 第8 6 1 0 2 7 7 5號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國9 1年1月修正 1 · 一種醣組成物，其包含以乾燥固形物爲基礎計之 至少3 Ow/w%海藻露糖和至多7 Ow/w%之1或多 種醣類，該醣類係選自果糖，葡萄糖，蔗糖，松二糖或泊 雷糖，獲致該醣組成物可藉由令麥芽糖/海藻糖轉化酶於 低於80°C之溫度和pH5. 5 - 9. 0下，作用於蔗糖 溶液達0 . 1 - 2 0 0小時，該蔗糖溶液之濃度爲’ 0. 1 — 5 Ow/v%且該麥芽糖/海藻糖轉化酶之用量 係爲1 0 — 1 000單位/g蔗糖。 2. 如申請專利範圍第1項之醣組成物，其中該麥芽 糖/海藻糖轉化酶係源自微生物。 3. 如申請專利範圍第2項之醣組成物，其中該微生 物係選自脂肪桿菌屬（Pimerobacter)，假單胞菌屬 (Pseudomonas)及棲熱菌屬（Thermus)之微生物。 4 · 一種產製含有海藻露糖之醣組成物的方法，該醣 組成物包含以乾燥固形物爲基礎計之至少3 0w/w%海 藻露糖和至多7 〇w/w%之1或多種醣類，該醣類係選 自果糖，蔔萄糖，蔗糖，松二糖或泊雷糖，該方法包含令 麥芽糖/海藻糖轉化酶於低於8 0 °C之溫度和p Η 5 . 5 -9 . 0下，作用於蔗糖溶液達0. 1 - 200小時，該 蔗糖溶液之濃度爲〇. 1 — 5 Ow/v%且該麥芽糖/海 藻糖轉化酶之用量係爲1 〇 — 1 〇 〇 〇單位/ g藤糖。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） Μ 經濟部智慧財產局工消費合作社印製

   482656 A8 Β8 C8 ___ D8 六、申請專利範圍 5.如申請專利範圍第4項之方法，其中該麥芽糖/ 海藻糖轉化酶係源自微生物。 6 ·如申請專利範圍第5項之方法，其中該微生物係 選自脂肪桿菌屬（Pimerobacter)，假單胞菌屬 (Pseudomonas)及棲熱菌屬（Thermus)之微生物。 7.如申請專利範圍第4項之方法，其進一步包含令 蔗糖酶作用於所收集之含有海藻露糖之混合物的步驟，且 將所得之混合物進行強酸性陽離子交換樹脂管柱層析以增 加海藻露糖之含量。 8 ·如申請專利範圍第1項之醣組成物，其係用於製 造食品，化粧品及藥品。 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 、言

   經濟部智慧財產局3(工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐）