NO306476B1

NO306476B1 - Rekombinant-DNA-mediert fremgangsmåte til produksjon av et xanthan-polysakkarid eller xanthan-variant-polysakkarid, plasmider og mikroorganismer brukt i fremgangsmåten

Info

Publication number: NO306476B1
Application number: NO874878A
Authority: NO
Inventors: Michael A Capage; Daniel H Doherty; Michael R Betlach; Rebecca W Vanderlice
Original assignee: Monsanto Co
Priority date: 1986-03-24
Filing date: 1987-11-23
Publication date: 1999-11-08
Also published as: JPH01502555A; EP0326544A1; EP0326544B1; DE3751554T2; NO874878L; ATE128731T1; CA1338138C; WO1987005938A1; NO874878D0; DE3751554D1; EP0326544A4; JP2612583B2

Description

Foreliggende søknad angår en rekombinant DNA-mediert fremgangsmåte til produksjon av et xanthan-polysakkarid eller xanthan-variant-polysakkarid, plasmider og mikroorganismer brukt i fremgangsmåten.

Denne søknad er en "continuation-in-part"-søknad av US patent-søknad nr. 844,332 innlevert 26. mars 1986.

Xanthangummi produseres naturlig ved bakterier av slekten Xanthomonas, nærmere bestemt ved mikroorganismer av arten

X. campestris. Xanthangummi er meget brukt i en rekke forskjellige anvendelser på grunn av dens uvanlige fysiske egenskaper, dvs. dens ekstremt høye spesifikke viskositet og dens pseudoplastisitet. I to spesielle anvendelser benyttes xanthangummi i matvarer som et fortykningsmiddel og i bistått oljeutvinning (enhanced oil recovery) som et mobilitets-regulerende og profilmodifiserende. middel. Dessuten er xanthangummi nyttig i sammensetningen av petroleumsborefluider.

Kjemisk er xanthangummi et anionisk heteropolysakkarid. Den repeterende enhet av polymeren er en pentamer sammensatt av fem sukkermolekyldsler, nærmere bestemt to glukose-, ett glukuronsyre- og to mannose-molekyldeler. Sukkerrestene er arrangert slik ac glukose-molekyldalene danner ryggraden i polymerkjeden med sidekjeder av mannose/glukuronsyre/mannose-rester som generelt rager ut fra vekslende glukose-molekyldeler. Vanligvis er denne grunnleggende struktur spesielt acetylert og pyruvylert som beskrevet, f.eks. av Janson,

E. P. et al. i Carbohydrate Research 45: 275-282 (1975),

her innlemmet som referanse.

Til dags dato har Xanthomonas campestris og beslektede Xanthomonas-arter vært den eneste kilde som har vært tilgjengelig for produksjonen av xanthangummi. Disse organismer har imidlertid lave temperaturoptima (27-30°C), langsomme veksthastigheter og er obligate aerober, hvilket alt sammen økeromkostningene ved fermentering. Xanthanproduksjonen øker drastisk viskositeten av gjæringsvæsken, hvilket reduserer oksygenoverføringshastigheten og nødvendiggjør bruken av kostbart gjennomluftings-, kjøle- og agitasjonsutstyr for oppnåelse av ønskede produktkonsentrasjoner.

Det er derfor en hensikt å tilveiebringe nye fremgangsmåter for produksjon

av xanthangummi, uten ovennevnte ulemper. Disse hensikter er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av kravene.

Oppfinnerne av den foreliggende oppfinnelse har nå oppdaget transportable DNA-sekvenser som koder for en gengruppe eller -klynge som er nødvendig for xanthanproduksjon, og de har klonet på plasmidvektorer disse transportable sekvenser. Når de benyttes i en passende vert, særlig en denitrifikasjonsbakterie, vil disse plasmidvektorer forårsake produksjon av xanthangummi i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen på en økonomisk og kommersielt gjennomførbar måte. Denne teknologi kan også anvendes til fremstilling av varianter av xanthangummi. Slike variant-polysakkarider er kjent for å produseres ved mutantstammer av X. campestris som inneholder mutasjoner inne i den kromosomale kopi av den gengruppe som er ansvarlig for xanthanproduksjon. Eksempeler på disse variantgummier er angitt i US patentsøknad nr. 762,878, Vanderslice et al., med tittelen "A Polysaccharide Polymer Made by Xanthomonas", innlevert 6. august 1985 og US patentsøknad nr. 844,435, Doherty et al., med tittelen "Family of Xanthan-Based Polysaccharide Polymers Including Non-Acetylated and/or Non-Pyruvylated

Gum and Acetylated and Non-Acetylated Polytetramer Gum", innlevert 26. mars 1986. Begge disse patentsøknader er herved innlemmet som referanse. Kloning av en transportabel DNA-sekvens som inneholder en slik mutasjon på en plasmidvektor og etterfølgende overføring av dette rekombinante plasmid inn i en passende bakterie vil føre til syntese ved denne bakterie av et polysakkarid som er ekvivalent med det

spesielle xanthangummivariant-polysakkarid som produseres

ved den muterte X. campestris-stamme som bærer denne mutasjon i sitt kromosom.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

En hensikt med den foreliggende oppfinnelse er å skaffe en fremgangsmåte til fremstilling av xanthangummi hvor gjæringen kan utføres ved en temperatur høyere enn 30°C og/eller som kan utføres under anaerobe forhold. En ytterligere hensikt med oppfinnelsen er å skaffe en rekombinant-DNA-mediert metode for fremstilling av xanthangummi ved bruk av mikroorganismer som kan bevirke polysakkaridproduksjon og som fortrinnsvis kan vokse ved en temperatur på 30°C eller høyere og/eller under anaerobe betingelser. De xanthangummier som fremstilles ved denne fremgangsmåte, er kjemisk ekvivalente med den som fremstilles ved Xanthomonas campestris. Ytterligere polysakkarider dannet ved mutasjoner i forskjellige biosyntetiske gener kan også produseres i alternative verter.

For å lette den rekombinante-DNA-formidlede syntese av disse

polysakkarider benyttes transportable DNA-sekvenser som kan dirigere produksjonen av polysakkarider. Det er en hensikt med opp-

finnelsen å skaffe vektorer som inneholder disse transportable sekvenser. Disse vektorer kan benyttes i rekombinant-systerner for å skaffe industrielt nyttige mengder av xanthangummier og andre polysakkarider.

Ytterligere hensikter og fordeler ved oppfinnelsen er dels angitt i beskrivelsen som følger og vil dels være åpenbare fra beskrivelsen eller kan bringes i erfaring ved utførelse av oppfinnelsen. Hensiktene og fordelene kan utføres og oppnås ved hjelp av de metoder og kombinasjoner som spesielt er fremhevet i de tilhørende krav.

For oppnåelse av hensiktene og i henhold til formålene med den foreliggende oppfinnelse er fremgangsmåter for produk sjonen av xanthangummi angitt, hvilke fremgangsmåter benytter mikroorganismer som kan produsere polysakkarid, fortrinnsvis ved 30°C eller høyere og/eller under anaerobe betingelser. Polysakkarider som fremstilles ved disse fremgangsmåter, er

i en utførelsesform kjemisk ekvivalente med de som fremstilles ved Xanthomonas campestris og i en annen utførelsesform kjemisk ekvivalente med de variantgummier som er beskrevet av Vanderslice et al. og Doherty et al., begge som angitt ovenfor.

De transportable sekvenser kan være enten syntetiske sekvenser eller restriksjonsfragmenter ("naturlige" DNA-sekvenser). I en foretrukket utførelsesform blir en transportabel DNA-sekvens isolert fra et X. campestris-bibliotek og kan, når den overføres inn i en alternativ vert, dirigere produksjonen av en xanthangummi som er ekvivalent med den som produseres ved Xanthomonas campestris.

Videre, for oppnåelse av hensiktene og i henhold til formålene med den foreliggende oppfinnelse er det angitt en rekombinant-DNA-metode som fører til mikrobiell fremstilling av xanthangummi og andre polysakkarider ved bruk av de transportable DNA-sekvenser som angitt ovenfor. Denne rekombinant-DNA-metode omfatter: (a) fremstilling av en transportabel DNA-sekvens som kan bringe en alternativ vertsmikroorganisme til å produsere enten et polysakkarid som er kjemisk ekvivalent med et polysakkarid produsert ved X. campestris eller et nytt

polysakkarid som er strukturelt beslektet med xanthan; (b) kloning av den transportable DNA-sekvens inn i en vektor som kan overføres inn i og replikeres i en vertsmikroorganisme, idet en slik vektor inneholder elementer for ekspresjonen av de gummi-biosyntetiske enzymer som

kodes for ved den transportable DNA-sekvens;

(c) overføring av vektoren som inneholder den transportable DNA-sekvens inn i en vertsmikroorganisme som kan produsere polysakkarid under styring av den transportable DNA-sekvens, fortrinnsvis ved høye syntetiske hastig-

heter, høy temperatur og/eller under anaerobe

betingelser;

(d) dyrking av vertsmikroorganismen under betingelser som

er riktige for opprettholdelse av vektoren og syntese

av polysakkaridet; og

(e) høsting av polysakkaridet.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen utgjøres den transportable DNA-sekvens av DNA-sekvenser som kan styre produksjonen av de følgende enzymer: transferase I, transferase II, transferase III, transferase IV, transferase V, acetylase, ketalase og polymerase. Disse enzymer, som anvendes i xanthangummi-biosyntese, er vist på fig. 1 og beskrevet i nærmere detalj nedenunder.

For ytterligere å oppnå hensiktene med oppfinnelsen og i henhold til formålene med den foreliggende oppfinnelse er der skaffet en rekke kloningsvektorer som hver inneholder minst en av de transportable DNA-sekvenser angitt ovenfor. Nærmere bestemt er plasmider pRK290-H336 og pX209 beskrevet.

Stammer E. coli LE392(TX209), bærerplasmid pX209 og stamme

E. coli LE392(pRK290-H366) som bærer plasmid pRK290-H366,

er blitt deponert i the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland den 21. mars 1986 under aksesjonsnr. henholdsvis 67051 og 67049.

Det skal forstås at både den foregående generelle beskrivelse og den etterfølgende detaljerte beskrivelse er angitt som eksempler og kun som eksempler og ikke begrenser oppfinnelsen slik den er krevet. De ledsagende tegninger, som er innlemmet i og utgjør en del av denne fremstilling, viser forskjellige utførelsesformer av oppfinnelsen, og sammen med beskrivelsen tjener de til å forklare prinsippene ved oppfinnelsen.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGEN

Fig. 1 viser den biosyntetiske vei for xanthangummi-syntese i X. campestris.

Fig. 2 er et restriksjonskart av lambda 655(+).

Fig. 3 er et restriksjonskart av lambda 708(+).

Fig. 4 er et BamHI-restriksjonskart av det område av X. campestris-qenomet som inneholder gummigen-gruppen. Tallene er molekylstørrelsen av fragmentet i kilobaser (kb). Fig. 5a viser den generelle struktur og aktuelle restriksjonsendonuklease-kløyvingsseter for kloningsvektor pMW79. Fig. 5b viser en representativ men ikke vidtfavnende prøve av segmenter av gummigen-DNA klonet inn i BamHI-setet av pMW79 fra enten partiell eller fullstendig fordøyelse av forskjellige lambda-rekombinanter med BamHI som beskrevet i eksempel 6. Fig. 6 viser partielle restriksjonskart av to rekombinante lambda-fager (lambda 708(8) og lambda 655(B)) vist i relasjon til BamHI-restriksjonskartet for X. campestris-DNA i nærheten av gummigen-gruppen. De klonede segmenter av gummigen-DNA som bæres i fire rekombinant-plasmider (pX206, pX207, pX208 og pX209) er også vist. For enkelhets skyld er pMW79-vektor-sekvensen av disse plasmider ikke vist, men detaljer for disse konstruksjoner er gitt i eksempel 6. Fig. 7 viser posisjonene innenfor BamHI-restriks.jonskartet for gummigengruppe-DNA av 22 innskuddsmutasjoner. Åpne sirkler angir in vitro-genererte innskudd (iblant også kalt innset-ningen) av Bqlll Tet<r->fragmentet av TnlO, mens fylte sirkler representerer in vivo-oppnådde TnlO-innskudd. Fenotypisk klassifikasjon av mutanter som bærer disse innskudd, som beskrevet i eksempel 2, er vist nedenunder. Fig. 8 viser plasseringen innenfor BamHI-restriksjonskartet av et sett på seks representative mutasjoner i gummi-gengruppen. Stammer X925, X928, X975, X1008 og X655 bærer innskuddsmutasjoner av TnlO eller Bglll Tetr-fragmentet av TnlO ved de angitte posisjoner. Stamme X974 bærer en utslettelse av 1,35 kb BamHI-fragmentet og en substitusjon av Bglll Tetr-fragmentet ved denne posisjon. Nedenfor restriksjonskartet er der vist representative plasmider som benyttes i komplementeringseksperimenter med de ovenfor angitte mutanter. For enkelhets skyld er bare klonede X. campestris-sekvenser vist, idet vektor pMW79-sekvenser er sløyfet. Et plusstegn (+) angir vellykket komplementering av mutanten ved plasmidet, mens et minustegn (-) angir at komplementering ikke fant sted. Detaljer for eksperimentene og tolkningene er gitt i eksempel 8. Fig. 9 viser et partielt restriksjonskart av plasmid pRK290 og forskjellige segmenter av DNA klonet ut av den rekcmbinanta lambda-fag 655 (L') og inn i Bqlll-setet av pRK290 som vist i detalj i eksempel 10. Fig. 10 består av nukleotidsekvensen av et segment på 16 080 basepar av Xanthomonas campestris-DNA som inneholder en gengruppe som styrer Xanthan-biosyntese. Fig. 11 gir en oversikt over organisasjonen og strukturen av de gener som inneholdes i 16 kb-segmentet av DNA. Den øverste linje på figuren er et BamHI-restriksjonskart og angir plasseringen av hver av BamHI-restriksjonssetene i sekvensen. Linjen som er tegnet ovenfor rammeanalysekurvene, viser den tilnærmede posisjon av noen av de mutasjoner som er blitt isolert ogkarakterisert. Rammeanalysekurvene som er angitt, viser fordelingen av G+C-innholdet av de første (blå linje), andre (rød linje) og tredje (sort linje) nukleotidposisjoner. Det skal bemerkes at fordelingen av G+C-inn-

holdet ved de tre nukleotidposisjoner er ikke-vilkårlig over hele sekvensen, hvilket indikerer at praktisk talt alt dette DNA koder for proteinprodukter. Leserammen for hvert protein er definert ved den nukleotidposisjon som har en mellomliggende verdi innenfor hvert område av ikke-vilkårlig G+C-fordeling. De punkter hvor G+C-fordelingen ved de tre nukleotidposisjoner forandrer seg, angir enten begynnelsen eller slutten av et gen eller slutten av ett gen og begynnelsen av det neste. I hvert tilfelle ble disse punkter funnet å korrelere med nærværet av enten et start- eller stopp-kodon i den riktige leseramme.

Nedenfor ramme-analysekurvene er separate piler tegnet for

å angi plasseringen og utstrekningen av hvert gen i sekvensen. For letthets skyld er hvert gen angitt med en bokstav, og

man bruker denne bokstav med forstavelen "gp" for å angi dets proteinprodukt. Ovenfor hver pil er molekylvekten av proteinproduktet vist i kD. Nedenfor hver pil er navnet på hvert genprodukt vist som sitt bokstaverte navn såvel som sitt funksjonelle navn for de tilfeller hvor genfunksjonen kan avledes fra mutantfenotypen.

Fig. 13 viser potensielle sekundære strukturer av mulige, transkripsjonsterminatorer identifisert innenfor DNA-sekvensen rundt posisjoner 900, 3400 og 12 400. Fig. 14 viser den sammenfoldede sekundære struktur av prolin tRNA identifisert i DNA-sekvensen fra posisjoner 732-808. Fig. 15a viser plasseringen av forskjellige TnK12-innskuddsmutasjoner innenfor det klonede X. campestris-DNA båret i rekombinant plasmid pRK290-H336. Fig. 15b viser utstrekningen av DNA som er slettet fra X. campestris-kromosomet i en serie av utslettelsesmutanter.

Det slettede DNA er angitt ved det skraverte rektangel.

Fig. 16a viser plasseringene av in vitro-generert Kan»- inn-skudds- og utslettelsesmutasjoner innenfor plasmid pRK290-HA3. Fig. 16b viser posisjonene av syv in vitro genererte Kan<r>innskuddsmutasjoner innenfor plasmid pRK290-H336.

DETALJERT BESKRIVELSE AV DE FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER

Oppfinnerne antar at biosyntese av xanthangummi i X. campestris finner sted via den vei som er vist på fig. 1. Denne figur viser sammensetningen av pentasakkarid (fem-sukker) repeterende enhet av xanthangummi koblet til et isoprenoid-lipid "bærer"-molekyl. Sammensetningen av dette pentasakkarid er vist å skride frem ved sekventiell addisjon i en spesiell og definert rekkefølge av de fem individuelle sukker-molekyldeler som forekommer i den repeterende pentasakkaridenhet. Hver unike sukker-addisjon katalyseres ved en spesiell enzymatisk aktivitet som er spesifikk for dette spesielle trinn. Sukrene avgis av spesielle sukkernukleotider. De enzymatiske aktiviteter er her betegnet som "trans-feraser". De individuelle enzymatiske aktiviteter blir ytterligere betegnet ved romertall I-V, som angir det trinn i den i rekkefølge anordnede serie av sukkeraddisjoner som hver transferase-aktivitet katalyserer.

De to mannosesukker-molekyldeler som foreligger i modent xanthan og i pentasakkarid-forløperenheten, vites å være modifisert. Mannose-molekyldelen som adderes ved trinn 3

ved aktiviteten av transferase III, er kjent for å være acetylert. Den fraksjon av denne molekyldel som foreligger i den acetylerte form i moden xanthangummi, er ved observasjon funnet å være variabel. En enzymatisk aktivitet, her betegnet acetylase, katalyserer addisjonen av acetylgruppen til man-nosen, skjønt det nøyaktige punkt i sekvensen av den biosyntetiske vei hvor acetylasen fungerer, er for tiden ikke kjent. På lignende måte er det kjent at mannosesukker-molekyldelen som festes ved aktiviteten av transferase V i trinn 5, er pyruvylert. En enzymatisk aktivitet, her kalt ketalase,

katalyserer addisjonen av pyruvatgruppen. Igjen varierer fraksjonen av disse mannosemolekyldeler som er observert å være pyruvylert i moden xanthangummi, og det punkt inne i den biosyntetiske vei hvor ketalasen virker, er for tiden ukjent.

Pentasakkarid-forløperenheter polymeriseres i en etterfølgende enzymatisk reaksjon katalysert ved en aktivitet som her er betegnet som "polymerase". Polymerase-aktiviteten katalyserer frigjøringen av en pentasakkarid-underenhet fra dets til-knyttede isoprenoid-lipid bærermolekyl og den samlede til-knytning av denne pentasakkaridenhet til et lipid-koblet pentasakkarid, dekasakkarid eller høyere orden av det grunnleggende pentasakkarid gjentar seg, med den resulterende økning i graden av polymerisasjon av mottagende nascerende xanthanmolekyler.

Som angitt i de innleverte US patentsøknader av Vanderslice et al. og Doherty et al. angitt ovenfor, og som begge er innlemmet ved referanse, er andre polysakkarider oppdaget som kan beskrives som "varianter" av xanthan. Disse innbefatter "polytrimeren" i henhold til Vanderslice et al. både i sin acetylerte og ikke-acetylerte form, såvel som "polytetrameren", både acetylert og ikke-acetylert, og de ikke-acetylerte, ikke-pyruvylerte eller ikke-acetylerte og ikke-pyruvylerte pentamere xanthangummier i henhold til Doherty et al. Det er klart fra både den foregående beskrivelse av de enzymer som er oppdaget i xanthan-veien og fra den etter-følgende beskrivelse av de nylig oppdagede mutantorganismer, at de materialer som er nødvendige for den rekombinant-DNA-formidlede produksjon av disse variantgummier her er beskrevet ifølge sakens natur. For eksempel, polytetramer kan synte-tiseres i et rekombinant-DNA-system som ikke har den DNA-sekvens som koder for transferase V, mens et ikke-acetylert polytetramer-syntetiserende plasmid mangler begge de gener som koder for transferase V og acetylase.

En mutasjon av Xanthomonas campestris er blitt identifisert, som spesielt inaktiverte aktiviteten av transferase IV. En stamme som bærer denne mutasjon, X655, er blitt beskrevet av Vanderslice et al. og er blitt deponert ved American Type Culture Collection (ATCC) i Rockville, Maryland under aksesjonsnr. 53195. Identifikasjonen av denne spesielle defekt i denne X. campestris mutante stamme X655 førte til kloning av X. campestris kromosomale DNA-sekvenser fra det område i kromosomet til hvilket setet for mutasjonen i stamme X655 var lokalisert. Mutagenese og analytisk teknologi ble brukt som beskrevet nedenunder i eksempel 1, 2 og 7 for å indusere og analysere de fenotypiske egenskaper av mutasjoner i DNA-sekvenser nær setet for X655-mutasjonen. Som en basis for den foreliggende" oppfinnelse antas det at de gener som koder for andre transferase-aktiviteter, ville være gruppert i nærheten av det gen som er identifisert i stamme X655 som koder for en nødvendig komponent av aktiviteten av transferase IV, fordi i bakterier er det kjent at gruppering av gener

for metabolske veier finner sted.

Kjennskap til transferase IV-defekten i stamme X655 ble

brukt til å klone og genetisk og fysisk analysere et stort segment (35 kb) av X. campestris kromosomalt DNA som spenner over setet for mutasjonen som forårsaker transferase IV-defekten i stamme X655. Tallrike mutasjoner innenfor dette DNA ble indusert ogkarakterisert. Analyser av genetiske plasseringer av disse mutasjoner og de fenotyper av mutantstammer som bærer disse mutasjoner (eksempel 2, 4 og 7) skaffet direkte bevis for at denne DNA-sekvens i X. campestris-kromosomet, og som et transportabelt DNA-segment på overførbare plasmidvektorer, inneholdt gener som koder for proteiner som er nødvendige for aktivitetene av transferase I, II, III og IV, acetylase og ketalase. Disse data ledet til den konklusjon at de transportable DNA-segmenter klonet inn i plasmider pRK290-H336 og pX209 inneholder gener som koder for proteiner som er nødvendige for aktivitetene av transferasene I t.o.m. V, acetylase, ketalase, polymerase og muligens andre fortsatt ikke-karakteriserte aktiviteter

som er nødvendige for eller henger sammen med xanthan-biosyntese. Overføring av plasmidvektorer inneholdende denne "gengruppe" for xanthan-biosyntese, som en transportabel DNA-sekvens, inn i bakterier andre enn Xanthomonas campestris, kan således benyttes til å redusere kostnadene ved produksjon av xanthangummi ved forandring av betingelsene for gjæringen.

Hittil har Xanthomonas campestris og beslektede Xanthomonas-arter vært den eneste mikrobielle kilde tilgjengelig for produksjonen av xanthangummi. Disse organismer har imidlertid lave temperaturoptima (27-30°C), langsomme veksthastigheter og er obligate aerober, hvilket alt sammen øker kostnadene ved fermentering. Dessuten krever den eksisterende aerobe fermenteringsteknologi en gjæringsvæske med lav viskositet for å tillate at væsken har en høy oksygenoverføringshastig-het. Fordi xanthan er et eksopolysakkarid, øker imidlertid xanthanproduksjonen drastisk viskositeten av gjæringsvæsken, hvilket reduserer oksygenoverføringshastigheten og nødvendig-gjør bruken av kostbart gjennomluftings-, agitasjons- og kjøleutstyr for oppnåelse av ønskede produktkonsentrasjoner.

Det har vært foreslått av oppfinnerne at denitrifikasjons-bakterier, som kan ha høyere temperaturoptima og hurtigere veksthastigheter og vil ha evnen til å vokse anaerobt dersom de innføres med en egnet nitrogenkilde, kan transformeres med transportable DNA-sekvenser som kan styre produksjonen av xanthangummi. Produksjon av xanthan i disse organismer vil være mindre kostbar enn i de arter som for tiden anvendes. Dessuten har oppfinnerne funnet en transportabel DNA-sekvens som koder for gengruppen som er ansvarlig for xanthan-produksjonen og har plasmidvektorer som inneholder disse transportable sekvenser. Ved anvendelse i en egnet vert, særlig en denitrifikasjonsbakterie, vil disse plasmider bevirke produksjon av xanthangummi i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen på en økonomisk og industrielt gjennomførbar måte. Dessuten er bakterieverter med bare noen av de foreslåtte fordeler påtenkt som alternative produksjonsverter.

De gener som er ansvarlige for omdannelsen av xanthan-for-løpere (UDP-glukose, UDP-glukuronsyre, GDP-mannose, acetyl-CoA og fosfoenolpyruvat) til xanthan er gruppert i X. campestris-genomet og er blitt klonet. I den foreliggende oppfinnelse vil disse gener bli innført i egnede alternative verter og gummi-biosyntesen målt. Korrigerende trinn er angitt i det tilfelle at de alternative verter med de biosyntetiske grupper til stede ikke syntetiserer xanthangummi.

Ytterligere utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse er påtenkt idet de anvender andre kjente og for tiden ikke oppdagede vektorer som vil inneholde en eller flere av de transportable DNA-sekvenser som her er beskrevet. Nærmere bestemt foretrekkes det at disse vektorer har noen eller alle av de følgende egenskaper: (1) er stabile i den ønskede vert; (2) kan foreligge i et passende kopitall i den ønskede vert; (3) har en regulerbar promotor; og (4) har minst én DNA-sekvens som koder for en selekterbar egenskap som foreligger på et parti av plasmidet separat fra det parti hvor den transportable DNA-sekvens skal innsettes.

Den følgende ikke-fullstendige liste over bakterieverter og plasmidvektorer antas å angi kombinasjoner som lett kan forandres for å møte de ovenfor angitte kriterier og derfor foretrekkes for bruk i den foreliggende oppfinnelse (Tabell I). Slike forandringer kan lett utføres av fagfolk med alminnelige kunnskaper i lys av den tilgjengelige litte-ratur og de retningslinjer som her er angitt.

Den store gruppe gummi-biosyntetiske gener er blitt klonet på et plasmid inneholdende et vidt vertsområde-opprinnelses-sted for DNA-replikasjon som kan overføres og opprettholdes i en rekke forskjellige gramnegative bakteriearter innbefattet X. campestris og X. campestris-stamme X1107, som inneholder en utslettelse av alle de kjente gummi-biosyntetiske gener. Plasmid pRK290-H336 omdanner X1107 til en xanthan-produserende stamme ved komplementering.

Når et plasmid såsom pRK290-H336 plasseres i en alternativ vert, må mange trinn inntreffe på riktig måte for at xanthan-biosyntese skal finne sted. Først må genene som koder for de biosyntetiske enzymer, transkriberes og translateres for å gi funksjonelle biosyntetiske enzymer på et riktig nivå. Deretter må de alternative verter inneholde tilstrekkelig store biosyntetiske kapasiteter for acetyl-CoA, fosfoenolpyruvat, UDP-glukose, UDP-glukuronsyre og GDP-mannose slik at de biosyntetiske enzymer kan polymerisere disse forløpere til xanthangummi. For det tredje må de biosyntetiske enzymer som kodes for av gruppen, aggregere dersom et slikt multi-protein-kompleks er den operative biosyntetiske enhet. For det fjerde må arkitekturen av dette kompleks (eller de enkelte enzymer) skaffe vektoriell polysakkarid-biosyntese slik at xanthanet sekreteres inn i dyrkningsmediet.

Utførelsen av genetikk, molekylbiologi, biokjemi, fermen-teringsteknikk, mikrobiell fysiologi og rekombinant-DNA-teknologi av en fagmann sannsynliggjør den likefremme og åpenbare isolering av alternative verter som uttrykker de xanthan-biosyntetiske gener og som kan produsere ekstracellulær xanthangummi.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Dette eksempel viser fremgangsmåtene for mutagenese og screening som anvendes for å generere de mutantstammer som er xanthangummi-defekte.

B1459 S4-L ble skaffet fra the Northern Regional Research Laboratories ved De forente staters landbruksdepartement.

Det ble genetisk merket med en kromosomal resistens overfor streptomycin og ble brukt som en mottager i samband med E. coli LE392 inneholdende plasmid pRK2013::TnlO. Plasmid pRK2013 inneholder Tn903 som koder for kanamycin-resistens som beskrevet av Figurski, D. H., og Helinski, D. R. i Proe. Nati. Acad. Sei., U.S.A., 76: 1648-1652 (1979), herved innlemmet som referanse. Plasmidet kan ikke replikere i X. campestris. Transposon TnlO koder for resistens overfor tetracyklin. Transkonjuganter ble selektere, som var resistente overfor streptomycin og kanamycin, eller streptomycin og tetracyclin. Den førstnevnte opptrådte med en hyppighet på ca. 4x10"<6>

pr. mottager og var tilsynelatende et resultat av en transposisjon av Tn903. Den sistnevnte opptrådte med en hyppighet på ca. 3xl0-<6>pr. mottager og var tilsynelatende et resultat av en transposisjon av TnlO inn i genomet av Xanthomonas campestris.

Auksotrofer ble funnet blant disse transkonjuganter med en hyppighet på ca. 2%; deres behov var vidt fordelt innenfor de forskjellige næringsbehov. Dette indikerer at disse transposoner ikke har en spesiell foretrukket locus for innsetting i X. campestris. Prototrofiske revertanter av auksotrofene ble selektert, og de fleste ble funnet å være medikament-sensitive; dette antyder at auksotrofiene var forårsaket ved transposon-innsetting.

For å sortere for xanthangummi-defekte mutanter blant de dobbelt-resistente transkonjuganter ble Congo Red fargestoff (200 Mg/ml) i som fremmer den morfologe forskjell mellom xanthangummi-produserende og ikke-produserende kolonier, satt til det faste medium. Kolonimorfologi ble undersøkt etter 7-12 dagers inkubasjon ved 30°C. Xanthangummi-defekte mutanter ble funnet med en hyppighet på ca. IO-<4>. Fra nå av blir stammer som ikke kan danne xanthan in vivo, betegnet som Gum--stammer, og de som er forårsaket ved innsetting av TnlO, også Gum--stammer, kan dessuten betegnes som gum::TnlO-mutanter.

Eksempel 2

Dette eksempel viser de biokjemiske fenotyper av Gum--mutantstammene og fremgangsmåtene som benyttes til å vurdere fenotypene .

Den grunnleggende metode som angår bruken av et cellefritt system for å undersøke den biosyntetiske vei for xanthangummi, er beskrevet av Ielpi, L., Couso, R. 0. og Dankert, M. A. i FE3S Lecters 130: 253-255 (1931), herved innlemmet som referanse. Det er funnet at en modifisert versjon av denne fremgangsmåte kan benyttes til analyse av Gum--isolater som her er beskrevet. For denne nye fremgangsmåte blir et in vitro cellefritt system fremstilt generelt ved lyse av celler av en mikroorganisme, fortrinnsvis Xanthomonas campestris, i nærvær av en egnet buffer, fortrinnsvis med EDTA, og oppnåelse av de passende biosyntetiske enzymer som deretter kan behandle eksogent tilsatte substrater. Alternative metoder til lyse kan benyttes, innbefattende, men ikke begrenset til lydbe-handling, vaskemiddelbehandling, enzymbehandling og kombinasjoner derav.

Generelt, for å bestemme det defekte trinn i den biosyntetiske

vei av en Gum--mutant, ble et lysat av denne mikroorganisme inkubert med de riktige substrater, som kan innbefatte UDP-glukose, GDP-mannose, UDP-glukuronsyre, acetyl-CoA og fosfoenolpyruvat. Valget av substrater avhenger av de trinn som

det erønskelig å analysere. Den biosyntetiske prosess kan i en utførelsesform overvåkes ved innlemmelsen av radioaktivt merkede substrater i de polymere enheter. Andre fremgangsmåter som er kjent for fagfolk, kan også benyttes for å tillate identifikasjon av de biosyntetiske mellomprodukter. Nærmere bestemt har kromatografiske metoder blitt utviklet for å separere og identifisere oligosakkarid-mellomproduktene etter hydrolyse fra lipid-bærerne. Disse innbefatter tynnskiktkromatografi (TLC) og væskekromatografi med høy ytelse

(HPLC).

Den cellefrie biosyntese av xanthan er funnet å være en tidsavhengig, sekvensiell prosess som avhenger av tilsetningen av alle tre spesifikke sukkernukleotider. Bakgrunnen for ikke-spesifikk innlemmelse av merket substrat er minimal og virker ikke forstyrrende inn på påvisningen av de xanthan-spesifikke mellomprodukter eller xanthanpolymer i gummifraksjonen.

Engasjement av lipid-bærere, spesielt C55 isoprenoid-pyro-fosfat, er blitt vist i en rekke polysakkarid-bicsyntetiske veier. Dessuten er engasjementet av en pyrofosforyl-koblet lipid-bærer i xanthan-biosyntese blitt vist og bekreftet. Således er de xanthan-biosyntetiske mellomprodukter, i det minste inntil pentasakkaridet, blitt funnet å være utvinnbare i den organiske oppløselige fraksjon med disse bærerlipider.

Ved bruk av fremgangsmåter som her er beskrevet for utvinning av mellomprodukter, er det funnet at under in vitro-betingelser vil mutante X. campestris-lysater produsere akkumulerte mellomprodukter og nye avkortede former for xanthangummi, selv i nærvær av alle substrater som er nødvendige for normal xanthan-biosyntese. De spesifikke blokkeringspunkter antyder hvilke spesielle enzymaktiviteter som mangler. Gum--stammer ble analysert og tildelt biokjemiske fenotyper. Disse biokjemiske fenotyper tillater at genotyper av mutantstammene defineres. For eksempel, en mutantstamme som akkumulerer cellobiose på lipid-bæreren in vitro, sies å ha en defekt i genet for transferase III.

Dersom lysatet av en gummi--mutant produserer normal xanthangummi når det tilføres alle substratene, trekker man den slutning at alle enzymene i den biosyntetiske vei er normale. Således er mangelen på evne til å fremstille gummi in vivo

et resultat av fraværet av et av deønskede substrater. En klasse av Gum--mutanter som kan produsere gummi bare in vitro når substratene er skaffet, ble funnet. Disse Gum--mutanter er beskrevet i nærmere detalj i US patentsøknad nr. 843 349 ved Betlach et al. med tittelen "Process for the Synthesis of Sugar Nucleotides Using Recombinant-DNA Methods", innlevert 24. mars 1986. Alle disse mutanter ble kartlagt bort fra (mapped away from) gummigruppen.

Spesielle fremgangsmåter for disse cellefrie undersøkelser

er her beskrevet. Gum--derivatene ble dyrket i YM (gjær-

malt medium) supplert med 2% (w/v) glukose som beskrevet av Jeanes, A. et al. (U.S. Department of Agriculture, ARS-NC-

51, 14 pp (1976)), her innlemmet som referanse. Cult. res ble dyrket til sen logaritmisk fase ved 30°C ved 300 o/min. Cellene ble titerert på YM pluss 2% (w/v) glukoseplater ved 30°C. Cellene ble høstet ved sentrifugering og vasket med kald Tris-HCl, 70 mM, pH 8,2. Vaskede celler ble resuspendert i Tris-HCl, 70 mM, pH 8,2 med 10 mM EDTA og ble fryse-tinet tre ganger ved en fremgangsmåte i likhet med den til Garcia, R. C. et al. (European Journal of Biochemistry 43:93-105, (1974)), her innlemmet som referanse. Denne fremgangsmåte brøt opp cellene, hvilket viste seg ved den økede viskositet av suspensjonene og det fullstendige tap av cellelevedyktighet (en av IO<6>overlevende) etter denne behandling. De fryse-tinte lysater ble frosset i porsjoner ved -80°C. Protein-konsentrasjonen ble bestemt ved BIO RAD-analyse (BIO RAD Laboratories, Richmond, California) og ble funnet å være 5-

7 mg celleprotein pr. ml lysat.

Som beskrevet hos Ielpi, L., Couso, R. 0. og Dankert, M. A., som angitt ovenfor, ble en porsjon av fryse-tint lysat (ekvivalent med 300-400 vg protein), DNAase I (10 gg/ml) og MgCl2(8 mM) preinkubert ved 20°C i 20 min. Et like stort volum

av 70 mM Tris-HCl, pH 8,2, med de ønskede radioaktivt merkede sukkernukleotider (UDP-glukose og GDP-mannose), med eller uten UDP-glukuronsyre, ble satt til og inkubert ved 20°C.

På forskjellige tidspunkter ble reaksjonene stanset ved tilsetning av EDTA til 4 mM. Prøvene ble sentrifugert, pel-letene ble vasket to ganger med buffer. For å tillate analyse av gummifraksjonene ble de ovenpåflytende væsker kombinert, bærer-xanthan (100 pg) ble tilsatt, og xanthan pluss syntetisert polymer ble utfelt med etanol(60%)-KC1(0,8%). Den utfelte polymer ble resuspendert i vann og re-utfelt nok to ganger for å fjerne ikke-innlemmet merkestoff. Radioaktivitet innlemmet i gummifraksjonen ble bestemt i en væske-scintillasjonsteller, og dataene ble behandlet for oppnåelse av innlemmelse uttrykt i picomol.

For å tillate analyse av de lipidbærer-koblede mellomprodukter ble den vaskede pellet ekstrahert to ganger med kloroform: metanol:vann (1:2:0,3). De lipidkoblede biosyntetiske mellomprodukter ble omdannet til de frie oligosakkarider ved mild syrehydrolyse (pH 2, 90°C, 20 min) og alkalisk fosfatase-behandling (storfe-alkalisk fosfatase, 50 mM MgCl2og 10 mM glycinbuffer, pH 9,8 ved 37°C over natten). Prøvene ble tilbakeekstrahert med kloroform:metanol (2:1) og sentrifugert. Den vandige fase ble fjernet og redusert i volum i vakuum

for analyse ved tynnskiktkromatografi.

Tynnskiktkromatografi ble utført på silikagel (Baker 250 pm, preformede baner) med butanol:dioksan:vann (35:50:20) ved bruk av tre fremkallinger. Forbindelser som var radioaktivt merket med karbon-14, ble påvist ved autoradiografi ved

-80°C ved bruk av Kodak X-Omat AR-film med standard fremkal-ling. Sukkerstandardene ble synliggjort med anilin-difenylamin (1,8% anilin og 1,8% difenylamin i syrnet aceton fra Sigma Chemical Co.). Mobiliteten av de xanthan-biosyntetiske mellom-

produkter ble sammenlignet med mobiliteten av sukkerstan-darder. For radiometrisk analyse av dobbeltmerkede oligosakkarider ble silikagel som ikke var behandlet med inter-fererende spray, skrapet, eluert og tellet med Budget-Solve vandig telle-cocktail (Aqueous Counting Cocktail) (RPI) i plastampuller i en Beckman LS-7500 scintillasjonsteller ved anvendelse av autobråkjøling-kompensasjon. Scintillasjons-dataene ble behandlet for oppnåelse av de absolutte mengder av [<3>H]-merkede og C1 4 C]-merkede materialer for å tillate at molforholdene av sukrene i forbindelsene kunne regnes ut.

Gum--stammene analysert in vitro ble målt på forskjellige måter: (1) radioaktivt merket UDP-glukose alene for vurdering av bærerlipidet med glukose eller cellobiose, (2) ikke-merket UDP-glukuronsyre og dobbelt radioaktivt merket UDP-glukose

og GDP-mannose for bestemmelse av molforholdet mellom glukose og mannose og (3) ikke-merket UDP-glukose og dobbelt radioaktivt merket GDP-mannose og UDP-glukuronsyre for å sammen-ligne molforholdet av mannose og glukuronsyre i de mellomliggende produkter og gummifraksjonen. Mutanter som man antok hadde defekter i acetylering eller pyruvylering, ble undersøkt for deres evne til å innlemme radioaktivt merket acetyl-CoA og fosfoenolpyruvat ved fremgangsmåtene ifølge Ielpi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 102:1400-1408

(1981) og Ielpi et al., Biochem. Intern. 6:323-333 (1983)), som begge her er innlemmet som referanse.

Stammene faller innenfor to store fenotyper. En gruppe var defekt i gummisyntese in vivo og in vitro. Alle disse mutanter hadde mutasjonelle innskudd i gummi-DNA-gruppen. Den andre gruppe, skjønt de ikke kunne syntetisere polysakkarid in vivo, kunne syntetisere xanthangummi in vitro når substratene var skaffet. Alle disse mutanter hadde mutasjonelle innskudd i DNA som ikke var koblet til gummigruppen. Disse mutanter ble undersøkt for nærværet av sukkernukleotidene og funnet å være defekte i forskjellige trinn i biosyntesene for sukkernukleotider.

Mutantene med blokkeringer i den gummi-biosyntetiske vei ble funnet å være av flere typer. De mulige biokjemiske fenotyper og de observasjoner som ble gjort, er angitt her og på fig.

7, hvor kartposisjonene av noen mutasjoner som meddeler disse spesielle fenotyper, er vist.

Transferase I og ukjente defekter

Mange mutantlysater oppviste dårlig innlemmelse av radioaktiv merking i den organiske fraksjon, med en liten mengde glukose som det eneste sukker som ble påvist over bakgrunnen. Ikke noe polymert materiale ble påvist i gummifraksjonen. Den lille mengde glukose er blitt påvist ved TLC og/eller HPLC. Der er flere mulige forklaringer for denne fenotype. Mengden av glukose som ses i denne klasse, er lik den ikke-xanthan-spesifikke eller "ikke-oppsporbare" ("unchaseable") glukose som ses når alle tre sukkernukleotider foreligger for S4-L. Denne fenotype kan være resultatet av en transferase I-defekt, som ikke tillater lasting (charging) av lipidbæreren med glukose. Alternativt kunne det være resultatet av en defekt i et annet gen som påvirker initieringen av biosyntesen, og direkte eller indirekte påvirker ekspresjonen av transferase

I.

Transferase II

To mutantlysater som oppviste en betydelig akkumulering av glukose på lipidbæreren, ble observert. Glukosen var ikke polymerisert til cellobiose på lipidbæreren. Disse lysater var upåvirket av nærværet av GDP-mannose og UDP-glukuronsyre. Ikke noe radioaktivt merket materiale ble funnet i gummifraksjonen. Denne defekt antas å ligge i genet for transferase

II.

Transferase III

Den radiometriske analyse av de cellefrie biosyntetiske reaksjonsblandinger fra noen lysater viste at i nærvær av UPD [x 4 C] glukose laster den organiske fraksjon godt (37% av S4-L-nivået). I nærvær av alle tre sukkernukleotidene var lastingen med glukose på det samme høye nivå, men der var ingen innlemmelse av hverken mannose eller glukuronat. Gummifraksjonen viste at ikke noe polymert materiale (cellulose) ble syntetisert. De frigjorte sukre fra den organiske fraksjon ble analysert ved TLC, og disse mutanter ble vist å syntetisere cellobiose meget effektivt. Cellobiosen akkumulerte i den organiske fraksjon. Nærværet av GDP-mannose eller UDP-glukuronat virket ikke inn på akkumuleringen av cellobiosen, idet cellobiosen ikke så ut til å bli ytterligere bearbeidet. Disse data indikerer at disse mutanter har en defekt i transferase III.

Transferase IV

Noen mutantlysater (innbefattet lysater fra X655, ATCC nr. 53195) viser akkumuleringen av det lipidkoblede trimere mellomprodukt (beskrevet i US patentsøknad av Vanderslice et al., se ovenfor) i den organiske fraksjon som har et molforhold på 2:1 mellom glukose og mannose. Gummifraksjonen av hvert cellelysat i denne gruppe inneholder radioaktivt merket polytrimergummi. Disse mutanter ligger i genet for transferase IV, det glykosyltransferase som overfører glukuronsyre til den lipidkoblede oligosakkarid-forløper.

Transferase V

Mutantstammer av denne type vil akkumulere dettetramere oligosakkarid på lipidbæreren og tilsynelatende produsere et forandret polysakkarid som mangler ende-mannose og

-pyruvatet.

Polymerase

Mutantstammer med en defekt polymerase kan akkumulere de lipidkoblede pentamere byggestener og være ute av stand til å polymerisere dem. Denne fenotype ble ikke observert. Et defekt gen for polymerasen kan føre til en forskjellig bio-kjemisk fenotype såsom ikke noe lasting eller en dødelig fenotype for organismen. Nærmere bestemt kan polymerase-mutanter oppvise en transferase-I-fenotype.

Acetylase og ketalase

Disse defekter ble funnet i Gum+-stammer. Polysakkarid ble høstet etter dyrking ved sentrifugering av dyrkningsvæske ved 12 000 x g i fra 30 min til en time ved 10-20°C. Utfelt gummi fra den ovenpåflytende væske ble analysert etter hydrolyse ved HPLC. HPLC-analysen for de hydrolyserte gummier viser at noen mutanter produserer xanthangummi uten pyruvat, og noen mutanter produserer xanthangummi med 2:2:1 molforhold mellom glukose/mannose/glukuronat uten noe acetat. In vitro-data bekreftet disse resultater. Disse mutasjoner eliminerer henholdsvis ketalasen eller acetylasen.

Eksempel 3

Eksempel 3 viser fremstillingen av et bibliotek for samlet genomisk X. campestris-DNA i lambda 1059.

Bakteriofag lambda 1059 er en substitusjonskloningsvektor konstruert av Karn et al. angitt i Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77: 5172-5176 (1980), her innlemmet som referanse. Kromosomet av denne fag inneholder en 14 kb sentral region begrenset av to BamHI-seter. Dette sentrale BamHI-fragment (heretter betegnet som "fyllstoff"-fragmentet ("stuffer" fragment)) inneholder ingen genetiske funksjoner som er nødvendige for fagvekst og kan således fjernes og erstattes med fremmed DNA. Vektorens to armer inneholder alle de viktige genetiske funksjoner for lambda-replikasjon og -modning. Levedyktige fagpartikler produseres ved ligasjon av et DNA-fragment som har en størrelse på 6-24 kb mellom venstre og høyre arm av vektor-DNA. Ligasjoner av venstre og høyre arm til hverandre gir ikke levedyktige fagpartikler fordi genom-størrelsen er for liten for riktig pakking inn i faghoder.

"Fyllstoff"-fragmentet av lambda 1059 bærer lambda- rød ( ekso-og beta-gener) og gamma under styring av den venstre promotor (pL). Disse gener meddeler vektoren en Spi<+->fenotype, dvs. fagen er i stand til å vokse på recA~-stammer, men ute av stand til å vokse på stammer som er lysogene for bakteriofag

P2. Da pL også er anordnet på "fyllstoff"-fragmentet, er ekspresjonen av Spi<+->fenotypen ikke påvirket av orienteringen av "fyllstoffet" mellom venstre og høyre arm av vektoren.

Vektor-DNA nedbrutt med BamHI ligatiseres med genomisk DNA fremstilt ved nedbrytning med et hvilket som helst restriksjonsenzym som danner "klebrige" ender som er forenlige med de kohesive ender på BamHI (f.eks. Bglll, Bell og Sau3A). Kløyving av genomisk DNA ved Sau3A er en effektiv teknikk for dannelse av en tilnærmet tilfeldig populasjon av DNA-fragmenter med høy molekylvekt, fordi gjenkjennelsessetet for kløyving ved dette enzym opptrer i gjennomsnitt en gang for hver 256 bp. Levedyktige fagpartikler inneholdende et innskudd av fremmed DNA vil uttrykke en Spi--fenotype og således kunne vokse på P2-lysogener, men ikke på recA~-stammer.

Høymolekylært genomisk DNA (større enn 100 kb) ble isolert fra 2 liter S4-L rif-101 ved bruk av fremgangsmåter beskrevet av Saito og Muria i Biochem. Biophys. Acta 72.: 619-629, her innlemmet som referanse. Høymolekylært X. campestris genomisk DNA ble delvis nedbrutt med Sau3A ved bruk av reaksjonsbe-tingelser som dannet en samling av fragmenter med en domi-nerende størrelse på 15-20 kb. For å unngå falsk binding fra multiple ligasjonshendelser ble de fragmenter som ble produsert ved Sau3A-nedbrytning, strengt.fraksjonert på en10-40% sukrosegradient til en størrelse på 15-24 kb. Stør-relsen av DNA ble bekreftet ved kjøring av en liten porsjon på en 0,4% agarosegel.

Fag-lambda-DNA ble isolert fra fagpartikler renset ved like-vektsentrifugering gjennom CsCl-gradienter. Lambda 1059-DNA ble nedbrutt med BamHI og Sali. BamHI-nedbrytning separerer de venstre og høyre armer fra "fyllstoff"-fragmentet. Sall-nedbrytning kløyver ytterligere "fyllstoffet" og begrenser derved nydannelsen av kloningsvektoren under ligasjon. En 2 pg porsjon av det BamHI- Sall-nedbrutte vektor-DNA ble blandet med 0,6 \ jg av 15-24 kb-fragmenter produsert ved Sau3A-kløyving av X. campestris-DNA og ligatisert med T4-ligase. Det ligatiserte DNA ble pakket in vitro ved bruk av lambda-pakkeblanding fra Boehringer Mannheim.

Fortynninger av det pakkede DNA ble brukt til å infisere

tre forskjellige E. coli-stammer: en ikke-restriktiv stamme Km392, en recA~-stamme KRO og en P2 lysogen stamme, Q359. Stamme Km392 er LE392 som bærer Tn5 innsatt i proC og er beskrevet av Young, R. A. i Science 222:778-782 (1983), her innlemmet som referanse. Infeksjon av KM392 gav en titer på 1 x IO<6>, mens infeksjon av KRO og Q359 gav titere på henholdsvis 6 x IO<4>og 1,2 x IO<3>. Titeret på KM392 er et mål på den samlede levedyktige fag. Titeret på KRO er et mål på antall fager uten et innskudd av X. campestris-DNA, mens titeret på Q359 indikerer antallet fager som inneholder et innskudd av X. campestris-DNA. Det relativt store antall levedyktige fager som ikke inneholder et innskudd av X. campestris-DNA, var overraskende, da dobbelt nedbrytning av vektor-DNA med BamHI og Sali skulle ha.hindret dannelsen av et betydelig antall lambda 1059-partikler ved religasjonshendelser. Det skal også bemerkes at det samlede antall levedyktige fager bestemt ved tilsetning av titerne på henholdsvis KRO og 0359 er tilnærmet fem ganger så lavt som de samlede levedyktige fager bestemt fra infeksjon av KM392. En tolkning av disse resultater er at platevirkningsgraden av fag med og uten innskutt DNA er ca. fem ganger så lav på både KRO og Q359

som på KM392. Med andre ord, antall fag med og uten et innskudd av X. campestris-DNA er i virkeligheten fem ganger større enn de kombinerte titere av KRO og Q359 antyder.

Denne tolkning ble utprøvet ved bestemmelse av andelen fag som vokste på KM392 som inneholder innskutt DNA. Det fag som forelå i 48 isolerte plaques som vokste på KM392, ble plukket med tannstikker (toothpicked) til dråper av steril buffer og deretter trykket på en plen (lawn) av Q359-celler, KRO-celler og KM392-celler. Alle isolatene vokste på KM392, 62% vokste på Q359, men ikke på KRO, og 38% vokste på KRO, men ikke på Q359. Således er andelen av fag som vokser på verdi er i god overensstemmelse med den på forhånd beregnede verdi på 66% (1,2 x 10<3>/1,8 x 10<=>) og indikerer at det samlede antall levedyktig fag som inneholder innskutt DNA, er 6 x 10<3>.

Ytterligere bevis på at X. campestris-DNA var blitt vellykket klonet, ble oppnådd ved isolering av det DNA som foreligger i seks uavhengige kloner som vokste på KM392 og Q359, men ikke på KRO. Størrelsen av hvert isolert fag-kromosom ble funnet å være noe større enn størrelsen av lambda 1059-kromosomet, hvilket indikerer at det innskutte stykke som foreligger i hver klon, er større enn 14 kb "fyllstoff"-fragmentet. En BamHI-nedbrytning av DNA fra hver av isolatene viste at hver hadde et unikt restriksjonsmønster som var forskjellig fra BamHI-restriksjonsmønsteret av lambda 1059.

Eksempel 4

Dette eksempel beskriver screeningen av biblioteket av X. campestris-DNA og viser at noen av genene som er involvert i xanthan-biosyntese, er gruppert (clustered).

Mutanter av X. campestris som ikke produserer xanthangummi, ble isolert ved bruk av TnlO-mutagenese. Tetracyclinresistens som kodes for ved TnlO, har vært brukt til å klone restriksjonsendonuklease-fragmenter inneholdende TnlO og det kromosomale DNA fra 35 gum::TnlO-mutanter. Disse kromosomsekvenser som flankerer TnlO-innskuddssetet, skaffet hybridiserings-prober som ble brukt til å identifisere vill type X. campestris-DNA-sekvenser klonet i det lambda genomiske bibliotek og til å produsere et fysisk kart av gum::TnlO-mutasjoner.

Kromosomalt DNA ble ekstrahert og renset fra gum::TnlO-mutantene som beskrevet ovenfor i eksempel 3. Dette DNA ble nedbrutt fullstendig med restriksjonsendonuklease PstI.

Dette enzym kløyver ikke innenfor TnlO. Derfor vil et kromosomalt Pstl-fragment inneholde TnlO-elementet intakt og føyet til X. campestris kromosomalt DNA like ved innskudd- setet. Det nedbrutte DNA ble ligatisert til Pstl-nedbrutt plasmid RSF1010 som følger: Nedbrytninger ble overvåket ved løpende porsjoner av reaksjonene på agarosegeler. I en typisk ligasjonsreaksjon ble tilnærmet 8 pg av plasmid og tilnærmet 5 pg av kromosomalt DNA kombinert i et samlet volum på 200 pl.

Ca. 20 enheter av T4 DNA-ligase (New England Biolabs) ble tilsatt, og reaksjoner ble inkubert ved 12°C i ca. 16 h. Graden av ligasjon ble målt ved agarosegelelektroforese av

en porsjon av reaksjonen før transformasjon.

Ligasjonsprodukter ble brukt til å transformere E. coli

LE392 ved selektering for resistens mot streptomycin (båret av RSF1010) eller tetracyclin. Hele ligasjonsreaksjonen ble deretter brukt til å transformere E. coli LE392. Seleksjon for Tet<r->transformanter bør selektere for rekombinante plasmider som inneholder både det store Psti-fragment av RSF1010 (som skaffer replikasjonsfunksjon) og Psti-fragmentet av kromosomalt DNA som inneholder TnlO (som skaffer tetracyclinresistens). For transformasjonsfremgangsmåten blir ligasjonsreaksjonen etanolutfelt, resuspendert i 50 pl buffer og satt til 0,2-1,0 ml celler (gjort transformasjonskompetente ved CaCl2-behandling) ved en konsentrasjon på ca. 3 x IO<9>

pr. ml. Denne blanding inkuberes på is i 45 min, underkastes varmesjokk ved 43°C i 2 min, fortynnes til fem ganger så stort volum med Luria-næringsvæske, inkuberes ved 37°C i 60 min og konsentreres til slutt og plates på det riktige medikament-holdige medium.

Alle ligasjoner med kromosomalt DNA inneholdende TnlO gav noen tetracyklin-resistente transformanter som inneholdt rekombinante plasmider som bærer klonet TnlO-DNA. Ikke noen tetracyklinresistente transformanter ble oppnådd fra kontroll-transformasjoner med RSF1010 alene uten noe DNA, og enda viktigere, med en ligasjonsreaksjon som benytter kromosomalt DNA ekstrahert fra S4-L str-101 som ikke bærer TnlO. Hyppig- heten for streptomycinresistente transformanter i denne kontroll-ligasjon var imidlertid ekvivalent med hyppighetene for streptomycinresistente transformanter oppnådd fra de andre ligasjoner.

Tetracyklinresistente transformanter ble analysert for nærværet av rekombinante plasmider som bærer TnlO. Kolonier ble underkastet tannpirkerplukking (picked) og dyrket over natten i LB med 10 pg/ml tetracyklin. Plasmid-DNA ble fremstilt ved bruk av en standard, klaret lysat-teknikk som beskrevet av Clewell og Helsinki i Biochemistry 62:1159-

1166 (1969), her innlemmet som referanse. Plasmider ble analysert ved nedbrytning med passende restriksjonsendonukleaser. For å teste for nærværet av TnlO på plasmidet ble en Hindlll-nedbrytning utført. TnlO inneholder to interne HindIII-fragmenter, 4,8 kb og 0,5 kb lange. Således bør

alle rekombinante plasmider generere disse to fragmenter når de kappes med Hindlll. Dessuten, når de kappes med Pstl, bør alle rekombinanter gi et 8,1 kb-fragment som fås fra RSF1010 pluss et annet større fragment som bør være større enn 9,3 kb. Dette er det Pstl-fragment av kromosomalt DNA

som inneholder TnlO, som i seg selv er 9,3 kb langt.

Nesten alle plasmider som ble undersøkt, syntes å inneholde TnlO ved disse kriterier. Psjbl-nedbrytninger avslørte imidlertid ofte nærværet av mer enn to Pstl-fragmenter. Tilsynelatende er disse "ekstra" fragmenter resultatet av multiple ligasjonshendelser. Disse ekstra fragmenter er uønskede,

fordi dersom en slik rekombinant ble brukt som en hybridisa-sjonsprobe, kunne festing til DNA-fragmenter homologe med det uvedkommende Pstl-fragment finne sted, såvel som festing til det Pstl-fragment som inneholder sekvenser fra det gen som er av interesse.

For å eliminere de uvedkommende Pstl-fragmenter ble det TnlO-holdige fragment deretter "reklonet". Renset plasmid-DNA ble fremstilt over CsCl-gradienter og nedbrutt fullstendig med Pstl. Nedbrytningsprodukter ble ligatisert ved lav DNA- konsentrasjon (ca. 10 (jg/ml) . Ved denne relativt lave konsentrasjon bør de fleste ligasjonshendelser sirkularisere lineære fragmenter. Tilfeldige dimersirkler vil dannes og multimerer av høyere orden bør være sjeldne.

Graden av ligasjon ble målt ved gelelektroforese av en porsjon av reaksjonen, og generelt kunne liten multimerdannelse observeres. Ligasjonsreaksjonen ble deretter brukt til å transformere E. coli LE392, og tetracyklinresistente transformanter ble selektert. De plasmider som forelå i disse transformanter, ble deretter analysert; de ble nesten alltid funnet å ha den ønskede rekombinante struktur. Dvs. de inneholdt to, og bare to, Pstl-fragmenter: ett med en stør-relse på 8,1 kb, som fås fra RSF1010, og et annet fragment større enn 9,3 kb, som er det X. campestris kromosomale fragment inneholdende TnlO og det tilstøtende genomiske DNA. Disse resulterende rekombinante plasmider ble betegnet pTXnnn, hvor T står for tetracyklinresistent, og Xnnn er stammenummeret av gummi::TnlO-mutanten fra hvilken tetracyklinresistensen klones. For eksempel, plasmid pTX655 ble oppnådd ved kloning av den tetrcyklinresistente determinant ut av gummi::TnlO-mutantstamme X555.

Gum--mutanten betegnet X655 produserer et polysakkarid som har underenheter med en trimerstruktur istedenfor den normale pentamerstruktur. Denne mutant er beskrevet nærmere av Vanderslice et al. som angitt ovenfor. Det syntes mulig at det gummi-biosyntetiske gen definert ved denne mutasjon kunne være en del av en gruppe gener som blir uttrykt ko-ordinert og regulert for å frembringe gummi-biosyntese. For å teste denne mulighet ble et sett med 26 lambda 1059-kloner som bærer X. campestris-DNA, som hybridiserer med plasmid pTX655 (heretter kalt lambda 655(+)), isolert og renset. Da genbanken ikke var blitt amplifisert, inneholdt hver klon X. campestris-DNA avledet fra en uavhengig ligasjonshendelse. Virkningen av dette var å "forflytte seg" ("walk") langs kromosomet i området av genomet som bærer gummigenet definert ved X655-mutasjonen. Da hvert klonet fragment er tilnærmet 15 kb, dekket "forflytningen" ca. 30 kb.

Settet på 26 fagkloner ble deretter hybridisert i sin tur med probe-DNA klonet fra hver av 35 Gum::TnlO-mutanter. Tjuefire av trettifem plasmidprober ble funnet å hybridisere med enten alle eller noen av de 26 fagkloner i settet. Disse resultater viser at i det minste noen av gummigenene er gruppert i det samme område av X. campestris-genomet som inneholder det gummi-biosyntetiske gen definert ved X655-mutasjon, transferase IV.

De 26 lambda 655(+) rekombinante fager inneholder som en populasjon tilnærmet 30 kb av kromosomalt X. campestris-DNA sentrert rundt Pstl-fragmentet klonet i pTX655. Ved hybridisering av de andre 34 pTX-plasmider mot disse fager ble det bestemt hvilke av de andre Gum--mutanter som hadde TnlO-innskudd innenfor dette 30 kb-segment. Alle 35 pTX-plasmider ble radioaktivt merket ved nick-translasjon og hybridisert til filter-bundet lambda 655(+)-fag-DNA sammen med lambda 105S kloningsvektor-DNA som tjente som en negativ kontroll.

Nick-translasjoner ble utført i 50 mM Tris-HCl (pH 7,5),

10 mM EDTA, 1 mM DTT og 50 pg/ml BSA (Sigma Pentax Fraction V). Typisk reaksjonsvolum var 30 pl, og generelt ble 0,4 pg DNA tilsatt. Kaldt dNTP forelå hver i 20 pM, og<32>P-merket dNTP forelå hver ved 3,3 pM. I alt ca. 80 pCi av<32>P ble satt til sammen med hver varm dNTP; generelt ble ett eller to nukleotider merket. Denne reaksjonsblanding ble behandlet med DNAasel (1 pliter av en 0,1 pg/ml oppløsning) i 1 min ved 37°C. Deretter ble 1 pl av E. coli DNA polymerase I (5 enheter som definert av Richardson et al. (1964)) satt til reaksjonen. Etter inkubasjon ved 37°C i.30 min ble reaksjonen etanolutfelt med bærer-DNA. Pelleten ble vasket med 70% etanol, vakuumtørket og resuspendert i 200 pl 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM EDTA.

Hybridiseringer ble utført ved følgende fremgangsmåte. Nitrocellulosefilter-bundet lambda DNA ble fremstilt ved bruk av protokollene i henhold til Davis et al. (1980). Disse filtere ble prehybridisert i 5x SSPE, 5x Denhardts oppløsning (Maniatis et al., som angitt ovenfor), 0,1% SDS og 50% formamid inneholdende 100 pg/ml denaturert, lydbehandlet kalvebrissel-DNA,i 4-16 h ved 42°C på en vuggemaskin. Selve hybri-diseringsreaksjonen ble utført i 2x SSPE, lx Denhardts opp-løsning, 50% formamid inneholdende 100 pg/ml denaturert, lydbehandlet kalvebrissel-DNA. Radioaktivt merket<32>P probe DNA ble denaturert i 0,1 M NaOH og nøytralisert ved tilsetning av 1/10 volum 2M Tris-HCl (pH 8,0). Typisk ble 10<6>cpm av innlemmet<32>P tilsatt pr. ml hybridiseringsreaksjon. Hybridiseringer ble inkubert ved 42°C i 12-20 h på en vuggemaskin. Deretter ble filterne vasket ved værelsetemperatur, en gang

i 2x SSPE og deretter en gang i 0,lx SSPE. Filterne ble blottet på Whatman 3 MM papir og tillatt å lufttørke. Filterne ble deretter plassert under Kodak X-OMAT AR-film og eksponert i 4-16 h ved -70°C. En Du Pont Coronex forsterkningsskjerm ble anvendt.

Det ble funnet at 25 av de 35 plasmider hybridiserte til

noe eller alt av lambda 655(+)-fag-DNA. Ti prober hybridiserte ikke til noe av lambda 655(+)-fag. Således er en betydelig fraksjon av gum::TnlO-mutasjonene (ca. 60%) anordnet innenfor denne klonede 30 kb region, men et betydelig antall ligger utenfor dette DNA-segment.

Hybridiseringsdataene tillater klassifikasjon av lambda 655(+)-fagen på grunnlag av hvilke prober som hybridiserte og hvilke som ikke hybridiserte. Disse hybridiseringsmønstre gjenspeiler de DNA-segmenter som er klonet i hver fag. Fordi hver av de klonede DNA-fragmenter er et enkelt tilgrensende stykke av X. campestris-kromosomet, ble rekkefølgen av mutasjonene i genomet anslått fra klassene av hybridiserings-mønstre. Nærværet eller fraværet av spesielle DNA-fragmenter korrelererer godt med hybridisering til eller ikke-hybridisering til spesielle prober.

Restriksjonskartene og hybridiseringsdataene antydet at mutanten X708 var anordnet temmelig nær en ende av det klonede 30 kb segment av X. campestris-DNA. X. campestris-kromosomet ble således "forflyttet" langsetter ved isolering av rekombi-nantlambda-fag som hybridiserte til pTX708-plasmidet. 26 slike rekombinanter ble plukket ut og analysert ved restrik-sjonskartlegging som beskrevet ovenfor. Dette fagsett utvidet den klonede region med ca. 8 kb.

Alle 35 pTX-plasmidprober ble deretter hybridisert til dette sett av rekombinant fag ved bruk av de samme fremgangsmåter som ble anvendt i hybridiseringer med lambda 655(+)-fagen.

De samme 25 pTX-prober føyet seg til noe eller alt av lambda 708(+)-fagen, og det samme sett prober som ikke lot seg hybridisere til noe lambda 655(+)-fag, lot seg heller ikke hybridisere til noe av lambda 708(+)-fagen. Igjen tillot restriksjonskartene av lambda 708(+)-fagene korrelasjon av nærværet eller fraværet av spesielle DNA-fragmenter med hybridisering til spesielle plasmidprober. Som en oppsummering ble fra disse hybridiseringer 25 mutasjoner funnet å være gruppert i et område av DNA i den umiddelbare nærhet av den mutasjon som bæres i transferase IV-stammen X655. Ti mutasjoner kartla ikke denne region av DNA. Noen av disse mutasjoner er beskrevet ovenfor og av Betlach et al., ovenfor. Disse mutasjoner forandrer ikke de gummi-biosyntetiske enzymer.

Eksempel 5

Dette eksempel beskriver restriksjonskartleggingen av klonet DNA som bærer grupperte gummi-biosyntetiske gener.

Da et stort antall av gummigenene definert ved oppsamlingen avTnlO innskuddsmutasjoner ble funnet å være gruppert rundt stedet for X655-mutasjonen, ble det område av X. campestris-genomet som bærer disse gener, viderekarakterisert vedrestriksjonsenzym-kartlegging. Dette ble utført ved dannelse av et restriksjonsenzym-kart av det klonede DNA som forelå i hver av de 26 fagkloner som utgjør settet med overlappende fragmenter som bærer gummigen-gruppen.

Da hver av fagklonene inneholdt lambda-1059 DNA foruten det klonede X. campestris-DNA, ble restriksjonsenzym-analysen utført med et restriksjonsenzym som lett tillater skjelning mellom lambda-DNA og X. campestris-DNA. Ett slikt enzym er BamHI. Fordi der ikke er noen BamHI-seter i noen av de to armer av lambda 1059, vil det lambda-DNA som foreligger i hver BamHI-nedbrytning, alltid være anordnet i to bånd: ett større ennn eller lik 20 kb inneholder lambda-DNA fra den venstre arm, det andre større enn eller lik 9 kb inneholder lambda-DNA fra den høyre arm.

DNA isolert fra hver av de 26 fagkloner ble nedbrutt med BamHI. Da de restriksjonsfragmenter som ble produsert, varierte i størrelse fra større enn 20 kb til mindre enn 0,5 kb, ble nedbrytningene kjørt på lav prosent agarosegeler (for å separere de store fragmenter) og med høy spenning (for å redusere diffusjon av de minste fragmenter). Gelene benyttet ofte en agarosekonsentrasjon på 0,4% kjørt ved 100 volt i ca. 5 h. Hver gel inneholdt prøver av fagklonene nedbrutt med BamHI, en HindiII-nedbrytning av vill type lambda-DNA

(for bruk som en størrelsesstandard) og en BamHI-nedbrytning av lambda 1059-DNA (for å markere plasseringen av vektor-

DNA i prøvenedbrytningene) .' Den avstand som ble tilbakelagt ved migrasjon av hvert restriksjonsfragment i prøvenedbryt-ningene ble målt og omdannet til en molekylstørrelse ved bruk av en standardkurve fremstilt fra Hindlll-nedbrytningen av vill type lambda-DNA.

Restriksjonsmønstrene generert ved BamHI-nedbrytningene av det DNA som forelå i hver av de 26 fagkloner, ble analysert for å bestemme regionene av overlappende DNA i hver av fagklonene. Fra overlappingsmønstrene ble rekkefølgen av restriksjonsfragmentene i hver av nedbrytningene bestemt (fig. 2).

Da posisjonen av X708-mutasjonen var meget nær en ende av

det klonede DNA, syntes det mulig at en eller flere av de 10 pTX probe-DNA som ikke hybridiserte, var anordnet like utenfor det område av DNA som var inneholdt i settet av overlappende fagkloner. Denne mulighet ble testet ved isolering av et sett av lambda-kloner som hybridiserer med pTX708 fra genbanken. På denne måte ble området av X. campestris-genomet som grenser opp til gummigen-gruppen, utvidet forbi stedet for den Gum--mutasjon som foreligger i X708. BamHI-restriksjonskarter ble fremstilt for det DNA som inneholdes i disse kloner (fig. 3).

For å bestemme om der var noen meget små BamHI-restriksjonsfragmenter (mindre enn 0,5 kb), som ikke ble oppdaget på

0,4% agarosegeler, ble utvalgte fagkloner inneholdende DNA som var skaffet fra hele det klonede område nedbrutt med BamHI og kjørt på en 5% polyakrylamid-gel. En slik gel kan oppløse fragmenter så små som 30 bp. Dette forsøk avslørte nærværet av to tidligere uoppdagede BamHI-fragmenter med størrelser på 300 bp og 190 bp.

Ytterligere analyse av disse data antydet at 300 bp-fragmentet er anordnet mellom 1,05 kb-fragmentet og 1,4 kb-fragmentet,

mens 190 bp-fragmentet er anordnet mellom 5,8 kb-fragmentet og 1,05 kb-fragmentet. Alle dataene for BamHI-restriksjons-kartlegging og probe-hybridisering ble kombinert for å generere et fysisk og genetisk kart av et område av X. campestris-kromosomet som bærer en gruppe gener involvert i xanthangummi-biosyntese (fig. 4).

Eksempel 6

Eksempel 6 beskriver subkloningen av gummigen-gruppe-DNA

fra lambda 1059-biblioteket på plasmidvektoren pMW79 med et vidt vertsområde.

Vektoren pMW79 er beskrevet i detalj av Wood et al. i J.

Bact. 14:1448-1451 (1981), her innlemmet som referanse.

Kort fortalt er det et kimærisk plasmid som kombinerer

Inc-Q-plasmidet RSF1010 som har et vidt vertsområde og den klassiske E. coli-kloningsvektor pBR322 (se fig. 5a). pMW79 kan overføres til og formeres i en rekke forskjellige gramnegative bakterier og bibeholder mange av de nyttige kloningsseter som foreligger i pBR322. Kloningsseter i pBR322-partiet av plasmidet er først og fremst blitt brukt, og spesielt er der blitt brukt seter som forekommer inne i det tetracyklin-resistente gen.

Lambda 1059-fagklonen 655 (I) inneholder hele området av X. campestris-genomet som bærer gummigenene definert ved TnlO-mutasjonene. X. campestris-DNA i fagklon I ble subklonet inn i plasmidkloningsvektoren pMW79.

En partiell BamHI-nedbrytning av DNA isolert fra lambda-klonen 655 (I) ble ligatisert med en BamHI-begrenset nedbrytning av pBR322 og pMW79. Det ligatiserte DNA ble brukt til å transformere KM392, idet man valgte ut Amp<r->transformanter. I alt 1200 Ampr-transformanter ble trykket på agarplater inneholdende tetracyklin for å bestemme hvilke av transformantene som er Tet<s>og således sannsynligvis inneholder et innskudd i det unike BamHI-sete anordnet i Tet-genet av pMW79. Seksti Amp<r->Tet<s->transformanter ble isolert og renset ved utstrykning. Plasmid-DNA ble deretter isolert fra hver av transformantene, nedbrutt med BamHI, og nedbrytningene ble kjørt på 0,4% ag.arosegeler for å fastslå nærværet og utstrekningen av X. campestris-DNA.

Majoriteten av de isolerte plasmider inneholdt ikke noe innskutt DNA. Det ble imidlertid funnet at 19 inneholdt innskudd. Ni av de 19 inneholdt et enkelt fragment-innskudd, mens 10 inneholdt innskudd sammensatt av to eller flere fragmenter. I alt 10 tilfeller hvor to eller flere BamHI-fragmenter foreligger i det klonede DNA, grenser fragmentene opp til BamHI-restriksjonskartet av lambda-klone 655 (I). Denne oppdagelse skaffer uavhengig bevis for at rekkefølgen av BamHI-fragmentene i lambda-klon 655 (I) er korrekt. Med unntagelse av 1,0 kb-fragmentet ved den høyre ende er alt Xanthomonas-DNA som foreligger i lambda-klon 655 (I), repre-sentert i ett eller flere av subklonderivatene.

Kloner av pMW79 inneholdende enten 5,8 kb-fragmentet eller 11,5 kb-fragmentet (som ikke inneholdes i lambda-klon 655

(I) ble fremstilt i et separat forsøk ved ligatisering av BamHI-begrensede nedbrytninger av lambda-klon 655 (C) og lambda-klon 708 (8) med BamHI-nedbrutt pMW79. En representativ prøve av X. campestris-DNA-fragmenter som var klonet på

denne måte inn i pMW79, er vist på fig. 5b.

I en rekke trinn ble et enkelt stort (20 kb) segment av DNA som spenner over det område som er genetisk implisert i xanthangummi-biosyntese, klonet inn i pMW79. De trinn som ble fulgt i denne kloning, var som følger: Faglambda-klon 655(B) (fig. 2) DNA ble nedbrutt fullstendig med Bglll og Hindlll og ligatisert med plasmid pMW79-DNA nedbrutt fullstendig med BamHI og Hindlll. BamHI og Bglll kutter forskjellige sekvenser, men danner identiske kohesive ender; således kan BamHI-ender ligatiseres til Bglll-ender. Ligasjonsproduktene ble brukt til å transformere E. coli, idet man selekterte for ampicillinresistens kodet for ved pMW79.

88 Ampr-transformanter ble sortert for resistens overfor tetracyklin og 75 Tet<s->isolater ble funnet. Kloning inn i BamHI-Hindlll-regionen av pMW79 fører til inaktivering av tetracyklinresistens. Den høye hyppighet av Tet<s->transformanter finner sted fordi Hindlll- og BamHI-ender ikke kan ligatiseres sammen for å reforsegle plasmidet; innsetting av et DNA-fragment er nødvendig for resirkularisasjon. Seks Tet<s->transformanter ble analysert for plasmid. Klarede lysater i liten skala ble fremstilt, nedbrutt med BamHI og kjørt ut på agarosegeler. To transformanter viste seg å ha plasmider som bærer det ønskede fragment. Ett isolat ble dyrket opp for større plasmidfremstilling. Dette plasmid-DNA ble renset ved CsCl-densitetgradientsentrifugering og reanalysert ved forskjellige restriksjonsendonuklease-nedbrytninger. Dette plasmid (nå kalt pX206) hadde den ventede struktur som er vist på fig. 6, som oppvist ved kappingsmønstrene av disse restriksjonsendonukleaser.

Et forsøk ble også gjort på å klone det 8 kb BglII-fragment av lambda 708(8) som vist på fig. 6. Renset lambda 708(8)-DNA ble nedbrutt fullstendig med Bglll og ligatisert med BamHI-kuttet pMW79-DNA. Ligasjonsblandingen ble brukt til å transformere E. coli, idet man igjen selekterte for Amp<r>.

166 Amp1*-transformanter ble testet for resistens overfor tetracyklin og 49 Tet<s->isolater ble funnet. Plasmid-DNA fra 18 av disse ble isolert og ett rekombinant plasmid som syntes å bære det BglII-fragment som var av interesse, ble funnet. Klaret lysat i stor skala ble fremstilt fra denne stamme og plasmid-DNA renset over CsCl-gradienter. Videre analyse antydet at plasmidet hadde det fragment som var av interesse, men inneholdt et annet, uvedkommende BglII-fragment også. ;Strukturen av denne tilfeldige rekombinant bød på en anledning til å konstruere en nyttigere subklon. Ved en tilfeldighet gav plasseringene av Bglll- og Clal-setene i dette plasmid en anledning til nedbrytning med Clal og Bglll og deretter ligatisering i det 2 kb Clal- BglII-fragment som er tilgrensende i gummigen-gruppen. Denne konstruksjon utvider det klonede DNA som foreligger i plasmidet med 2 kb bortenfor Bglll-setet; dette ekstra DNA var nyttig for å lette gen-ers tatnings-forsøk. Dessuten inneholdt dette konstruerte stykke unike Hindlll- og Bglll-seter innenfor det klonede Xanthomonas-DNA. Strukturen av dette plasmid, betegnet pX207, er vist på fig. 6. ;Deretter ble det store (8 kb) BglII- Clal-fragment av lambda 655(B) innsatt i pX207, idet det erstattet det lille (2 kb) Bg_l 11-Clal-segment av pX207. Plasmid pX207 ble nedbrutt fullstendig med begge disse enzymer og ligatisert med DNAet av lambda-rekombinanten lambda 655(B) som også var nedbrutt med Bglll og Clal. Dobbeltnedbrytningen med Clal og Bglll selekterer for rekombinante plasmider blant transformantene fordi Bglll-ender ikke kan ligatiseres til Clal-ender og således kan ikke pX207-plasmidet resirkularisere med mindre et annet BglII- ClaI-fragment ligatiseres inn i det. I virkeligheten inneholdt alle de 12 transformanter som ble under-søkt, rekombinante plasmider, og en av disse viste seg å være den ønskede rekombinant. Dette plasmid, pX208, er vist på fig. 6. Dette plasmid inneholder gummigen-DNA fra det høyre Bglll-sete av 5,8 kb BamHI-fragmentet t.o.m. Clal-setet av 11,5 kg BamHI-fragmentet med unntagelse av et mellomliggende 4,5 kb BamHI-stykke. Det manglende 4,5 kb Bglll-fragment ble senere innsatt i pX208 for å danne den store subklon som var av interesse, kalt pX209. ;pX208-plasmid-DNA ble linearisert ved nedbrytning med Bglll. Det manglende 4,5 kb BglII-fragment ble renset ved elektro-eluering ut av en preparativ agarosegel og ligatisert til det Bglll-kappede pX208. Ligasjonsproduktene ble brukt til å transformere E. coli, og ampicillinresistente transformanter ble oppnådd. I denne ligasjon er der ingen selektering for rekombinanter, og der er ingen enkel screening-metode. Transformantene ble screenet for rekombinante plasmider ved kolonihybridiseringsteknikken (Maniatis et al., se ovenfor). Denne fremgangsmåte er analog med den plaquehybridiserings-protokoll som benyttes for å screene lambdakloner for DNA-segmenter av interesse. Transformanter plukkes ut med tann-pirkere på en "master"-plate i en ordnet rekke. Denne master-plate blir deretter brukt til å produsere en kopi på et nitrocellulosefilter. Denne filterkopi inkuberes oppå en agarplate med det resultat at bakterievekst finner sted på overflaten av filteret, matet ved diffusjon av næringsmidler fra agaren gjennom filteret. Deretter blir bakteriene på filteret lysert in situ, og DNA blir irreversibelt bundet til filteret. Dette filter kan deretter probes med et hvilket som helst radioaktivt merket DNA. I dette tilfelle ble et radioaktivt merket 4,5 kb Bglll-fragment benyttet; bare rekombinanter som tok opp dette fragment, hybridiserte til proben. De fleste transformanter inneholdt bare det resirku-lariserte plasmid pX208 og hybridiserte ikke. 576 transformanter ble screenet ved bruk av det 4,5 kb Bglll-DNA som ;var merket med<32>P ved nicktranslasjonsmetoden. Blant disse ble 20 transformanter funnet som hybridiserte til proben. Plasmid-DNA fra noen av disse transformanter ble analysert for å bekrefte nærværet av 4,5 kb-fragmentet og bestemme dets orientering. Plasmider fra 12 slike mulige rekombinanter ble analysert ved bruk av agarosegelelektroforese. 11 av disse inneholdt det forventede Bglll 4,5 kb-fragment, og av disse 11 bar 8 fragmentet i den riktige orientering. En av disse åtte ble plukket ut for ytterligere analyse. Dette plasmid, betegnet pX209, er vist på fig. 6. ;Eksempel 7 ;Dette eksempel beskriver metodologi for in vivo og in vitro regionalt styrt mutagenese av det klonede gummigen-DNA-segment som bæres på pMW79. ;Regionstyrt mutagenese ble utført på subklonede partier av det gummi-DNA som bæres i plasmid pMW79. Disse klonede DNA-segmenter ble mutagenisert in vivo med transposoner og in vitro ved bruk av rekombinant DNA-teknologi for å danne innskudd-, sletting- og substitusjonsmutasjoner inne i det klonede X. campestris-DNA. For å studere de fenotyper som ble meddalt ved disse mutasjoner ble plasmidene som bar mutasjonene, overført tilbake inn i X. campestris, og deretter ble rekombinanter identifisert hvor det plasmid-bårede, muterte gen var blitt innsatt i kromosomet via homolog rekombinasjon. Tetracyklinresistens som kodes for ved TnlO, gir et bekvemt selektivt system for flytting av mutasjoner fra et plasmid inn i kromosomet. ;I preliminære eksperimenter konstruert for å undersøke rekombinasjon mellom plasmid-båret X. campestris-DNA og X. campestris-kromosomet, ble plasmidet pTX655 brukt som et modellsystem. Dette plasmid bærer et TnlO-innskudd i midten av et 2,3 kb X. campestris- Psti-fragment klonet inn i plasmid RSF1010. Forsøket gikk ut på å mobilisere pTX655 med plasmid pRK2013 og overføre det fra E. coli inn i X. campestris ved selektering for bevegelse av den tetracyklinresistens som kodes for ved TnlO. De opprinnelige resultater av denne sammenføyning (mating) var anomale og antydet at TnlO ikke uttrykte tetracyklinresistens effektivt i X. campestris når det ble båret på plasmidet, men at medikamentresistensen ble mer effektivt uttrykt når TnlO ble båret i kromosomet av X. campestris. Dette fenomen er også blitt beskrevet for TnlO ;i E. coli. Der er det blitt vist at stammer som bærer én kopi av TnlO innsatt i kromosomet, er resistente overfor betydelig høyere konsentrasjoner av tetracyklin enn er stammer som bærer TnlO på et multikopi-plasmid. Seleksjonen av Tetr X. campestris ut av den ovenfor nevnte sammenføyning førte til en høy hypppighet (0,5 pr. mottaker) av avkom som vokste meget dårlig (bare små, utvannede kolonier) på tetracyklin. Etter forlenget inkubasjon produserte en stor fraksjon av koloniene (25%) sektorer med mer kraftigvoksende celler. ;Mer enn 50% av disse sektorer syntes å være Gum- i morfologi. Disse er sannsynligvis resultatet av rekombinasjon mellom ;det plasmidbårede DNA inneholdende TnlO-innskuddet og den kromosomale ville type DNA. Når TnlO rekombineres inn i kromosomet, fås et høyt nivå av Tet<r>, og den kraftigvoksende sektor observeres. Mår disse Gum-- Tet<r->sektorer ble plukket og strøket ut pånytt på tetracyklin, vokste de godt og oppviste en karakteristisk Gum--morfologi. Dette tyder sterkt på at den opprinnelige X655-mutasjon er blitt rekonstituert ved rekombinasjon av det plasmidbårede TnlO-innskudd inn i kromosomet. ;Lambda 173, som beskrevet av Kleckner et al. i Genetics 90:426-461 (1978), her innlemmet som referanse, ble brukt for å innføre TnlO i plasmider inneholdende X. campestris-DNA. Denne bakteriofag inneholder en temperaturfølsom undertrykker av lytiske funksjoner og et TnlO-innskudd i en ikke-essensiell gen. Porsjoner av denne fag ble brukt til å infisere en lambda-følsom E. coli som bærer et rekombinant plasmid av interesse ved infeksjonsmultiplisitet på 0,1 ved 30°C. Etter 45 min (for å tillate fagadsorpsjon, DNA-injeksjon og ekspresjon av tetracyklinresistens) blir cellene pelletert for å fjerne eventuelt uadsorbert fag. Deretter blir cellene resuspendert i Luria-næringsvæske, og porsjoner inneholdende IO<8>celler plates på Luria-plater inneholdende 20 pg/ml tetracyklin, 100 pg/ml ampicillin og 2,5 mM natrium-pyrofosfat. Tetracyklinet selekterer for TnlO, mens pyro-fosfatet chelaterer magnesium for å bringe på et minimum sekundære faginfeksjoner. Dannelsen av lysogener bringes på et minimum ved inkubering av platene ved 42°C. Tet<r->overlevende oppstår med en hyppighet på IO-<7>- IO-<6>. I et eksperi-ment konstruert for plasmidmutagenese blir 10<10>celler infi-sert med IO<9>fag, og IO<2>plater strykes ut. Etter 24 timers inkubasjon blir koloniene fra hver plate suspendert i 4 ml Luria-næringsvæske og kombinert på is. Etter sentrifugering ekstraheres plasmidene fra cellene ved bruk av lysozym-Triton klaret-lysatprotokoll, og deretter blir plasmid-DNA renset ved etidiumbromid/cesiumklorid-densitetgradientsentrifugering. Etter ytterligere rensing blir plasmid-DNA brukt til å transformere E. coli LE392 med seleksjon for Ampr, Tetr. Deretter blir plasmid-DNA ekstrahert fra hver transformant og kuttet med BamHI for å lokalisere innskuddet til X. campestris-DNA eller vektor-DNA. Disse plasmider med TnlO innskutt i X. campestris-sekvensene blir deretter mobi-lisert innn i Gum+ X. campestris. Seleksjon for tetracyklinresistent X. campestris ut av denne sammenføyning fører ofte til bevegelse av det plasmidbårede TnlO-innskudd inn i kromosomet av X. campestris via homolog rekombinasjon, som angitt i detalj ovenfor. De fenotypiske egenskaper av X. campestris-stammer som bærer disse kromosomale innskudd, ;kan deretter analyseres. ;En annen strategi for isolering av TnlO-innskudd in vivo ;ble også anvendt. Denne strategi benytter plasmid pRK2013::TnlO beskrevet i eksempel 1 som en kilde til TnlO. Man drar fordel av uforenligheten mellom Amp<r>pMW79-replikonet (av pX113) og pRK2013::TnlO, og mangelen på et Smal-restriksjonssete i pX113. Rif<r>Amp<r>E. coli (pX113) ble sammenføyet med RifsE. coli (pRK2013::TnlO), med seleksjon for RifrAmp<r>Tet<r>. Seleksjonen for Amp<r>Tet<r>med plasmid-uforenligheten bør favorisere celler som opprettholder transposisjoner ;av TnlO på pX113. Plasmid-DNA ble renset fra en sammenslåing av flere tusen kolonier og deretter kappet fullstendig med restriksjonsendonuklease Smal. Plasmid pRK2013::TnlO har Smal-seter inne i vektorpatiet av plasmidet, mens der ikke ;er noen Smal-seter inne i TnlO. Det resulterende DNA ble brukt til å transformere en nativ E. coli til Amp<r>Tet<r>. ;Bare pX113::TnlO-plasmider kunne meddele denne fenotype ;under transformasjonen. Plasmidinnholdet av Ampr Tetr-transformanter ble analysert ved BamHI-restriksjonsendonuklease ved kutting og agarosegelelektroforese. Noen av dem inneholdt innskudd av TnlO inne i de klonede Xanthomonas campestris-sekvenser. Slike plasmidbårede innskuddsmutasjoner kan inn-føres i X. campestris-kromosomet via generstatning som beskrevet ovenfor. ;In vitro mutageneseforsøkene ble også konstruert for å utnytte de nyttige egenskaper av den TnlO-tetracyklinresistente determinant. Et 2,8 kb BglII-fragment ble renset fra TnlO. Tidligere arbeid har vist at dette fragment inneholder intakt det gen som koder for proteinet som meddeler tetracyklinresistens og et regulerende gen som koder for et protein som regulerer ekspresjonen av det resistente gen. I E. coli, ;i det minste, må dette reguleringsgen være funksjonelt for at forskjellen mellom plasmid-båret og kromosomalt anordnet tetracyklinresistens kan observeres. DNA-fragmentet av interesse ble renset fra preparative agarosegeler ved elektroforetisk eluering av DNA ut av gelskiver (Maniatis et al., (1982). Det eluerte DNA ble ekstrahert med fenol to ganger, etanolutfelt, vasket med 70% etanol, vakuumtørket og resuspendert i passende buffer. ;In vitro-innsettinger av dette DNA-fragment ble deretter utført i Bglll- og BamHI-seter som forelå inne i det klonede gummigen-DNA som ble båret på forskjellige pMW79-derivater. Ved fremstilling av disse nye konstruerte stykker benyttet man seg av det faktum at de kohesive ender av BamHI-kuttet DNA er identiske med de kohesive ender av Bglll-nedbrutt ;DNA; derfor kan Bglll-kuttet DNA ligatiseres inn i et BamHI- ;sete. Plasmid-DNA ble nedbrutt med BamHI i nærvær av 20- ;80 pg/ml etidiumbromid. I nærvær av etidiumbromid blir aktiviteten av restriksjonsendonuklease forstyrret. Resultatet er at denne nedbrytning gir en høy andel av enkeltkappede lineære produkter. A priori kan man vente at det BamHI-sete som er kappet, ville bli valgt mer eller mindre tilfeldig, og som en første tilnærmelse virker til slik. Det rensede Bglll Tetr-fragment kan ligatiseres til denne populasjon av lineære fragmenter. Ligasjonsproduktene ble benyttet til å transformere E. coli, og tetracyklinresistente transformanter ble valgt. Plasmider ble ekstrahert fra disse transformanter og analysert ved restriksjonsendonuklease-nedbrytning. Plasmider som bærer et innskudd av Bglll Tetr-fragmentet enten ved BamHI- eller Bglll-setet, ble deretter føyet inn i X. campestris, og den differensielle tetracyklinresistens mellom det kromosomale og plasmidbårede Tet<r->element ble benyttet for identifisering av homologe rekombinasjonelle hendelser som genererer generstatning. Med en liten modifikasjon av denne teknologi ble også utslettelsesmutasjoner konstruert. Når plasmid-DNA nedbrutt i nærvær av etidiumbromid pådro ;seg co eller flere kløyvinger ved BamHI, gikk det segment som var flankert av de to kløyvede seter, tapt. Når Tet1" BglII-fragmentet ble ligatisert til slike lineære plasmid-molekyler, inneholdt den resulterende rekombinant en utslettelse av et segment av gummigen-DNA. Plasmider inneholdende utslettelser av gummigen-DNA ble også konstruert med hensikt ved ligatisering av ikke-tilgrensende segmenter av gummigen-DNA. Dersom Tetr Bglll-fragmentet foreligger ved sammen-føyningen til to slike klonede, ikke-tilgrensende gummigen-gruppe-DNA-segmenter, har det ofte vist seg mulig å innføre selv svært store utslettelser inn i Xanthomonas campestris-kromosomet via generstatning. For eksempel ble utslettelsesstammen X1107, som sletter 15 kb av DNA fra gummigen-gruppen, konstruert ved denne teknikk. ;Ved anvendelsen av både in vivo og in vitro regionrettet mutageneseteknologi på et antall subklonede segmenter av gummigen-DNA ble en rekke plasmidbårede innskudd oppnådd, som senere gav opphav til tetracyklinresistente X. campestris-derivater i generstatningsforsøket. Et fysisk kart av noen av disse innsetningsmutasjoner er vist på fig. 7. Southern blott hybridiseringsanalyser av det kromosomale DNA av disse generstatnings-stammer ble utført for å bekrefte at posisjonene av de kromosomale innskudd svarte til stillingene av de plasmidbårede innskudd som de var avledet fra. For disse forsøk ble samlet kromosomalt DNA fremstilt fra hver mulig generstatnings-stamme, som beskrevet ovenfor. Det rensede DNA ble nedbrutt med diagnostiske restriksjonsendonukleaser, vanligvis BamHI, Bglll, EcoRI, Hindlll eller Pstl eller en eller annen kombinasjon av disse. DNA-nedbrytninger ble kjørt ut på agarosegeler, overført til nitro-cellulosefiltre og underkastet probing med radioaktivt merket plasmid-DNA. Autoradiografer avslører hybridiseringsmønsteret, som sammenlignes med vill type kontroller for at man skal kunne slutte seg til plasseringen og orienteringen av innskuddet av TnlO eller Bglll Tet<r->fragmentet. Alle innskuddene vist på fig. 7 ble funnet å være genuine generstatnings-stammer. Dvs. ingen plasmidsekvenser ble påvist ved hybridisering, cg d=z kromosomale DNA var forandret fra den ville type ved den antydede innsettingsmutasjon og ved ingen annen åpenbar hendelse. Fenotypene av alle disse innsettingsmutasjoner ble undersøkt ved in vitro og/eller in vivo metodolo-gier beskrevet i eksempel 2. De fenotyper som således ble identifisert, er antydet på fig. 7. ;Eksempel 8 ;Dette eksempel beskriver fremgangsmåter brukt i komplement-teringsforsøk som viser ekspresjonen i X. campestris av klonede gummi-biosyntetiske gener båret på plasmidvektorer. ;Komplementeringsforsøk er blitt utført med plasmider som bærer segmenter av gummigen-DNA og Gum--innsetningsmutasjoner inne i gummigen-gruppen. Resultatene av disse forsøk er vist på fig. 8. I disse forsøk ble plasmidene føyet inn i X. campestris-mottakere og opprettholdt der ved bruk av seleksjon for streptomycinresistens. Nærværet av plasmid ble bekreftet ved at plasmid-DNA-preparater (preps) ble fremstilt fra hver mottakerstamme og plasmid-DNA analysert med restriksjonsendonuklease-nedbrytning og agarosegelelektroforese. Plasmid "herde" ("curing") forsøk ble utført for å vise at tapet av plasmidet var korrelert med tapet av Gum+-fenotypen i komplementerte stammer. Generelt ble mutanter komplementert med plasmid-DNA som spente over det mutasjonelle innsetningssete. For eksempel, plasmid pXHO komplementerte X925, X928, X975 og X655, men ikke utslettelsesmutantstammen X974. Gummigen-DNA båret av plasmid pXHO strekker seg vesent-lig forbi innsetningssetene av alle de komplementerte mutasjoner. Som det imidlertid kan ses på fig. 8, strekker ut-slettelsesmutasjonen-i X974 seg helt opp til det høyre ende-punkt av klonet gummi-DNA båret i pXHO. Det er derfor mulig at pXHO ikke bærer en intakt kopi av det gen som elimineres ved utslettelsen i stamme X974. Det faktum at man ikke kan oppnå komplementering av X974 ved pXHO, taler for at dette er tilfellet. ;Et overraskende resultat var at pX206 ikke kunne komplementere X974. Dette plasmid kan heller ikke komplementere X975, men det klonede segment rager bare 1,0 kb forbi setet for X975-innsetningen. Det er fullt mulig at et eller annet element (f.eks. en promotor) som er nødvendig for ekspresjonen av genet som er mutert i X975, er anordnet utenfor det klonede segment i pX206. At ikke pX206 kan komplementere X974, er mer forvirrende, da det klonede gummigen-DNA strekker seg 4-5 kb forbi mutasjonssetet i begge retninger. Denne spesielle sammenføyning var imidlertid unik idet den gav en uvanlig lav hyppighet for plasmidoverføring. Denne hyppighet var tre størrelsesordener lavere enn den som observeres i alle andre sammenføyninger i dette sett med forsøk. I alle andre sammenføyninger ble plasmid pX206 overført ved den høyere frekvens, og i alle andre sammenføyninger med X974 som mottakeren, ble den høyere overføringshyppighet observert. Således kan det foreligge en negativ innvirkning som et resultat av kombinasjonen av denne spesielle kromosomale mutasjon og dette spesielle klonede DNA-segment. ;De fleste komplementeringsresultater kan tolkes på en likefrem måte. De plasmidbårede gummigener kan uttrykkes i det minste i X. campestris. ;Eksempel 9 ;Dette eksempel viser sekvenseringen av DNA fra gummigen-, biosyntetisk gruppe. ;Nukleotidsekvensen av det klonede segment av DNA som inneholder gummigen-gruppen, bestemmes ved bruk av dideoksykjede-avslutningssekvenseringsmetoder beskrevet av Sanger et al. ;i Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:5463-5468 (1977), her innlemmet som referanse. Hver av BamHI-fragmentene som inneholdes i gummigen-gruppen, er blitt klonet ( i begge orienteringer) inn i M13-kloningsvektorene MP18 eller MP19. Hvert klone-fragment ble deretter subklonet ved bruk av fremgangsmåten beskrevet av S. Henikoff i Gene 28:351-359 (1984), her innlemmet som referanse. Ved sekvensering av det DNA som inneholdes i et nestet sett av overlappende subkloner, kan en nukleotidsekvens for hele det klonede BamHI-fragment oppnås. Således er en fullstendig sekvens for hver av de to DNA-tråder blitt bestemt for de 0,3, 1,4, 1,5 cg 2,2 kb 3amHI-fragmenter som er angitt nedenunder: ; ; G+C-innholdet av Xanthomonas-DNA er forholdsvis høyt (rappor-tert i Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol- 1 ;(1984) Williams og Wilkins, Baltimore, Maryland, som 65-70%). På grunn av dette høye G+C-innhold inntreffer bånd-sammenpressinger på sekvenseringsgelene med forholdsvis høy hyppighet. Dette problem er blitt søkt løst på to måter: (1) nukleotidsekvensen fås for begge tråder av DNA, slik at hele sekvensen kan bekreftes ved komplementæritet av tråder og (2) deoksyinosin ble substituert for deoksyguanosin for oppnåelse av sekvensen i området hvor båndssmmanpressing var et akutt problem. Til tross for disse tiltak for å unngå feil, er den ovenfor angitte sekvens gjenstand for en liten unøyaktighet, først og fremst på grunn av tekniske vanske-ligheter som resulterer fra det høye G+C-innhold av DNA. ;Eksempel 10 ;Dette eksempel beskriver kloning av et stort segment av X. campestris-DNA som inneholder alt det DNA som er kjent for å kode for gummi-biosyntetiske gener. ;For effektiv overføring av gummigen-gruppen fra X. campestris til alternative produksjonsorganismer ble gummigen-gruppen klonet på plasmid pRK290, beskrevet av Titta et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:7347-7351 (1980), her innlemmet som referanse. Denne plasmidvektor har et lavt kopitall, et vidt vertsområde og kan overføres konjugalt fra E. coli til en rekke forskjellige gramnegative bakterier. Det ble funnet at restriksjonsenzymet Pral ikke kapper innenfor noe av det klonede X. campestris-DNA av gummiregionen, men det kapper flere ganger innenfor den lambda-kloningsvektor som benyttes i konstruksjonen av X. campestris-genbanken. Kløyving av rekombinant bakteriofag-DNA med Pral genererte derfor flere DNA-fragmenter, av hvilke ett inneholder hele X. campestris-innskuddet og en forholdsvis liten mengde lambda-PNA (ca. 3 kb) føyet til på hver ende. Pet ble derfor bestemt å velge en lambda-rekombinant som inneholder alt det X. campestris-PNA som antas å inneholde gummigener, å rense en stor mengde av dette fag-PNA, å bryte ned PNA med Pral og å rense og deretter klone det restriksjonsfragment som inneholder X. campestris innskutt PNA. ;Ved isolering av hver lambda-fag som bærer gummigen-PNA ble et BamHI-restriksjonskart konstruert for hver fag. Som et resultat av den mutasjonelle analyse utviklet der seg et bilde av hvilke segmenter av klonet PNA som bar gummigener. Man trakk den konklusjon at lambda 655(L') vist på fig. 2 inneholdt den intakte gummigen-gruppe. Perfor ble denne fag valgt for de opprinnelige kloningsforsøk. Ved bruk av standardteknikker ble lysat av lambda 655(L') fremstilt i stor målestokk (1 liter). Pette lysat gav i alt ca. 8 x IO<11>fagpartikler. Fagpartiklene ble renset ved polyetenglykol-utfelling og CsCl-densitetgradientsentrifugering. Fag-PNA ble ekstrahert fra virionene, og et utbytte på ca. 225 pg ble oppnådd. ;Ca. halvparten av det rensede lambda 655(L')-PNA (120 pg) ;ble behandlet med EcoRI-metylase og BamHI-metylase. Pisse enzymer kjenner igjen og modifiserer, f.eks. metylat, de nukleotidsekvenser som gjenkjennes og kløyves av de tilsvarende restriksjonsendonukleaser. Metylering gjør sekvensen motstandsdyktig mot kløyving ved endonukleasen. Metylering tillater bruk av BamHI- eller EcoRI-oligonukleotidlinkere og endene av Pral-fragmentene, som er butte og derfor dårlige substrater i ligasjonsreaksjoner. Suksessen av metylerings-fraksjonen overvåkes ved analyse av senere motstand av lambda ;655(L')-DNA overfor kløyving ved EcoRI og BamHI. Det metylerte DNA ble ikke i merkbar grad kløyvet med et overskudd på ca. 20x av hvert enzym i en 2 timers nedbrytning. ;Ca. 100 pg metylert DNA ble deretter nedbrutt fullstendig ;med Pral, og ca. 80 pg av dette DNA ble deretter omsatt i en ligasjon med en 8 bp BamHI-oligonukleotidlinker. Linkeren er et lite, dobbelttrådet, butt-endet PNA som ligatiseres på de butte Pral-ender i en reaksjon som anvender høye PNA-konsentrasjoner og ca. 100x molart overskudd av linker-fragment i forhold til Pral-lambda 655(L')-fragment. Pe ligatiserte linkerfragmenter kan senere kløyves med BamHI for å danne festende (sticky) ender egnet til kloning inn i BamHI-kuttet vektor-PNA. Før BamHI-nedbrytning blir imidlertid PNA fraksjonert ved sedimentering gjennom en sukrosegradient. Fraksjoneringen over sukrose har to hensikter: For det første kan en stor anrikning av 20 kb-fragmentet oppnås, skjønt oppløsningen av sukrose-gradientsedimenteringen tillater ikke absolutt rensing av 20 kb-fragmentet fra de andre Pral-fragmenter. For det andre kan ikke-ligatiserta BamHI-linker-moiekyler elimineres, fordi disse små DNA-segmencer store sett ikke kommer inn i gradienten. Således vil gradient-fraksjonene som inneholder 20 kb Dral-fragmentet, for alle praktiske formål være fullstendig frie for linker-DNA. Dette er viktig, fordi linker-DNA kan potensielt virke forstyrrende inn på de etterfølgende nedbrytnings- og/eller ligasjonstrinn. PraI-nedbrytningen ble sentrifugert gjennom en 5 ml's 5-20% sukrosegradient. Fraksjoner (ca. 250 pl) ble samlet opp og analysert ved at en porsjon av hver fraksjon ble kjørt på ;en agarosegel. Fraksjoner inneholdende mesteparten av 20 kb Pral-fragmentet ble slått sammen, etanolutfelt, resuspendert ;i buffer og lagret for fremtidig bruk. ;20 kb Pral-fragmentet ble deretter nedbrutt med BamHI for å kløyve de dertil festede linkermolekyler og danne enkelttrådede PNA-ender egnet til kloning. Plasmidet pRK290 ble nedbrutt med Bglll som danner enkelttrådede PNA-ender identiske med BamHI-endene. Ligasjonsreaksjonen ble utført i 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 20 mM ditiotreotol og 1,0 mM ATP. 20 pl's reaksjonen inneholdt 0,2 [ sg pRK290 (nedbrutt med Bglll) og 0,1 pg 20 kb Dral-fragment (nedbrutt med BamHI) og ble katalysert med T4-DNA-ligase (6 Weiss-enheter). Reaksjonen ble tillatt å skride frem over natten (ca. 18 h) ved 12°C. ;Produktene fra ligasjonsreaksjonen ble deretter brukt til å transformere E. coli. Tetracyklinresistente transformanter ble utvalgt og deretter sortert for nærværet av rekombinante plasmider inneholdende den klonede gummigen-gruppe. Denne sortering ble utført ved sammenføyning av individuelle tetracyklinresistente transformanter med en X. campestris-stamme inneholdende en Gum--mutasjon (inne i gummigen-gruppen), selektering for konjugal overføring av tetracyklinresistensen inn i X. campestris og visuell bedømmelse av den resulterende Gum-fenotype. De fleste sammenføyninger produserte Gum- ;Tet<r>X. campestris, men et mindre antall gav Tet<r->kolonier som virket meget slimaktige (mucoid). Analyse av plasmider utført av E. coli-plasmiddonorer i disse sammenføyninger viste nærværet av rekombinante plasmider som besto av pRK2S0 og det innskutte gummigen-gruppe-DNA. ;Fem rekombinante plasmider er blitt analysert. Renset plasmid-DNA ble fremstilt ved CsCl-densitetgradientsentrifugering ;og analysert ved BamHI-nedbrytning og agarosegelelektroforese. Restriksjonsfragmentene som ble dannet, ble sammenlignet med BamHI-nedbrytningsproduktene av lambda 655(L'). Vektoren pRK290 hadde ingen BamHI-seter (Dral-fragmentet, som bærer BamHI-linkere på sine ender, ble klonet inn i et Bglll-sete) og lambda 655(L')-fagen inneholder ikke noen BamHI-seter utenfor det klonede X. campestris-DNA. Derfor skulle ikke BamHI-nedbrytninger produsere identiske sett av X. campestris-DNA-fragmenter. Imidlertid inneholdt bare to pRK290-derivater (H627 og H806) alle de BamHI-fragmenter som ble funnet i lambda 655(L'). De andre tre rekombinanter inneholdt hver et unikt og tilgrensende subsett av disse BamHI-fragmenter. ;Den mest sannsynlige forklaring for disse avkortede kloner ;er at metyleringen av BamHI-seter ( et trinn i fremstillingen av Dral-fragmentet for kloning) var ufullstendig. Dvs. en liten fraksjon av BamHI-setene ble ikke metylert og derfor ikke beskyttet mot den etterfølgende BamHI-nedbrytning som ble brukt for å kløyve de dertil festede linkere. Dersom f.eks. 5% av BamHI-setene var ubeskyttet, vil 40% av Dral-fragmentene inneholde et umetylert BamHI-sete. Den etter-følgende BamHI-nedbrytning ville kløyve disse seter og gi en familie av avkortede fragmenter som kunne klones inn i pRK290. Målingen av BamHI-metylering som ble brukt for å undersøke den opprinnelige reaksjon, ville ikke ha påvist et 5% nivå av umetylerte BamHI-seter. De ufullstendige kloner oppsto sannsynligvis som beskrevet ovenfor. I alle fall er strukturene av de fem kloner som ble oppnådd, vist på fig. 9. ;Eksempel 11 ;Dette eksempel viser, ved bruk av immunologiske analyser, ;at de enzymer som kodes for ved den gummi-biosyntetiske gruppe, bare forelå i små mengder i X. campestris. ;Proteiner ble oppvist ved todimensjonal elektroforese-teknikk. Vill type X. campestris ble sammenlignet med en X. campestris-stamme som ikke kunne syntetisere en sukkernukleotid-forløper, men som kunne syntetisere xanthan in vitro. Disse to stammer inneholder gummi-biosyntetiske enzymer. Det protein som man mener er UDP-glukosedehydrogenase, manglet fra mønsteret av den annen stamme. En X. campestris-stamme som var slettet for hele den gummi-biosyntetiske gruppe ble også analysert. Flere proteiner manglet fra ekstrakter av utslettelsesstammen. Intensiteten av de steder som man mente svarte til de gummi-biosyntetiske enzymer, var meget lav. ;Ytterligere data er gitt. En innsetningsmutasjon i det sentrale parti av 2,2 kb BamHI-fragmentet gir en Gum--mutant som er defekt i transferase III-aktivitet. Denne innsetting er anordnet ved Bglll-setet tilnærmet i posisjon 1132 i DNA-sekvensen av 2,2 kb BamHI-fragmentet. DNA-sekvensen indi kerer at en stor åpen leseramme (ORF) foreligger i denne region av sekvensen. Det mulige proteinprodukt som har transferase III-aktivitet, begynner med ATG-startkodonet ved tilnærmet posisjon 738. Åtte basepar ovenfor startkodonet er et ribosom-bindingssete (AGGAGA). ORF strekker seg klart godt forbi Bglll-setet, hvor innsetningsmutasjonen som definerer transferase III-aktiviteten, er anordnet. ;Peptider svarende til flere forskjellige regioner av den forutsagte proteinsekvens, ble utvalgt for deres forutsagte immunogenisitet ved en hydrofilisitet-plotting kjent for fagfolk og utviklet av Hopp og Woods og beskrevet i en artik-kel med tittelen "Prediction of Protein Antigenic Determinants from Amino Acid Sequences", i Proe. Nati. Acad. Sei. USA, ;Vol. 78, nr. 6, pp 3824-3828, juni 1981, her innlemmet som referanse. De peptider som ble valgt og hvor de er anordnet inne i 2,2 kb BamHI-fragmentet, er vist i tabell 2. ;Peptidene ble syntetisert ved fastfase-peptidsyntese, konjugert til bovinserumalbumin og brukt til immunisering av kaniner. Etter fire immuniseringer ble de hyperimmune sera funnet å inneholde respektable titere av antistoffer spesifikke for de immuniserende peptider ved ELISA (enzymkoblet immunsorbent prøve) som er meget brukt innen faget, og det henvises herved til Eva Engvall, Methods in Enzymology, ;vol. 70, pp. 419-439, 1980, " Enzyme Immuno- Assay ELISA and ;EMIT". ;Disse spesielle antistoffer reagerte også med et 40 kd-protein kodet for ved 2,2 kb BamHI-fragmentet på Western immunoblott som beskrevet av Towbin, H., Staehelin, T. og Gordon, J. i "Electrophoretic Transfer of Proteins from Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Appli-cations", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76:4350-4354 (1979), herved innlemmet som referanse, av cellelysater av X. campestris S4-L. Proteinet forelå ikke i cellelysater av X1107, stammen med gummigruppe-DNA slettet, eller X928, en stamme med en mutasjonell innsetning i 2,2 kb BamHI-fragmentet. Dette 40 kd-protein blir ikke synliggjort i S4-L ;ved den mindre følsomme metode med direkte farging av protein i gelen med Coomassie-blått; således utgjør dette gummi-biosyntetiske protein en meget liten prosentandel av det samlede celleprotein. Det virker som om lav ekspresjon av de gummi-biosyntetiske proteiner er tilstrekkelig for xanthangummi-produksjon i S4-L. ;Eksempel 12 ;Dette eksempel beskriver de spesielle sukkernukleotid-sammen-slåinger som er identifisert i forskjellige X. campestris-stammer som er Gum- in vivo, og i bakterier som er påtenkt som alternative verter. ;Forskjellige Gum--stammer kunne fremstille xanthan in vitro når de ble supplert med sukkernukleotidene UDP-glukose, GDP-mannose og UDP-glukuronsyre. Disse mutanter var defekte ;i sukkernukleotid-syntese, snarere enn biosyntese av xanthan selv. Senere ble slike mutanter funnet å være følsomme for fargen toluidinblått. Ytterligere sukkernukleotidmutanter ble oppnådd ved screening av andre Gum--stammer for toluidinblått- følsomhet . ;Den følgende fremgangsmåte ble benyttet for identifisering ;av de spesielle sukkernukleotid-defekter i stammer som var Gum+ in vitro, men Gum- in vivo. En isolert koloni fra hver stamme ble plukket ut og podet inn i 10 ml YM-næringsvæske (3 g gjæringsekstrakt, 3 g maltekstrakt og 5 g pepton pr. liter) med 2% glukose i en 125 ml's erlenmeyer-kolbe. Kulturer ble inkubert ved 30°C, 250 o/min i 24 h eller inntil turbi-ditet. 5% podestoff ble overført fra YMG-næringsvæske til mineralsaltmedium med glukose som karbonkilden og tillatt å vokse ved 30°C i 24 h. Kulturer ble høstet ved sentrifugering, vasket to ganger med salter og resuspendert i et volum som var tilstrekkelig til å gi en absorbans ved 500 nm på 100. Prøver, 1,5 ml, ble plassert i 50 ml erlenmeyer-kolber inneholdende tilstrekkelig mengde glukose til å bringe konsentra-sjonen på 20 mM. Hver prøve ble inkubert i et 30°C vannbad v.ed 400 o/min i 10 min, deretter ble 1 ml fjernet og satt til 0,1 ml av 11 N maursyre i et eppendorf-sentrifugerør. Røret ble lukket, innholdet blandet i 5 s på en virvelmikser, deretter ble røret plassert i et tørt is/alkohol-bad. Etter at alle prøver var blitt behandlet, ble rørene fjernet fra det tørre isbad, tinet ved værelsetemperatur og sentrifugert i 5 min for å pelletere celleavfallet. Supernatantene ble plassert i på forhånd avkjølt 15 ml's koniske sentrifugerør og frosset i et tørt is/alkohol-bad igjen. Frosne prøver ble plassert på et lyofiliseringsapparat og tatt til tørrhet. Innholdet av hvert rør ble oppløst i 0,2 ml HPLC-buffer, ;40 mM fosforsyre justert på pH 6,5 med trietylamin (Aldrich). Prøver ble filtrert gjennom 0,45 pm filter inn i mikroprøve-ampuller, deretter analysert ved injeksjon på en 4,6 mm x ;250 mm C18-revers fase ionepar-kolonne, 40°C, strømnings-hastighet på 0,8 ml pr. min. Sukkernukleotider ble identifisert ved sammenligning av tilbakeholdelsestidene med dem for standardforsøk under de samme betingelser og ved under-søkelse av spektraene av forbindelser som elueres i området av interesse. ;Fire klasser sukkernukleotid-mutanter av X. campestris ble identifisert ved bruk av denne fremgangsmåte: (1) mutanter som ikke kunne syntetisere UDP-glukose og ;UDP-glukuronsyre, ;(2) mutanter som ikke kunne syntetisere GDP-mannose, ;(3) mutanter som kunne syntetisere UDP-glukose, men ikke ;UDP-glukuronsyre, og ;(4) mutanter som ikke kunne syntetisere UDP-glukose, GDP-mannose og UDP-glukuronsyre. ;Ekstrakter fra vill-type stammer av X. campestris hadde ;alle de sukkernukleotider som kreves for xanthan-biosyntese. Gum--mutanter som var defekte i selve den xanthan-biosyntetiske vei, hadde høyere konsentrasjoner av forløper-sukkernukleotider enn vill-type celler hadde. Disse data antyder at hastigheten av xanthan-syntese i kulturer av vill type kan være begrenset av tilførselen av forløper-sukkernukleotider. ;Sukkernukleotidene i Paracoccus denitrificans (ATCC 17741), Pseudomonas stutzeri (ATCC 17588) og Pseudomonas perfeetomarina (ATCC 14405) ble analysert ved fremgangsmåter utviklet for X. campestris. Alle organismer ble dyrket i 12 h i DENITE-medium, et mineralsaltmedium med 2% glukose som karbonkilde. Celler ble samlet opp, vasket og resuspendert til en absorbans ved 600 nm på 100. Cellepelletene hadde en lyserød farge typisk for denitifikasjonsbakterier som har de-undertrykket syntese av de cytokromer som er nødvendige for anaerob vekst (en typisk reaksjon på oksygenbegrensning under vekst). Følgelig ble 25 mM nitrat inkludert som en ytterligere elektronakseptor i inkubasjonsblandingene. Celle- suspensjoner ble inkubert med 20 mM glukose i 5 min med og uten nitrat, deretter ekstrahert med maursyre. Ekstrakter ble lyofilisert, oppløst i TEA-fosfatbuffer og analysert ved HPLC. Paracoccus denitrificans hadde UDP-glukose og GDP-mannose, men ikke-påvisbare mengder av UDP-glukuronsyre, som bekreftet ved spektra av topper i de områder som var av interesse. På samme måte hadde Pseudomonas perfectornarina og Pseudomonas stutzeri UDP-glukose og GDP-mannose. UDP-glukuronsyre ble ikke påvist i ekstrakter fra noen av orga-nismene . ;Eksempel 13 ;Dette eksempel viser at flere gummi-biosyntetiske enzymer ;er blitt uttrykt i den alternative vert E. coli. ;Mange gummigruppe-DNA-fragmenter er blitt klonet i ekspre-sjonsvektoren pp3, som ble konstruert fra plasmidet pKO-1. Dette plasmid ble beskrevet av K. McKenny et al. i Gene Amplification and Analysis, Volume II Elsevier, North Holland, p. 383, 1981, her innlemmet ved referanse. ;2,2 kb BamHI-fragmentet av gummigruppen som koder for transferase III, ble klonet inn i pp3, hvilket gav pJPl. E. coli JM105 transformert med pJPl ble dyrket i rikt medium, indusert med IPTG (IO-<3>M) og høstet ved sentrifugering etter 3 h ved 37°C. Et cellelysat ble fremstilt ved to passasjer gjennom en fransk trykkcelle ved 124 MPa og kjørt på en 10% SDS-akrylamidgel for å separere proteinene ved molekylvekt. ;Disse proteiner ble underkastet probing med antistoffer spesifikke for transferase III ved Western immunoblott-tek-nikken. Cellelysatet av JM105(pJPl) viste et distinkt bånd for 40 kd-proteinet. Det på samme måte behandlede E. coli-cellelysat med.pp3 uten et innskudd hadde ikke 40 kd-proteinet. Selv i JM105(pJPl)-cellene indusert ved IPTG var 40 kd-proteinet fra det X. campestris-klonede DNA ikke synlig ved Coomassie-blått-farging og utgjorde således en liten prosentandel av det samlede celleprotein. Når elektroblottene av E. coli JM105 (pJPl) ble underkastet probing med affinitets rensede antistoffer, reagerte antistoffene bare med transferase III. Det gummi-biosyntetiske gen var utvetydig uttrykt i E. coli JM105. ;Ytterligere bevis er gitt ved ekspresjonen av fragmenter av den gummi-biosyntetiske DNA-gruppe klonet inn i pp3 som ble brukt til å transformere E. coli FD1098 (F'lacl«). FD1098 ;er en stamme som avgir ved ulik celledeling miniceller som ikke inneholder kromosomalt DNA, men som inneholder kopier av de pp3-avledede plasmider. Bruken av miniceller for analyse av genekspresjon er beskrevet av J. E. Clark-Curtiss og R. Curtiss III i Methods in Enzymology 101:347-362 (1983), her innlemmet som referanse. Etter at minicellene er blitt separert fra hele celler ved sentrifugering gjennom en serie sukrosegradienter, blir minicellene indusert med IPTG, og de merkes radioaktivt under uttrykkelse av proteiner som er kodet for ved det pp3-avledede plasmid. Minicellene høstes, kjøres ut på 10% SDS-akrylamidgel, og de uttrykte proteiner gjøres synlige ved autoradiografi. ;Det gummi-biosyntetiske DNA kodet klart for flere forskjellige proteiner som ble gjort synlige ved denne metode. Et protein på 40 kd ble igjen sett i E. coli, og det var avhengig av nærværet av 2,2 kb BamHI-fragmentet. Et protein med en molekylvekt på 47 kd ble kodet for ved 3,5 kb BamHI-fragmentet. ;Et protein på 27 kd kodes for ved X. campestris-DNA som spenner over 3,5 og 1,35 kd BamHI-fragmentene. Beviset for andre gummi-biosyntetiske proteiner i E. coli-miniceller er tentativt. Ekspresjonen av gummigruppe-DNA er lav i den alternative vert E. coli, hvilket er tilfellet i X. campestris. ;Eksempel 14 ;Dette eksempel undersøker midler for oppnåelse av genekspresjon i en alternativ vert. ;Det er tenkelig at gummigruppen av biosyntetiske gener, når den introduseres i en alternativ vert, enten vil være tran- ;skripsjonelt passiv (silent) eller translasjonelt passiv. ;Det er tenkelig at noen, men ikke alle de biosyntetiske ;gener vil bli uttrykt. Med nukleinsyre-prober og antistoffer rettet mot proteinene som kodes for ved gummigruppen, vil transkripsjon og translasjon av alle gener innenfor gruppen bli målt. ;Dersom noen eller alle genene ikke transkriberes, vil reguler-bare promotorer bli satt til gruppen på passende steder. RNA-polymerasene av eubacteria er meget like, innbefattet ;dem fra gramnegative og grampositive arter. DNA-sekvensene som tillater initiering av transkripsjon, er tilstrekkelig forstått av en fagmann til at han kan introdusere slike promotorer med letthet. ;På samme måte er både grampositive og gramnegative ribosom-bindingsseter (som anvendes til å initiere translasjon) tilstrekkelig forstått for oppnåelse av translasjon av eventuelt mRNA som er blitt transkribert. Ved bruk av standard-metoder ved seterettet mutagenese vil et eventuelt gummigruppe-enzym som er uriktig uttrykt i forhold til dets ekspresjon i vill type X. campestris, justeres for riktig utbytte i den alternative vert. ;Eksempel 15 ;Dette eksempel beskriverøket termostabilitet av gummi-biosyntetiske enzymer. ;Den foreliggende oppfinnelse forutser bruken av organismer som vokser ved over 30°C som potensielle alternative verter. Xanthan-biosyntese finner sted optimalt i X. campestris ved temperaturer på mellom 27 og 30°C. Dersom de enzymer som er involvert i gummi-biosyntese, ikke fungerer godt ved temperaturer over 30°C, men uttrykkes, vil enzymene forandres til termostabile varianter som beskrevet av Liao et al. i US patentsøknad nr. 793 475 med tittelen "Method for the Gene-ration and Detection of Enzyme Variants with Enhanced Thermo-stability and Activity", innlevert 28. oktober 1935 som en fortsettelse av US patentsøknad nr. 532 765, innlevert 16. september 1983, her innlemmet som referanse. Enkle amino-syresubstitusjoner i et protein kan øke den maksimumstempe-ratur som et enzym fungerer ved med mer enn 10°C. De gen-sekvenser som her er beskrevet, tillater lett slike utskift-ninger . ;Eksempel 16 ;Dette eksempel beskriver ytterligere forbedringer som vil tillate alternative verter å syntetisere polysakkarider. ;Alternative verter inneholdende de gummi-biosyntetiske gener og som er i stand til transkripsjon og translasjon av disse gener, kan mislykkes i å produsere polysakkarid i det hele tatt eller ved noen betydelig hastighet. ;De første forsøk, dersom dette finner sted, vil rette seg ;mot utbredelsen av og den potensielt syntetiske hastighet av sukkernukleotid-forløperne (UDP-glukose, UDP-glukuronsyre og GDP-mannose). Klonede gener for nøkkelenzymene i sukkernukleotid-veiene er tilgjengelige fra X. campestris ved bruk av fremgangsmåter beskrevet av Betlach et al. som angitt ovenfor. Dersom en spesiell sukkernukleotid-sammenslåing er for lav for tilstrekkelig polysakkaridproduksjon, vil de riktige X. campestris-gener bli satt til den alternative vert. Den alternative vert kan da gi tilstekkelig polysakkarid, eller hastigheten kan forbli lav. ;Dersom hastigheten for polysakkaridsyntese forblir lav, vil man forsøke forbedring nr. to ved undersøkelse av alle regioner av X. campestris-genomet for gener som tillater gummigen-gruppen og, om nødvendig, sukkernukleotid-veien å fungere slik at de produserer polysakkarid. Et bibliotek av X. campestris genomiske fragmenter slik det er konstruert i eksempel 3, på ca. 20 000 basepar i lengde vil tilføyes konjugalt ved standardteknikker som beskrevet av Titta et al. til de alternative verter som har alle gummigruppe-genene og sukkernukleotidgenene, men fortsatt ikke produserer poly sakkarid. Mottagere av dette bibliotek vil bli observert på petriplater for mucoide kolonier; bakteriekolonier som produserer polysakkarider skiller seg lett fra dem som ikke gjør det. Selv når de er overfylt, kan petriplater med IO<3>bakteriekolonier lett observeres. Bare et lite antall mottakere må observeres (mindre enn IO<3>) for å se hvorvidt en annen gengruppe som foreligger på et X. campestris-DNA-fragment vil gi et manglende genprodukt som er nødvendig for polysakkaridproduksjon. ;Dersom dette forsøk ikke gir en polysakkaridprodusent, vil hele samlingen av mottagende alternative verter (som nå inneholder de vel-uttrykte gummi-biosyntetiske gener, de manglende sukkernukleotid-enzymer, om nødvendig, og en tilfeldig samling av 20 000 basepar DNA-fragmenter fra X. campestris) bli mutagenisert med kjemikalier som forårsaker basepar-substitusjoner (såsom, men ikke eksklusivt, nitroso-guanidin, 2-aminopurin eller etylmetansulfonat). Mutageniserte bakterier vil bli platet på agarmedium for å observere mucoide kolonier. Mucoide kolonier er funnet som meget sjeldne revertanter av noen transposisjonsinduserte Gum--mutasjoner av X. campestris. Mer enn IO<8>mutageniserte kolonier av en hvilken som helst alternativ vert vil bli screenet for polysakkaridproduksjon. ;Valgene av alternative verter behøver ikke være begrenset ;til noen få av de beste kandidater. Plasmid pRK290-H336 har et vidt vertsområde og kan flyttes konjugalt til et stort antall potensielle alternative produksjonsstammer. Lignende konstruksjoner som bærer sukkernukleotid-biosyntetiske enzym(er), vil fremstilles slik at mange alternative verter kan prøves. Hittil har pRK290-H336 blitt plassert inne i de potensielle produksjonsstammer Pseudomonas putids, Pseudomonas cepacis, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri, Escherichia coli og Enterobacter cloacae. ;En strategi for alternativ vertsutvelgelse ville være å ;velge en bakterie som man vet er i stand til ekstracellulær polysakkarid-biosyntese. Slike stammer kan lett muteres til å sette ut av virksomhet den endogene polysakkarid-biosyntese før pRK290-H336 innlemmes i stammen. Slike stammer kan inneholde viktige genprodukter som må reagere med X. campestris gummi-biosyntetiske enzymer og/eller biosyntetiske mellomprodukter for å lette polysakkaridsyntese og sekresjon. Da plasmidoverføringsforsøkene er så likefremme, vil verter med vidt varierende kapasitet for fremstilling av en gummi bli utprøvet. ;Ifølge den foreslåtte oppfinnelse er der påtenkt en alternativ vert som produserer polysakkarid, inne i hvilken der er en gummigen-gruppe av biosyntetiske enzymer, hvilke gener sørger for biosyntesen av de riktige sukkernukleotider og et tilfeldig X. campestris-DNA-fragment. Dessuten kan stammen inneholde et antall basepar substitusjonsmutasjoner fra det seneste trinn i stammeforbedringen. Den alternative vert vil suksessivt herdes ved standardteknikker av det tilfeldige X. campestris-DNA-fragment og det sukkernukleocid biosyntetiske gen. Dersom polysakkaridproduksjonen forblir ufor-andret, vil disse DNA-fragmenter ikke bli benyttet i produk-sjonsstansene med alternativ vert. ;Til slutt vil den vellykkede alternative vert benyttes i kombinasjon med de mutasjoner i den gummi-biosyntetiske gruppe som bevirker syntese av variant-polysakkarider. Således vil den alternative vert med dens kombinasjon av fordeler fra metabolsk hastighet, dyrkningstemperatur og anaerob metabolisme benyttes til å fremstille xanthan og xanthan-varianten ifølge Vanderslice et al. og Doherty et al. og et hvilket som helst annet eksopolysakkarid. ;Eksempel 17 ;Dette eksempel beskriver avledningen av nukleotidsekvensen for en strekning på 16 kb av Xanthomonas genomisk DNA som inneholder en gruppe gener involvert i xanthangummi-biosyn- ;tese. Et parti av DNA-sekvensen (dvs. sekvensen av 0,3, ;I, 4, 1,5 og 2,2 kb BamHI-fragmentene) som her er angitt, ;ble tidligere beskrevet i en patentsøknad av Capage et al. med tittelen "Recombinant-DNA Mediated Production of Xanthan Gum", innlevert 26. mars 1986. Den tidligere sekvens er ;blitt modifisert (korrigert) ved senere resultater som ble oppnådd ved sekvenseringsreaksjoner som benyttet deoksyinosin for å oppløse arealer med båndsammenpressing på sekvenseringsgelene. Dette eksempel viser også hvordan riktig analyse av DNA-sekvensene avslører strukturen og organisasjonen av gummigenene. ;Den fullstendige nukleotidsekvens for hele 16 kb-segmentet ;av DNA er presentert i et dobbelttrådet format på fig. 10. Den øverste tråd av sekvensen leser fra 5' til 3' i venstre mot høyre-retningen av det BamHI-restriksjonskart som er vist på fig. 4. Datamaskinteknikk (rammeanalyse) beskrevet av Bibb et al. i Gene 30:157-166 (1984), her innlemmet som referanse, ble brukt til bestemmelse av G+C-distribusjonen ved hver av de tre nukleotidposisjoner som definerer de tre mulige leserammer for sekvensen i hver retning. Disse rammeanalyse-resultater viser at hele dette DNA transkriberes i retningen fra venstre mot høyre. Således er den øvre tråd av sekvensen som er vist på fig. 10, kodetrådsekvensen (dvs. sekvensen av mRNA med T substituert for U). Den nøyaktige plassering av genene definert ved sekvensen kan fås fra de data som er vist i tabell 3. ;En oversikt over organisasjonen og strukturen av de gener ;som inneholdes i 16 kb-segmentet av DNA, er gitt på fig. ;II. Den øverste linje på figuren er et BamHI-restriksjonskart og angir plasseringen av hver av BamHI-restriksjonssetene i den sekvens som er vist på fig. 10. På fig. 11 viser linjen som er tegnet over rammeanalysekurvene, den tilnærmede posisjon av noen av mutasjonene som er blitt isolert ogkarakterisert(eksempel 1, 2, 7, 19, 20). Rammeanalysekurvene vist på fig. 11 viser fordelingen av G+C-innholdet ved den første (blå linje), andre (rød linje) og tredje (sort linje) ; ; nukleotidposisjon. Det skal bemerkes at fordelingen av G+C-innholdet ved de tre nukleotidposisjoner er ikke-tilfeldig over mesteparten av hele sekvensen, hvilket indikerer at så ;å si alt dette DNA koder for proteinprodukter. Hvert område av ikke-tilfeldig G+C-fordeling langs sekvensen varsler enten områder av DNA som koder for proteinprodukter. Leserammen for hvert protein er definert ved den nukleotidposisjon som har en mellomliggende verdi innenfor hvert område av ikke-tilfeldig G+C-fordeling. Punktene hvor G+C-fordelingen ved de tre nukleotidposisjoner forandrer seg, varsler enten begynnelsen eller slutten av et gen eller slutten av ett gen og begynnelsen av det neste. I hvert tilfelle ble disse punkter funnet å korrelere med nærværet av enten et start-eller stoppkodon i den riktige leseramme. ;Nedenfor rammeanalysekurvene er separate piler tegnet for å angi plasseringen og utstrekningen av hvert gen i sekvensen. For letthets skyld er hvert gen betegnet med en bokstav, og denne bokstav med uttrykket "gp" foran er brukt til å angi dets proteinprodukt. Over hver pil er molekylvekten av proteinproduktet vist i kD. Nedenfor hver pil er navnet på hvert genprodukt vist som sitt bokstavangitte navn såvel som sitt funksjonelle navn for de tilfeller hvor genfunksjonen kan avledes fra mutantfenotypen. ;Rammeanalysekurvene antyder at der var tre områder av sekvensen (sentrert på basenumrene 900, 3400 og 12400) hvor G+C-innholdet av hver av de tre nukleotidposisjoner viser ;en tilfeldig fordeling. Følgelig var det ikke ventet at disse tre områder av DNA ville kode for proteinprodukter. Alle tre av disse områder inneholder et transkripsjonsav-slutningssignal som definert ved et sekvensområde inneholdende en rekke T"er som kommer etter en GC-rik region som danner en stamme-krets sekundær struktur. Den sekundære struktur av disse avslutningsstykker (terminators) er vist på fig. ;13. Basert på plasseringen av transkripsjonsavslutningsstyk-kene er DNA av 16 kb-segmentet avgrenset til tre transkripsjonsenheter. Pilene nederst på fig. 11 viser utstrekningen, plasseringen og retningen av transkripsjonen for hver av de tre enheter som er betegnet som transkripsjonsenheter I, II og III. DNA-sekvensen mellom hvert avslutningsstykke og begynnelsen av det første gen innenfor hver transkripsjonsenhet bør inneholde en sekvens (promotor) som spesifiserer det punkt hvor transkripsjonen initieres. Da resultatene angitt i littera-turen antyder at sekvensen av i det minste noen pseudomonale promotorer har en likhet med sekvensen av E. coli-promotorer, ble de passende områder av DNA-sekvens innenfor hver av de tre transkripsjonsenheter undersøkt for homologi med de overensstemmende sekvenser av E. coli-promotorer både ved -10 (Pribnow-boks) og -35-stillingene. Det antas generelt at sekvensen for Pribnow-boksen er den viktigste av disse to sekvenser når det gjelder å spesifisere bindingen av RNA-polymerase til DNA for å initiere transkripsjon. De overensstemmende sekvenser av Pribnow-boksen og -35-heksameren er henholdsvis TAtaaT og TTGAca (store bokstaver angir de godt bevarte nukleotider av hver heksamer). Således er et minimumskriterium for definering av en mulig promotor nærværet av en heksamer som har sekvensen TANNNT ("N" er et hvilket som helst nukleotid). ;Transkripsjonsenheter I og III ble funnet å inneholde mulige promotorer (ved posisjonene henholdsvis 1199 og 12664) som tilfredsstilte bare minstekriteriet, dvs. homologi med de første, andre og sjette nukleotider i Pribnow-boksen. Således er plasseringen av de mulige promotorer for disse to tran-skrips jonsenheter meget usikker. Transkripsjonsenhet II inneholdt en mulig promotor (rundt posisjon 3580) med en sekvens som har en slående homologi med den overensstemmende sekvens av E. coli-promotorer. Sekvensen i Pribnow-boksen viser homologi med fire av de seks nukleotider, innbefattet de tre som er meget godt bevart. Sekvensen for -35-heksameren viser homologi med fem av seks nukleotider, innbefattet de fire som er meget godt bevart. Avstanden mellom de to heksa-merer er 16 basepar, hvilket stemmer fullstendig med den overensstemmende avstand på 16-19 basepar. Således, skjønt det ikke er mulig å identifisere utvetydig en promotor fra sekvenseringsdata alene, synes det meget sannsynlig at den formodede promotor for transkripsjonsenhet II er korrekt. ;Dataene angitt på fig. 10, 11 og 12 og tabell 3 (tatt i sammenheng) viser et ensartet bilde av strukturen og organisasjonen av gummigenene, samtidig som de gir en lett tilgjengelig kilde til spesifikk informasjon. For eksempel viser fig. 11 at der er en innskuddsmutasjon i 4,7 kb BamHI-fragmentet som genererer mutante Xanthomonas-celler som produserer ikke-acetylert gummi. Mutasjonen er anordnet rundt posisjon 7000 av DNA-sekvensen i et område inneholdende en ramme-2 ;ORF som angir et proteinprodukt (gpF) med en molekylvekt på 39,9 kD. Den nøyaktige posisjon av genet innenfor DNA-sekvensen er vist i tabell 3. Denne informasjon kan brukes til å lokalisere DNA-sekvensen av genet på fig. 10. Fig. 11 ;viser at genet er anordnet inne i transkripsjonsenheten II ;og sannsynligvis fungerer som acetylase-enzymet. Den forutsagte aminosyresekvens av acetylase-enzymet er vist på fig. 12 sammen med ytterligere data som indikerer at enzymet inneholder en høy andel hydrofobe aminosyrerester som er fordelt over hele proteinsekvensen. Derfor fungerer acetylase-enzymet sannsynligvis i bakteriemembranene. ;Den region av DNA-sekvensen som begynner med det første nukleotid på det venstre BamHI-sete av det 0,3 kb BamHI-fragment og strekker seg til transkripsjonsavslutningsstykket rundt posisjon 800, er DNA som synes å ligge utenfor det område av Xanthomonas-kromosomet som inneholder gener involvert i gummi-biosyntese. DNA-sekvensen i dette område viser at der er en ramme-3 ORF som strekker seg over BamHI-setet som avgrenser 0,3 og 1,4 kb BamHI-fragmentene. ORF angir et proteinprodukt (gpA) som har en molekylvekt på 24,4 kD. Innsetninger i BamHI-setet som er anordnet innenfor genet, produserer Xanthomonas-celler med en Gum<+->fenotype. Således synes gpA å være det endelige gen i en transkripsjonsenhet som begynner ett eller annet sted til venstre for 0,3 kbBamHI-fragmentet i et område av Xanthomonas-kromosomet inneholdende gener som ikke er involvert i gummi-biosyntese. ;Området av DNA-sekvensen mellom slutten av gpA og transkripsjonsavslutningsstykket ble funnet å inneholde et prolin-tRNa-gen. Den sammenfoldede sekundære struktur av dette tRNA-transkript er vist på fig. 14. G- og C-nukleotider på toppen av antikodonløkken (vist omgitt av sirkler på fig.14) vil sannsynligvis utelukke at dette tRNA fungerer i translasjon. Kromosomale slettinger som fullstendig fjerner dette tRNA-gen samt hele gummigen-gruppen og innsetninger inn i antikodonløkken gir Xanthomonas-celler som er levedyktige, men Gum- i tilfellet av slettinger og Gum+ i tilfellet av innsetninger. Således er dette prolin-tRNA-gen ikke essensielt for levedyktighet eller gummi-biosyntese.Rammeanalysekurvene (fig. 11) for det område av DNA-sekvensen som inneholdes i transkripsjonsenhet I antyder at dette område av Xanthomonas-kromosomet inneholder en stor ramme-1 ORF. Plasseringen av start- og stopp-kodoner (tabell 3) viser at ORF inneholder to proteiner (gp3 og gpC) som har molekylvekter på henholdsvis 23,3 og 42,8 kD. Opprinnelige resultater fra undersøkelser utført for å karakterisere mutante Xanthomonas-stammer inneholdende TnlO-innsetninger innenfor 1,4 og 1,5 kb BamHI-fragmentene viste at begge disse proteiner oppviste en "ingen tilførsel" ("no charger") mutasjonell fenotype. Disse resultater var imidlertid tve-tydige, da Southern blott av det kromosomale DNA fra mutantstammene klart indikerte at DNA hadde gjennomgått et re-arrangement. Senere resultater fra komplementeringsforsøk viste at sletting av 1,5 kb BamHI-fragmentet var dødelig i Xanthomonas-celler. Xanthomonas-mutanten X1231 inneholder ;en sletting av hele 16 kb-segmentet av DNA (som inkluderer 1,5 kb BamHI-fragmentet), og skjønt stammen er Gum-, forblir den fullt levedyktig. Således er gpC eller gpB begge essen-sielle for levedyktighet i Xanthomonas-celler som inneholder en ellers funksjonell gummigen-vei. ;Det DNA som angir transkripsjonsenhet II (fig. 11), er større enn 9 kb i lengde og koder for syv genprodukter. Innsetningsmutasjoner i hver av disse gener er blitt isolert ogkarakterisert. Virkningene av innsetninger i det område av DNA som angir gpJ, er fortsatt usikre. Foreløpige resultater tyder på at innsetninger i dette område sannsynligvis er dødelige. Innsetninger på forskjellige steder i den ORF som angir gpG gir Xanthomonas-celler som produserte mucoide kolonier som produserer tilsynelatende normal gummi, skjønt mengden av gummi som produseres, kan være noe redusert. De hydrofobe egenskaper av de aminosyrer som inneholdes i gpG (fig. 12), tyder på at dette genprodukt sannsynligvis er et membranprotein. Man kan ikke forklare det tilsynelatende fravær av eventuelle skadelige virkninger fra innsetningsmutagenese. To av genene (gpF og gpH) i transkripsjonsenhet II spiller en åpenbar rolle i gummi-biosyntese. De mutasjonene fenotyper for disse to gener antyder at gpF er acetylase og gpH er transferase III. To av genene, gpD og gpl, viser en "ingen tilførsel" mutasjonen fenotype. Denne fenotype vil være ventet for det gen som angir transferase I samt et hvilket som helst genprodukt involvert i den regula-toriske styring av transkripsjon og/eller translasjon av gummigenene. Denne fenotype kan også ventes for et genprodukt som spiller en strukturell rolle for opprettholdelse av et enzymkompleks som er nødvendig for gummi-biosyntese. Tre av de ventede fem gener som definerer transferase-enzymer, er blitt klart identifisert fra deres mutasjonelle fenotyper. Disse er gpH, gpK og gpM, som er henholdsvis transferase III, IV og II (se fig. 11). Alle tre av disse gener er sammensatt av aminosyrer med en forholdsvis lav hydrofobisitets-profil (fig. 12) og er anordnet i DNA på høyre side av gummigen-gruppen. Hvis man antar at disse egenskaper er generelle karakteristikker for Xanthomonas-transferase-enzymene, så ;er gpl klart den beste kandidat for transferase I, hvilket etterlater gpD som et mulig regulatorisk eller strukturelt protein som er nødvendig for gummi-biosyntese. Innsetninger i det område av DNA som okkuperes av gpE, er dødelige i Xanthomonas-celler som inneholder en ellers intakt gummigen- ;vei. Slik det også var tilfellet for de gener som er anordnet i 1,5 kb BamHI-fragmentet (diskutert ovenfor), er gpE i seg selv ikke et essensielt protein for celle-levedyktighet, da flere utslettelsesstammer som fjerner det område av kromosomet som inneholder gpE, er Gum-, men levedyktige. Det virker som om gpE samt gpC og/eller gpB må være proteiner som er nødvendige for å hindre opphopningen av ett eller flere produkter (produsert av de funksjonerende gummigener) som er giftige med mindre det metaboliseres ytterligere ved enzymaktivitetene av gpE, gpC og/eller gpB. Således virker det sannsynlig at disse proteiner fungerer i polymerisasjonen og/eller transporten av xanthangummi ut av cellen. ;Det DNA som følger transkripsjonsavslutningsstykket ved posisjon 12570 og strekker seg forbi det høyre BamHI-sete av 1,0 kb-fragmentet (dvs. bortenfor enden av det sekvenserte DNA) angir hva man tror er en tredje transkripsjonen enhet. Det skal bemerkes at det transkripsjonsavslutningsstykke ;som angir slutten av transkripsjonsenheten II, har en forholdsvis kort hårnålsstamme med en fri energi (G) med styrke på bare -4,4 kcal/mol. Dersom styrken av hårnålen er relatert til effektiviteten av transkripsjonsavslutning, er det mulig at transkripsjonen gjennomlesning finner sted i dette område. Transkripsjonsenhet III inneholder klart minst tre gener angitt ved mutasjonelle fenotyper som indikerer at deres proteinprodukter er transferase IV (gpK), ketalase (gpD og transferase II (gpM). Transferase II-genet slutter ved posisjon 15284, hvilket er 227 basepar inn fra det venstre BamHI-sete av 1,0 kb BamHI-fragment. Bortenfor dette punkt og bortover mot høyre mot enden av det sekvenserte DNA viser rammeanalysekurvene en ikke-tilfeldig G+C-fordeling ved de tre nukleotidposisjoner som er karakteristiske for DNA som koder for et proteinprodukt. Skjønt man ikke var i stand til klart å angi posisjonen, utstrekningen eller antallet ORF i dette område, viser rammeanalyseprofilen klart at dette DNA inneholder minst ett gen eller muligens et gen og et ;lite parti av et annet gen som strekker seg over det høyre BamHI-sete av 1,0 kb-fragmentet, idet det strekker seg inn ;i DNA som ennå ikke er blitt sekvensert. På den annen side, innsetninger i det høyre BamHI-sete av 1,0 kb-fragmentet samt en innsetning innenfor 1,0 kb-fragmentet anordnet ca. 300 basepar til høyre for det venstre BamHI-sete viser begge en Gum<+->fenotype. ;Generelt inneholder membranproteiner en høy prosentandel hydrofobe aminosyrerester (f.eks. Phe, Trp, Tyr, Ile, Leu, Met og Val). For å bestemme hvilke av gummigen-proteinene som sannsynligvis var anordnet i bakteriemembranene, ble datamaskinen brukt til å bestemme proporsjonen av hydrofobe aminosyrerester samt fordelingen av hydrofobe regioner innenfor hver proteinsekvens. Disse data er angitt på fig. 12 og viser at proteiner gpD, gpE, gpF, gpG og gpJ inneholder en forholdsvis høy andel hydrofobe aminosyrerester (høyere enn 40%) som er fordelt over det hele av hver aminosyresekvens. Således er disse proteiner sannsynligvis membranproteiner. ;Eksempel 18 ;Dette eksempel viser at et enzym som er kodet for ved den gummi-biosyntetiske gruppe, uttrykkes i flere alternative vertsstammer av en forskjellig slekt. ;Antistoffer som gjenkjenner transferase III, ble renset ved affinitetskromatografi og brukt til å påvise transferase III på Western-immunoblott. Produksjonen av sera inneholdende antipeptid-antistoffene spesifikke for det 40 kD-protein som er identifisert som transferase III, er beskrevet i eksempel 11. Et av disse sera ble absorbert til en peptid-affinitetskolonne som besto av det immuniserende peptid som var blitt konjugert til CH-Sepharose via karbodiimid. De spesifikke antipeptid-antistoffer ble eluert fra affinitets-kolonnen med glycin-HCl (0,2 M, pH 2,6) og nøytralisert med Tris. Det rensede serum gjenkjente spesifikt transferase ;III på Western-immunoblott (se ovenfor). ;Det affinitetsrensede antipeptid-antiserum ble brukt til å påvise nærværet eller fraværet av transferase III i celle lysater av alternative vertsstammer inneholdende et plasmid med (pRK290-H336) eller uten (pRK290-Hll) gummigruppe-DNA (eksempel 16). De stammer som ble utprøvet, er vist i tabell 4.Nærværet av transferase III på Western-immunoblott antydet at gummigruppe-DNA uttrykkes i de alternative vertsstammer. Transferase III ble uttrykt i Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas stutzeri og Pseudomonas putida med pRK290-H336. Uttrykkelsesnivået i Pseudomonas stutzeri var nesten ekvivalent med det i Xanthomonas campestris selv. Uttrykkelse av transferase III utenfor (off of) pRK290-H336 i disse alternative verter skyldes sannsynligvis transkripsjonen av et budbringer-RNA som initieres ved en endogen X. campestris-promotorsekvens anordnet i den venstre ende av 4,7 kb BamHI-fragmentet. DNA-sekvensen av gummigen-gruppen angitt i eksempel 17 identifiserer to mulige sterke transkripsjonsavslut-ningsstykker mellom transferase III og plasmidet DNA av vektoren pRK290. Disse avslutningssekvenser som forekommer ved posisjoner 814-844 og 3457-3493, vil så godt som sikkert hindre transkripsjonen av transferase III og hvilke som helst andre gener på nedsiden ved RNA-polymerasemolekyler som initierte transkripsjonen på oversiden av avslutnings-stykkene. Det transkript som inneholder transferase III-genet, må derfor ha sin opprinnelse innenfor gummigen-DNA ;og har høyst sannsynlig sin opprinnelse fra en formodet promotorsekvens anordnet i 4,7 kb BamHI-fragmentet rundt posisjon 3580. Dette tyder på at transkripsjonssignalene som foreligger i gummigruppen og normalt benyttes av X. campestris, også gjenkjennes og benyttes i disse alternative verter. Dette tyder på at mange eller alle de gummigener som bæres på pRK290-H336, transkriberes og meget mulig translateres i de alternative verter. ;Enzymet ble ikke uttrykt fra dette konstruerte plasmidstykke i de E. coli-stammer som ble utprøvet. Åpenbart må de riktige ekspresjonssignaler for E. coli foreligge for ekspresjonen av xanthomonad-DNA i E. coli. Eksempel 13 viste ekspresjon av transferase III fra pp3, et plasmid med riktige E. coli-ekspesjonssignaler. Det er ventet at de andre proteiner som er kodet for ved den gummi-biosyntetiske gruppe, kan uttrykkes i en rekke alternative vertsstammer. ;Eksempel 19 ;Dette eksempel beskriver metodologi for regionrettet mutagenese av klonet gummigen-DNA båret av rekombinante plasmiderPRK290-H336 og pRK290-HA3. ;Regionrettet mutagenese ble utført på gummigen-DNA båret av plasmider pRK290-H336 (H336) og pRK290-HA3 (HA3) beskrevet i eksempel 10. Disse klonede DNA-segmenter ble underkastet transposon-mutagenese in vivo og mutagenisert in vitro ved bruk av rekombinant-DNA-teknologi for å generere innsetnings-og utslettelsesmutasjoner innenfor det klonede X. campestris-DNA. Plasmider som bar slike mutasjoner, ble overført inn i ;X. c e s t r i s-mo 11ak e r e innbefattet utslettelses-mutantstammer som mangler alt eller nesten alt det gummigen-DNA som bæres av K336. Den resulterende mottagningsstamme som bærer det mutante plasmid, oppviser da øyeblikkelig den gummi-fenotype som resulterer fra plasmidmutasjonen. Denne fremgangsmåte eliminerer nødvendigheten av det gen-erstatningstrinn som ble benyttet tidligere (eksempel 7). ;Transposon-mutagenese anvendte et transposon beskrevet av Kleckner et al. i Gene 32:369-379 (1984) og av henne kalt "element 12" og her betegnet som TnK12 (Kleckners element 12). Dette transposon bærer et DNA-segment som inneholder kanamycinresistens-determinanten av Tn5. Dessuten bærer dette DNA-segment også et gen som koder for resistens overfor streptomycin. Dette gen fungerer ikke i E. coli, men er blitt vist å være aktivt i andre gramnegative bakterier. Tidligere viste man at dette gen var aktivt i Xanthomonas ;og meddelte en streptomycinresistent fenotype, når det ble ;introdusert, på et plasmid, inn i Xanthomonas. Bevegelsen av TnK12 inn i Xanthomonas bør derfor meddele lignende resistens overfor kanamycin og streptomycin og således gi en sterk seleksjon for plasmider som bærer TnK12-innsetninger. ;TnK12 bæres i kromosomet av en E. coli-stamme, NK7133, som er resistent for rifampcin, det medikament som hyppigst benyttes til utvelgelse av X. campestris-mottakere i plasmid-overføringsforsøk. Derfor isolerte og benyttet man et kloramfenicol-resistent (Cam<r>) derivat av utslettelsesstammen X1107 (fig. 15) som mottageren i de opprinnelige TnK12-trans-posisjonsforsøk. Det første forsøk ble utført som følger. Plasmidet pRK290-H336 ble introdusert i stamme NK7133 ved transformasjon ved bruk av renset plasmid-DNA. Deretter utførte man en triparental sammenføyning ved bruk av NK7133 (pRK290-H336) som giveren, LE392 (pRK2013) som en mobilisator og X1107 Camr som mottakeren. Nye kulturer av disse stammer som hadde fått stå over natten, ble vasket en gang i LB, og 3 ml av hvert opphav (parent) ble blandet sammen og filtrert gjennom et 0,45 pM filter. Filteret ble inkubert på en LB-piate vad 30°C i 4 h. Cellene ble deretter resuspendert utenom filteret i 3 ml (samlet) YM-næringsvæske. Porsjoner ble platet ut på YMG-plater inneholdende kloramfenicol, kanamycin og streptomycin eller streptomycin alene. Hver av 15 plater av hver type medium ble strøket ut med 0,1 ml av den resuspenderte sammenføyningsblanding. Plater ble inkubert ved 30°C i 6-12 dager og deretter bedømt. Fra dette forsøk oppnådde man til slutt 100 Kan<r>Str<r->kolonier. De fleste av disse var Gum+ og vill type etter utseendet å dømme. Syv var Gum-, og fem kolonier var klart mucoide, men syntes å være morfologisk forskjellige fra vill type Gum<+.>Fjorten av disse Kanr Strr-derivater av X1107 ble sammenføyet i triparentale krysninger med E. coli HB101 og X. campestris S4L rif- 101 (R68.45 tet::Tn7). Plasmidet R68.45 tet::Tn7 er et tetracyklin-følsomt derivat av det konjugalt aktive plasmid R68.45. I sammenføyningen tjener dette plasmid som mobilisa-toren som dirigerer overføringen av pRK290-H336::TnK12-derivater til E. coli. Fordi plasmidgenet som koder for tetra cyklinresistens inaktiveres (på grunn av Tn7-innsetningen), fører seleksjon for Tet<r>E. coli HB101 ved seleksjon for vekst ved 37°C på 10 pg/ml tetracyklin til spesifikk seleksjon for overføringen av pRK290-H336-derivatet inn i HB101. Analysen av den fysiske struktur av disse plasmider er teknisk lettere i E. coli enn i Xanthomonas. De 14 sammenføyninger gav alle sammen Tet<r->derivater av HB101 ved hyppigheter som varierte fra IO-<3>til 10-<4>pr. mottaker. ;Plasmid-DNA ble fremstilt fra disse stammer og analysert ;ved restriksjonsendonuklease-nedbrytninger og agarosegelelektroforese. Molekylvekter for spesielle restriksjonsfragmenter ble bestemt ved sammenligning av fragmentmobilitet og den elektroforetiske mobilitet av DNA-fragmentstandarder av kjent molekylvekt. Mønsteret for restriksjonsfragmenter produsert av spesielle enzymer gjorde det mulig å bestemme posisjonene av TnK12-innsetningene. Disse er vist på fig. 15. Elleve innsetninger ble funnet å ligge i det klonede gummigen-DNA-segment av pRK290-H336. Alle disse innsetninger førte til en Gum- eller mucoid fenotype når det spesielle mutantplasmid forelå i X1107. To Gum* -plasrr.idderivater ble funnet å inneholde TnK12-innsetninger i pRK290-partiet av molekylet; dette er i overensstemmelse med Gum<+->fenotypen.

En innsetning (13) forekom i vektoren, men forholdsvis nær gummigen-DNA. Denne innsetning meddelte en litt forskjelligGum-fenotype (morfologisk), skjønt X1107 (pRK290-H336.13)-stammen produserer store mengder gummi. Dette plasmid-muta-genesesystem tillot at man effektivt kunne isolere og påvise mutasjoner innenfor det klonede gummigen-DNA. Bruk av denne fremgangsmåte, med noen mindre variasjoner, isolerte og karakteriserte man et sett TnK12-innsetningsmutasjoner i pRK290-H336. I noen forsøk ble en annen X. campestris Gum--utslettelsesstamme benyttet. Denne utslettelsesstamme, X1231 (se fig. 15), er slettet for hele det gummigen-DNA som bæres av pRK290-H336. Noen forsøk benyttet også forskjellige seleksjonsskjemaer. For eksempel, i visse tilfeller ble kanamycin pluss streptomycin eller streptomycin alene benyttet til selektering for overføring av TnK12 fra E. coli inn i X. campestris. Til slutt ble 45 TnK12-innsetninger i pRK290-H336 isolert og analysert. De fleste av disse ble funnet å forekomme sammen med gummigener, og de fleste var enkle innsetninger, skjønt noen bar tegn på sekundære DNA-rearrangementer også.

Innsetning- og utslettelsesmutasjoner er også blitt isolert

i pRK290-H336 og pRK290-HA3 ved in vitro-mutagenese ved bruk av et 1,3 kb restriksjonsfragment av transposon Tn903. Dette fragment kan kuttes ut fra et plasmid (pUC4-K) ved en rekke forskjellige restriksjonsenzymer, innbefattet EcoRI,BamHI, Sali, AccI, HincII og Pstl. HincII-nedbrytningen gir et DNA-fragment med butte ender som kan modifiseres ved tilsetningen av et DNA-"linker"-molekyl for å generere DNA-ender som kan ligatiseres inn i andre restriksjonsseter. Generelt er fremgangsmåten for innsetningsmutagenese med dette fragment analog med fremgangsmåten brukt for å isolere innsetnings- og utslettelsesmutasjoner innenfor klonet gummigen-DNA båret i plasmid pMW79 som beskrevet i eksempel 7.Plasmidet pUC4-K ble nedbrutt ved den passende restriksjonsendonuklease , og 1,3 kb Kan1"-fragmentet ble deretter renset fra preparative agarosegeler ved elektroforetisk eluering ut av gelskiver. Når det var nødvendig å tilsette et DNA-linkermolekyl til enden av Kan<r->fragmentet, ble en HincII-nedbrytning av pUC4-K ligatisert med det ønskede linkermolekyl før trinnet med preparativ elektroforese. Senere rensing avKan<r->fragmentet fjernet de ikke-ligatiserte linkermolekyler. Det rensede 1,3 kb Kan<r->fragment ble deretter benyttet i in vitro-mutageneseforsøk. I disse forsøk ble partielle restriksjonsendonuklease-nedbrytninger utført på renset plasmid-

DNA ved begrensning av mengden av restriksjonsenzym som ble satt til reaksjonen. Ved tilsetning av den passende mengde av et gitt enzym til en reaksjon, ble en høy andel enkelt-kuttede lineære molekyler oppnådd. Den passende mengde av hvert spesielle enzym ble bestemt empirisk. Deretter ble det rensede Kan<r->fragment ligatisert til det delvis rensede plasmid-DNA. Produkter fra denne ligasjonsreaksjon benyttes til transformasjon av E. coli, og seleksjon for kanamycin- resistente transformanter selekterer for rekombinante plasmid-molekyler som inneholder Kan<r->DNA-fragmentet innsatt på et restriksjonssete i plasmidet. Plasmid-DNA fra Kan<r->transformanter ble analysert for å identifisere plasseringen av spesielle innsetningsmutasjoner. Utslettelsemutasjoner ble oppnådd når Kan<r->DNA-fragmentet ble ligatisert til et plasmid-molekyl som var blitt kuttet to eller flere ganger ved res-triks jonsendonuklease . Innsetning- og utslettelsemutasjoner konstruert i plasmider H336 og HA3, er vist på fig. 15.

For å analysere fenotypene av både in vivo- og in vitro-genererte innsetningsmutasjoner ble de mutante plasmider overført via konjugasjon inn i X. campestris Gum--utslettelse-mutanter. Mutantderivater av pRK290-H336 ble overført inn i utslettelsestammen X1231, hvor Gum-fenotypen vil gjenspeile innvirkningen av innsetningsmutasjonen som bæres av plasmidet. Fenotypene av mange av mutasjonene er blitt analysert in

vivo og/eller in vitro ved fremgangsmåter beskrevet i eksempel 2. Plasmider som bærer visse innsetningsmutasjoner, kunne ikke overføres inn i utslettelsesstamme X1231. Det er høyst sannsynlig at disse innsetningsmutasjoner er dødelige eller meget skadelige i X. campestris. Disse mutasjoner og andre dødelige mutasjoner er beskrevet i eksempel 20.

Eksempel 20

Dette eksempel beskriver beviset for dødelige mutasjoner

inne i gummigen-gruppen og diskuterer de mulige funksjoner av de proteiner som er inaktivert av disse dødelige mutasjoner .

Som beskrevet i eksempel 19 ble mutasjoner isolert i gummigen-DNA ved in vitro-innsetning av 1,3 kb Kan<r->fragmentet i det klonede gummigen-DNA båret på pRK290-H336. Disse innset-ningsmutantplasmider ble konstruert og analysert i E. coli. For å vurdere Gum-fenotypene av disse mutanter forsøkte man deretter å overføre konjugalt mutantplasmider inn i Gum--utslettelsesstamme X1231. De fleste mutantplasmider ble effektivt overført inn i X1231 via standard triparentale sammenføyninger. Noen få mutantplasmider ble imidlertid ikke overført inn i X1231 eller ble overført ved lav hyppighet.

Ett slikt mutantplasmid var pRK290-H336.KR9 (KR9). Dette plasmid inneholder et innskudd i EcoRI-setet ved posisjon 6089 inne i DNA-sekvensen av gummigen-gruppen og avbryter den åpne leseramme som koder for gpE, som beskrevet i eksempel 17. Dette er det eneste innskudd som er isolert til dags dato, som avbryter dette gen. Oppfinnernes opprinnelige forsøk på å overføre dette innsetningsmutantplasmid, pRK290-H336.KR9, inn i X1231 lyktes ikke, hvilket heller ikke en gjentagelse av dette forsøk gjorde. Dette resultat antyder muligheten av at KR9-innskuddet var en dødelig mutasjon i X. campestris. Senere forsøkte de å overføre KR9 i andre X. campestris-stammer. En sammenføyning ble utført med mottakere X1231, X77 (vill type) og X1205, en Gum--utslettelsesstamme som mangler gummi-DNA mellom det høyre BamHI-sete på 2,2 kb-fragmentet og Hindlll-setet på 11,5 kb BamHI-fragmentet (fig. 15). Denne stamme har en intakt kopi av 4,7 kb BamHI-fragmentet cg således en intakt kopi av det gen som inaktiveres ved innsetning av KR9. I dette forsøk ble KR9 nok en gang ikke overført inn i X1231. Plasmidet ble imidlertid lett overført inn i X77 og X1205. I X1205-stammen førte plasmidet til en "gummi-aktig" fenotype. Dette antyder at genfunksjonene som mangler fra den kromosomale sletting av X1205, ble tilført ved det tilsvarende segment av klonet gummigen-DNA på plasmidet. Disse resultater er i overensstemmelse med den følelse at KR9~innsetting er en dødelig mutasjon. Det gen som inaktiveres ved KR9-mutasjonen, kan imidlertid ikke være et essensielt gen som sådan, fordi dette gen elimineres i mange av de store utslettelsesstammer såsom X1231, X1107 og X1106,

som er levedyktige. Således synes det som om KR9-mutasjonen er dødelig bare nå resten av den gummi-biosyntetiske vei forblir operativ.

Lignende resultater ble observert for to innsettingsmutant-plasmider som var innsettingsmutasjoner inn i Spel-setet ved posisjon 11716 inne i sekvensen. Disse mutant-plasmider, pRK290-H336.KSpl2 (KSpl2) og pRK290-H336.KSpl3 (KSpl3) skiller seg ad bare i orienteringen av det innsatte Kan1" DNA-f ragment. I standard triparentale sammenføyninger med en serie av X. campestris-mottakere ble begge plasmider effektivt overført inn i Gum<+->mottaker X1229 og inn i Gum--mottaker X1217 som bærer en vill type kopi av 3,5 kb BamHI-fragmentet i sitt kromosom og således en vill type kopi av det gen som koder for gpJ. Overføring av disse to plasmider inn i Gum--mottakeren X1205 var tilnærmet tre størrelsesordener mindre,

og overføring inn i Gum--stammen X1231 var enda lavere. Slettingen i X1205 fjerner 3,5 kb BamHI-fragmentet, men er ellers identisk med X1217. Stamme X1231 er den største gummigen-utslettelse og eliminerer hele det klonede gummigen-DNA som bæres av pRK290-H336 og dets innsettingsderivater såsom KSpl2 og KSpl3. Disse resultater indikerer at KSpl2- og KSpl3-innsettinger kan være skadelige eller dødelige i X. campestris.

Ved bruk av en noe forskjellig forsøksmetode ble det ved et tilfelle oppdaget at en sletting av 1,5 kb BamHI-fragmentet synes å være dødelig når resten av gummigen-gruppen er intakt. Plasmidet pRK290-HA3 (HA3), som vist på fig. 10, inneholder alt gummigen-gruppe-DNA bortsett fra 1,4 kb og 1,5 kb BamHI-fragmentene. Man var interessert i å bestemme fenotypen av utslettelsesstammen X1106 som bærer HA3-plasmidet for å bestemme virkningen av å bryte opp gummigruppen ved BamHI-setet som avgrenser 1,5 og 4,7 kb BamHI-segmentene. Derfor ble et derivat av HA3 (HA3.1) som bar TnK12-innskuddet inne i vektorpartiet av HA3, overført inn i utslettelseX1106. Denne stamme ble funnet å være mucoid, hvilket antyder at ikke noe gen som var viktig for gummi-biosyntese, spenner over dette BamHI-sete. Videre viser dette at de klonede gummigener av HA3.1 uttrykkes bortenfor plasmidet.

En mer interessant observasjon ble imidlertid gjort da man forsøkte å overføre HA3.1 inn i utslettelser X1107 og X1231. Man håpet å analysere de fenotyper som ville resultere fra effektiv sletting av 1,5 kb BamHI-segmentet (i X1107) og sletting av både 1,5 og 1,4 kb BamHI-fragmentene (i X1231). Hva man fant, var at HA3.1 ikke kunne overføres inn i noen

av utslettingsstammene. Dette forsøk ble gjentatt og resultatet bekreftet. HA3.1 ble lett overført inn i X1106 og X77 (vill type), men kunne ikke overføres inn i X1107 eller X1231. Således trekker man den konklusjon at slettingen av 1,5 kb BamHI-segmentet og slettingen av 1,5 kb og 1,4 kb BamHI-segmentene begge er dødelige mutasjoner. Da utslettel-sesstamer X1107 og X1231 imidlertid begge mangler 1,5 kb BamHI-fragmentet og er levedyktige, må det være slik at den genetiske informasjon som elimineres ved denne sletting,

ikke er påkrevet i og for seg. Igjen antyder dette at mangel på 1,5 kb BamHI-segmentet blir dødelig når resten av gummigen-veieri er operativ.

Det er funnet bevis på at minst tre forskjellige mutasjoner

i gummigen-gruppen har dødelige fenotyper. Denne dødelighet synes å gjøre seg gjeldende bare når minst et parti av den gummi-biosyntetiske vei forblir aktiv. Oppsamling av et giftig produkt som normalt metaboliseres av den manglende funksjon eller funksjoner, kan forklare denne dødelighet. Under en slik modell ville aktiviteten av den gummi-biosyntetiske vei (eller et parti av den) føre til dødelighet dersom visse andre genfunksjoner var fraværende. For eksempel kan slike gener kode for polymerase. Syntese av Csg-lipid-koblet pentasakkarid kan være dødelig, fordi Cs s lipidet er absolutt nødvendig i minst én annen cellulær funksjon, som var essensiell for vekst - cellevegg-biosyntese. Således kan sekvestering av Css-lipidet til en ikke-metaboliserbar form bevirke dødelighet. Alternativt kan slike gener kode for proteiner som er involvert i transporten av polymeren ut av cellen. Syntese av polymeren i fravær av et transportsystem kan også ha skadelige virkninger på cellevekst og kan godt være dødelig. Det er også mulig at et "dødelig" gen kan kode for transferase V. Ikke noen transferase V-mutanter er blitt identifisert hittil. Muligens kan transferase V-defekten være dødelig, fordi den fører til biosyntese av en polymer

(polytetramer), som er giftige for mikroben. For eksempel kan det hende at polytetrameren ikke bli fullgodt transpor-tert ved transportsystemet som normalt sekreterer xanthan.

Den hypotese at blokkering av gummi-biosyntese på et tidlig trinn i veien undertrykker dødelighet, kan testes. Forsøket ville gå ut på å konstruere dobbeltmutanter mellom store Gum--slettinger og sukkernukleotid-mutanter. En stamme som er defekt i UDP-glukosesyntese, kan ikke initiere xanthan-biosyntese og bør derfor ikke underkastes denne dødelighet. Derfor bør plasmider som bærer de dødelige innsetningsmutasjoner, lett la seg overføre inn i og opprettholdes av slike dobbeltmutanter. Dersom dette viste seg å være tilfelle, kunne man identifisere de funksjoner som kodes for ved de "dødelige gener" ved in vitro-analyse av xanthan-biosyntese hvor sukkernukleotidene tilføres eksogent. Det vil være åpenbart for fagfolk at forskjellige modifikasjoner og forandringer kan utføres i fremgangsmåtene og produktene avoppfinnelsen. Det er således meningen at den foreliggende oppfinnelse skal dekke modifikasjoner og variasjoner avoppfinnelsen, forutsatt at de faller innenfor området av de tilhørende krav og deres ekvivalenter.

Claims

1. Rekombinant-DNA-mediert fremgangsmåte til produksjon av et xanthan-polysakkarid eller xanthan-variant-polysakkarid,karakterisert vedat den omfatter: (a) fremstilling av en DNA-sekvens som omfatter et DNA-innskudd som inneholdt i plasmidet pRK290-H336, deponert under ATCC 67049 (i E. coli LE392) eller redundante eller degenererte variasjoner derav og koder en xanthan polymerase og en eller flere enzymer valgt fra gruppen som består av transferase I, transferase II, transferase III, transferase IV, transferase V, ketalase og acetylase, eller en DNA-sekvens som koder for en del av en av de ovennevnte enzymer derav med samme biologiske effekt; (b) kloning av den isolerte DNA-sekvens i minst en vektor som kan overføres inn i og replikeres i en vertsmikroorganisme, idet en slik vektor inneholder elementer for ekspresjon av de biosyntetiske enzymer som kodes av den isolerte DNA-sekvens; (c) overføring av vektoren som inneholder den isolerte DNA-sekvens inn i en vertsmikroorganisme forskjellig fra Xanthomonas som kan produsere xanthan-polysakkarid eller xanthan-variant-polysakkarid under styring av den isolerte DNA-sekvens; (d) dyrking av vertsmikroorganismen under betingelser som er egnet for opprettholdelse av vektoren og syntese av xanthan-polysakkaridet eller xanthan-variant-polysakkarid; og (e) høsting av xanthan-polysakkaridet eller xanthan-variant-polysakkarid; eventuelt at den minst én vektor ytterligere omfatter minst én av de isolerte DNA-sekvenser som koder for de enzymer som styrer syntesen av sukkernukleotider, idet de nevnte sukkernukleotider velges fra gruppen bestående av UDP-glukose, UDP-glukuronsyre og GDP-mannose.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat det polysakkarid som skal produseres, er xanthangummi.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat det polysakkarid som skal produseres, er polytrimer.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat det polysakkarid som skal produseres, er ikke-acetylert polytrimer.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat det polysakkarid som skal produseres, er polytetramer.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat det polysakkarid som skal produseres, er ikke-acetylert polytetramer.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat det polysakkarid som skal produseres, er ikke-pyruvylert xanthangummi.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat det polysakkarid som skal produseres, er ikke-acetylert xanthangummi.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat det polysakkarid som skal produseres, er ikke-acetylert og ikke-pyruvylert xanthangummi.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat den minst én vektor omfatter en vektor valgt fra gruppen bestående av pRK290-H336 og pX209.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat verten kan produsere det nevnte polysakkarid ved høye syntetiske hastigheter.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat verten kan produsere det nevnte polysakkarid ved høy temperatur.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert vedat verten kan produsere det nevnte polysakkarid ved en temperatur høyere enn 30°C.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat verten kan produsere det nevnte polysakkarid under anaerobe betingelser.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat verten er en denitrifikasjonsbakterie.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 15, karakterisert vedat den nevnte vert velges fra bakterier av slekten Clostridium.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat verten velges fra gruppen bestående av Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia. Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas fluorescens. Pseudomonas stutzeri. Escherichia coli og Enterobacter cloacae.

18. Plasmid, karakterisert vedat det er plasmidet pX209, deponert i E. coli LE392 (TX209) under aksesjonsnummer ATCC 67051.

19. Plasmid, karakterisert vedat det er plasmidet pRK290-H336, deponert i E. coli LE392 (pRK290-H336) under aksesjonsnummer ATCC 67049.

20. Mikroorganisme, karakterisert vedat den tilhører stammen E. coli LE392 (TX209) og innbefatter plasmidet i henhold til krav 19.

21. Mikroorganisme, karakterisert vedat den tilhører stammen E. coli LE392 (pRK290-H336) og innbefatter plasmidet i henhold til krav 20.