JP2670256B2 - ポリサッカライドポリマー - Google Patents
ポリサッカライドポリマーInfo
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- Processes Of Treating Macromolecular Substances (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ポリサッカライド
ポリマーに関する。とくに、本発明は、キサンタンに基
づくポリサッカライドポリマーであり、このポリマー
は、ここでキサンタンガムに構造的に類似するポリマー
として定義され、そしてアセチル化されていない、ピル
ビル化されていない、アシル化されておらず且つピルビ
ル化されていない、低度にピルビル化されている、およ
び完全にピルビル化されているキサンタン（ペンタマ
ー）ガム、およびポリテトラマーガム、アセチル化され
ている、およびアセチル化されていないの両者、を含
み、キサンタン生物合成通路の成分によって生成され
る。
ポリマーに関する。とくに、本発明は、キサンタンに基
づくポリサッカライドポリマーであり、このポリマー
は、ここでキサンタンガムに構造的に類似するポリマー
として定義され、そしてアセチル化されていない、ピル
ビル化されていない、アシル化されておらず且つピルビ
ル化されていない、低度にピルビル化されている、およ
び完全にピルビル化されているキサンタン（ペンタマ
ー）ガム、およびポリテトラマーガム、アセチル化され
ている、およびアセチル化されていないの両者、を含
み、キサンタン生物合成通路の成分によって生成され
る。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】キサンタ
ンガムは、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）
属（以後キサントモナスと呼ぶ）のバクテリア、特に
Ｘ．カンペストリス種の微生物によって生成される。キ
サンタンガムは、通常の物理的性質、すなわち、きわめ
て高い比粘度および擬塑性をもつため、広く使用されて
いる生成物である。それは、普通、食物において増粘剤
として、そして第２または第３油回収において移動性調
節剤またはプロフィル変更剤として、ならびに石油掘削
流体において使用されている。
ンガムは、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）
属（以後キサントモナスと呼ぶ）のバクテリア、特に
Ｘ．カンペストリス種の微生物によって生成される。キ
サンタンガムは、通常の物理的性質、すなわち、きわめ
て高い比粘度および擬塑性をもつため、広く使用されて
いる生成物である。それは、普通、食物において増粘剤
として、そして第２または第３油回収において移動性調
節剤またはプロフィル変更剤として、ならびに石油掘削
流体において使用されている。
【０００３】化学的には、キサンタンガムは陰イオン性
ヘテロポリサッカライドである。このポリマーの反復単
位は、５つの糖部分、詳しくは２つのグルコース部分、
１つのグルクロン酸部分および２つのマンノース部分か
ら構成されたペンタマーである。これらの糖残基は、グ
ルコース部分がポリマー鎖の主鎖を形成し、マンノース
−グルクロン酸−マンノース残基が一般に交互するグル
コース部分から延びているように配置されている。
ヘテロポリサッカライドである。このポリマーの反復単
位は、５つの糖部分、詳しくは２つのグルコース部分、
１つのグルクロン酸部分および２つのマンノース部分か
ら構成されたペンタマーである。これらの糖残基は、グ
ルコース部分がポリマー鎖の主鎖を形成し、マンノース
−グルクロン酸−マンノース残基が一般に交互するグル
コース部分から延びているように配置されている。
【０００４】通常、この基本構造は、特別のアセチル化
およびピルビル化されている。これは、例えば、次の文
献に記載されている：Janson, P.E., Kenne, L. および
Lindberg, B., Carbohydrate Reseach, 45：275-282 (1
975)およびMelton, L.D., Minot, L., Rees, D.A. およ
び Sanderson, G.R., Carbohydrate Reseach, 46：245-
257 (1976)。これらの各々を特別にここに引用によって
加える。アシル化およびピルビル化の程度は変化するこ
とが知られている。キサンタンガムの構造を下に描く：
およびピルビル化されている。これは、例えば、次の文
献に記載されている：Janson, P.E., Kenne, L. および
Lindberg, B., Carbohydrate Reseach, 45：275-282 (1
975)およびMelton, L.D., Minot, L., Rees, D.A. およ
び Sanderson, G.R., Carbohydrate Reseach, 46：245-
257 (1976)。これらの各々を特別にここに引用によって
加える。アシル化およびピルビル化の程度は変化するこ
とが知られている。キサンタンガムの構造を下に描く：
【０００５】
【化１】
【０００６】天然キサンタンガムの広い利用にかかわら
ず、その物理的性質が制限されるようになる場合が存在
する。とくに、第２または第３の油の回収において、油
含有容器の温度および容器内の塩濃度がキサンタン溶液
にとって最適より高くなることはまれなことではない。
これらの状態が起こると、キサンタンは沈澱し、凝集し
そして／またはその粘度を失うことがある。したがっ
て、油の回収の間に直面する種々の条件、例えば、高温
および高い塩濃度において良好に作用する新しい増粘性
生成物が望ましいであろう。
ず、その物理的性質が制限されるようになる場合が存在
する。とくに、第２または第３の油の回収において、油
含有容器の温度および容器内の塩濃度がキサンタン溶液
にとって最適より高くなることはまれなことではない。
これらの状態が起こると、キサンタンは沈澱し、凝集し
そして／またはその粘度を失うことがある。したがっ
て、油の回収の間に直面する種々の条件、例えば、高温
および高い塩濃度において良好に作用する新しい増粘性
生成物が望ましいであろう。
【０００７】本発明は、自然キサンタンガムに関して改
良された性質を有するキサンタンの基づく多糖の１つの
族を開示する。キサンタンガムの変更は従来記載されて
きている。例えば、Bradshawら（Carbohydrate Polymer
s,３：23-38 (1983)) は、脱アセチル化または脱ピルビ
ル化されている、化学的に変更したキサンタンガムの製
造法を記載している。また、キサントモナス・カンペス
トリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉ
ｓ）種（以後、Ｘ．カンペストリスと呼ぶ）によって生
成されるキサンタンガムを化学的に脱アセチル化する種
々の手段は、米国特許第３，０００，７９０号および米
国特許第３，０５４，６８９号に記載されている。
良された性質を有するキサンタンの基づく多糖の１つの
族を開示する。キサンタンガムの変更は従来記載されて
きている。例えば、Bradshawら（Carbohydrate Polymer
s,３：23-38 (1983)) は、脱アセチル化または脱ピルビ
ル化されている、化学的に変更したキサンタンガムの製
造法を記載している。また、キサントモナス・カンペス
トリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉ
ｓ）種（以後、Ｘ．カンペストリスと呼ぶ）によって生
成されるキサンタンガムを化学的に脱アセチル化する種
々の手段は、米国特許第３，０００，７９０号および米
国特許第３，０５４，６８９号に記載されている。
【０００８】今日まで、これらの脱アセチル化法に利用
された唯一の方法は、通常アセチル化されたキサンタン
ガムからアセテート部分を化学的に除去することによっ
た。キサンタンガムを脱アセチル化する化学的方法は、
多くの望ましくない副作用を生じ、そしてグリコシドの
主鎖を加水分解させて、分子の立体配座を不可逆的に変
化させそして分子量を低下させることがあることが見出
された。
された唯一の方法は、通常アセチル化されたキサンタン
ガムからアセテート部分を化学的に除去することによっ
た。キサンタンガムを脱アセチル化する化学的方法は、
多くの望ましくない副作用を生じ、そしてグリコシドの
主鎖を加水分解させて、分子の立体配座を不可逆的に変
化させそして分子量を低下させることがあることが見出
された。
【０００９】水性媒質中で脱アセチル化したキサンタン
のレオロジー的性質のあるものは知られている。参照、
例えば、Takoおよび Nakamura, Agric. Biol. Chem. 4
8：2987-2933 (1984)および米国特許第３，０００，７
９０号および米国特許第３，０５４，６８９号。また、
脱アセチル化ポリサッカライドを使用して水溶液の粘度
を増加する方法は米国特許第３，０９６，２９３号に記
載されている。こうして、不適当な副作用を起こさな
い、アセチル化されていないキサンタンを得る方法は探
究されてきている。
のレオロジー的性質のあるものは知られている。参照、
例えば、Takoおよび Nakamura, Agric. Biol. Chem. 4
8：2987-2933 (1984)および米国特許第３，０００，７
９０号および米国特許第３，０５４，６８９号。また、
脱アセチル化ポリサッカライドを使用して水溶液の粘度
を増加する方法は米国特許第３，０９６，２９３号に記
載されている。こうして、不適当な副作用を起こさな
い、アセチル化されていないキサンタンを得る方法は探
究されてきている。
【００１０】キサンタンガムは同様によく化学的に脱ピ
ルビル化することができる。これは次の文献に記載され
ている：Holzwarth およびOgletree, Caobo. Res. 76：
277-280 (1979)。この脱ピルビル化の方法は、また、キ
サンタンポリマーの単位を変更しそして／またはグリコ
シド主鎖の加水分解を起こすことがある。ピルビル化さ
れていないキサンタンガムを生成するＸ．カンペストリ
スの菌株は米国特許第４，２９６，２０３号に記載され
ているが、このピルビル化されていないガムは化学的手
段により完全にアセチル化されるか、あるいは脱アシル
化された。本発明者らが信ずるところによると、アセチ
ル化されておらずかつピルビル化されていないキサンタ
ンポリサッカライドは、改良されたレオロジー的および
粘性化の性質を有し、したがってこのようなガムおよび
それを製造する微生物学的方法が探究された。
ルビル化することができる。これは次の文献に記載され
ている：Holzwarth およびOgletree, Caobo. Res. 76：
277-280 (1979)。この脱ピルビル化の方法は、また、キ
サンタンポリマーの単位を変更しそして／またはグリコ
シド主鎖の加水分解を起こすことがある。ピルビル化さ
れていないキサンタンガムを生成するＸ．カンペストリ
スの菌株は米国特許第４，２９６，２０３号に記載され
ているが、このピルビル化されていないガムは化学的手
段により完全にアセチル化されるか、あるいは脱アシル
化された。本発明者らが信ずるところによると、アセチ
ル化されておらずかつピルビル化されていないキサンタ
ンポリサッカライドは、改良されたレオロジー的および
粘性化の性質を有し、したがってこのようなガムおよび
それを製造する微生物学的方法が探究された。
【００１１】さらに、キサンタンの側鎖上の内部のマン
ノースのアセチル化の程度および末端マンノースのピル
ビル化の程度は変化しうる。本発明者らは、完全にアセ
チル化および／または完全にピルビル化されたキサンタ
ンは、ある油の回収の目的に対して改良されたレオロジ
ー的性質を有すると信ずる。その上、本発明者らは、通
常のキサンタンペンタマー構成ブロックの変更に基づ
く、ポリサッカライドを同定した。これらのポリマー
は、剪断速度、塩度に耐える能力、および粘性化性質に
影響を及ぼす温度に対する応答に関して、通常のキサン
タンガムよりも改良されたレオロジー的性質を示す。こ
の変更された多糖は、下に描くポリテトラマーおよびア
セチル化されていないポリテトラマーを包含する。
ノースのアセチル化の程度および末端マンノースのピル
ビル化の程度は変化しうる。本発明者らは、完全にアセ
チル化および／または完全にピルビル化されたキサンタ
ンは、ある油の回収の目的に対して改良されたレオロジ
ー的性質を有すると信ずる。その上、本発明者らは、通
常のキサンタンペンタマー構成ブロックの変更に基づ
く、ポリサッカライドを同定した。これらのポリマー
は、剪断速度、塩度に耐える能力、および粘性化性質に
影響を及ぼす温度に対する応答に関して、通常のキサン
タンガムよりも改良されたレオロジー的性質を示す。こ
の変更された多糖は、下に描くポリテトラマーおよびア
セチル化されていないポリテトラマーを包含する。
【００１２】
【化２】
【００１３】これらの多糖は、また、１９８５年８月６
日に提出された「キサントモナスにより作られたポリサ
ッカライドポリマー」と題する同時係属米国特許出願第
７６２，８７８号（これをここに特別に引用によって加
える）において、Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅらの記載する
アセチル化されたおよびアセチル化されていないポリテ
トラマーを包含する。
日に提出された「キサントモナスにより作られたポリサ
ッカライドポリマー」と題する同時係属米国特許出願第
７６２，８７８号（これをここに特別に引用によって加
える）において、Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅらの記載する
アセチル化されたおよびアセチル化されていないポリテ
トラマーを包含する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、天然キ
サンタンガムよりもすぐれた水の粘性化剤である、ポリ
サッカライドポリマーの族を提供することである。本発
明の他の目的は、高温および／または塩類の存在下に、
天然キサンタンガムよりも改良されたレオロジー的性質
を有し、そして他の所望の性質を有するポリサッカライ
ドポリマーの族を提供することである。
サンタンガムよりもすぐれた水の粘性化剤である、ポリ
サッカライドポリマーの族を提供することである。本発
明の他の目的は、高温および／または塩類の存在下に、
天然キサンタンガムよりも改良されたレオロジー的性質
を有し、そして他の所望の性質を有するポリサッカライ
ドポリマーの族を提供することである。
【００１５】また、本発明の目的は、これらの生成物を
あるものを得る生体外法および生体内でポリサッカライ
ドポリマーのこの族の構成員を生成する能力を有する微
生物を提供することである。本発明の他の目的は、種々
のポリサッカライドポリマーを生成する能力を有する微
生物を好気的に発酵することによって、ポリサッカライ
ドのこの族の構成員を調製する方法を提供することであ
る。本発明の追加の目的および利点は、一部分の説明に
おいて記載されており、そして一部分この説明から明ら
かであり、あるいは本発明の実施により学ぶことができ
るであろう。これらの目的および利点は、添付した請求
の範囲において指摘されている手段および組み合わせに
よって実現および達成できるであろう。
あるものを得る生体外法および生体内でポリサッカライ
ドポリマーのこの族の構成員を生成する能力を有する微
生物を提供することである。本発明の他の目的は、種々
のポリサッカライドポリマーを生成する能力を有する微
生物を好気的に発酵することによって、ポリサッカライ
ドのこの族の構成員を調製する方法を提供することであ
る。本発明の追加の目的および利点は、一部分の説明に
おいて記載されており、そして一部分この説明から明ら
かであり、あるいは本発明の実施により学ぶことができ
るであろう。これらの目的および利点は、添付した請求
の範囲において指摘されている手段および組み合わせに
よって実現および達成できるであろう。
【００１６】これらの目的を達成するために、かつ、こ
こに具体化されかつ広く記載されているように、本発明
の目的に従い、２：１：１のＤ−グルコース：Ｄ−マン
ノース：Ｄ−グルクロン酸の比を有する多糖ポリマーを
含んでなり、Ｄ−グルコース部分がベーター〔１，４〕
立体配置において結合しており、Ｄ−マンノース部分が
アルファー〔１，３〕立体配置において、一般に交互す
るグルコース部分に結合しており、そしてＤ−グルクロ
ン酸部分がベーター〔１，２〕立体配置においてマンノ
ース部分に結合している組成物が提供される。
こに具体化されかつ広く記載されているように、本発明
の目的に従い、２：１：１のＤ−グルコース：Ｄ−マン
ノース：Ｄ−グルクロン酸の比を有する多糖ポリマーを
含んでなり、Ｄ−グルコース部分がベーター〔１，４〕
立体配置において結合しており、Ｄ−マンノース部分が
アルファー〔１，３〕立体配置において、一般に交互す
るグルコース部分に結合しており、そしてＤ−グルクロ
ン酸部分がベーター〔１，２〕立体配置においてマンノ
ース部分に結合している組成物が提供される。
【００１７】この多糖ポリマーは、反復テトラマー：グ
ルコース−グルコース−マンノース−グルクロン酸から
成るので、「ポリテトラマー」と呼ぶ。また、マンノー
ス部分の少なくとも９０％、好ましくは９５％および最
も好ましくは１００％が６−０位置においてアセチル化
されている、前述の、ポリテトラマー組成物ならびにア
セチル化されていないポリテトラマーが提供される。さ
らに、これらの目的を達成するために、かつ、本発明の
目的に従い、マンノース部分がアセチル化されていない
キサンタンガムを含んでなる組成物が提供される。この
ガムは、以後、「アセチル化されていないキサンタン」
と呼ぶ。キサンタンガムの末端マンノース部分がピルビ
ル化されていない、第２構造体をここで言及する。この
ガムを「ピルビル化されていないキサンタン」と呼ぶ。
その上、アセチル化されておらずかつピルビル化されて
いないガムを開示する。
ルコース−グルコース−マンノース−グルクロン酸から
成るので、「ポリテトラマー」と呼ぶ。また、マンノー
ス部分の少なくとも９０％、好ましくは９５％および最
も好ましくは１００％が６−０位置においてアセチル化
されている、前述の、ポリテトラマー組成物ならびにア
セチル化されていないポリテトラマーが提供される。さ
らに、これらの目的を達成するために、かつ、本発明の
目的に従い、マンノース部分がアセチル化されていない
キサンタンガムを含んでなる組成物が提供される。この
ガムは、以後、「アセチル化されていないキサンタン」
と呼ぶ。キサンタンガムの末端マンノース部分がピルビ
ル化されていない、第２構造体をここで言及する。この
ガムを「ピルビル化されていないキサンタン」と呼ぶ。
その上、アセチル化されておらずかつピルビル化されて
いないガムを開示する。
【００１８】このポリマーを、以後、「非アセチル化、
非ピルビル化キサンタンガム」と呼ぶ。また、本発明
は、「完全にアセチル化されたキサンタンガム」と呼ぶ
キサンタンガムに関し、ここで内部のマンノース部分の
少なくとも９０％はアシル化されており、好ましくは９
５％、より好ましくは１００％アシル化されている。ま
た、本発明は、末端マンノース部分の少なくとも９０
％、好ましくは９５％、より好ましくは１００％がピル
ビル化されているキサンタンガムに関し、ここでこれを
「完全にピルビル化されたキサンタンガム」と呼ぶ。
非ピルビル化キサンタンガム」と呼ぶ。また、本発明
は、「完全にアセチル化されたキサンタンガム」と呼ぶ
キサンタンガムに関し、ここで内部のマンノース部分の
少なくとも９０％はアシル化されており、好ましくは９
５％、より好ましくは１００％アシル化されている。ま
た、本発明は、末端マンノース部分の少なくとも９０
％、好ましくは９５％、より好ましくは１００％がピル
ビル化されているキサンタンガムに関し、ここでこれを
「完全にピルビル化されたキサンタンガム」と呼ぶ。
【００１９】本発明は、また、前述のポリサッカライド
ポリマーの製造法を包含する。本発明のポリサッカライ
ドポリマーは、一般にポリサッカライドの生成を導く、
微生物の生物合成通路の遺伝子操作によって一般につく
ることができる。とくに、キサンタンガムを生成する微
生物の通路は、変更されたポリマー単位の生成のために
生体内または生体外の系をつくるように操作することが
できる。こうして、この系は、とくに調節可能なアセチ
ラーゼ遺伝子およびケタラーゼ遺伝子を使用して、種々
の程度にアシル化またはピルビル化されたポリサッカラ
イドをつくることができる。
ポリマーの製造法を包含する。本発明のポリサッカライ
ドポリマーは、一般にポリサッカライドの生成を導く、
微生物の生物合成通路の遺伝子操作によって一般につく
ることができる。とくに、キサンタンガムを生成する微
生物の通路は、変更されたポリマー単位の生成のために
生体内または生体外の系をつくるように操作することが
できる。こうして、この系は、とくに調節可能なアセチ
ラーゼ遺伝子およびケタラーゼ遺伝子を使用して、種々
の程度にアシル化またはピルビル化されたポリサッカラ
イドをつくることができる。
【００２０】例えば、１０％，２０％，３０％，４０％
または５０％であるキサンタンガムを合成することがで
き、あるいは１０％，２０％，３０％，４０％または５
０％がピルビル化されているキサンタンを合成できるこ
とが考えられる。本発明のポリサッカライドポリマーを
生体内で生成する微生物およびこれらのポリサッカライ
ドポリマーを使用する方法も記載する。
または５０％であるキサンタンガムを合成することがで
き、あるいは１０％，２０％，３０％，４０％または５
０％がピルビル化されているキサンタンを合成できるこ
とが考えられる。本発明のポリサッカライドポリマーを
生体内で生成する微生物およびこれらのポリサッカライ
ドポリマーを使用する方法も記載する。
【００２１】下により完全に説明するキサントモナス・
カンペストリス種の種々の菌株は、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryl
and ）に１９８６年３月２１日に受託された。これらの
菌株はＸ９２１，Ｘ１００６，Ｘ９３４およびＸ１２３
１であり、そして、それぞれ、受託番号５３４７２，５
３４７３，５３４７４および６７３４４で受託された。
上の一般的説明および下の詳細な説明の両者は、例示お
よび説明のみであり、そして請求の範囲に記載されてい
る本発明を限定しない。この明細書の一部に組込まれか
つそれを構成する添付図面は、本発明の種々の実施態様
を例示し、そして、この説明と一緒に、本発明の原理を
説明役目をする。
カンペストリス種の種々の菌株は、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryl
and ）に１９８６年３月２１日に受託された。これらの
菌株はＸ９２１，Ｘ１００６，Ｘ９３４およびＸ１２３
１であり、そして、それぞれ、受託番号５３４７２，５
３４７３，５３４７４および６７３４４で受託された。
上の一般的説明および下の詳細な説明の両者は、例示お
よび説明のみであり、そして請求の範囲に記載されてい
る本発明を限定しない。この明細書の一部に組込まれか
つそれを構成する添付図面は、本発明の種々の実施態様
を例示し、そして、この説明と一緒に、本発明の原理を
説明役目をする。
【００２２】
【発明の実施の形態】本発明の現在好ましい実施態様に
ついて説明する。これは、下の実施例と一緒に、本発明
の原理を説明する。本発明のポリサッカライドポリマー
は上に詳細に説明した。これらのポリサッカライドポリ
マーは細胞不含酵素系を使用して生体外で製造すること
ができるが、あるいは適当な突然変異体菌株の細胞を増
殖することによって生体内で製造することができる。ポ
リサッカライドポリマーを調製する他の手段もまた、下
に記載する。
ついて説明する。これは、下の実施例と一緒に、本発明
の原理を説明する。本発明のポリサッカライドポリマー
は上に詳細に説明した。これらのポリサッカライドポリ
マーは細胞不含酵素系を使用して生体外で製造すること
ができるが、あるいは適当な突然変異体菌株の細胞を増
殖することによって生体内で製造することができる。ポ
リサッカライドポリマーを調製する他の手段もまた、下
に記載する。
【００２３】生体外の多糖の合成
変種でないキサンタンガムをつくるための無細胞系の使
用に関する基本法は、次の文献に記載されている：L.,
Couso, R.O. およびDankert, M.A., FEBS Letters 130
：253-256 (1981)（ここに特別に引用によって加え
る）。この方法の変法を使用して本発明の変種の多糖を
つくることが可能であることがわかった。
用に関する基本法は、次の文献に記載されている：L.,
Couso, R.O. およびDankert, M.A., FEBS Letters 130
：253-256 (1981)（ここに特別に引用によって加え
る）。この方法の変法を使用して本発明の変種の多糖を
つくることが可能であることがわかった。
【００２４】この新規な変法のために、生体外無細胞系
は、一般に、好ましくはＥＤＴＡを含む、適当な緩衝液
の存在下に、キサントモナス属、好ましくはキサントモ
ナス・カンペストリスの微生物の細胞を溶解し、そして
適当な生合成酵素を得ることによって調製され、前記酵
素は外的に添加した基質を引続いて処理することができ
る。細胞の溶解の別の手段は、超音波処理、フレンチ・
プレス処理、洗浄剤処理、酵素処理およびそれらの組合
わせを包含するが、それらに限定されない。
は、一般に、好ましくはＥＤＴＡを含む、適当な緩衝液
の存在下に、キサントモナス属、好ましくはキサントモ
ナス・カンペストリスの微生物の細胞を溶解し、そして
適当な生合成酵素を得ることによって調製され、前記酵
素は外的に添加した基質を引続いて処理することができ
る。細胞の溶解の別の手段は、超音波処理、フレンチ・
プレス処理、洗浄剤処理、酵素処理およびそれらの組合
わせを包含するが、それらに限定されない。
【００２５】一般に、本発明の形体ポリサッカライドポ
リマーを製造するために、所望のポリサッカライドを組
み立てるために要求される酵素を有する微生物の細胞溶
解物を、適当な基質とともにインキュベーションし、前
記基質は、所望のガムに依存して、ＵＤＰ−グルコー
ス、ＧＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−グルクロン酸、アセ
チル−ＣｏＡおよびホスホエノールピルベートを包含で
きる。基質の選択は、生成しようとする多糖に依存す
る。例えば、アセチル化されていない多糖は基質として
アセチル−ＣｏＡを排除することによって得られる。同
様に、ピルビル化されていないガムは基質としてホスホ
エノールピルベートを排除することによって得られる。
内因性基質を消耗するための細胞溶解物の化学的および
／または酵素的処理は、この分野において明らかであろ
う。
リマーを製造するために、所望のポリサッカライドを組
み立てるために要求される酵素を有する微生物の細胞溶
解物を、適当な基質とともにインキュベーションし、前
記基質は、所望のガムに依存して、ＵＤＰ−グルコー
ス、ＧＤＰ−マンノース、ＵＤＰ−グルクロン酸、アセ
チル−ＣｏＡおよびホスホエノールピルベートを包含で
きる。基質の選択は、生成しようとする多糖に依存す
る。例えば、アセチル化されていない多糖は基質として
アセチル−ＣｏＡを排除することによって得られる。同
様に、ピルビル化されていないガムは基質としてホスホ
エノールピルベートを排除することによって得られる。
内因性基質を消耗するための細胞溶解物の化学的および
／または酵素的処理は、この分野において明らかであろ
う。
【００２６】さらに、無細胞系は、図１に記載するキサ
ンタン生合成通路の酵素の１または２以上を欠乏する突
然変異体からつくることができる。このような突然変異
体由来の細胞溶解物は、突然変異体のみにより、あるい
は差し控えた基質との組み合わせにおける突然変異体に
より、ここに記載する変形体ガムを生成するであろう。
例えば、トランスフェラーゼＶを欠く突然変異体培養物
からつくられる無細胞系はポリサッカライドポリマーを
生成するであろうが、同一の細胞不含系が、アセチル−
ＣｏＡが存在しないとき、アセチル化されていないポリ
テトラマーを生成するであろう。
ンタン生合成通路の酵素の１または２以上を欠乏する突
然変異体からつくることができる。このような突然変異
体由来の細胞溶解物は、突然変異体のみにより、あるい
は差し控えた基質との組み合わせにおける突然変異体に
より、ここに記載する変形体ガムを生成するであろう。
例えば、トランスフェラーゼＶを欠く突然変異体培養物
からつくられる無細胞系はポリサッカライドポリマーを
生成するであろうが、同一の細胞不含系が、アセチル−
ＣｏＡが存在しないとき、アセチル化されていないポリ
テトラマーを生成するであろう。
【００２７】生物合成法は、１つの実施態様において、
放射標識した基質をポリマー単位中に組込むことによっ
て監視することができる。他の方法は、また、この分野
において知られている生物合成中間体を同定するために
使用できる。とくに、クロマトグラフィー法がオリゴサ
ッカリド中間体を分離しかつ同定するために開発され
た。これは薄層クロマトグラフィーおよび高性能液体ク
ロマトグラフィーを包含する。キサンタンの無細胞生合
成は、すべての３つの特異的糖ヌクレオチドの添加に依
存する、時間依存性の逐次過程であることがわかった。
標識した基質の非特異的組込みのバックグラウンドは、
最小であり、そしてガム分画中のキサンタン特異的ポリ
マーの検出を妨害しない。
放射標識した基質をポリマー単位中に組込むことによっ
て監視することができる。他の方法は、また、この分野
において知られている生物合成中間体を同定するために
使用できる。とくに、クロマトグラフィー法がオリゴサ
ッカリド中間体を分離しかつ同定するために開発され
た。これは薄層クロマトグラフィーおよび高性能液体ク
ロマトグラフィーを包含する。キサンタンの無細胞生合
成は、すべての３つの特異的糖ヌクレオチドの添加に依
存する、時間依存性の逐次過程であることがわかった。
標識した基質の非特異的組込みのバックグラウンドは、
最小であり、そしてガム分画中のキサンタン特異的ポリ
マーの検出を妨害しない。
【００２８】脂質キャリヤー、とくにイソプレノイドピ
ロホフェートの関与は、いくつかのポリサッカライド生
合成通路において示された。さらに、キサンタンの生合
成においてピロホスホリル結合脂質キャリヤーの関与が
立証された。こうして、キサンタン生合成中間体は、こ
れらのキャリヤー脂質を使用して有機可溶性分画におい
て回収可能であることがわかった。これらの回収された
オリゴサッカリドは、引続いて、キャリヤー脂質から、
例えば、pH２および９０℃における２０分の、穏和な加
水分解によって分離し、そして分析のためアルカリ性ホ
スファターゼで脱ホスホリル化することができる。
ロホフェートの関与は、いくつかのポリサッカライド生
合成通路において示された。さらに、キサンタンの生合
成においてピロホスホリル結合脂質キャリヤーの関与が
立証された。こうして、キサンタン生合成中間体は、こ
れらのキャリヤー脂質を使用して有機可溶性分画におい
て回収可能であることがわかった。これらの回収された
オリゴサッカリドは、引続いて、キャリヤー脂質から、
例えば、pH２および９０℃における２０分の、穏和な加
水分解によって分離し、そして分析のためアルカリ性ホ
スファターゼで脱ホスホリル化することができる。
【００２９】中間生成物を回収するこれらの方法を使用
すると、生体外の条件下に、Ｘ．カンペストリス突然変
異体のある種の細胞溶解物は、非変形体ガムの合成に要
求されるすべての基質の存在下でさえ、アセチル化され
ていないキサンタンガムまたはピルビル化されていない
キサンタンガムを生成するであろうことが見出された。
ここの教示に照して、これらの方法により、当業者は、
他の変形されたポリサッカライドを生成する細胞溶解
物、例えば、ポリテトラマーガムを生成する突然変異体
細胞溶解物を同定することができるであろう。
すると、生体外の条件下に、Ｘ．カンペストリス突然変
異体のある種の細胞溶解物は、非変形体ガムの合成に要
求されるすべての基質の存在下でさえ、アセチル化され
ていないキサンタンガムまたはピルビル化されていない
キサンタンガムを生成するであろうことが見出された。
ここの教示に照して、これらの方法により、当業者は、
他の変形されたポリサッカライドを生成する細胞溶解
物、例えば、ポリテトラマーガムを生成する突然変異体
細胞溶解物を同定することができるであろう。
【００３０】生体内でのポリサッカライドの合成
前述のポリサッカライドのための無細胞合成法の開発
は、種々のキサントモナス・カンペストリス細胞が、ア
セチル化されたまたはアセチル化されていないポリテト
ラマー、アセチル化されていないおよび／またはピルビ
ル化されていないキサンタンガム、および完全にアセチ
ル化されたキサンタンガムを生成するために必要な酵素
のすべてを有することを立証した。しかしながら、ポリ
テトラマーを生体内で合成するために全細胞を使用する
ために、反応Ｖ（図１）においてキサンタンガムの合成
をブロッキングする手段が要求されるであろう。その
上、全細胞がアセチル化されていないポリテトラマーを
合成するようにするために、アセチル化反応（図１参
照）ならびに反応Ｖをブロッキングする手段が要求され
るであろう。
は、種々のキサントモナス・カンペストリス細胞が、ア
セチル化されたまたはアセチル化されていないポリテト
ラマー、アセチル化されていないおよび／またはピルビ
ル化されていないキサンタンガム、および完全にアセチ
ル化されたキサンタンガムを生成するために必要な酵素
のすべてを有することを立証した。しかしながら、ポリ
テトラマーを生体内で合成するために全細胞を使用する
ために、反応Ｖ（図１）においてキサンタンガムの合成
をブロッキングする手段が要求されるであろう。その
上、全細胞がアセチル化されていないポリテトラマーを
合成するようにするために、アセチル化反応（図１参
照）ならびに反応Ｖをブロッキングする手段が要求され
るであろう。
【００３１】さらに、全細胞がアセチル化されていない
キサンタンガムを合成するようにするために、キサンタ
ンガムの合成の間アセチル化工程をブロッキングする手
段が要求されるであろう。さらに、全細胞が非アセチル
化、非ピルビル化キサンタンガムを合成するようにする
ために、アセチル化およびピルビル化の両者の工程にお
いてキサンタンガムの合成をブロッキングする手段が要
求されるであろう。本発明の１つの実施態様において、
突然変異誘発を使用してこれらの反応の原因となる遺伝
子のあるものを変更した。
キサンタンガムを合成するようにするために、キサンタ
ンガムの合成の間アセチル化工程をブロッキングする手
段が要求されるであろう。さらに、全細胞が非アセチル
化、非ピルビル化キサンタンガムを合成するようにする
ために、アセチル化およびピルビル化の両者の工程にお
いてキサンタンガムの合成をブロッキングする手段が要
求されるであろう。本発明の１つの実施態様において、
突然変異誘発を使用してこれらの反応の原因となる遺伝
子のあるものを変更した。
【００３２】トランスポゾン類（これはＴｎ１０および
Ｔｎ９０３を包含するが、これらに限定されない）を使
用してキサントモナス・カンペストリスを突然変異誘発
することができる。これらのトランスポゾン類は、１つ
の実施態様において、それぞれ、テトラサイクリンおよ
びカナマイシンに対する耐性を付与する。トランスポゾ
ン類、遺伝子中に自らを挿入する能力を有し、その遺伝
子中でコード配列を中断することによって突然変異を生
じさせる。
Ｔｎ９０３を包含するが、これらに限定されない）を使
用してキサントモナス・カンペストリスを突然変異誘発
することができる。これらのトランスポゾン類は、１つ
の実施態様において、それぞれ、テトラサイクリンおよ
びカナマイシンに対する耐性を付与する。トランスポゾ
ン類、遺伝子中に自らを挿入する能力を有し、その遺伝
子中でコード配列を中断することによって突然変異を生
じさせる。
【００３３】トランスポゾン類は、種々のベクター、例
えば、いわゆる自殺ベクター、例えば、ｐＲＫ２０１３
上でキサントモナス・カンペストリスに導入され得る。
ｐＲＫ２０１３は、Ditta, G. Corbin, D.および Helin
ski, D.R., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 7347
-7351 (1981)（ここに特別に引用によって加える）に記
載されているように、それ自体を、非腸内バクテリア、
例えば、キサントモナス・カンペストリスの中に移送す
る能力を有するが、その宿主内で複製することはできな
い。
えば、いわゆる自殺ベクター、例えば、ｐＲＫ２０１３
上でキサントモナス・カンペストリスに導入され得る。
ｐＲＫ２０１３は、Ditta, G. Corbin, D.および Helin
ski, D.R., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 7347
-7351 (1981)（ここに特別に引用によって加える）に記
載されているように、それ自体を、非腸内バクテリア、
例えば、キサントモナス・カンペストリスの中に移送す
る能力を有するが、その宿主内で複製することはできな
い。
【００３４】こうして、自殺ベクターがキサントモナス
・カンペストリス細胞の集団中に導入され、そしてその
集団が次にテトラサイクリンまたはカナマイシンにより
チャレンジされればトランスポゾン類の１つがキサント
モナス・カンペストリスのゲノム中に挿入された個体が
生存する。このようなチャレンジに対して生存した個体
を、キサンタンガムをつくる能力の喪失についてスクリ
ーニングすることができる。このような突然変異体は、
野生型キサントモナス・カンペストリスよりもムコイド
が少ないように思われるであろう。
・カンペストリス細胞の集団中に導入され、そしてその
集団が次にテトラサイクリンまたはカナマイシンにより
チャレンジされればトランスポゾン類の１つがキサント
モナス・カンペストリスのゲノム中に挿入された個体が
生存する。このようなチャレンジに対して生存した個体
を、キサンタンガムをつくる能力の喪失についてスクリ
ーニングすることができる。このような突然変異体は、
野生型キサントモナス・カンペストリスよりもムコイド
が少ないように思われるであろう。
【００３５】本発明の他の実施態様においては、突然変
異誘発の他の手段を使用して、キサンタンガムをつくる
能力を失った突然変異体、またはそれらが生成するガム
をアセチル化および／またはピルビル化しない突然変異
体を発生させる。このような手段はこの分野において知
られており、そして、次のものを包含するが、これらに
限定されない。
異誘発の他の手段を使用して、キサンタンガムをつくる
能力を失った突然変異体、またはそれらが生成するガム
をアセチル化および／またはピルビル化しない突然変異
体を発生させる。このような手段はこの分野において知
られており、そして、次のものを包含するが、これらに
限定されない。
【００３６】照射、組換えＤＮＡ技術〔とくに、「キサ
ンタンガムの組換えＤＮＡ仲介生成」と題するＣａｐａ
ｇｅらの１９８６年３月２６日に提出された米国特許出
願第８４２，９４４号（これをここに特別に引用によっ
て加える）、および下の実施例１に記載されている〕お
よび化学的突然変異誘発処理。このような突然変異誘発
手順の例は、次の文献に記載されている：Miller, J.
H., Experiment in Molecular Genetics (1972) ；Davi
su R.W., Bostein, D.およびRoht, J.R., Advanced Bac
terial Benetics (1980)；およびManiatis, T., Feitsc
h, E.F. およびSambrock, T., Molecular Cloning (198
2), Cold Spring Harbor。
ンタンガムの組換えＤＮＡ仲介生成」と題するＣａｐａ
ｇｅらの１９８６年３月２６日に提出された米国特許出
願第８４２，９４４号（これをここに特別に引用によっ
て加える）、および下の実施例１に記載されている〕お
よび化学的突然変異誘発処理。このような突然変異誘発
手順の例は、次の文献に記載されている：Miller, J.
H., Experiment in Molecular Genetics (1972) ；Davi
su R.W., Bostein, D.およびRoht, J.R., Advanced Bac
terial Benetics (1980)；およびManiatis, T., Feitsc
h, E.F. およびSambrock, T., Molecular Cloning (198
2), Cold Spring Harbor。
【００３７】野生型生物体よりもムコイドが少ないよう
に思われる突然変異体をまず選択することができるが、
一般に多少のポリサッカライドをつくる能力を保持して
いるものが望まれる。キサンタン突然変異体の各々の無
細胞抽出物を調製し、そして前述のように、基質の異な
る組み合わせの添加および得られる生成物の分析により
試験することができる。あるいは、適当な突然変異体
は、各突然変異体の培養ブロスを所望の多糖、例えば、
アセチル化されているかあるいはアセチル化されていな
いポリテトラマーガムまたはアセチル化されていない、
アセチル化されておらず且つピルビル化されていない、
低度にピルビル化された、または完全にアセチル化され
たキサンタンガムの存在についてアッセイすることによ
って検出できる。
に思われる突然変異体をまず選択することができるが、
一般に多少のポリサッカライドをつくる能力を保持して
いるものが望まれる。キサンタン突然変異体の各々の無
細胞抽出物を調製し、そして前述のように、基質の異な
る組み合わせの添加および得られる生成物の分析により
試験することができる。あるいは、適当な突然変異体
は、各突然変異体の培養ブロスを所望の多糖、例えば、
アセチル化されているかあるいはアセチル化されていな
いポリテトラマーガムまたはアセチル化されていない、
アセチル化されておらず且つピルビル化されていない、
低度にピルビル化された、または完全にアセチル化され
たキサンタンガムの存在についてアッセイすることによ
って検出できる。
【００３８】キサントモナス・カンペストリスのアセチ
ル化されていないキサンタンガムを生成する突然変異体
（Ｘ１００６）、ピルビル化されていないキサンタンガ
ムを生成する突然変異体（Ｘ９２１）、低いレベルのピ
ルビル化を含有するキサンタンガムを生成する突然変異
体（５％より少ない未満マンノース、Ｘ９３４）、およ
びアセチル化されておらず且つピルビル化されていない
キサンタンガムを生成する突然変異体（１２３１）（ｐ
４１ＫＳ２２）の各々は、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（American Type Culture Collecti
on, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland ）
に、それぞれ、受託番号５３４７２，５３４７３，５３
４７４および６７３４４としてブダペスト条約に基き国
際寄託されている。
ル化されていないキサンタンガムを生成する突然変異体
（Ｘ１００６）、ピルビル化されていないキサンタンガ
ムを生成する突然変異体（Ｘ９２１）、低いレベルのピ
ルビル化を含有するキサンタンガムを生成する突然変異
体（５％より少ない未満マンノース、Ｘ９３４）、およ
びアセチル化されておらず且つピルビル化されていない
キサンタンガムを生成する突然変異体（１２３１）（ｐ
４１ＫＳ２２）の各々は、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（American Type Culture Collecti
on, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland ）
に、それぞれ、受託番号５３４７２，５３４７３，５３
４７４および６７３４４としてブダペスト条約に基き国
際寄託されている。
【００３９】野生型トランスフェラーゼＶ、アセチラー
ゼおよびケタラーゼの酵素阻害剤を使用して同一の生成
物をつくることは、この発明の範囲を逸脱するものでは
ない。多糖のこの族を生成する、その他の変法が考えら
れ、これには天然のキサンタンガムの酵素的および化学
的分解が包含される。突然変異体は、野生型キサントモ
ナス・カンペストリスの増殖について、この分野におい
て一般に知られている条件下に増殖させることができ
る。例えば、それらは適当な同化可能な炭素源、例え
ば、グルコース、スクロース、マルトース、澱粉、転化
糖、複合炭水化物、例えば、糖蜜またはコーンシロッ
プ、種々の有機酸類などで増殖させることができる。炭
素源の混合物を使用することもできる。炭素源の供給濃
度は、しばしば、１０〜６０ｇ／ｌである。
ゼおよびケタラーゼの酵素阻害剤を使用して同一の生成
物をつくることは、この発明の範囲を逸脱するものでは
ない。多糖のこの族を生成する、その他の変法が考えら
れ、これには天然のキサンタンガムの酵素的および化学
的分解が包含される。突然変異体は、野生型キサントモ
ナス・カンペストリスの増殖について、この分野におい
て一般に知られている条件下に増殖させることができ
る。例えば、それらは適当な同化可能な炭素源、例え
ば、グルコース、スクロース、マルトース、澱粉、転化
糖、複合炭水化物、例えば、糖蜜またはコーンシロッ
プ、種々の有機酸類などで増殖させることができる。炭
素源の混合物を使用することもできる。炭素源の供給濃
度は、しばしば、１０〜６０ｇ／ｌである。
【００４０】また、有機または無機の同化可能な窒素
源、一般に約０．１〜１０．０ｇ／ｌ、および無機類
が、増殖に必要であり、そしてそれらの選択は当業者に
とって容易であろう。適当な窒素源の例は、アンモニウ
ム塩類、硝酸塩、尿素、酵母エキス、ペプトン、または
他の加水分解可能な蛋白質の物質またはそれらの混合物
である。適当な無機類の例は、リン、イオウ、カリウ
ム、ナトリウム、鉄、マグネシウムであり、これらはキ
レート化剤、例えば、ＥＤＴＡまたはクエン酸と一緒に
添加される。
源、一般に約０．１〜１０．０ｇ／ｌ、および無機類
が、増殖に必要であり、そしてそれらの選択は当業者に
とって容易であろう。適当な窒素源の例は、アンモニウ
ム塩類、硝酸塩、尿素、酵母エキス、ペプトン、または
他の加水分解可能な蛋白質の物質またはそれらの混合物
である。適当な無機類の例は、リン、イオウ、カリウ
ム、ナトリウム、鉄、マグネシウムであり、これらはキ
レート化剤、例えば、ＥＤＴＡまたはクエン酸と一緒に
添加される。
【００４１】キサントモナス・カンペストリスの増殖に
最適な温度は、一般に、１８℃〜３５℃、好ましくは約
２７℃〜３０℃である。キサントモナス・カンペストリ
スの細胞は、溶存酸素の適切なレベル、例えば約１０％
飽和が維持されるように空気または酸素を供給すること
によって好気的に増殖させる。好ましくは、このレベル
を約２０％以上に保持する。pHは、しばしば、約６．０
〜８．０、好ましくは約６．５〜７．５に維持される。
本発明のポリサッカライドは発酵ブロスから適当な手段
によって回収できる。イソプロパノール、エタノールま
たは他の適当なアルコールによる沈澱により、本発明ポ
リサッカライドが容易に得られる。一般にアルコール
は、体積基準で約５０〜７５％の濃度に、塩化カリウ
ム、塩化ナトリウムまたは他の塩の存在下に添加する。
あるいは、ポリマーはブロスから限外濾過によって回収
できる。
最適な温度は、一般に、１８℃〜３５℃、好ましくは約
２７℃〜３０℃である。キサントモナス・カンペストリ
スの細胞は、溶存酸素の適切なレベル、例えば約１０％
飽和が維持されるように空気または酸素を供給すること
によって好気的に増殖させる。好ましくは、このレベル
を約２０％以上に保持する。pHは、しばしば、約６．０
〜８．０、好ましくは約６．５〜７．５に維持される。
本発明のポリサッカライドは発酵ブロスから適当な手段
によって回収できる。イソプロパノール、エタノールま
たは他の適当なアルコールによる沈澱により、本発明ポ
リサッカライドが容易に得られる。一般にアルコール
は、体積基準で約５０〜７５％の濃度に、塩化カリウ
ム、塩化ナトリウムまたは他の塩の存在下に添加する。
あるいは、ポリマーはブロスから限外濾過によって回収
できる。
【００４２】ピルビル化されていないキサンタンガム
は、特定の用途において水性媒質の粘性付与剤としてキ
サンタンより優れる。アセチル化されていないキサンタ
ンおよびピルビル化されていないキサンタンの溶液の粘
度は、高い温度および／または高い塩濃度の条件下で保
持される。こうして、本発明の生成物は第２および第３
の油回収における使用に理想的に適する。
は、特定の用途において水性媒質の粘性付与剤としてキ
サンタンより優れる。アセチル化されていないキサンタ
ンおよびピルビル化されていないキサンタンの溶液の粘
度は、高い温度および／または高い塩濃度の条件下で保
持される。こうして、本発明の生成物は第２および第３
の油回収における使用に理想的に適する。
【００４３】油回収の増強において使用するための移動
度調節溶液はまた、ここに開示する種々の変種形体ポリ
サッカライドポリマーから調製することができる。約５
００〜約３０００ppm の濃度のポリサッカライドポリマ
ーの溶液がこのような移動度調節溶液に適する。他の既
知の添加剤をさらにこれらの溶液と組み合わせて使用し
て、さらに油の回収を増大することができる。このよう
な添加剤は、例えば、界面活性剤、アルカリ剤または金
属または有機架橋剤を包含する。ポリサッカライドポリ
マーはさらに、キサンタンガムのように、食品、化粧
品、医薬製剤、紙のサイジング、掘削泥しょう、印刷イ
ンキなどにおける増粘剤として、およびゲル化剤として
使用できる。さらに、それらはパイプ中の流体の流れの
摩擦抵抗を減少するために使用できる。
度調節溶液はまた、ここに開示する種々の変種形体ポリ
サッカライドポリマーから調製することができる。約５
００〜約３０００ppm の濃度のポリサッカライドポリマ
ーの溶液がこのような移動度調節溶液に適する。他の既
知の添加剤をさらにこれらの溶液と組み合わせて使用し
て、さらに油の回収を増大することができる。このよう
な添加剤は、例えば、界面活性剤、アルカリ剤または金
属または有機架橋剤を包含する。ポリサッカライドポリ
マーはさらに、キサンタンガムのように、食品、化粧
品、医薬製剤、紙のサイジング、掘削泥しょう、印刷イ
ンキなどにおける増粘剤として、およびゲル化剤として
使用できる。さらに、それらはパイプ中の流体の流れの
摩擦抵抗を減少するために使用できる。
【００４４】実施例１
この実施例は、アセチラーゼまたはケタラーゼの活性を
欠くＸ．カンペストリス突然変異体株を発生するために
使用した突然変異誘発およびスクリーニングの方法を示
す。キサンタンガムの生合成の酵素をコードする遺伝子
は、Ｘ．カンペストリスの染色体上に集まった遺伝子の
組からなることが示された。この「ガム遺伝子のクラス
ター（ｃｌｕｓｔｅｒ）」はＣａｐａｇｅらによって詳
細に記載された。ガム遺伝子ＤＮＡのセグメントは、Ｃ
ａｐａｇｅらが詳述しているように、プラスミドベクタ
ー、例えばｐＭＷ７９の上にクロー化されている。
欠くＸ．カンペストリス突然変異体株を発生するために
使用した突然変異誘発およびスクリーニングの方法を示
す。キサンタンガムの生合成の酵素をコードする遺伝子
は、Ｘ．カンペストリスの染色体上に集まった遺伝子の
組からなることが示された。この「ガム遺伝子のクラス
ター（ｃｌｕｓｔｅｒ）」はＣａｐａｇｅらによって詳
細に記載された。ガム遺伝子ＤＮＡのセグメントは、Ｃ
ａｐａｇｅらが詳述しているように、プラスミドベクタ
ー、例えばｐＭＷ７９の上にクロー化されている。
【００４５】領域特異的突然変異誘発を、プラスミドｐ
ＭＷ７９中に担持されたガムＤＮＡのサブクローン化部
分に対し実施した。これらのクロー化ＤＮＡセグメント
を生体内でトランスポゾンを使用して、そして生体外
で、組換えＤＮＡ技術により突然変異誘発して、クロー
化Ｘ．カンペストリスＤＮＡ内に、挿入、欠失および置
換突然変異を発生させた。これらの突然変異によって与
えられる表現型を研究するために、突然変異を担持する
プラスミドをＸ．カンペストリスに移して戻し、引続い
て、プラスミドに担持された突然変異した遺伝子が相同
組換えを経て染色体中に挿入されている組換え体を同定
した。Ｔｎ１０によってコードされるテトラサイクリン
耐性は、プラスミドから染色体中への突然変異の移動に
ついての便利な選択的系を与える。
ＭＷ７９中に担持されたガムＤＮＡのサブクローン化部
分に対し実施した。これらのクロー化ＤＮＡセグメント
を生体内でトランスポゾンを使用して、そして生体外
で、組換えＤＮＡ技術により突然変異誘発して、クロー
化Ｘ．カンペストリスＤＮＡ内に、挿入、欠失および置
換突然変異を発生させた。これらの突然変異によって与
えられる表現型を研究するために、突然変異を担持する
プラスミドをＸ．カンペストリスに移して戻し、引続い
て、プラスミドに担持された突然変異した遺伝子が相同
組換えを経て染色体中に挿入されている組換え体を同定
した。Ｔｎ１０によってコードされるテトラサイクリン
耐性は、プラスミドから染色体中への突然変異の移動に
ついての便利な選択的系を与える。
【００４６】１つのこのような突然変異株（Ｘ１００
６）はＴｎ１０挿入を有し、アセチラーゼ活性を不活性
化することがわかった。この突然変異体株は、実施例２
および３において特徴づけられており、そしてアセチル
化されていないポリサッカライドを生成することがわか
った。第２の突然変異株は、Ｔｎ１０のテトラサイクリ
ン耐性遺伝子を含有するＤＮＡの断片を、ガム遺伝子ク
ラスター内の制限部位の中に生体外挿入することによっ
て構成した。この突然変異株（Ｘ９２１）はケタラーゼ
活性に欠けることがわかった。実施例２および３の方法
によって見出されたように、この突然変異体はピルビル
化されていないキサンタンを生成した。
６）はＴｎ１０挿入を有し、アセチラーゼ活性を不活性
化することがわかった。この突然変異体株は、実施例２
および３において特徴づけられており、そしてアセチル
化されていないポリサッカライドを生成することがわか
った。第２の突然変異株は、Ｔｎ１０のテトラサイクリ
ン耐性遺伝子を含有するＤＮＡの断片を、ガム遺伝子ク
ラスター内の制限部位の中に生体外挿入することによっ
て構成した。この突然変異株（Ｘ９２１）はケタラーゼ
活性に欠けることがわかった。実施例２および３の方法
によって見出されたように、この突然変異体はピルビル
化されていないキサンタンを生成した。
【００４７】第３の突然変異体（Ｘ９３４）は、また、
ケタラーゼ活性を大きく減少させていることがわかっ
た。この突然変異株は、ピルビル化が非常に低いキサン
タンガムを生成する：通常のキサンタン中に存在するピ
ルビル化の１〜５％。突然変異株Ｘ９３４は下に記載す
るようにして見出された。プラスミドに担持されたＸ．
カンペストリスＤＮＡとＸ．キサントモナス染色体との
間の組換えを研究するように設計した予備実験におい
て、プラスミドｐＴＸ６５５をモデル系として使用し
た。このプラスミドは、プラスミドＲＳＦ１０１０中に
クロー化された２．３kbのＸ．カンペストリスＰｓｔＩ
断片の中央にＴｎ１０挿入部を有する。このＴｎ１０の
挿入により、ＣａｐａｇｅらおよびＶａｎｄｅｒｓｌｉ
ｃｅらが記載するように、突然変異体株ｐＴＸ６５５に
おいてＧｕｍ−欠損が生ずる。
ケタラーゼ活性を大きく減少させていることがわかっ
た。この突然変異株は、ピルビル化が非常に低いキサン
タンガムを生成する：通常のキサンタン中に存在するピ
ルビル化の１〜５％。突然変異株Ｘ９３４は下に記載す
るようにして見出された。プラスミドに担持されたＸ．
カンペストリスＤＮＡとＸ．キサントモナス染色体との
間の組換えを研究するように設計した予備実験におい
て、プラスミドｐＴＸ６５５をモデル系として使用し
た。このプラスミドは、プラスミドＲＳＦ１０１０中に
クロー化された２．３kbのＸ．カンペストリスＰｓｔＩ
断片の中央にＴｎ１０挿入部を有する。このＴｎ１０の
挿入により、ＣａｐａｇｅらおよびＶａｎｄｅｒｓｌｉ
ｃｅらが記載するように、突然変異体株ｐＴＸ６５５に
おいてＧｕｍ−欠損が生ずる。
【００４８】この実験は、ｐＴＸ６５５をプラスミドｐ
ＲＫ２０１３によって動員し、そしてそれをＥ．コリか
らＸ．カンペストリス中にＴｎ１０によってコードされ
たテトラサイクリン耐性の転移について選択することに
よって転移させることであった。この交配の初期の結果
は例外的であり、そしてＴｎ１０がプラスミド上に担持
されている場合には、Ｘ．カンペストリス中でテトラサ
イクリン耐性を効率的に発現しないが、Ｔｎ１０がＸ．
カンペストリスの染色体中に担持されている場合には前
記薬物耐性はより効率よく発現されることを示唆した。
ＲＫ２０１３によって動員し、そしてそれをＥ．コリか
らＸ．カンペストリス中にＴｎ１０によってコードされ
たテトラサイクリン耐性の転移について選択することに
よって転移させることであった。この交配の初期の結果
は例外的であり、そしてＴｎ１０がプラスミド上に担持
されている場合には、Ｘ．カンペストリス中でテトラサ
イクリン耐性を効率的に発現しないが、Ｔｎ１０がＸ．
カンペストリスの染色体中に担持されている場合には前
記薬物耐性はより効率よく発現されることを示唆した。
【００４９】この現象は、また、Ｅ．コリでのＴｎ１０
についても記載されている。そこにおいて示されている
ように、染色体中に挿入されているＴｎ１０の１つのコ
ピーを有する菌株は、マルチコピーのプラスミド上にＴ
ｎ１０を有する菌株よりも、有意に高いテトラサイクリ
ン濃度に対して耐性である。上の交配からのＴｅｔ
rＸ．カンペストリスの選択は、テトラサイクリン上で
の増殖が非常に劣る（すなわち、小さい淡いコロニー）
子孫を高い頻度（０．５／受容体）で生じさせた。延長
したインキュベーションの後、大きい割合（２５％）の
コロニーがより激しく増殖する細胞のセクター（ｓｅｃ
ｔｏｒ）を生成した。
についても記載されている。そこにおいて示されている
ように、染色体中に挿入されているＴｎ１０の１つのコ
ピーを有する菌株は、マルチコピーのプラスミド上にＴ
ｎ１０を有する菌株よりも、有意に高いテトラサイクリ
ン濃度に対して耐性である。上の交配からのＴｅｔ
rＸ．カンペストリスの選択は、テトラサイクリン上で
の増殖が非常に劣る（すなわち、小さい淡いコロニー）
子孫を高い頻度（０．５／受容体）で生じさせた。延長
したインキュベーションの後、大きい割合（２５％）の
コロニーがより激しく増殖する細胞のセクター（ｓｅｃ
ｔｏｒ）を生成した。
【００５０】これらのセクターの５０％より多くは形態
がＧｕｍ−であるように見えた。これらは、多分、Ｔｎ
１０の挿入を含有するプラスミドに担持されたＤＮＡと
染色体の野生型ＤＮＡとの間の組換えから生ずる。Ｔｎ
１０が染色体中に組み込まれるとき、高いレベルのＴｅ
ｒr が得られ、そして激しく増殖するセクターが観察さ
れる。こられのＧｕｍ−，Ｔｅｔr セクターを取り上
げ、そしてテトラサイクリン上に再びストリーキング
（ｓｔｒｅａｋ）すると、それらは良好に増殖し、そし
て特徴的なＧｕｍ−形態を表わす。
がＧｕｍ−であるように見えた。これらは、多分、Ｔｎ
１０の挿入を含有するプラスミドに担持されたＤＮＡと
染色体の野生型ＤＮＡとの間の組換えから生ずる。Ｔｎ
１０が染色体中に組み込まれるとき、高いレベルのＴｅ
ｒr が得られ、そして激しく増殖するセクターが観察さ
れる。こられのＧｕｍ−，Ｔｅｔr セクターを取り上
げ、そしてテトラサイクリン上に再びストリーキング
（ｓｔｒｅａｋ）すると、それらは良好に増殖し、そし
て特徴的なＧｕｍ−形態を表わす。
【００５１】Ｇｕｍ+ ，Ｔｅｒr 単離体も特徴づけた。
これらの株のあるもの（とくにＸ９３４）は、相同組換
えを介してＸ．カンペストリスの染色体中に挿入された
全体プラスミドｐＴＸ６５５を含有することがわかっ
た。Ｘ９３４株の染色体の構造を、染色体ＤＮＡのサザ
ン・ブロットハイブリダイゼーションによって決定し、
これはプラスミド配列が染色体的に一体化された形態で
存在することを示す。
これらの株のあるもの（とくにＸ９３４）は、相同組換
えを介してＸ．カンペストリスの染色体中に挿入された
全体プラスミドｐＴＸ６５５を含有することがわかっ
た。Ｘ９３４株の染色体の構造を、染色体ＤＮＡのサザ
ン・ブロットハイブリダイゼーションによって決定し、
これはプラスミド配列が染色体的に一体化された形態で
存在することを示す。
【００５２】実施例２
この実施例は、本発明の変形されたポリサッカライドを
生体外で調製できる方法を示す。例えば、これはアセチ
ル化されていないおよび／またはピルビル化されていな
いキサンタンガムを生体外でどのようにして調製したか
を示す。
生体外で調製できる方法を示す。例えば、これはアセチ
ル化されていないおよび／またはピルビル化されていな
いキサンタンガムを生体外でどのようにして調製したか
を示す。
【００５３】細胞溶解部の調製
実施例１および５に記載するキサントモナス・カンペス
トリスＢ１４５９ Ｓ４−ＬまたはＳ４−Ｌ突然変異株
を、Ｊｅａｎｅｓ，Ａ．ら、米国農務省、ＡＲＳ−ＮＣ
−５１，ｐｐ１４（１９７６）（ここに特別に引用によ
って加える）に記載されているように、２％（ｗ／ｖ）
のグルコースを補充したＹＭ（酵母−麦芽培地）中で増
殖せしめた。培養物を対数期後期まで３０℃において増
殖せしめた。細胞を遠心分離によって収得し、そして冷
トリス−ＨＣｌ、７０ミリモル（pH８．２）および１０
ミリモルのＥＤＴＡで洗浄し、そしてGarcia, R.C.ら、
European Journal of Biochemistry 43：93-105 (197
4) （ここに特別に引用によって加える）に類似する手
順により、３回凍結−溶融した。
トリスＢ１４５９ Ｓ４−ＬまたはＳ４−Ｌ突然変異株
を、Ｊｅａｎｅｓ，Ａ．ら、米国農務省、ＡＲＳ−ＮＣ
−５１，ｐｐ１４（１９７６）（ここに特別に引用によ
って加える）に記載されているように、２％（ｗ／ｖ）
のグルコースを補充したＹＭ（酵母−麦芽培地）中で増
殖せしめた。培養物を対数期後期まで３０℃において増
殖せしめた。細胞を遠心分離によって収得し、そして冷
トリス−ＨＣｌ、７０ミリモル（pH８．２）および１０
ミリモルのＥＤＴＡで洗浄し、そしてGarcia, R.C.ら、
European Journal of Biochemistry 43：93-105 (197
4) （ここに特別に引用によって加える）に類似する手
順により、３回凍結−溶融した。
【００５４】この手順は、懸濁液の粘度増加によって示
されるように、細胞を破裂させ、そして処理後細胞の生
存能力を完全に損失させた（１／１０6 の生存）。凍結
−溶融による細胞溶解物を小分けして−８０℃において
凍結した。蛋白質濃度はBIORAD のアッセイ（BIO RAD L
aboratories, Richmond, California）で決定し、そし
て１mlの細胞溶解物につき５〜７mgの細胞蛋白質が存在
することがわかった。
されるように、細胞を破裂させ、そして処理後細胞の生
存能力を完全に損失させた（１／１０6 の生存）。凍結
−溶融による細胞溶解物を小分けして−８０℃において
凍結した。蛋白質濃度はBIORAD のアッセイ（BIO RAD L
aboratories, Richmond, California）で決定し、そし
て１mlの細胞溶解物につき５〜７mgの細胞蛋白質が存在
することがわかった。
【００５５】生合成アッセイの手順
Ielpi, L., Couso, R.O.および Danker, J.A., FEBS Le
tters 130 ：253-256(1981)（ここに特別に引用によっ
て加える）に記載されているように、凍結−溶融による
細胞溶解物のアリコート（３００〜４００μｇの蛋白質
に等しい）、ＤＮアーゼＩ（１０μｇ／ｌ）およびＭｇ
Ｃｌ2 （８ミリモル）を２０℃において２０分間予備イ
ンキュベーションした。等しい体積の７０ミリモルのト
リス−ＨＣｌ、pH８．２、および所望の放射線標識した
糖ヌクレオチド（ＵＤＰ−グルコース、ＧＤＰ−マンノ
ースおよびＵＤＰ−グルクロン酸）を添加し、そして２
０℃でインキュベーションした。
tters 130 ：253-256(1981)（ここに特別に引用によっ
て加える）に記載されているように、凍結−溶融による
細胞溶解物のアリコート（３００〜４００μｇの蛋白質
に等しい）、ＤＮアーゼＩ（１０μｇ／ｌ）およびＭｇ
Ｃｌ2 （８ミリモル）を２０℃において２０分間予備イ
ンキュベーションした。等しい体積の７０ミリモルのト
リス−ＨＣｌ、pH８．２、および所望の放射線標識した
糖ヌクレオチド（ＵＤＰ−グルコース、ＧＤＰ−マンノ
ースおよびＵＤＰ−グルクロン酸）を添加し、そして２
０℃でインキュベーションした。
【００５６】放射線標識したホスホエノールピルベート
およびアセチル補酵素Ａを、Ielpi等（前掲）及びIelp
i, L., Couso, R.O.及び Damkert, M.A., Biochem. Bio
phys. Res. Comm. 102 ：1400-1408 (1981)、並びにIe
lpi, L., Couso, R.O.及び Dankert, M.A., Biochem. I
ntern. ６：323-333 (1983)（両者を引用によりこの明
細書に組み入れる。）に記載されているように、必要に
応じて添加する。種々の時間において、反応を４℃にて
緩衝液で停止した。試料を遠心分離し、そして沈澱物を
緩衝液で２回洗浄した。
およびアセチル補酵素Ａを、Ielpi等（前掲）及びIelp
i, L., Couso, R.O.及び Damkert, M.A., Biochem. Bio
phys. Res. Comm. 102 ：1400-1408 (1981)、並びにIe
lpi, L., Couso, R.O.及び Dankert, M.A., Biochem. I
ntern. ６：323-333 (1983)（両者を引用によりこの明
細書に組み入れる。）に記載されているように、必要に
応じて添加する。種々の時間において、反応を４℃にて
緩衝液で停止した。試料を遠心分離し、そして沈澱物を
緩衝液で２回洗浄した。
【００５７】上澄みを一緒にし、キャリヤーキサンタン
（１００μｇ）を添加し、そしてキサンタン＋合成した
ポリマーをエタノール（６０％）−ＫＣｌ（０．８％）
で沈澱させた。沈澱したポリマーを水中に再懸濁し、そ
して２回以上再沈澱させて取り込まれていない標識を除
去した。沈澱物（ガム分画と呼ぶ）中に取り込まれた放
射能を液体シンチーションカウンターで決定し、そして
データを処理して取り込み放射線標識された成分のピコ
モルで表わす）を算出した。
（１００μｇ）を添加し、そしてキサンタン＋合成した
ポリマーをエタノール（６０％）−ＫＣｌ（０．８％）
で沈澱させた。沈澱したポリマーを水中に再懸濁し、そ
して２回以上再沈澱させて取り込まれていない標識を除
去した。沈澱物（ガム分画と呼ぶ）中に取り込まれた放
射能を液体シンチーションカウンターで決定し、そして
データを処理して取り込み放射線標識された成分のピコ
モルで表わす）を算出した。
【００５８】Ｘ１００６の細胞リゼイトは、炭素−１４
アセテートを〔14Ｃ〕アセチルＣｏＡから生体外合成系
のガム分画中に取り込まなかった。Ｓ４−Ｌの細胞溶解
物は、〔14Ｃ〕アセテートで放射線標識されたガムを生
体外で生成しなかった。同様に、Ｘ９２１の細胞溶解物
は〔14Ｃ〕ピルベートをガム画分中に組入れず、これに
対してＳ４−Ｌ細胞溶解物は放射線標識したピルベート
をホスホエノール〔14Ｃ〕ピルベースからガム画分中に
生体外で取り込んだ。こうして、Ｘ１００６はアセチラ
ーゼの遺伝子中に欠損をもつ突然変異株として同定さ
れ、そしてＸ９２１はケタラーゼの遺伝子中に欠損をも
つ突然変異株として同定された。これらの株の細胞溶解
物は、それぞれ、アセチル化されていないキサンタンお
よびピルビル化されていないキサンタンを生体外で生成
した。
アセテートを〔14Ｃ〕アセチルＣｏＡから生体外合成系
のガム分画中に取り込まなかった。Ｓ４−Ｌの細胞溶解
物は、〔14Ｃ〕アセテートで放射線標識されたガムを生
体外で生成しなかった。同様に、Ｘ９２１の細胞溶解物
は〔14Ｃ〕ピルベートをガム画分中に組入れず、これに
対してＳ４−Ｌ細胞溶解物は放射線標識したピルベート
をホスホエノール〔14Ｃ〕ピルベースからガム画分中に
生体外で取り込んだ。こうして、Ｘ１００６はアセチラ
ーゼの遺伝子中に欠損をもつ突然変異株として同定さ
れ、そしてＸ９２１はケタラーゼの遺伝子中に欠損をも
つ突然変異株として同定された。これらの株の細胞溶解
物は、それぞれ、アセチル化されていないキサンタンお
よびピルビル化されていないキサンタンを生体外で生成
した。
【００５９】また、基質を省略することにより、Ｘ．カ
ンペストリスＢ１４５９ Ｓ４−Ｌ細胞溶解物は生体外
で変形した多糖を生成した。例えば、Ｓ４−Ｌの細胞溶
解物は、内因性アセチル−ＣｏＡおよびホスホエノール
ピルベートが消耗されたとき、アセチル化されておらず
ピルビル化されていないキサンタンガムを生体外で生成
した。トランフフェラーゼＶについての遺伝子の突然変
異は、ポリテトラマーを生成するであろう。この表現型
は、前述の方法によって立証されるであろう。このガム
分画は２：１：１のモル比でグルコース、マンノースお
よびグルクロン酸から構成されたことを明らかにするで
あろう。脂質キャリヤーから加水分解したテトラマーの
中間体は、また、ＴＬＣ上の移動度および糖類のモル比
によって検出されるであろう。
ンペストリスＢ１４５９ Ｓ４−Ｌ細胞溶解物は生体外
で変形した多糖を生成した。例えば、Ｓ４−Ｌの細胞溶
解物は、内因性アセチル−ＣｏＡおよびホスホエノール
ピルベートが消耗されたとき、アセチル化されておらず
ピルビル化されていないキサンタンガムを生体外で生成
した。トランフフェラーゼＶについての遺伝子の突然変
異は、ポリテトラマーを生成するであろう。この表現型
は、前述の方法によって立証されるであろう。このガム
分画は２：１：１のモル比でグルコース、マンノースお
よびグルクロン酸から構成されたことを明らかにするで
あろう。脂質キャリヤーから加水分解したテトラマーの
中間体は、また、ＴＬＣ上の移動度および糖類のモル比
によって検出されるであろう。
【００６０】実施例３
この実施例は、アセチル化されていないガムを生体内で
生成するために、アセチラーゼ欠失株、Ｘ１００６、を
使用することを明らかにする。この実施例は、また、ケ
タラーゼ−マイナス株Ｘ９２１、からピルビル化されて
いないガムを、および株Ｘ９３４からピルビル化のレベ
ルが低いキサンタンガムが、生体内で生成することを明
らかにする。
生成するために、アセチラーゼ欠失株、Ｘ１００６、を
使用することを明らかにする。この実施例は、また、ケ
タラーゼ−マイナス株Ｘ９２１、からピルビル化されて
いないガムを、および株Ｘ９３４からピルビル化のレベ
ルが低いキサンタンガムが、生体内で生成することを明
らかにする。
【００６１】前述の３種類の突然変異株およびＳ４−Ｌ
を、２％のグルコースを含むブロス中で３０℃において
一夜増殖させた。細胞を遠心により除去し、上澄みから
ガムを２−プロパノールまたはエタノールおよび０．５
〜１％の塩化カリウムの添加により沈澱させることによ
ってガムを収得した。沈澱物の遠心によりガムを回収
し、そして再懸濁した。この手順を反復した。再懸濁し
たガムを水に対して透析した。各ポリサッカライドの試
料を酸加水分解し、そしてＢＩＯ ＲＡＤ ＨＰＸ−８
７Ｈカラムを使用するＨＰＬＣによって分析した。キサ
ンタン成分を、既知濃度の標準の注入によって定量し
た。
を、２％のグルコースを含むブロス中で３０℃において
一夜増殖させた。細胞を遠心により除去し、上澄みから
ガムを２−プロパノールまたはエタノールおよび０．５
〜１％の塩化カリウムの添加により沈澱させることによ
ってガムを収得した。沈澱物の遠心によりガムを回収
し、そして再懸濁した。この手順を反復した。再懸濁し
たガムを水に対して透析した。各ポリサッカライドの試
料を酸加水分解し、そしてＢＩＯ ＲＡＤ ＨＰＸ−８
７Ｈカラムを使用するＨＰＬＣによって分析した。キサ
ンタン成分を、既知濃度の標準の注入によって定量し
た。
【００６２】加水分解したガムのＨＰＬＣ分析は、Ｘ９
２１がピルビン酸を含まないキサンタンガムを生成する
ことを示した。株Ｘ１００６はアセテートを含まないキ
サンタンガムを生成した。株Ｘ９３４は、Ｓ４−Ｌガム
の１〜５％のレベルでピルビル酸を含有するガムを生成
した。
２１がピルビン酸を含まないキサンタンガムを生成する
ことを示した。株Ｘ１００６はアセテートを含まないキ
サンタンガムを生成した。株Ｘ９３４は、Ｓ４−Ｌガム
の１〜５％のレベルでピルビル酸を含有するガムを生成
した。
【００６３】実施例４
この実施例は、アセチル化されておらず且つピルビル化
されていないキサンタンを生成する、Ｘ．カンペストリ
スの突然変異体を造成するために使用できる方法を記載
する。ケタラーゼ（Ｘ９２１）またはアセチラーゼ（Ｘ
１００６）活性を欠くＸ．カンペストリスの突然変異株
は記載されている。ＶａｎｄｅｒｓｌｉｃｅらおよびＣ
ａｐａｇｅらが記載する微生物遺伝学および組換えＤＮ
Ａ法を使用して、ケタラーゼ欠失および脂肪族欠失を
Ｘ．カンペストリスの単一の株の中に導入することがで
きた。この二重突然変異の株は、アセチル化されておら
ず且つピルビル化されていないキサンタンガムを生成す
るであろう。
されていないキサンタンを生成する、Ｘ．カンペストリ
スの突然変異体を造成するために使用できる方法を記載
する。ケタラーゼ（Ｘ９２１）またはアセチラーゼ（Ｘ
１００６）活性を欠くＸ．カンペストリスの突然変異株
は記載されている。ＶａｎｄｅｒｓｌｉｃｅらおよびＣ
ａｐａｇｅらが記載する微生物遺伝学および組換えＤＮ
Ａ法を使用して、ケタラーゼ欠失および脂肪族欠失を
Ｘ．カンペストリスの単一の株の中に導入することがで
きた。この二重突然変異の株は、アセチル化されておら
ず且つピルビル化されていないキサンタンガムを生成す
るであろう。
【００６４】プラスミドベクター上に担持されたクロー
ン化ガム遺伝子ＤＮＡの中への挿入突然変異を生成する
方法は、Ｃａｐａｇｅらによって記載されている。生体
内または生体外における突然変異誘発の第２ラウンドの
ための基材として突然変異株Ｘ９２１を生ずる、挿入変
異を有するプラスミドの使用を考えることができるであ
ろう。この突然変異誘発の第２ラウンドは、この分野に
おいて容易に思い浮かぶ多くの転移可能な要素のいずれ
をも、あるいは容易に明らかな数の選択可能な遺伝標識
を含有するＤＮＡ制限断片のいずれをも使用できるであ
ろう。
ン化ガム遺伝子ＤＮＡの中への挿入突然変異を生成する
方法は、Ｃａｐａｇｅらによって記載されている。生体
内または生体外における突然変異誘発の第２ラウンドの
ための基材として突然変異株Ｘ９２１を生ずる、挿入変
異を有するプラスミドの使用を考えることができるであ
ろう。この突然変異誘発の第２ラウンドは、この分野に
おいて容易に思い浮かぶ多くの転移可能な要素のいずれ
をも、あるいは容易に明らかな数の選択可能な遺伝標識
を含有するＤＮＡ制限断片のいずれをも使用できるであ
ろう。
【００６５】２つの挿入突然変異体を有するプラスミド
の組は、Ｃａｐａｇｅらの遺伝子置換技術において使用
して、プラスミドに担持された突然変異をＸ．カンペス
トリスの染色体中に転移することができるでろう。得ら
れる株の表現型は、実施例においてＶａｎｄｅｒｓｌｉ
ｃｅらおよびＣａｐａｇｅらが記載する生体内および生
体外技術によって分析できる。これらの分析は、ケタラ
ーゼおよびアセチラーゼ活性の両者においてブロッキン
グされている、二重突然変異株を明らかにするであろ
う。これらの二重突然変異株は、同時にピルビル化され
ておらず且つアシル化されていないキサンタンを生成す
るであろう。
の組は、Ｃａｐａｇｅらの遺伝子置換技術において使用
して、プラスミドに担持された突然変異をＸ．カンペス
トリスの染色体中に転移することができるでろう。得ら
れる株の表現型は、実施例においてＶａｎｄｅｒｓｌｉ
ｃｅらおよびＣａｐａｇｅらが記載する生体内および生
体外技術によって分析できる。これらの分析は、ケタラ
ーゼおよびアセチラーゼ活性の両者においてブロッキン
グされている、二重突然変異株を明らかにするであろ
う。これらの二重突然変異株は、同時にピルビル化され
ておらず且つアシル化されていないキサンタンを生成す
るであろう。
【００６６】実施例５
この実施例は、ポリテトラマーを生成するＸ．カンペス
トリス突然変異体を得る手順を記載する。上におよびＶ
ａｎｄｅｒｓｌｉｃｅら（前掲）に記載されているよう
に、切断された側鎖のポリテトラマーをもつキサンタン
に関係するポリサッカライドはすでに得られた。この突
然変異体は、ここに記載する生体内および生体外の方法
によって特徴づけられた。この明細書及び参照した特許
出願に記載される方法を使用して、この分野に熟達して
いる者は、前述のポリテトラマーをつくるＸ．カンペス
トリスの突然変異株を生成できる。
トリス突然変異体を得る手順を記載する。上におよびＶ
ａｎｄｅｒｓｌｉｃｅら（前掲）に記載されているよう
に、切断された側鎖のポリテトラマーをもつキサンタン
に関係するポリサッカライドはすでに得られた。この突
然変異体は、ここに記載する生体内および生体外の方法
によって特徴づけられた。この明細書及び参照した特許
出願に記載される方法を使用して、この分野に熟達して
いる者は、前述のポリテトラマーをつくるＸ．カンペス
トリスの突然変異株を生成できる。
【００６７】これらの突然変異株の同定は、この明細書
およびＣａｐａｇｅら、ｓｕｐｒａに記載されているよ
うに、生体外法により、あるいは生体内で生成されたポ
リサッカライドの分析により達成することができる。い
ったんポリテトラマー生産性突然変異体が得られると、
追加の突然変異工程、例えば、実施例１および４に記載
されている工程、およびこの分野に熟達している者に一
般に知られている工程を実施して、アセチル化されてい
ないポリテトラマーを生成する突然変異株を発生させる
ことができる。
およびＣａｐａｇｅら、ｓｕｐｒａに記載されているよ
うに、生体外法により、あるいは生体内で生成されたポ
リサッカライドの分析により達成することができる。い
ったんポリテトラマー生産性突然変異体が得られると、
追加の突然変異工程、例えば、実施例１および４に記載
されている工程、およびこの分野に熟達している者に一
般に知られている工程を実施して、アセチル化されてい
ないポリテトラマーを生成する突然変異株を発生させる
ことができる。
【００６８】実施例６
この実施例はアセチラーゼ遺伝子およびケタラーゼ遺伝
子をベクター上にクローン化して、ここに記載するポリ
サッカライドを完全にアシル化、完全にピルビル化、ま
たは完全にアシル化および完全にピルビル化することを
保証することを論ずる。Ｘ．カンペストリス株Ｘ１００
６およびＸ９２１は、実施例２および３に記載したよう
に、それぞれ、アセチラーゼおよびケタラーゼの遺伝子
において突然変異を有する。これらの突然変異体は実施
例１に記載する方法を使用してつくられた。当業者は、
Ｂｅｔｌａｃｈら、ｓｕｐｒａに記載される方法を使用
して、アセチラーゼまたはケタラーゼの遺伝子を含有す
る天然ＤＮＡ制限断片を回収することができる。
子をベクター上にクローン化して、ここに記載するポリ
サッカライドを完全にアシル化、完全にピルビル化、ま
たは完全にアシル化および完全にピルビル化することを
保証することを論ずる。Ｘ．カンペストリス株Ｘ１００
６およびＸ９２１は、実施例２および３に記載したよう
に、それぞれ、アセチラーゼおよびケタラーゼの遺伝子
において突然変異を有する。これらの突然変異体は実施
例１に記載する方法を使用してつくられた。当業者は、
Ｂｅｔｌａｃｈら、ｓｕｐｒａに記載される方法を使用
して、アセチラーゼまたはケタラーゼの遺伝子を含有す
る天然ＤＮＡ制限断片を回収することができる。
【００６９】すなわち、薬物耐性遺伝標識によって中断
されたアセチラーゼまたはケタラーゼの遺伝子を含有す
るＤＮＡ制限断片をもつプラスミドを使用して、ラムダ
ゲノムのライブラリーをプロービングして、アセチラー
ゼまたはケタラーゼの遺伝子のための天然ＤＮＡ配列を
得ることができる。他の実施態様において、アセチラー
ゼまたはケタラーゼ酵素の遺伝子は、すでに、プラスミ
ドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６，ＡＴＣＣ受託No.
（Ｃａｐａｇｅら、ｓｕｐｒａに記載されている）、お
よびその中に記載されている他のプラスミドの上にクロ
ーン化されている。当業者にとって、これらのプラスミ
ドからアセチラーゼおよびケタラーゼの遺伝子自体をサ
ブクロー化することは簡単である。
されたアセチラーゼまたはケタラーゼの遺伝子を含有す
るＤＮＡ制限断片をもつプラスミドを使用して、ラムダ
ゲノムのライブラリーをプロービングして、アセチラー
ゼまたはケタラーゼの遺伝子のための天然ＤＮＡ配列を
得ることができる。他の実施態様において、アセチラー
ゼまたはケタラーゼ酵素の遺伝子は、すでに、プラスミ
ドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６，ＡＴＣＣ受託No.
（Ｃａｐａｇｅら、ｓｕｐｒａに記載されている）、お
よびその中に記載されている他のプラスミドの上にクロ
ーン化されている。当業者にとって、これらのプラスミ
ドからアセチラーゼおよびケタラーゼの遺伝子自体をサ
ブクロー化することは簡単である。
【００７０】次いで、いずれかの方法によって得られた
天然ＤＮＡ配列は、Ｘ．カンペストリス中で複製できる
プラスミド、例えばｐＭＷ７９上に、Ｂｅｔｌａｃｈら
およびＣａｐａｇｅらによって明らかにされた方法を用
いて挿入することができる。アセチラーゼおよび／また
はケタラーゼの遺伝子の発現は、存在するＤＮＡ配列を
修飾することにより、あるいはその遺伝子から上流に調
節可能なプロモーターを挿入することによって調節する
ことができる。このような技術は分子生物学および遺伝
学において熟達しているものによく知られている。
天然ＤＮＡ配列は、Ｘ．カンペストリス中で複製できる
プラスミド、例えばｐＭＷ７９上に、Ｂｅｔｌａｃｈら
およびＣａｐａｇｅらによって明らかにされた方法を用
いて挿入することができる。アセチラーゼおよび／また
はケタラーゼの遺伝子の発現は、存在するＤＮＡ配列を
修飾することにより、あるいはその遺伝子から上流に調
節可能なプロモーターを挿入することによって調節する
ことができる。このような技術は分子生物学および遺伝
学において熟達しているものによく知られている。
【００７１】同様に、遺伝子をその上に挿入するプラス
ミドは高いコピー数のプラスミドであることができる。
Ｇａｐａｇａらにおいて明らかにされているように、キ
サンタンの生合成酵素はＸ．カンペストリス中に少量で
存在する。前述のプラスミドをＸ．カンペストリス中に
挿入し、そしてプラスミドに担持された遺伝子の発現に
適当な条件下で培養物を増殖せしめることにより、他の
キサンタンの生合成酵素よりも、非常に多量のアセチラ
ーゼおよび／またはケタラーゼ酵素が生ずるであろう。
アセチラーゼの過度の発現は、キサンタンのポリサッカ
ライドを完全にアセチル化する、すなわち、すべての内
部マンノース残基をアセチル化する。同様に、ケタラー
ゼの過度の発現は、キサンタンの多糖を末端マンノース
上で完全にピルビル化させる。
ミドは高いコピー数のプラスミドであることができる。
Ｇａｐａｇａらにおいて明らかにされているように、キ
サンタンの生合成酵素はＸ．カンペストリス中に少量で
存在する。前述のプラスミドをＸ．カンペストリス中に
挿入し、そしてプラスミドに担持された遺伝子の発現に
適当な条件下で培養物を増殖せしめることにより、他の
キサンタンの生合成酵素よりも、非常に多量のアセチラ
ーゼおよび／またはケタラーゼ酵素が生ずるであろう。
アセチラーゼの過度の発現は、キサンタンのポリサッカ
ライドを完全にアセチル化する、すなわち、すべての内
部マンノース残基をアセチル化する。同様に、ケタラー
ゼの過度の発現は、キサンタンの多糖を末端マンノース
上で完全にピルビル化させる。
【００７２】当業者にとって明らかなように、キサンタ
ンの完全なアセチル化および完全なピルビル化は前述の
方法によって達成できる。さらに、ポリテトラマーの完
全なアセチル化、およびポリトリマーの完全なアセチル
化（Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅら、ｓｕｐｒａに記載され
ている）は、ここに記載する方法を使用して達成するこ
とができる。
ンの完全なアセチル化および完全なピルビル化は前述の
方法によって達成できる。さらに、ポリテトラマーの完
全なアセチル化、およびポリトリマーの完全なアセチル
化（Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅら、ｓｕｐｒａに記載され
ている）は、ここに記載する方法を使用して達成するこ
とができる。
【００７３】実施例７
この実施例は、高温において水を粘性化するための、遺
伝的に修飾されたキサントモナス・カンペストリスによ
り生成されるピルビル化されていない多糖の経済的およ
び技術的利点を明らかにする。キサンタンガム、すなわ
ちキサントモナス・アンペストリス天然生成物は、例え
ば、石油の回収を増大するために使用する水の有効な粘
性化剤である。これらの粘度の用途は、頻繁に、キサン
タンガムを高い温度において、そして食塩水中で適用す
ることを必要とする。キサンタンガムは高温（例えば、
７５〜１００℃）においてさえ有効な粘性化剤である
が、そられの粘度はより低い温度（例えば、２５〜６０
℃）において実質的に減少する。
伝的に修飾されたキサントモナス・カンペストリスによ
り生成されるピルビル化されていない多糖の経済的およ
び技術的利点を明らかにする。キサンタンガム、すなわ
ちキサントモナス・アンペストリス天然生成物は、例え
ば、石油の回収を増大するために使用する水の有効な粘
性化剤である。これらの粘度の用途は、頻繁に、キサン
タンガムを高い温度において、そして食塩水中で適用す
ることを必要とする。キサンタンガムは高温（例えば、
７５〜１００℃）においてさえ有効な粘性化剤である
が、そられの粘度はより低い温度（例えば、２５〜６０
℃）において実質的に減少する。
【００７４】本発明者らは、キサントモナス・アンペス
トリスの遺伝的に修飾された株（株９２１）によって生
成される新しい新規なポリサッカライドが、Ｓ４−Ｌ親
株（株Ｘ２７３）から生成される野生型キサンタンガム
のそれに等しい、高温における粘度を発生させることを
発見した。このキサンタンガムは、正常のペンタマーの
キサンタンの構造を有するが、遺伝的に修飾されている
ために、末端マンノース上にピルビル酸成分を含有しな
い。この新規な多糖は、３０℃付近の発酵温度において
低い粘度を有し、その結果実質的にコストが節約されか
つ処理が便利になる。ピルビル化されたキサンタンガム
を製造するコストは、主として、このポリマーの高い粘
度が攪拌、通気および冷却のためのエネルギーの入力を
大きくするために高い。
トリスの遺伝的に修飾された株（株９２１）によって生
成される新しい新規なポリサッカライドが、Ｓ４−Ｌ親
株（株Ｘ２７３）から生成される野生型キサンタンガム
のそれに等しい、高温における粘度を発生させることを
発見した。このキサンタンガムは、正常のペンタマーの
キサンタンの構造を有するが、遺伝的に修飾されている
ために、末端マンノース上にピルビル酸成分を含有しな
い。この新規な多糖は、３０℃付近の発酵温度において
低い粘度を有し、その結果実質的にコストが節約されか
つ処理が便利になる。ピルビル化されたキサンタンガム
を製造するコストは、主として、このポリマーの高い粘
度が攪拌、通気および冷却のためのエネルギーの入力を
大きくするために高い。
【００７５】図２は、新規なピルビル化されていないキ
サンタンガムと修飾されない親によって生成された野生
型キサンタンガムとの粘度の比較を示す。野生型ガムは
低温において高い粘度を示すが、温度上昇とともに粘度
は急速に減少する。ピルビル化されていないガムは、他
方において、低温において低い粘度を有するが、野生型
キサンタンガムに本質的に等しい高温における粘度を保
持する。図２に報告する粘度は、８ｓ-1の剪断速度で同
心シリンダー粘度計で５０００ppm のＮａＣｌブライン
中の１０００ppm の活性ポリマー固体の溶液について記
録した。
サンタンガムと修飾されない親によって生成された野生
型キサンタンガムとの粘度の比較を示す。野生型ガムは
低温において高い粘度を示すが、温度上昇とともに粘度
は急速に減少する。ピルビル化されていないガムは、他
方において、低温において低い粘度を有するが、野生型
キサンタンガムに本質的に等しい高温における粘度を保
持する。図２に報告する粘度は、８ｓ-1の剪断速度で同
心シリンダー粘度計で５０００ppm のＮａＣｌブライン
中の１０００ppm の活性ポリマー固体の溶液について記
録した。
【００７６】実施例８
この実施例は、水溶液のための粘性化剤として使用する
ための、遺伝的に修飾されたキサントモナス・カンペス
トリスにより生成されるアセチル化されていないキサン
タンの利点を明らかする。図３は、化学的に脱アセチル
化された市販のキサンタンおよびその親化合物の粘度
を、遺伝的に修飾されたキサントモナス・カンペストリ
ス（株Ｘ１００６）により生成されるアシル化されてい
ないキサンタンおよび野生型Ｘ．カンペストリス親（株
Ｘ２３７）からつくられるキサンタンの粘度と比較す
る。粘度は８ｓ -1の剪断速度で５０００ppm のＮａＣｌ
ブライン中の１０００ppm のポリマーについて得た。粘
度は２５℃〜約８０℃の温度範囲にわたって測定した。
ための、遺伝的に修飾されたキサントモナス・カンペス
トリスにより生成されるアセチル化されていないキサン
タンの利点を明らかする。図３は、化学的に脱アセチル
化された市販のキサンタンおよびその親化合物の粘度
を、遺伝的に修飾されたキサントモナス・カンペストリ
ス（株Ｘ１００６）により生成されるアシル化されてい
ないキサンタンおよび野生型Ｘ．カンペストリス親（株
Ｘ２３７）からつくられるキサンタンの粘度と比較す
る。粘度は８ｓ -1の剪断速度で５０００ppm のＮａＣｌ
ブライン中の１０００ppm のポリマーについて得た。粘
度は２５℃〜約８０℃の温度範囲にわたって測定した。
【００７７】図３から明らかなように、キサンタンの化
学的脱アセチル化は、この温度範囲全体にわたって粘性
化力を損失させる。しかしながら、遺伝的手段によるア
セチル化の排除は野生型キサンタンガムに比較して粘度
を実質的に増大させる。こうして、Ｘ．カンペストリス
の突然変異株により生成されるアセチル化されていない
キサンタンガムは、キサンタンそれ自体に比較して、お
よび化学的方法によって製造された脱アセチル化キサン
タンガムに比較して、改良されたポリサッカライドであ
る。
学的脱アセチル化は、この温度範囲全体にわたって粘性
化力を損失させる。しかしながら、遺伝的手段によるア
セチル化の排除は野生型キサンタンガムに比較して粘度
を実質的に増大させる。こうして、Ｘ．カンペストリス
の突然変異株により生成されるアセチル化されていない
キサンタンガムは、キサンタンそれ自体に比較して、お
よび化学的方法によって製造された脱アセチル化キサン
タンガムに比較して、改良されたポリサッカライドであ
る。
【００７８】実施例９
この実施例は、アセチル化されておらず且つピルビル化
されていないキサンタンを生成するＸ．カンペストリス
の二重突然変異体を構成するために使用する方法を明ら
かにする。Ｃａｐａｇｅらは、キサンタンの生合成を指
令する遺伝子を含有するＸ．カンペストリスからの遺伝
子クラスターのクローン化を記載している。彼らは、ま
た、この遺伝子クラスターのすべてまたは種々の部分を
除去する、Ｘ．カンペストリスにおける染色体欠失突然
変異の分離を記載している。
されていないキサンタンを生成するＸ．カンペストリス
の二重突然変異体を構成するために使用する方法を明ら
かにする。Ｃａｐａｇｅらは、キサンタンの生合成を指
令する遺伝子を含有するＸ．カンペストリスからの遺伝
子クラスターのクローン化を記載している。彼らは、ま
た、この遺伝子クラスターのすべてまたは種々の部分を
除去する、Ｘ．カンペストリスにおける染色体欠失突然
変異の分離を記載している。
【００７９】１つのこのような欠失突然変異体Ｘ１２３
１株は、組換えプラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６上に
担持されるＸ．カンペストリスのＤＮＡのすべてを欠
く。従って、株Ｘ１２３１はキサンタンを合成しない。
ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６をＸ１２３１株中に転移する
と、キサンタンを合成する能力が回復する。Ｃａｐａｇ
ｅらは、また、ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６上に担持された
クローン化ガム遺伝子ＤＮＡ内のトランスポゾンＴｎＫ
１２の挿入突然変異を分離しかつ特徴づける方法を記載
している。
１株は、組換えプラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６上に
担持されるＸ．カンペストリスのＤＮＡのすべてを欠
く。従って、株Ｘ１２３１はキサンタンを合成しない。
ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６をＸ１２３１株中に転移する
と、キサンタンを合成する能力が回復する。Ｃａｐａｇ
ｅらは、また、ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６上に担持された
クローン化ガム遺伝子ＤＮＡ内のトランスポゾンＴｎＫ
１２の挿入突然変異を分離しかつ特徴づける方法を記載
している。
【００８０】２つのこのような突然変異体プラスミド
は、ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．２２およびｐＲＫ２９０
−Ｈ３３６．４１である。これらのプラスミドの各々上
のＴｎＫ１２挿入部のおおまかな位置は図４に示されて
いる。ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．２２がＸ１２３１中に
移行すると、得られる株アセチル化されていないキサン
タンを生成する。ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．４１がＸ１
２３１中に移行すると、ピルビル化されていないキサン
タンが生成する。これらの２つのプラスミドの突然変異
体を使用して、生体外組換えによって、欠失Ｘ１２３１
株に担持された場合に、アシル化されておらず且つピル
ビル化されていないキサンタンの合成を指令する二重突
然変異プラスミドを造成した。
は、ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．２２およびｐＲＫ２９０
−Ｈ３３６．４１である。これらのプラスミドの各々上
のＴｎＫ１２挿入部のおおまかな位置は図４に示されて
いる。ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．２２がＸ１２３１中に
移行すると、得られる株アセチル化されていないキサン
タンを生成する。ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．４１がＸ１
２３１中に移行すると、ピルビル化されていないキサン
タンが生成する。これらの２つのプラスミドの突然変異
体を使用して、生体外組換えによって、欠失Ｘ１２３１
株に担持された場合に、アシル化されておらず且つピル
ビル化されていないキサンタンの合成を指令する二重突
然変異プラスミドを造成した。
【００８１】アシル化されず且つピルビル化されない二
重突然変異のプラスミドを発生させる生体外法は次の通
りである。ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．４１のカナマイシ
ン感受性（Ｋａｎs ）誘導体を、このプラスミドの部分
的Ｈｉｎｄ III消化を実施し、非常に低ＤＮＡ濃度にお
いて消化生成物を結合し（分子内結合を促進するため
に）、次いでテトラサイクリン耐性（Ｔｅｒr ）形質転
換体をカナマイシン感受性についてスクリーニングする
ことによって造成した。
重突然変異のプラスミドを発生させる生体外法は次の通
りである。ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．４１のカナマイシ
ン感受性（Ｋａｎs ）誘導体を、このプラスミドの部分
的Ｈｉｎｄ III消化を実施し、非常に低ＤＮＡ濃度にお
いて消化生成物を結合し（分子内結合を促進するため
に）、次いでテトラサイクリン耐性（Ｔｅｒr ）形質転
換体をカナマイシン感受性についてスクリーニングする
ことによって造成した。
【００８２】次いで、プラスミドのＤＮＡをＴｅｔr ，
Ｋａｎs 単離体から調製し、そして制限エンドヌクレア
ーゼ消化およびアガロースゲルの電気泳動によって分析
した。わずかに３つのＨｉｎｄ III部位がｐＲＫ２９０
−Ｈ３３６．４１中に存在し、そしてこれらのうち２つ
はＴｎＫ１２内に存在し、そしてＫａｎ遺伝子の限界を
確定する。部分的消化において発生する欠失の多くはＫ
ａｎ遺伝子について欠失され、これに対してプラスミド
の残部は無傷に保持された。Ｋａｎs プラスミドは、な
お、ケタラーゼ遺伝子中に挿入部（１kb）を維持し、こ
うしてピルビル化されていないガムを生成することが期
待される。
Ｋａｎs 単離体から調製し、そして制限エンドヌクレア
ーゼ消化およびアガロースゲルの電気泳動によって分析
した。わずかに３つのＨｉｎｄ III部位がｐＲＫ２９０
−Ｈ３３６．４１中に存在し、そしてこれらのうち２つ
はＴｎＫ１２内に存在し、そしてＫａｎ遺伝子の限界を
確定する。部分的消化において発生する欠失の多くはＫ
ａｎ遺伝子について欠失され、これに対してプラスミド
の残部は無傷に保持された。Ｋａｎs プラスミドは、な
お、ケタラーゼ遺伝子中に挿入部（１kb）を維持し、こ
うしてピルビル化されていないガムを生成することが期
待される。
【００８３】このプラスミドはｐ４１ＫＳと呼ばれる。
次の工程は、非アセチル化突然変異体プラスミドｐＲＫ
２９０−Ｈ３３６．２２の大きいＳｐｅＩ断片をｐ４１
ＫＳ中にクローン化することであった。図４に示すよう
に、各プラスミドはＣａｐａｇｅらのＤＮＡ配列内の位
置７５８，７７１、および１１，７１６にＳｐｅＩ部位
を含有する。１０．９kbのＳｐｅＩ断片は、ｐＲＫ２９
０−Ｈ３３６．２２のＴｎＫ１２挿入を担持する。小さ
い（１３bp）ＳｐｅＩ断片は、Ｘ．カンペストリスの増
殖およびキサンタンの生成物に必須ではないｔＲＮＡ遺
伝子内に完全に横たわる。
次の工程は、非アセチル化突然変異体プラスミドｐＲＫ
２９０−Ｈ３３６．２２の大きいＳｐｅＩ断片をｐ４１
ＫＳ中にクローン化することであった。図４に示すよう
に、各プラスミドはＣａｐａｇｅらのＤＮＡ配列内の位
置７５８，７７１、および１１，７１６にＳｐｅＩ部位
を含有する。１０．９kbのＳｐｅＩ断片は、ｐＲＫ２９
０−Ｈ３３６．２２のＴｎＫ１２挿入を担持する。小さ
い（１３bp）ＳｐｅＩ断片は、Ｘ．カンペストリスの増
殖およびキサンタンの生成物に必須ではないｔＲＮＡ遺
伝子内に完全に横たわる。
【００８４】従って、二重突然変異体の造成の過程にお
けるこの小さいＳｐｅＩセグメント欠失は、キサンタン
生合成に影響を与えないに違いない。プラスミドｐ４１
ＫＳ２２およびｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．２２を精製
し、そしてＳｐｅＩで完全に消化し、そして連結を実施
した。この連結において、ｐ４１ＫＳ２２・ＳｐｅＩを
１０×モル過剰でＨ３３６．２２／ＳｐｅＩと連結し
た。こうして、Ｈ３３６．２２のＫａｒ r ＳｐｅＩ断片
を含有する組換え体を選択すると、それらは最も頻繁に
ｐ４１ＫＳ２２のＳｐｅＩベクター断片と関連するであ
ろう。
けるこの小さいＳｐｅＩセグメント欠失は、キサンタン
生合成に影響を与えないに違いない。プラスミドｐ４１
ＫＳ２２およびｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．２２を精製
し、そしてＳｐｅＩで完全に消化し、そして連結を実施
した。この連結において、ｐ４１ＫＳ２２・ＳｐｅＩを
１０×モル過剰でＨ３３６．２２／ＳｐｅＩと連結し
た。こうして、Ｈ３３６．２２のＫａｒ r ＳｐｅＩ断片
を含有する組換え体を選択すると、それらは最も頻繁に
ｐ４１ＫＳ２２のＳｐｅＩベクター断片と関連するであ
ろう。
【００８５】本発明者等はこれらの連結物を用いて形質
転換を行い、そしてＫａｎr 形質転換体を得た。これら
の形質転換体により担持されるプラスミドを分析して、
問題の組換え体を同定した。所望の組換え体プラスミド
は、Ｋａｎr 組換えの中から容易に同定された。組換え
体プラスミド、ｐ４１ＫＳ２２と呼ぶ、はケタラーゼ遺
伝子中にｐ４１ＫＳ由来の挿入を含有し、そしてアセチ
ラーゼ遺伝子内にＨ３３６．２２由来のＴｎＫ１２挿入
を含有する。適当な制限消化分析は両者の挿入突然変異
体の存在を確証し、そして、さらに、ＴｎＫ１２突然変
異を含有するＳｐｅＩ断片が正しい向きで挿入されてい
ることを示した。
転換を行い、そしてＫａｎr 形質転換体を得た。これら
の形質転換体により担持されるプラスミドを分析して、
問題の組換え体を同定した。所望の組換え体プラスミド
は、Ｋａｎr 組換えの中から容易に同定された。組換え
体プラスミド、ｐ４１ＫＳ２２と呼ぶ、はケタラーゼ遺
伝子中にｐ４１ＫＳ由来の挿入を含有し、そしてアセチ
ラーゼ遺伝子内にＨ３３６．２２由来のＴｎＫ１２挿入
を含有する。適当な制限消化分析は両者の挿入突然変異
体の存在を確証し、そして、さらに、ＴｎＫ１２突然変
異を含有するＳｐｅＩ断片が正しい向きで挿入されてい
ることを示した。
【００８６】プラスミドｐ４１ＫＳ２２を引続いて１連
のＸ．カンペストリス株中に接合を介して転移した。大
きいＧｕｍ−欠失株Ｘ１２３１が受容体の中に存在し
た。この欠失はｐ４１ＫＳ２２上に担持されるガム遺伝
子ＤＮＡのすべてを欠き、それゆえ、ｐ４１ＫＳ２２を
担持するＸ１２３１はアセチル化されておらず且つピル
ビル化されていないキサンタンを生成するであろう。
のＸ．カンペストリス株中に接合を介して転移した。大
きいＧｕｍ−欠失株Ｘ１２３１が受容体の中に存在し
た。この欠失はｐ４１ＫＳ２２上に担持されるガム遺伝
子ＤＮＡのすべてを欠き、それゆえ、ｐ４１ＫＳ２２を
担持するＸ１２３１はアセチル化されておらず且つピル
ビル化されていないキサンタンを生成するであろう。
【００８７】プラスミドは効率よくＸ１２３１中に転移
し、そして得られる表現型は明瞭にムコイドであるが、
野生型の対照よりも有意にムコイドが低い。ｐ４１ＫＳ
２２を担持するＸ１２３１により生産されたポリサッカ
ライドを調製しそして分析した。このポリマーはグルコ
ース、マンノースおよびグルクロン酸を含有するが、検
出可能なアセテート及びピルベートを有せず、こうして
Ｘ１２３１（ｐ４１ＫＳ２２）は期待通りのアセチル化
されておらずピルビル化されていないガムを生成するこ
とが示される。なお、Ｘ１２３１株の培養、及び培養物
からのポリサッカライドの回収・精製は、Ｘ１０００株
について実施例３に記載したのと同様にして行った。
し、そして得られる表現型は明瞭にムコイドであるが、
野生型の対照よりも有意にムコイドが低い。ｐ４１ＫＳ
２２を担持するＸ１２３１により生産されたポリサッカ
ライドを調製しそして分析した。このポリマーはグルコ
ース、マンノースおよびグルクロン酸を含有するが、検
出可能なアセテート及びピルベートを有せず、こうして
Ｘ１２３１（ｐ４１ＫＳ２２）は期待通りのアセチル化
されておらずピルビル化されていないガムを生成するこ
とが示される。なお、Ｘ１２３１株の培養、及び培養物
からのポリサッカライドの回収・精製は、Ｘ１０００株
について実施例３に記載したのと同様にして行った。
【００８８】実施例１０
この実施例は、アセチラーゼ突然変異およびトランスフ
ェラーゼＶ突然変異を兼備する二重突然変異体プラスミ
ドの構成および性質を記載する。Ｃａｐａｇｅらは、プ
ラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６により担持されるクロ
ーン化ガム遺伝子ＤＮＡ内のトランスポゾンＴｎＫ１２
挿入を分離しかつ特徴づける方法を記載している。この
ような挿入を担持する１つの突然変異体プラスミドは、
ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．６である。
ェラーゼＶ突然変異を兼備する二重突然変異体プラスミ
ドの構成および性質を記載する。Ｃａｐａｇｅらは、プ
ラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３３６により担持されるクロ
ーン化ガム遺伝子ＤＮＡ内のトランスポゾンＴｎＫ１２
挿入を分離しかつ特徴づける方法を記載している。この
ような挿入を担持する１つの突然変異体プラスミドは、
ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．６である。
【００８９】このプラスミド中のＴｎＫ１２挿入のおお
まかな位置は図４に示されている。このプラスミドは、
欠失株Ｘ１２３１中に存在するとき、トランスフェラー
ゼＩＶの挿入失活の結果として、ポリテトラマーガムの
合成を指令する。実施例９に記載するものに類似する手
順を用いて、二重突然変異体プラスミドを構成した。こ
れはトランスフェラーゼＩＶ欠失とｐＲＫ２９０−Ｈ３
３６．２２中に担持されるアセチラーゼ突然変異とを兼
備する。ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．６のカナマイシン感
受性誘導体を、ＴｎＫ１２のＨｉｎｄ III断片の欠失に
よって誘導した。
まかな位置は図４に示されている。このプラスミドは、
欠失株Ｘ１２３１中に存在するとき、トランスフェラー
ゼＩＶの挿入失活の結果として、ポリテトラマーガムの
合成を指令する。実施例９に記載するものに類似する手
順を用いて、二重突然変異体プラスミドを構成した。こ
れはトランスフェラーゼＩＶ欠失とｐＲＫ２９０−Ｈ３
３６．２２中に担持されるアセチラーゼ突然変異とを兼
備する。ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．６のカナマイシン感
受性誘導体を、ＴｎＫ１２のＨｉｎｄ III断片の欠失に
よって誘導した。
【００９０】このプラスミド、ｐ６ＫＳ、はＫａｎr ｐ
４１ＫＳに類似し、そしてなおトランスフェラーゼＩＶ
遺伝子内に挿入された１kbのＴｎＫ１２を保持する。引
続いて、ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．２２の大ＴｎＫ１２
含有ＳｐｅＩ断片を、実施例９に記載するようにＳｐｅ
Ｉ消化したｐ６ＫＳプラスミド中に結合し、そして二重
突然変異体プラスミドｐ６ＫＳ２２を得た。このプラス
ミドはトランスフェラーゼＩＶおよびアセチラーゼ中に
挿入突然変異を担持する。欠失株Ｘ１２３１中に転移す
ると、それはアセチル化されていない蛋白質の合成を指
令するに違いない。
４１ＫＳに類似し、そしてなおトランスフェラーゼＩＶ
遺伝子内に挿入された１kbのＴｎＫ１２を保持する。引
続いて、ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６．２２の大ＴｎＫ１２
含有ＳｐｅＩ断片を、実施例９に記載するようにＳｐｅ
Ｉ消化したｐ６ＫＳプラスミド中に結合し、そして二重
突然変異体プラスミドｐ６ＫＳ２２を得た。このプラス
ミドはトランスフェラーゼＩＶおよびアセチラーゼ中に
挿入突然変異を担持する。欠失株Ｘ１２３１中に転移す
ると、それはアセチル化されていない蛋白質の合成を指
令するに違いない。
【００９１】しかしながら、いくつかの独立のプラスミ
ド転移実験において、株Ｘ１２３１中へのｐ６ＫＳ２２
の転移は検出されなかったが、プラスミドはＧｕｍ- お
よびＧｕｍ+ 株を含む他の受容体中に高い頻度で首尾よ
く転移された。この結果が示唆するように、株１２３１
中のｐ６ＫＳ２２の存在は、多分アセチル化されていな
いポリトリマーガムの生成の直接の結果として、致死的
である。Ｃａｐａｇｅらは、ガム遺伝子クラスター内の
３つの他の致死突然変異体を記載し、そしてこれらの致
死的突然変異はキサンタンの生合成において毒性の中間
体を蓄積させると結論した。アセチル化されていないポ
リトリマーの蓄積は、このポリサッカライドが通常キサ
ンタンを分泌する転移系によって分泌されえない場合、
潜在的に毒性となりうるであろう。
ド転移実験において、株Ｘ１２３１中へのｐ６ＫＳ２２
の転移は検出されなかったが、プラスミドはＧｕｍ- お
よびＧｕｍ+ 株を含む他の受容体中に高い頻度で首尾よ
く転移された。この結果が示唆するように、株１２３１
中のｐ６ＫＳ２２の存在は、多分アセチル化されていな
いポリトリマーガムの生成の直接の結果として、致死的
である。Ｃａｐａｇｅらは、ガム遺伝子クラスター内の
３つの他の致死突然変異体を記載し、そしてこれらの致
死的突然変異はキサンタンの生合成において毒性の中間
体を蓄積させると結論した。アセチル化されていないポ
リトリマーの蓄積は、このポリサッカライドが通常キサ
ンタンを分泌する転移系によって分泌されえない場合、
潜在的に毒性となりうるであろう。
【００９２】本発明の技術の特定の微生物への応用は、
その中に含有される教示に照して当業者の能力の範囲内
であることを理解すべきである。種々の変更および変化
は本発明の方法および生成物において可能であることは
当業者にとって明らかであろう。こうして、本発明は、
本発明の変更および変化が添付する請求の範囲および同
等物の範囲内に入るかぎり、それらを包含する。
その中に含有される教示に照して当業者の能力の範囲内
であることを理解すべきである。種々の変更および変化
は本発明の方法および生成物において可能であることは
当業者にとって明らかであろう。こうして、本発明は、
本発明の変更および変化が添付する請求の範囲および同
等物の範囲内に入るかぎり、それらを包含する。
【図１】図１は、キサンタンガムの生物合成の推定した
通路を示す。略号は次の通りである：Ｇｌｕ＝グルコー
ス；ＧｌｕＡ＝グルクロン酸；Ｎａｎ＝マンノース；Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｕ＝セルビオース；Ｐ＝ホスフェート；ＰＰ
＝ピリホスフェート；Ｃ５５＝イソプレノイド脂質キャ
リヤー；ＰＥＰ＝ホスホエノールピルベート；ＡｃＣｏ
Ａ＝アセチル補酵素Ａ；Ｉ−Ｖ＝グルコシルトランスフ
ェラーゼ；ＵＤＰ＝ウリジン５′−ジホスフェート；お
よびＧＤＰ＝グアノシン５′−ジヒスフェート。
通路を示す。略号は次の通りである：Ｇｌｕ＝グルコー
ス；ＧｌｕＡ＝グルクロン酸；Ｎａｎ＝マンノース；Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｕ＝セルビオース；Ｐ＝ホスフェート；ＰＰ
＝ピリホスフェート；Ｃ５５＝イソプレノイド脂質キャ
リヤー；ＰＥＰ＝ホスホエノールピルベート；ＡｃＣｏ
Ａ＝アセチル補酵素Ａ；Ｉ−Ｖ＝グルコシルトランスフ
ェラーゼ；ＵＤＰ＝ウリジン５′−ジホスフェート；お
よびＧＤＰ＝グアノシン５′−ジヒスフェート。
【図２】図２は、野生型ガムおよびピルビル化されてい
ないガムの間の粘度の比較を示す。
ないガムの間の粘度の比較を示す。
【図３】図３は、アシル化されていないガムおよび化学
的に脱アシル化したガムの粘度の比較を示す。
的に脱アシル化したガムの粘度の比較を示す。
【図４】図４は、組換えプラスミドｐＲＫ２９０−Ｈ３
３６のクロー化遺伝子クラスターＤＮＡ内の３ＴｎＫ１
２挿入突然変異体のおよその物理的位置を示す。この図
面は、また、ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６中のＳｐｅＩ制限
エンドヌクレアーゼ切断部位のおよその位置を示す。
３６のクロー化遺伝子クラスターＤＮＡ内の３ＴｎＫ１
２挿入突然変異体のおよその物理的位置を示す。この図
面は、また、ｐＲＫ２９０−Ｈ３３６中のＳｐｅＩ制限
エンドヌクレアーゼ切断部位のおよその位置を示す。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
(Ｃ１２Ｐ 19/06
Ｃ１２Ｒ 1:64）
(72)発明者 マレリー，ジョン，ディー.
アメリカ合衆国，テキサス 77009，ヒ
ューストン，リーガン 3709
(72)発明者 バンダースライス，レベッカ，ダブリ
ュ.
アメリカ合衆国，コロラド 80303，ボ
ールダー，タントラ パーク サークル
1011
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．約２：１：１の比でＤ−グルコース：Ｄ−マンノー
ス：Ｄ−グルクロン酸を有する反復するテトラマーユニ
ットを含んで成り、Ｄ−グルコース成分がβ−〔１，
４〕配置で連結されており、Ｄ−マンノース成分が一般
に交互のグルコース成分にα−〔１，３〕配置で連結さ
れており、そしてＤ−グルクロン酸成分が前記マンノー
ス成分にβ−〔１，２〕配置で連結されているポリサッ
カライドポリマーの製造方法であって、 前記ポリサッカライドポリマーを生産することができる
キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属微生物
を、該ポリサッカライドポリマーの生産のために十分な
条件下で培養することを特徴とする方法。 ２．前記キサントモナス属微生物がキサントモナス・カ
ンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓ
ｔｒｉｓ）である、請求項１に記載の方法。 ３．前記キサントモナス属微生物がキサントモナスのト
ランスフェラーゼＶ欠損変異株である、請求項１に記載
の方法。 ４．前記キサントモナス属微生物がキサントモナスのト
ランスフェラーゼＶ及びアセチラーゼ欠損変異株であ
る、請求項１に記載の方法。 ５．前記キサントモナス属微生物がキサントモナスのト
ランスフェラーゼＶ及びアセチルコエンザイムＡ欠損変
異株である、請求項１に記載の方法。 ６．前記ポリサッカライドポリマーがアセチル化されて
いる、請求項１に記載の方法。 ７．前記ポリサッカライドポリマーがアセチル化されて
いない、請求項１に記載の方法。 ８．約２：１：１の比でＤ−グルコース：Ｄ−マンノー
ス：Ｄ−グルクロン酸を有する反復するテトラマーユニ
ットを含んで成り、Ｄ−グルコース成分がβ−〔１，
４〕配置で連結されており、Ｄ−マンノース成分が一般
に交互のグルコース成分にα−〔１，３〕配置で連結さ
れており、そしてＤ−グルクロン酸成分が前記マンノー
ス成分にβ−〔１，２〕配置で連結されているポリサッ
カライドポリマー。 ９．アセチル化されている、請求項８に記載のポリサッ
カライドポリマー。 １０．アセチル化されている、請求項８に記載のポリサ
ッカライドポリマー。 １１．キサントモナス属微生物により生産される、請求
項８に記載のポリサッカライドポリマー。 １２．前記キサントモナス属微生物がキサントモナスの
トランスフェラーゼＶ欠損変異株である、請求項１１に
記載のポリサッカライドポリマー。 １３．前記キサントモナス属微生物がキサントモナスの
トランスフェラーゼＶ及びアセチラーゼ欠損変異株であ
る、請求項１１に記載のポリサッカライドポリマー。 １４．前記キサントモナス属微生物がキサントモナスの
トランスフェラーゼＶ及びアセチルコエンザイムＡ欠損
変異株である、請求項１１に記載のポリサッカライドポ
リマー。 １５．約２：１：１の比でＤ−グルコース：Ｄ−マンノ
ース：Ｄ−グルクロン酸を有する反復するテトラマーユ
ニットを含んで成り、Ｄ−グルコース成分がβ−〔１，
４〕配置で連結されており、Ｄ−マンノース成分が一般
に交互のグルコース成分にα−〔１，３〕配置で連結さ
れており、そしてＤ−グルクロン酸成分が前記マンノー
ス成分にβ−〔１，２〕配置で連結されているポリサッ
カライドポリマーを生産することができるキサントモナ
ス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属微生物。 １６．キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏ
ｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である、請求項１
５に記載の微生物。 １７．キサントモナスのトランスフェラーゼＶ欠損変異
株である、請求項１５又は１６に記載の微生物。 １８．キサントモナスのトランスフェラーゼＶ及びアセ
チラーゼ欠損変異株である、請求項１５又は１６に記載
の微生物。 １９．キサントモナスのトランスフェラーゼＶ及びアセ
チルコエンザイムＡ欠損変異株である、請求項１５又は
１６に記載の微生物。 ２０．約２：２：１の比でＤ−グルコース：Ｄ−マンノ
ース：Ｄ−グルクロン酸を有する反復するペンタマーユ
ニットを含んで成り、Ｄ−グルコース成分がβ−〔１，
４〕配置で連結されており、内部Ｄ−マンノース成分が
主として交互のＤ−グルコース成分にα−〔１，３〕配
置で連結されており、Ｄ−グルクロン酸成分が前記内部
Ｄ−マンノース成分にβ−〔１，２〕配置で連結されて
おり、そして外部マンノース成分が前記グルクロン酸成
分にβ−〔１，４〕配置で連結されており、アセチル化
されていない水溶性ポリサッカライドポリマーを生産す
ることができるキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ
ｓ）属微生物。 ２１．キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏ
ｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である請求項２０
に記載の微生物。 ２２．キサントモナスのアセチラーゼ欠損変異株であ
る、請求項２０又は２１に記載の微生物。 ２３．キサントモナス・カンペストリスＸ１００６（Ａ
ＴＣＣ５３４７３）である請求項２０〜２２のいずれか
１項に記載の微生物。 ２４．キサントモナスのケタラーゼ及びアセチラーゼ欠
損変異株である、請求項２０又は２１に記載の微生物。 ２５．キサントモナス・カンペストリスＸ１２３１（Ａ
ＴＣＣ６７３４４）である、請求項２０，２１又は２３
項に記載の微生物。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US84294586A | 1986-03-24 | 1986-03-24 | |
| US842945 | 1986-03-24 | ||
| US84443586A | 1986-03-26 | 1986-03-26 | |
| US844435 | 1986-03-26 | ||
| US2909087A | 1987-03-23 | 1987-03-23 | |
| US029090 | 1987-03-23 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62502340A Division JP2559437B2 (ja) | 1986-03-24 | 1987-03-24 | アセチル化されていないおよび／またはピルビル化されていないガムおよびアセチル化されたまたはアセチル化されていないポリテトラマーガムを含むキサンタンに基づくポリサッカライドポリマー群 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09176205A JPH09176205A (ja) | 1997-07-08 |
| JP2670256B2 true JP2670256B2 (ja) | 1997-10-29 |
Family
ID=27363404
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62502340A Expired - Lifetime JP2559437B2 (ja) | 1986-03-24 | 1987-03-24 | アセチル化されていないおよび／またはピルビル化されていないガムおよびアセチル化されたまたはアセチル化されていないポリテトラマーガムを含むキサンタンに基づくポリサッカライドポリマー群 |
| JP8070588A Expired - Lifetime JP2670256B2 (ja) | 1986-03-24 | 1996-03-26 | ポリサッカライドポリマー |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62502340A Expired - Lifetime JP2559437B2 (ja) | 1986-03-24 | 1987-03-24 | アセチル化されていないおよび／またはピルビル化されていないガムおよびアセチル化されたまたはアセチル化されていないポリテトラマーガムを含むキサンタンに基づくポリサッカライドポリマー群 |
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|---|---|
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| JP (2) | JP2559437B2 (ja) |
| AT (2) | ATE92965T1 (ja) |
| CA (1) | CA1339113C (ja) |
| DE (2) | DE3787026T2 (ja) |
| NO (2) | NO172945C (ja) |
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| WO (1) | WO1987005939A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| CA2021414C (en) * | 1989-07-25 | 2004-09-28 | Daniel H. Doherty | Genetic control of acetylation and pyruvylation of xanthan gum |
| WO1992019753A1 (en) * | 1991-05-07 | 1992-11-12 | Getty Scientific Development Company | Genetic control of acetylation and pyruvylation of xanthan based polysaccharide polymers |
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| FR2766203B1 (fr) * | 1997-07-17 | 2002-05-24 | Rhodia Chimie Sa | Fluides utilisables dans l'exploitation du petrole comprenant de la gomme xanthane desacetylee et au moins un compose augmentant la force ionique du milieu |
| US6139895A (en) * | 1999-07-06 | 2000-10-31 | Monsanto Company | Viscosity stable acidic edible liquid compositions and method of making |
| US7285409B1 (en) * | 2000-05-09 | 2007-10-23 | Fundacao De Amparo A Pesquisa Do Estado De Sao Paulo | Isolated gum operon from Xyllela fastidiosa, isolated nucleic acid molecules therefrom, and uses thereof |
| US6573221B2 (en) | 2000-05-12 | 2003-06-03 | Cp Kelco U.S., Inc. | Non-pyruvylated xanthan in oil field applications utilizing high density calcium-based brines |
| US20080078545A1 (en) * | 2006-09-28 | 2008-04-03 | Halliburton Energy Services, Inc. | Treatment fluids viscosifield with modified xanthan and associated methods for well completion and stimulation |
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| US9380803B2 (en) | 2009-04-02 | 2016-07-05 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Xanthan gum |
| US20110274629A1 (en) * | 2010-05-04 | 2011-11-10 | Cp Kelco U.S., Inc. | Natural Polymer Blends for Use in Personal Care Products |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US3096293A (en) | 1959-12-30 | 1963-07-02 | Allene R Jeanes | Method of increasing the viscosity of an aqueous solution of a deacetylated polysaccharide |
| US3000790A (en) * | 1959-12-30 | 1961-09-19 | Allene R Jeanes | Method of producing an atypically salt-responsive alkali-deacetylated polysaccharide |
| US4296203A (en) * | 1977-11-15 | 1981-10-20 | Pfizer Inc. | Xanthomonas bipolymer for use in displacement of oil from partially depleted reservoirs |
| CA1153971A (en) * | 1980-07-14 | 1983-09-20 | Standard Oil Company | Semi-continuous method for production of xanthan gum using xanthomonas campestris atcc 31601 |
| DE3274467D1 (en) * | 1981-05-22 | 1987-01-15 | Kelco Biospecialties Ltd | Production of xanthan having a low pyruvate content |
| US4713449A (en) * | 1985-08-06 | 1987-12-15 | Getty Scientific Development Company | Polysaccharide polymer made by xanthomonas |
| DE3751554T2 (de) * | 1986-03-24 | 1996-06-13 | Texaco Development Corp | Erzeugung von xanthangummi durch rekombinant-dns. |
-
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