JPH11235191A - 細胞の遺伝的集団において所望の組換え遺伝子を維持する方法 - Google Patents

細胞の遺伝的集団において所望の組換え遺伝子を維持する方法

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JPH11235191A
JPH11235191A JP10358165A JP35816598A JPH11235191A JP H11235191 A JPH11235191 A JP H11235191A JP 10358165 A JP10358165 A JP 10358165A JP 35816598 A JP35816598 A JP 35816598A JP H11235191 A JPH11235191 A JP H11235191A
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asd
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enzyme
plasmid
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Iii Roy Curtiss
カーティス ザ サード レイ
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University of Washington
Washington University in St Louis WUSTL
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝的に安定な集団において維持され得る平
衡致死である、所望の遺伝子産物を発現するのに有用
な、遺伝的に操作された微生物を提供すること。 【解決手段】 ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の生合成
における工程を触媒する酵素１を欠くことに起因する表
現型を有する細菌株を補完するに有用な組換えプラスミ
ドであって、ＤＡＰの生合成において酵素１と同じ工程
を触媒する酵素２をコードする第１の組換え遺伝子を含
み、そして所望の産物をコードする第２の組換え遺伝子
が挿入され得る制限酵素部位を含む、組換えプラスミ
ド。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ワクチンおよび組
換えＤＮＡ発現産物を調製するための材料および方法論
に関する。さらに詳細には、所望の遺伝子産物を発現す
るのに有用な、遺伝的に操作された微生物に関し、この
微生物は、遺伝的に安定な集団において維持され得る平
衡致死であるという理由から、所望の遺伝子産物を発現
するのに有用である。
【０００２】引用文献 ＡｍａｎｎおよびＢｒｏｓｉｕｓ（１９８５）、Ｇｅｎ
ｅ ４０：１９３ Ｂａｃｈｍａｎｎｚ、ＧＥＮＥＴＩＣ ＭＡＰＳ １９
８７ （Ｓ．Ｊ． Ｏ’Ｂｒｉｅｎ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）１７
８−１８４頁 Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｔ．、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第４版、Ｃ．Ｖ．Ｍｏｓｂｙ Ｃ
ｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ（１９８３） Ｂｕｃｈａｎａｎら（１９８７）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍ
ｍｕｎ． ５５：１０００ Ｂｕｘｔｏｎら（１９８０）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ． １２０：２８３ ＣａｒｄｉｎｅａｕおよびＣｕｒｔｉｓｓ（１９８
７）、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ． ２６２：３３４４ Ｃｕｒｔｉｓｓら（１９６５）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ． ８９：２８ Ｃｕｒｔｉｓｓら（１９８２）、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｓ．Ｍｉｔｓｕｈａ
ｓｈｉ編）第３巻、１５−２７頁 ＣｕｒｔｉｓｓおよびＫｅｌｌｙ（１９８７）、Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍ． ５５：３０３５ Ｄａｖｉｓ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ、Ｅｉｓｅｎ、Ｇｉｎｓ
ｂｅｒｇおよびＷｏｏｄ、ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ
（Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ） Ｄａｖｉｓ、ＢｏｔｓｔｅｉｎおよびＲｏｔｈ、ＡＤＶ
ＡＮＣＥＤ ＢＡＣＴＥＲＩＡＬ ＧＥＮＥＴＩＣＳ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ） Ｄｅａｎ（１９８１）、Ｇｅｎｅ １５：１９０ ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．
Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５） Ｄｕｌら（１９７３）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １
１５：１２１２ Ｇｕｙｅｒ（１９８３）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．
１０１：３６２ Ｊａｇｕｓｚｔｙｎ−Ｋｒｙｎｉｃｋａら（１９８
２）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １２８：１
１３５ Ｋａｈｎら（１９７９）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ ６８：２６８ Ｋｌｅｃｋｎｅｒら（１９７７）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ． １１６：１２５ Ｌｕｇｔｅｎｂｅｒｇら（１９７３）、Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ． １１３：９６ Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏ
ｏｋ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡ
ＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１９８
２） ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．） Ｍａｒｑｕｅｚら（１９８５）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ． １６４：３７９ Ｍｉｌｌｅｒ（１９７２）、ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＳ
ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ） Ｍｉｙａｋａら（１９７２）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ． １１２：９５０ Ｎａｋａｙａｍａら（１９８８）、Ｂｉｏｔｅｃｈ．
６：６９３ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯ
Ｎ （Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎ
ｓ編、１９８４） ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ
（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４） Ｐｅｒｂａｌ、Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ
ＴＯ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ（１９８
４） ＳａｎｄｅｒｓｏｎおよびＲｏｔｈ、ＧＥＮＥＴＩＣ
ＭＡＰＳ １９８７（Ｓ．Ｊ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ編、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）１５５−１７７頁 ＳｃｈｌｅｉｆｅｒおよびＫａｎｄｌｅｒ（１９７
２）、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ． ３６：４０７ Ｓｈｅｐａｒｄら（１９８０）、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｌｅｐ
ｒ． ４８：３７１ Ｕｍｂａｒｇｅｒ（１９７８）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ． ４７：５３３ ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ ＳＵＲＶＥＹ ＯＦ ＭＯＬＥＣ
ＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ ＶＥＣＴＯＲＳ ＡＮＤ
ＴＨＥＩＲ ＵＳＥＳ（Ｒ．Ｌ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚお
よびＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ編、１９８７、Ｂｕｔｔ
ｅｒｗｏｒｔｈｓ）； Ｗｉｊｓｍａｎ（１９７２ａ）、Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．
２０：２６９ Ｗｉｊｓｍａｎ（１９７２ｂ）、Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．
２０：６５ 米国特許第４,１９０,４９５号
【０００３】
【従来の技術】遺伝的に操作された微生物は有用性およ
び重要性が広い。たとえば、それらは外来のタンパクを
生産するために利用され得、そしてそれゆえに、インタ
ーフェロン、インシュリン、生長ホルモン等の生産物の
合成のために工業的に利用され得る。それらはまた、免
疫応答をひきおこすワクチンとして利用され得る。さら
に、それらは環境中に放出され、環境に存在する汚染物
を分解し、あるいはさらに農業上重要な作物を悩ます害
虫を殺し得る。しかし、遺伝的に操作された微生物は、
しばしば利益をもたらさない遺伝子産物を合成するに違
いないし、組換え体タンパクの高いレベルの発現は、微
生物にとって有害であり得る。このように、遺伝的に操
作された微生物は、クローン化された遺伝子産物を生産
しない同じタイプの微生物と比べて選択的に不利であり
得る。その結果、所望の遺伝子産物を特徴づけているＤ
ＮＡ配列を失った自然発生的な分離個体により遺伝的に
操作された微生物の集団が、ただちに過密なものとな
る。これは、微生物が発酵槽中、土壌中、植物上、ある
いは動物中で増殖する場合にも起こる。
【０００４】細菌の集団に選択圧を与える１つの方法
は、所望のポリペプチドをコードしている組換え遺伝子
を、抗生物質耐性をコードしている遺伝子をも含むプラ
スミドに挿入する方法である。現在使用されているほと
んどのクローニングベクターは抗生物質耐性を特定して
いる１またはそれ以上の遺伝子を有する。それゆえに、
組換えプラスミドを失っているこれらの細菌を殺すため
に、遺伝的に操作された微生物の増殖のための培養培地
に抗生物質が加えられ得る。この実施はいくつかの欠点
を有する。ます第一に、構成物質を増殖培地に加えるこ
とは高くつくことである。第二に、抗生物質耐性はしば
しば、薬剤を不活化させる酵素の合成に基づいているた
め、薬剤耐性の遺伝子の消失後、多くの細胞世代にわた
って細胞は表現型では薬剤耐性のままである。このこと
は、所望の組換えＤＮＡの生産物を特定する遺伝子と関
連がある。第三に、クローン化された抗生物質耐性遺伝
子が、所望の生産物を発現する遺伝子と隣接していなけ
れば、後者のＤＮＡ配列は、抗生物質耐性を消失するこ
となく、非正統的組換えにより除かれる。その結果とし
て、抗生物質に耐性ではあるが、所望の生産物を合成す
る能力を欠く細菌が得られる。第四に、遺伝的に操作さ
れた細菌が生ワクチンとして使用される場合には、食品
医薬品局は抗生物質耐性を発現する菌株を承認すること
を避けてきた。
【０００５】遺伝的に操作された微生物中で組換えプラ
スミドおよび/またはクローン化されたプラスミドを維
持するための抗生物質耐性に代わるものは、重大な生合
成の酵素が欠損した変異細菌株を用いることであり、そ
して、プラスミドクローニングベクター上に、その酵素
のための野生型の遺伝子を供給することである。Ｋａｈ
ｎら（１９７９）およびＤｅａｎ（１９８１）。残念な
ことに、これは多くの状況下において実践的ではない。
アミノ酸、プリン、ピリミジン、ビタミンの生合成に包
含される酵素が欠失している変異体の使用は、これらの
変異体の増殖をしばしば妨げない。なぜなら、増殖に必
要とされる経路の最終産物が、しばしば環境から供給さ
れるためである。たとえば、培養槽での組換え生物の生
長のために使用される安価な培地は、しばしばこれらの
最終産物を含んでいる。さらに、特に生ワクチンの場合
には、最終産物はワクチンを接種された宿主によりイン
ビボで供給され得る。
【０００６】プラスミド上にクローン化された遺伝子を
有する遺伝的に操作された微生物の遺伝的な不安定さの
問題は、微生物の染色体にクローン化された遺伝子を組
込むことにより軽減され得ると示唆されてきた。この示
唆には少なくとも１つの欠点がある。もし、プラスミド
上の外来のクローン化された遺伝子配列が非正統的組換
えにより消失し得るならば、クローン化された遺伝子
が、細菌の染色体に組込まれた時にもまた同じタイプの
組換えがおこり得る。すなわち、非正統的組換えにより
ＤＮＡ配列の欠失につながるような構造的および酵素的
な事柄は、ＤＮＡ配列がプラスミド上に存在しようが細
菌の染色体の組込まれた部分であろうが、基本的には類
似している。さらに、組換えＤＮＡの染色体への組込み
により、プラスミド上にそれが存在するときの潜在的な
利点の多くが達成される。たとえば、クローン化された
遺伝子を含んでいるプラスミドのプラスミドコピー数の
制御により、生産物の収量を増加させるための機構が提
供される。それにより、高いレベルの発現力が増殖周期
のより有害性の少ない時期におこるように生産物の発現
を一時的に制御するための機構も提供される。
【０００７】すべての細菌は形状と硬さを与える細胞壁
のペプチドグリカン層を持っている。ペプチドグリカン
は、ムラミン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを繰り返し
単位とする重合体からできており、短いペプチドにより
架橋されている。すべてのグラム陰性細菌と、マイコバ
クテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびユー
バクテリアのノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）種とにお
いては、そのペプチドはＬ−アラニン、Ｄ−グルタミン
酸、メソジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）およびＤ−アラ
ニンから構成される。ほとんどのグラム陽性微生物で
は、ＤＡＰがその脱炭酸された産物であるＬ−リシンで
おきかえられている。
【０００８】ＤＡＰは、β−アスパラギン酸セミアルデ
ヒドから６つの酵素的工程を経て合成され、このβ−ア
スパラギン酸セミアルデヒドは、Ｌ−アスパラギン酸か
ら２つの工程を経て合成される。第１工程では、Ｌ−ア
スパラギン酸は、いくつか（通常は３つ）のβ−アスパ
ラギン酸キナーゼの１つによりリン酸化される。このβ
−アスパラギン酸キナーゼはいくつか（通常は３つ）の
別々の遺伝子によりコードされており、その遺伝子は、
究極の最終産物であるＬ−スレオニン、Ｌ−メチオニン
およびＬ−リシンによる遺伝子産物の抑制および/また
はフィードバック阻害により、独立して調節されてい
る。β−アスパートホスフェートは、ａｓｄ遺伝子の生
産物であるβ−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼによりβ−アスパラギン酸セミアルデヒドに、
１工程で変換される。ａｓｄ遺伝子に点突然変異あるい
は欠失がおこった変異体およびβ−セミアルデヒドをＤ
ＡＰに変換する酵素を特定している６つの遺伝子のいく
つかに変異がおこった変異体は、すべての培地において
ＤＡＰを必ず必要とする。ＤＡＰ要求性突然変異体がＤ
ＡＰを除かれるとＤＡＰがないことにより死滅し、その
内容物を放出しながら溶解する。
【０００９】細菌株にａｓｄ、従ってｄａｐの変異を包
含させることにより生物的封じ込めをおこなうことがで
きる。なぜなら、そのような変異株は、注意深く制御さ
れた実験室の環境以外の環境では生きのこることができ
ないからである。この基本原理は米国特許第４,１９０,
４９５号に広範囲にわたり記載されている。
【００１０】Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎ
ｓ ＰＳ１４（ＵＡＢ６２）由来のβ−アスパラギン酸
セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの遺伝子はクローン化
され、Ｅ．ｃｏｌｉのａｓｄ変異体で発現されている。
Ｊａｇｕｓｚｔｙｎ−Ｋｒｙｎｉｃｋａら（１９８
２）；Ｃｕｒｔｉｓｓら（１９８２）。次いで、Ｓ．Ｍ
ｕｔａｎｓ ａｓｄ遺伝子が配列決定された。Ｃａｒｄ
ｉｎｅａｕおよびＣｕｒｔｉｓｓ（１９８７）。
【００１１】グラム陽性微生物およびグラム陰性細菌で
は、ムラミン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを繰り返し
単位とする重合体を架橋しているペプチドは、Ｄ−アラ
ニンを含んでいる。Ｄ−アラニンはａｌｒ遺伝子（Ｅ．
ｃｏｌｉ）またはｄａｌ遺伝子（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）の産物であるアラニンラセマーゼによりＬ−アラニ
ンから合成され、次いで、ｄｄｌ遺伝子の生産物である
酵素Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼによりＤ−ア
ラニル−Ｄ−アラニンジペプチドに変換される。ひとつ
のムラミン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン重合体に結合
し、ペンタペプチドを形成するＬ−アラニルＤ−グルタ
ミルＤＡＰまたはＬ−アラニル−Ｄ−グルタミル−Ｌリ
シントリペプチドが加えられた後、末端のＤ−アラニン
は、次のムラミン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン重合体
に対する酵素的架橋反応の間に切断される。Ｄ−アラニ
ンを合成する能力またはＤ−アラニル−Ｄ−アラニンを
合成する能力を欠くＥ．ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの変異体は、Ｄ−アラニンまたは
そのジペプチドを欠く培地中では溶解する。アラニンラ
セマーゼを欠くａｌｒ Ｅ．ｃｏｌｉ変異体が単離され
〔Ｗｉｊｓｍａｎ（１９７２ａ）〕、同様に、アラニン
ラセマーゼを欠くＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｄａｌ変異体
もまた単離された〔Ｄｕｌら（１９７３）〕。Ｄ−アラ
ニルＤ−アラニンリガーゼを欠くｄｄｌ変異体がＥ．ｃ
ｏｌｉから単離され〔Ｗｉｊｓｍａｎ（１９７２ｂ）、
Ｍｉｙａｋａｗａら（１９７２）、Ｌｕｇｔｅｎｂｅｒ
ｇら（１９７３）〕、そしてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓから
単離された。ａｓｄとｄａｐ変異の場合には、細菌株中
でａｌｒ（またはｄａｌ）および/またはｄｄｌ変異を
包含することにより生物的封じ込めを行うことができ
る。なぜなら、そのような変異株は、注意深く制御され
た実験室の環境以外の環境で生きのびることができない
からである。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本願発明は、ワクチン
および組換えＤＮＡ発現産物を調製するための材料およ
び方法論を提供する。より具体的には、本願発明は、所
望の遺伝子産物を発現するのに有用な、遺伝的に操作さ
れた微生物を提供する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明の様々な実施態様
は、遺伝的に安定した集団中で維持され得る平衡致死で
あるために、所望の遺伝子産物の発現に有用な遺伝的に
操作された宿主細胞を特徴づける。
【００１４】従って、本発明の１つの局面は、所望の組
換え遺伝子を発現する細胞の遺伝的集団において、該組
換え遺伝子を維持する方法であって、該方法は、次の
ａ、ｂ、ｃおよびｄにより特徴づけられる遺伝子的に操
作された細胞を増殖させることを包含し： ａ）細胞の生存に必須な酵素１をコードする先天的染色
体遺伝子の機能を欠くこと、ここで該酵素１は、細胞壁
の必須構成成分の生合成の工程を触媒する、 ｂ）酵素１の機能性代替物である酵素２をコードする第
１の組換え遺伝子が存在すること、ここで該第１の組換
え遺伝子は、該欠損染色体遺伝子に取って替わることは
できない； ｃ）所望のポリペプチドをコードする第２の組換え遺伝
子が存在すること、 ｄ）該第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子間
の物理的結合、ここで、第１の組換え遺伝子の発現によ
る生産物が存在しない環境に該細胞が存在するときに
は、該第１の組換え遺伝子の欠失により該細胞が溶解す
る；そして、該増殖は、該第１の組換え遺伝子の欠失に
より細胞が溶解するような環境により行なわれる。
【００１５】本発明の他の局面は上述の遺伝的に操作さ
れた細胞である。
【００１６】本発明のさらに他の局面は、細胞壁の必須
構成成分の生合成の工程を触媒する酵素をコードする遺
伝子に変異を有する細菌を創製し単離する方法であっ
て、該細胞壁の成分はＤＡＰから次のａおよびｂを包含
する工程により合成される： ａ）ＤＡＰを含む培地中で親細菌を増殖させ変異させる
こと；および ｂ）栄養要求性の発現を許容するが、ＤＡＰを含みそし
て該細菌内で細胞壁の生合成を妨害する抗生物質を含む
培地を用いて、変異細菌を選択すること。
【００１７】本発明のさらに他の局面は、β−アスパラ
ギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコ
ードする遺伝子に変異を有する細菌を創製し単離する方
法であって、該方法は、 ａ）トランスポゾンを用いて欠失を生じさせることによ
り、細菌の染色体遺伝子中に欠失を導入すること；およ
び ｂ）ａｓｄをコードする遺伝子に欠失を有する変異体
を、ＤＡＰを含む単離培地を用いて単離すること；を包
含する。
【００１８】本発明のさらに他の局面は、ａｓｄ-変異
体を構築するのに有用であり、ａｓｄをコードする遺伝
子に欠失変異を有する組換え細菌株であって、該組換え
細菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ χ２１０８および
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍχ３５２０、およびそれら
の変異体でなる群から選択される。
【００１９】本発明の他の局面は、ａｓｄ-表現型を有
する細菌株を補足するのに有用な組換えプラスミドであ
って、該組換えプラスミドは、ａｓｄをコードする第１
の遺伝子を有し、そして所望の生産物をコードする第２
の組換え遺伝子が挿入され得る制限部位を有する。
【００２０】さらに本発明の他の局面は、ワクチンであ
って、次のａ、ｂ、ｃおよびｄにより特徴づけられる弱
毒性細菌株を含有し： ａ）細胞の生存に必須な酵素１をコードする先天的染色
体遺伝子の機能を欠くこと、ここで該酵素１は、細胞壁
の必須構成成分の生合成の工程を触媒する、 ｂ）酵素１の機能性代替物である酵素２をコードする第
１の組換え遺伝子が存在すること、ここで該第１の組換
え遺伝子は、該欠損染色体遺伝子に取って替わることは
できない、 ｃ）所望のポリペプチドをコードする第２の組換え遺伝
子が存在すること、および ｄ）該第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子間
の物理的結合、ここで、第１の組換え遺伝子の発現によ
る生産物が存在しない環境に該細胞が存在するときに
は、該第１の組換え遺伝子の欠失により該細胞が溶解す
る；そして、該細菌は薬学的に受容され得る賦形剤中に
存在し、そして、該細菌は薬理学的に効果的な量で存在
する。
【００２１】さらに本発明の他の局面は、ｐＹＡ２４８
でなる群から選択されるプラスミド、ポリペプチドをコ
ードする遺伝子を制限酵素部位に挿入することにより、
それらから誘導されるプラスミド；およびそれらの変異
体である。
【００２２】さらに本発明の他の局面は、ｐＹＡ２９２
でなる群から選択されるプラスミド、ポリペプチドをコ
ードする遺伝子を制限酵素部位に挿入することにより、
それらから誘導されるプラスミド；およびそれらの変異
体である。
【００２３】さらに本発明の他の局面は、ＰＹＡ２３２
を有するχ６０９７、χ２９７８、χ３５２０、ＰＹＡ
２４８を有するχ４０７２、χ３００８、χ２１０８お
よびｐＹＡ２９２を有するχ６０９７でなる群から選択
される細菌株である。
【００２４】
【発明の実施の形態】Ａ．定義 「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」などの微
生物を意味する用語は、交換して用いることができ、組
換えベクターの受容体もしくは他の挿入されたＤＮＡの
受容体として用いられ、トランスフェクトされた元の細
胞の子孫を包含する。単一の親細胞の子孫は、ゲノムも
しくは全ＤＮＡの相補体において、偶然もしくは計画的
な変異のために、もとの親細胞と必ずしも完全に同一で
はないことは明らかである。親細胞の子孫は、親細胞に
十分類似していて、関連する性質、例えば必須の酵素を
コードする先天的遺伝子を、所望の遺伝子産物をコード
する構造遺伝子に連結されたクローン化遺伝子で置換す
ることによって特徴づけられる。
【００２５】「制御配列」は、自らが連結されているコ
ード配列の発現を行うのに必要なＤＮＡ配列を意味す
る。一般にこのような制御配列は、プロモーターとリボ
ソーム結合部位を持っている。「制御配列」という用語
は、その存在が発現に必須な全要素を少なくとも含み、
またその存在が有利な付加的要素、例えばオペレーター
類も含むことを意味する。
【００２６】「作用可能に連結された」という用語は、
このように記載された要素が、意図された方式で機能で
きるようにする関係になるような位置に並置されている
ことを意味する。コード配列に「作用可能に連結され
た」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合
する条件下で達成されるような仕方で連結されている。
【００２７】「グラム陰性菌」には、球菌（ｃｏｃｃ
ｉ）、非腸管内桿菌および腸管内桿菌が含まれる。グラ
ム陰性菌の属としては、例えばナイセリア（Ｎｅｉｓｓ
ｅｒｉａ）、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、パス
ツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕ
ｃｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、フラ
ンシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス
（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅ
ｔｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ
（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅ
ｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、ビブリオ
（Ｖｉｂｒｉｏ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ｓ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ア
エロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテ
リウム（Ａｇｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾトバクタ
ー（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、スピリラ（Ｓｐｉｒｉ
ｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、ビブリオ
（Ｖｉｂｒｉｏ）リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、
クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、リケッチア（Ｒｉ
ｃｈｅｔｔｓｉａ）、トリポネーマ（Ｔｒｅｐａｎｅｍ
ａ）およびフソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）が含まれる。
【００２８】「グラム陽性菌」には、球菌、非胞子形成
桿菌および胞子形成桿菌が含まれる。グラム陽性菌の属
には、例えば、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｓ）、バシラス（Ｂａｃｃｉｌｌｕｓ）、クロストリ
ジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウ
ム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリジペロリ
ックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、ラクトバシ
ラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌ
ｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃ
ｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、スタピロコ
ッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプト
コッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレ
プトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）が含まれる。
【００２９】「マイコバクテリア」は、その特有の染色
性に基づいて定義される。すなわち酸性有機溶媒による
脱色に耐性であり、および長連鎖（約６０個の炭素原
子）のミコール酸の存在下での脱色に耐性である。
【００３０】「先天的染色体遺伝子」は、野生型生物体
の染色体に生じる遺伝子であり、「先天的染色体遺伝
子」には、例えばイー・コリもしくはサルモネラ内のア
スパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓ
ｄ）をコードする遺伝子、アラニンラセマーゼをコード
する遺伝子、およびＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガー
ゼをコードする遺伝子がある。先天的遺伝子の他の例は
後で述べる。
【００３１】本願で用いられる「組換え体遺伝子」とい
う用語は、天然のより大きな分子と関連しては見出せな
いような、このより大きなポリヌクレオチド分子中に存
在するポリヌクレオチドの同定可能なセグメントとして
定義される。
【００３２】「細胞壁の必須成分」は、細胞壁のもとの
構造をそのまま維持するのに必要な成分であり、この成
分がない場合には、細胞は浸透に対して感受性になる。
菌株の浸透感受性は、細胞を低張媒体中に置くことによ
り測定できる。そして、細胞が溶解する塩の濃度の測定
は、例えば細胞の懸濁液の濁度の変化により測定するこ
とができる。変異菌株の浸透感受性は、細胞壁の必須成
分を含有する野生型菌株の浸透感受性と比較される。細
胞壁必須成分を欠いている結果、生じる浸透圧に敏感な
細胞の特性は、細胞タンパクの質量が増大したことであ
る。例えば、タンパク合成の結果、細胞が溶解する。細
胞壁必須成分の例としては、グリカン類、特に原核生物
のペプチドグリカン類、真菌類の細胞壁のキチンおよび
植物の細胞壁のセルロースがある。
【００３３】「ペプチドグリカン」は、ほとんどすべて
の原核細胞の細胞壁の代表的な成分であって、細胞壁の
硬さに関与している。ペプチドグリカン類は、アシル化
アミノ糖類と３〜６種のアミノ酸を含有する一群の巨大
分子であり、このヘテロポリマーは、短いペプチドを介
して架橋されたグリカン鎖を含有している。ペプチドグ
リカン類については、ＳｃｈｌｅｉｆｅｒとＫａｎｄｌ
ｅｒが概説している（１９７２）。
【００３４】本願で用いる「ＤＡＰ」という用語は、特
に特別な記載がなければ、ジアミノピメリン酸の立体異
性体、すなわちＬＬ形とメソ形の両者およびその塩類の
両者を意味する。
【００３５】本願で利用される変異菌株の遺伝子記号
は、Ｂａｃｈｍａｎｎ（１９８７）およびＳａｎｄｅｒ
ｓｏｎとＲｏｔｈ（１９８７）が記載したのと同じもの
である。トランスポゾン類、特にＴｎ１０に用いる記号
は、Ｂｕｋｈａｒｉらが述べた規定（１９７７）に従っ
ている。
【００３６】本発明のワクチンで処置される「個体」
は、本願では、すべての脊椎動物を含むと定義される。
例えば、家畜とヒトを含む哺乳類、特に農業上有用な家
禽類を含む色々な種の鳥類が含まれる。さらに軟体動物
などのある種の非脊椎動物は原始的な免疫系を持ってい
るので「個体」に含まれる。
【００３７】本願で用いられる「形質転換」という用語
は、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入を意味
する。「形質転換」は、挿入に用いる方法、例えば直接
取込法、形質導入法もしくは接合法とは無関係である。
外因性ポリヌクレオチドは、プラスミドとして保持され
るか、または宿主のゲノムに組み込まれる。
【００３８】Ｂ．一般説明 本発明の実施は、特に記載がなければ、細胞培養法、分
子生物学、微生物学、組換え体ＤＮＡおよび免疫学の通
常の技術を使用するが、これらは当業者に知られてい
る。このような技術は文献類に充分説明されている〔例
えば以下のものを参照：Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｆｒｉｔｓ
ｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ Ｃ
ＬＯＮＯＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵ
ＡＬ（１９８２）；ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ、第Ｉ巻お
よび第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；
ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ
（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；ＮＵＣＬＥＩＣ
ＡＣＩＤ ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．Ｈａ
ｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；
Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤ
Ｅ ＴＯ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ（１９
８４）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ， ＭＥＴＨＯＤＳ Ｉ
Ｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ， Ｉｎｃ）；ＶＥＣＴＯＲＳ： Ａ ＳＵＲＶＥ
Ｙ ＯＦ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ ＶＥ
ＣＴＯＲＳ ＡＮＤ ＴＨＥＩＲ ＵＳＥＳ（Ｒ．Ｌ．
ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ
編、１９８７、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）；ならびに
Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ、 ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＳ Ｉ
ＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９７２、
Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ）〕。
【００３９】本願に記載した特許、特許出願および刊行
物が、すでに記載したもの、以下に記載するものにかか
わらずすべて本願に援用される。
【００４０】本発明は、一部は、遺伝子が安定した集団
として保持されることができるように宿主細胞に遺伝子
操作をして、該集団の中で、この宿主細胞に所望の組換
え体遺伝子産物を発現させることを目的とする。この集
団の中の宿主細胞は、細胞の生存に必須の酵素であって
細胞壁必須成分の生合成の工程を触媒する酵素をコード
する先天的遺伝子を、特徴的に不活化してきた。さら
に、この先天的遺伝子の機能は、組換え体遺伝子によっ
て取り換えられるが、この組換え体遺伝子は欠陥染色体
遺伝子を取り換えることができず、欠陥染色体の発現が
所望の遺伝子産物の発現に対して作用可能に連結されて
いる。本発明は、適切な宿主細胞である細胞を作製し分
離する方法を提供する。また宿主細胞を形質転換するの
に適し、置換組換え体酵素を含有し、所望のポリペプチ
ドをコードする遺伝子が挿入されたプラスミドを提供す
る。本発明の細胞は、工業用装置、例えば醗酵器中で培
養させることにより、所望のポリペプチド生産に使用す
るのに適している。またこれらの細胞は、ワクチンの成
分、特に生ワクチンの成分である。
【００４１】本発明の宿主細胞の一つの特徴は、その細
胞壁が、ペプチドグリカンもしくはキチンもしくはセル
ロースのような構造高分子を含有していることである。
これらの高分子は、宿主細胞がもとのままの構造を維持
するのに必要なもので、これらの高分子がない場合に
は、細胞が浸透に対して鋭敏になる。したがって、宿主
細胞は、例えばペプチドグリカンを含有する細菌のよう
な原核細胞、または例えばキチンを含有する真菌のよう
な真核細胞、またはセルロースを含有する植物細胞であ
ってもよい。好ましくは、本発明の宿主細胞としては、
細胞壁の一部としてペプチドグリカンを含有する原核細
胞である。このペプチドグリカンは、例えば架橋ペプチ
ドにＤ−アラニンを含有するものでもよい。この種の架
橋部を有する宿主細胞は、当該技術分野で公知である。
本発明の宿主細胞として最も好ましいのは、ペプチドグ
リカンがＤＡＰを含有している原核細胞である。ペプチ
ドグリカンがＤＡＰを含有する宿主細胞の例は、当業者
に公知である〔例えば、ＳｃｈｌｅｉｆｅｒとＫａｎｄ
ｌｅｒ（１９７２）の文献参照〕。このような宿主細胞
には、例えば、恐らくすべてのグラム陰性菌と、バシラ
ス（ｂａｃｉｌｌｉ）、クロストリジウム（ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉａ）、ラクトバシラス（ｌａｃｔｏ−ｂａｃｉ
ｌｌｉ）、コリネバクテリウム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉａ）、プロピオニバクテリウム（ｐｒｏｐｉｏｎ
ｉｂａｃｔｅｒｉａ）、アクチノミセタール（Ａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、ミクソバクテリアレス（Ｍ
ｙｘｏ−ｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、リケッチア（Ｒｉ
ｃｈｅｔｔｓｉａｅ）およびラン藻のいくつかの種のよ
うな多数の生物が含まれる。ペプチドグリカンがＤＡＰ
を含有することを特徴とする方法の概説は、Ｓｃｈｌｅ
ｉｆｅｒとＫａｎｄｌｅｒ（１９７２）の文献に記載さ
れている。
【００４２】本発明の宿主細胞の他の特徴は、この宿主
細胞が、変異させられたために、細胞壁必須成分生合成
の工程を触媒する酵素をコードする先天的染色体遺伝子
が機能しなくなること、すなわち機能性酵素を生成しな
いことである。細胞を生成させて、本発明の宿主細胞を
製造する方法は公知であり、例えば、化学的変異誘発
法、ＵＶ変異誘発法およびトランスポゾンの作用によっ
て誘発させる変異法が含まれる〔例えば、Ｍｉｌｌｅｒ
（１９７２）；Ｄａｖｉｓ、ＢｏｔｓｔｅｉｎおよびＲ
ｏｔｈ；ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙを参照〕。上記遺伝子中に点変異部分を含有す
る宿主細胞は本発明に含まれるが、これらの遺伝子中に
欠失変異部を有する宿主細胞を使用することが好まし
い。なぜならば欠失変異体は一般に復帰しないからであ
る。
【００４３】細胞壁成分とその前駆体の生合成を触媒す
る酵素は公知である。例えば、ペプチドグリカンを合成
する場合、酵素は、架橋ペプチドの挿入を触媒する酵
素、例えばＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ、また
は炭水化物ポリマーを合成する酵素、または前駆体、例
えばＤＡＰを生合成する工程を触媒する酵素でもよい。
図１は、アスパラギン酸系のアミノ酸生合成の過程を示
し、ＤＡＰの両方の立体異性体がメンバーになっている
〔このアミノ酸系の生合成の概説についてはＵｍｂａｒ
ｇｅｒ（１９７８）の文献参照〕。ＤＡＰの生合成の工
程を触媒する酵素をコードする遺伝子の例は、種々の微
生物について当該技術分野で公知であるが〔例えば、Ｇ
ＥＮＥＮＴＩＣ ＭＡＰＳ １９８７ （Ｓ．Ｊ．Ｏ’
ｂｒｉｅｎ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）参照〕例えばエス・ティ
フィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）内のｄａ
ｐＡとｄａｐＢ遺伝子と、例えばイー・コリ中のｄａｐ
Ａ、ｄａｐＢ、ｄａｐＣ、ｄａｐＤおよびｄａｐＥ遺伝
子が含まれる。このタイプのものを例示するその他の酵
素は、すなわちＤＡＰの生合成に必須のものであって、
アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＳ
Ｄ）であり、ａｓｄ遺伝子でコードされている。
【００４４】エンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉａｃａｅ）のメンバーである多様な細菌株
中のａｓｄ遺伝子（δ−ａｓｄ）に欠失変異を導入する
方法と、他のグラム陰性菌とマイコバクテリアのａｓｄ
変異体を分離する方法は、後述の実施例で述べる。表１
〜６に、ａｓｄ変異体とその誘導体を分離するのに用い
るイー・コリＫ−１２とエス・ティフィムリウム（Ｓ．
Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＬＴ−２を列挙するが、列挙
したＡｓｄ-菌株は、後述のトランスポゾン技術を利用
して他の菌株を構築するのに利用できる菌株の例であ
る。またＡｓｄ-菌株は、米国特許第４,１９０,４９５
号にも記載されている。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【表２】
【００４７】
【表３】
【００４８】
【表４】
【００４９】
【表５】
【００５０】
【表６】
【００５１】標準の変異誘発法と変異体の強化プロトコ
ルはａｓｄ変異体の回収に有効ではない。その理由は、
ＤＡＰを必要とする変異体は、ＤＡＰがなければ溶解し
て死ぬからである。したがって先に分離されたａｓｄ変
異体は、間接的に偶然に発見されたか、または何百万も
の潜在的変異体の自然力によるスクリーニングによって
発見されたのである。本発明には、ａｓｄ変異体の選択
的な強化と単離の効率的な方法が含まれる。
【００５２】合成培地において、ａｓｄ変異体は、増殖
するためにＬ−メチオニン、Ｌ−トレオニンおよびＤＡ
Ｐが必要である。Ｌ−メチオオンとＬ−トレニオンに対
する要求はホモセリンにより満たされる。ホモセリンは
メチオニンとトレオニンとの両者の共通の前駆体である
（図１参照）。イー・コリ菌株またはエス・ティフィム
リウム菌株の変異誘発に続いてアンピシリン−シクロセ
リン処理をして栄養素要求型変異体を強化しても、ホモ
セリンに対する単独の要求をもった変異体を回収するこ
とはまれである。Ｃｕｒｔｉｓｓら（１９６５）は、栄
養素要求株を選択するシクロセリン強化法を報告してい
る。本発明は、この方法を改変してアンピシリンに採用
した場合を包含しており、実施例に挙げられている。ホ
モセリンを要求する栄養素要求株がまれにしか単離され
ない理由は、β−アスパラギン酸セミアルデヒドが２つ
の遺伝子にコードされている２つのデヒドロゲナーゼの
いずれかによってホモセリンに変換されるためである。
単一の細胞内で両方の遺伝子を不活化する確率は非常に
小さいので、ホモセリンを必要とする栄養素要求株は、
ランダムスクリーニング法では検出されない。
【００５３】この問題は、変異誘発中の全培地にＤＡＰ
を含有させ、およびアンピシリン−シクロセリン法を用
いて強化もしくは選択することによって、ホモセリンと
ＤＡＰの両方を要求するａｓｄ変異体が回収されるよう
になることが見出されることによって克服される。アン
ピシリンとシクロセリンは、両方ともタンパクを合成で
きる細胞の増殖において細胞壁の合成を阻害するが、タ
ンパクを合成できない栄養素要求型変異体では栄養を要
求しないので影響がない。ａｓｄ変異体菌株のχ３００
８（表３参照）とχ２１０８（表１参照）は、それぞれ
エス・ティフィムリウムとイー・コリの菌株であるが、
この方法を用いて分離された。χ３００８のＡｓｄ-表
現型はａｓｄ遺伝子中の点変異によるものなので、Ａｓ
ｄ+に復帰する頻度はかなり高い。一方、χ２１０８の
Ａｓｄ-表現型は、ａｓｄ遺伝子の欠失によるものであ
るから復帰の頻度は非常に低い。
【００５４】ａｓｄ遺伝子の変異を有する菌株であっ
て、特に望ましい欠失変異を有するものは、トランスポ
ゾンを利用する方法で生成させることができる。トラン
スポゾンは、細胞染色体の多くの点に添加することがで
きる。トランスポゾンの挿入と欠失の特徴についてはＫ
ｌｅｃｋｎｅｒ（１９７７）の文献に概説されている。
例えば、トランスポゾンＴｎ１０は、テトラサイクリン
に対する耐性（およびフザリン酸に対する感受性）を与
えるが、例えばイー・コリとエス・ティフィムリウムを
含む色々な細菌の種にδ−ａｓｄ変異体を生成させるの
に利用できる。
【００５５】イー・コリとエス・ティフィムリウム中に
δ−ａｓｄ変異体を生成させる方法は、後述の実施例で
述べる。まず、細菌の染色体へのランダムＴｎ１０挿入
のライブラリーを、適切なトランスポゾンベクター、例
えばイー・コリに対するλ−ＮＫ５６１〔Ｋｌｅｃｋｎ
ｅｒら（１９７７）〕を、エス・ティフィムリウムのλ
−感受性菌株（その例は表１〜６のχ３３２４である）
に対して用いて作製する。例えば、イー・コリとエス・
ティフィムリウムそれぞれに対する適切な形質導入ファ
ージＰ１Ｌ４もしくはＰ２２ＨＴｉｎｔを適切な種の中
のＴｎ１０ライブラリー上で増殖させ、その種のＡｓｄ
-変異体を形質導入するのに用いて、Ａｓｄ+ Ｔｃr表現
型を有する細菌を選択する。使用できるａｓｄ-菌株の
例は、イー・コリ菌株χ２１０８（表１参照）とエス・
ティフィムリウム菌株χ３００８である（表３参照）。
一重鎖の場合が二重鎖よりも形質導入の確率が高いの
で、ほとんどの形質導入体、例えばχ２９７８（表１参
照）とχ３１０３（表３参照）は、ａｓｄ遺伝子に近接
して連結されたＴｎ１０をもっている。Ｔｎ１０とＴｎ
１０に隣接するＤＮＡ配列との欠失の結果生じるフザリ
ン酸耐性を選択すると、Ｔｎ１０に近接して連結された
ａｓｄ遺伝子のすべてもしくは一部が欠失したδ−ａｓ
ｄ変異体が得られる。エス・ティフィムリウムχ３０２
１菌株内のδ−ａｓｄＡ１変異は、このような方法を用
いてχ３０１３（表３）から単離した。
【００５６】欠失変異も、組換えＤＮＡ技術を用いて細
菌染色体内に導入することができる。したがって、トラ
ンスポゾン変異誘発法でサブクローン化してｐＹＡ２７
５内でのエス・ティフィムリウムの範囲を決定し、次い
でこのエス・ティフィムリウムａｓｄ遺伝子をｐＵＣ１
８内にクローン化してｐＹＡ２７２を得た（図１４）。
この情報に基づいて、ａｓｄ遺伝子をｐＹＡ２７２から
欠失させることができ、得られたプラスミドを、ａｓｄ
+エス・ティフィムリウム菌株に導入すると、相同組換
えがおこって、染色体とプラスミド内に遺伝子操作によ
るδ−ａｓｄの変異を有する細胞が得られる。この培養
物を、次に約４３℃のような上昇させた温度で、低濃度
のノボビオシンの存在下で増殖させ、構成物質の入って
いない媒体上にプレートし、次にアンピシリンを含有す
る培地にレプリカプレートして、アンピリシン耐性を示
すｐＵＣ１８由来の組換え体プラスミドを失ったクロー
ンを同定する。
【００５７】欠失変異体を単離し特性決定した後、欠失
部に隣接してＴｎ１０を置いて、欠失部を他の菌株に移
動させることができるのは有利である。例えば、イー・
コリＫ−１２菌株χ６０９６内のｚｈｆ−２：：Ｔｎ１
０挿入物（表２）は、Ｐ１Ｌ４に対する標準の形質導入
法を用いて形質導入され得、非常に多様な細菌菌株およ
び種に、トランスポゾンを導入することができる。そし
て、これらの細菌菌株および種は、宿主の範囲が広範囲
にわたっている普遍形質導入性ファージＰ１Ｌ４で形質
導入可能である。テトラサイクリン耐性は、フザリン酸
に対する感受性を伴うので、δ−ａｓｄ変異を有する菌
株、例えばχ２９８４（表２）上で増殖したＰ１Ｌ４溶
解物を採取し、ｚｈｆ−２：：Ｔｎ１０を有する受容体
菌株を形質導入することができ、次いでフザリン酸耐性
についてされる。この場合、δ−ａｓｄ変異によってｚ
ｈｆ−２：：Ｔｎ１０が取り換えられる。受容体菌株が
イー・コリＫ−１２と異なる制限挙動をもっている場
合、このような障壁は、受容体菌株を、例えば５〜１０
分間、４５〜５０℃のような簡単な熱ショックに付すこ
とによってなくすことができる。
【００５８】エス・ティフィムリウムの各種菌株のδ−
ａｓｄ変異体を単離するのに類似の方法を用いることが
できる。普遍形質導入性ファージＰ２２ＨＴｉｎｔは、
例えばχ３０１３、χ３５３６またはχ３５３７のよう
な、それぞれｚｈｆ−１：：Ｔｎ１０、ｚｈｆ−４：：
Ｔｎ１０およびｚｈｆ−３：：Ｔｎ１０を有する菌株
（表３〜５参照）上で増殖させることができる。トラン
スポゾンを有するファージは、次に、他の適切な受容体
株を形質導入してテトラサイクリン耐性にするのに利用
される。Ｐ２２ＨＴｉｎｔの溶解物は、δ−ａｓｄ変異
を有する細菌菌株、例えばχ３０２１もしくはχ３６２
８上のファージの増殖が原因であるが、ｚｈｆ：：Ｔｎ
１０挿入物を有する菌株を形質導入するのに用いること
ができる。フザリン酸耐性の変異体が選択される。イー
・コリの場合と同様に、δ−ａｓｄ変異によって、挿入
されたＴｎ１０が取り換えられる。
【００５９】フザリン酸に対する耐性により所望の形質
導入体を選択することによって、ｚｈｆ：：Ｔｎ１０挿
入物を変えてδ−ａｓｄ変異を挿入する形質導入が１０
-4〜１０-5の頻度で起こり、一方、欠失型変異によるＴ
ｎ１０挿入物の自然喪失は約１０-8の頻度で起こること
が示される。したがって所望の菌株を構築する際にδ−
ａｓｄ遺伝子を有するファージによる形質導入を用いる
ことによって、新しい欠失変異体が回復する確率は非常
に小さいけれども正しい遺伝子型を保証する。
【００６０】サルモネラの多くの菌株は、ファージＰ２
２で形質導入できない。ａｓｄ遺伝子に連結された２つ
のＴｎ１０挿入物、すなわち、ｚｈｆ−４：：Ｔｎ１０
に連結された、δ−ａｓｄＡ１３変異とδ−ａｓｄＡ４
変異とを、ｇａｌＥ変異を有するサルモネラ菌株内に入
れた。これらの菌株χ３６２９、χ３６３８、χ３６３
０およびχ３６５６はそれぞれ、ガラクトースの存在下
で増殖させると、正常でなめらかな、リポ多糖のコート
（ＬＰＳ）を有し、Ｐ２２に対して感受性になる。しか
しガラクトースなしで増殖させると、細胞はＬＰＳの側
鎖を欠いたラフなコートを有するようになるが、ガラク
トースなしで増殖させた細胞は、ＰＩＬ４による感染が
可能である。ＰＩＬ４はχ３６２９上で増殖可能であり
（表５）、その溶解物がＰＩＬ４感受性菌株を形質導入
するのに用いられ、その菌株にｚｈｆ−３：：Ｔｎ１０
が挿入される。χ３６３０上で増殖させたＰＩＬ４は、
δ−ａｓｄＡ１３変異をもっていて、Ｔｎ１０を有する
菌株を形質導入するのに用いられ、次いでフザリン酸耐
性細胞が選択される。その結果、新しいサルモネラの種
にδ−ａｓｄＡ１３変異が導入される。代わりに、ＰＩ
Ｌ４をχ３６５６上で増殖させることができ、適切な受
容体がＤＡＰの存在下でＴｃrに形質導入される。この
方法では、δ−ａｓｄＡ４変異は、ｚｈｆ−４：：Ｔｎ
１０に連結されて遺伝される。次にｚｈｆ−４：：Ｔｎ
１０を、χ３３８５（表４）上で増殖させたＰＩＬ４で
形質導入することによって除去することができ、フザリ
ン酸耐性について選択することによって、Ｔｃsに形質
導入するのに用いられる。
【００６１】選択した種もしくは菌株に、利用しうるａ
ｓｄ欠失変異の１つを形質導入することが実行できない
かまたは不可能な場合は、ａｓｄ変異体を単離する前述
の方法を利用することができる。細菌菌株を変異誘発
し、変異体の集積および選択強化をＤＡＰの存在下で行
って、ホモセリンを合成できない変異体を選択して単離
する。ａｓｄ変異を得た後、変異体の復帰頻度を測定し
た。欠失変異が所望の場合、当該技術分野で公知の種々
の方法で実施できるが、最も簡単な方法は、Ｔｎ１０ト
ランスポゾンライブラリーを形質導入で導入し、同時に
起こるＡｓｄ+およびＴｃr発現型を選択することであ
る。一般にＴｎ１０は、ａｓｄ遺伝子に近接して連結さ
れているから、フザリン酸耐性の単離物を選択する場
合、Ｔｎ１０とａｓｄ遺伝子に隣接するＤＮＡとが欠失
するとａｓｄ欠失変異が得られる。このＴｎ１０法では
細菌の種に対して成果が得られない場合は、他のトラン
スポゾンを用いてａｓｄ遺伝子に連結させることができ
る。利用可能なトランスポゾンは当該技術分野で公知で
ある（Ｂｕｈｋａｒｉらの文献参照）。トランスポゾン
−ａｓｄ遺伝子複合体は、公知の遺伝子操作技術を用い
てクローン化することができる。ａｓｄ遺伝子を正確に
欠失した組換え体を作製することができ、欠失したａｓ
ｄ遺伝子は、次に、前述のようにして野生型細菌菌株に
戻すことができる。
【００６２】本発明の宿主細胞のその他の特徴は、２つ
の遺伝子をコードする組換えポリヌクレオチド構造で形
質転換されたということである。第１の組換え遺伝子
は、不活性な先天的遺伝子の酵素活性を機能的に置換す
るポリペプチドをコードする。例えば、Ａｓｄ-イー・
コリ細胞は、Ｓ．ミュータンス由来のａｓｄ遺伝子をコ
ードする組換えポリヌクレオチドの構築で形質転換する
ことができる。Ｓ．ミュータンスａｓｄ遺伝子の産物
が、イー・コリ遺伝子産物を機能的に置換するというこ
とは、Ｃｕｒｔｉｓｓら（１９８２）が報告している。
さらには、Ｓ．ミュータンス遺伝子は、第１の組換え遺
伝子として必要なその他の特性を例示している。すなわ
ち、それは配列の相同性を欠いているため、イー・コリ
遺伝子との組換えは、通常行わない。Ｓ．ミュータンス
ａｓｄ遺伝子配列と、それがイー・コリの配列に対する
相同性を欠いていることは、ＣａｒｄｉｎｅａｕとＣｕ
ｒｔｉｓｓ（１９８７）が報告している。宿主細胞遺伝
子と組換え遺伝子との間に組換えがおこらないというこ
とは、第２の組換え遺伝子に対する連鎖した選択圧を維
持するのに必要である。しかし、所望の受容体菌株由来
のクローン化されたａｓｄ遺伝子を用いると、ａｓｄ+
遺伝子のヌクレオチド配列および/または隣接のヌクレ
オチド配列のいくらかまたはすべてを有する受容体宿主
を提供することができるために、ベクター中のクローン
化されたａｓｄ遺伝子との２重交差組換えが不可能とな
る。この例には、ベクターｐＹＡ２９２中に含まれ、ｐ
ＹＡ２９２に含まれているいずれかおよびすべてのヌク
レオチドが欠けたδ−ａｓｄ菌株によって各種のイー・
コリおよび/またはエス・ティフィムリウム菌株に入れ
た、エス・ティフィムリウムａｓｄ遺伝子を用いること
が含まれている。そして、その系では、欠失がａｓｄ構
造遺伝子については部分的ではあるが、その隣接領域に
まで延びている。ａｓｄ変異を補足できる遺伝子の他の
例は、当該技術分野では公知であり、例えばビー・ラク
トファーメンタム（Ｂ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔａ
ｌ）〔Ｍａｒｑｕｅｚら（１９８５）〕由来のａｓｄ遺
伝子が挙げられる。Ｓ．ミュータンス由来のａｓｄ遺伝
子を含むベクターの構築法は、イー・コリとエス・ティ
フィムリウムのａｓｄ-菌株を形質転換するのに利用す
ることができ、後述の実施例で考察するように、この構
築法にはｐＹＡ２４８とｐＹＬＡ２９２が含まれる。表
１〜６は細菌菌株を示し、表７（実施例１０に示す）
は、プラスミドを構築するための菌株とプラスミドを示
す。
【００６３】ポリヌクレオチド配列中の第２の組換え遺
伝子は、所望のポリペプチド、例えばウイルス、細菌、
真菌もしくは寄生体の抗原、商業上望ましい酵素もしく
はポリペプチドなどの配列をコードし、このコード発現
は、第１遺伝子に連結された制御配列によって決まる。
この連結はベクター中の２つの遺伝子の配向によるもの
であるから、両遺伝子は、例えば同じ制御要素、例えば
同じプロモーターとオペレーターとの制御下にあり得
る。これらの特徴を有するベクターを構築する方法は、
組換えＤＮＡ技術を用いる当該技術分野で公知であり、
後述のワクチンの項で充分に考察する。第２遺伝子がβ
−ガラクトシダーゼをコードするベクターの例である、
Ｓ．ミュータンスの表面タンパク抗原Ａ（ＳｐａＡ）と
エム・レプラエ（Ｍ．ｌｅｐｌａｅ）由来の抗原につい
ては、後の実施例の項で述べる。実施例の項には、Ｓ．
ミュータンスａｓｄ遺伝子もしくはエス・ティフィムリ
ウムａｓｄ遺伝子を含有する発現ベクターが含まれてお
り、これらは、エス・ティフィムリウムとイー・コリ中
のＡｓｄ-表現型を捕捉するのに有用である。
【００６４】本発明のその他の実施態様は、所望のポリ
ペプチドの調製法に本発明の宿主細胞を利用することで
ある。細胞の増殖条件は、選択された宿主細胞の属と菌
株によって決まり、このことは当該技術分野で公知であ
る。しかし、この細胞は、組換え遺伝子の欠失によって
細胞溶解が起こる環境内で増殖する。この組換え遺伝子
の産物は、細胞壁を産生する際に欠失している酵素を機
能的に補足する。例えば、宿主細胞がイー・コリもしく
はエス・ティフィムリウムのａｓｄ-変異体である場
合、第２の組換え遺伝子に操作して連結された組換えａ
ｓｄ遺伝子を含む細胞は、ＤＡＰを欠いているがホモセ
リンもしくはトレオニン、およびメチオニンを含有する
環境内で増殖する。組換えａｓｄ遺伝子が損失すると、
ＤＡＰ-表現型への復帰が起こり、ＤＡＰなしで増殖が
続くと細胞溶解が起こる。
【００６５】本発明のその他の実施態様は、殺虫剤、殺
真菌剤などを産生するために、または毒性汚染物を分解
するために、環境中に放出するのに設計された細菌とし
ての使用についてである。殺虫剤、殺真菌剤、もしくは
毒性廃棄物分解酵素を特定する組換え遺伝子は、細菌の
変異を機能的に補足する産物を産生する組換え遺伝子に
連結される。この細菌は細胞壁産生に必須の酵素の欠落
の原因となる。このことは致死平衡を構成するので、所
望の特性を発現する細菌のみが生存して増殖し、その結
果、殺虫剤、殺真菌剤などまたは毒性廃棄物を分解する
酵素の連続生産を保証する。
【００６６】本発明のその他の実施態様は、変異の致死
平衡配列を、細胞壁の独特な必須の成分の合成をブロッ
クする染色体中に、野生型非相同性遺伝子によって構築
する用途である。この遺伝子は、その欠陥を補足し、医
学、工業もしくは農業に有用な価値のある産物の生産を
特定する遺伝子に連結されている。このような場合、致
死平衡構築物は、発酵技術を用いてたいてい増殖される
であろう。
【００６７】本発明の宿主細胞はまた、生ワクチンの成
分として有用である。この場合、第２組換え遺伝子は、
真菌、細菌、寄生性もしくはウイルス性病原体の抗原を
コードする。生ワクチンは、局所免疫が重要な場合、特
に有用であり、これは第１の防御ラインとなる。しか
し、この場合、宿主細胞が、予防接種される個体に対し
て非病原性であることが必須である。適切な宿主細胞
が、前述のように、例えばａｓｄ変異の挿入とこれにつ
づいて２つの組換え遺伝子を含有するポリヌクレオチド
で形質転換して誘導される細胞の例は、Ｃｕｒｔｉｓｓ
とＫｅｌｌｙ（１９８７）の文献に記載されたδ−ｃｙ
ａδ−ｃｒｐ変異体である。
【００６８】例えば、δ−ｃｙａδ−ｃｒｐ変異の導入
によって、一旦微生物が無発病性にされると、その微生
物は、ワクチンの免疫原性成分として役立てることがで
き、そして微生物に対する免疫性を誘発する。したがっ
て、非病原性を含めて前記の宿主細胞の特性を有する微
生物のいずれもが本発明に用いられる。この微生物とし
ては、サルモネラ、イー・コリ−エス・ティフィムリウ
ムのハイブリッド、シゲラ、エルシニア、パスツレラ、
レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、またはブルセラ
が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい微生物
は、サルモネラ属に属する微生物で、エス．ティフィム
リウム、エス・ティフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、エス・パ
ラティフィ（Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、エス・ガリナ
ルム（Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エス・エンテリテ
ィディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、エス・コレ
レスイス（Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｉｕｓ）、エス・ア
リゾナ（Ｓ．ａｒｉｚｏｎａ）、またはエス・ドゥブリ
ン（Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ）が挙げられる。
【００６９】本発明のその他の実施態様において、ここ
でキャリアー細菌と言われている、病原性微生物の無発
病性誘導体は、選択された抗原を、ＧＡＬＴ、例えば回
腸のパイエル板（Ｐｅｙｅｒ’ｓ ｐａｔｃｈ）に送る
のに利用され得る。サルモネラのようないくつかの属の
細菌は、パイエル板に向かって進むことが知られている
（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．Ｂ．およびＦ．Ｍ．Ｃｏｌｌｉｎ
ｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１３９：１１８９、１９７
４）。エス・ティフィムリウム−イー・コリのハイブリ
ッドも、マウスのパイエル板にコロニーをつくることが
分かっている（Ｈｏｈｍａｎｎ、Ａ．Ｗ．ら、Ｉｎｆｅ
ｃｔ．ａｎｄ Ｉｍｍｎ．、２２：７６３、１９７
８）。これらのキャリアー細菌が病原性生物由来の組換
え遺伝子を含有し発現する場合、その病原体から産生さ
れる抗原性遺伝子産物に対する抗体が誘発される。遺伝
子組換え技術の出現によって、全く独特なワクチンを開
発することが可能である。このワクチンは、特異的抗原
が、病原体からではなくて、その抗原の遺伝子を発現で
きる他の宿主細菌菌株によって産生される。抗原が哺乳
類の宿主の抗原と交差反応して自己免疫の誘発を高める
場合には、組換えＤＮＡ技術を用いて遺伝子を変えて、
影響する交差反応性抗原決定基が産生されないようにす
ることもできる。したがって、組換えＤＮＡ技術は、脊
椎動物の宿主抗原と交差反応し得る物質、または自己免
疫状態を誘発できる物質のいずれもを含有しないワクチ
ンを開発するのに利用することができる。
【００７０】本発明は、局所免疫が重要でこれが防御の
第１のラインになる場合、細菌、真菌、寄生性もしくは
ウイルス性病原体に対して有効なワクチンを開発するた
めに広範囲の応用性をもっていることは明らかである。
いくつかの例として、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒ
ｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）によって起こるペスト肺
炎、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏ
ｎｏｒｒｈｏｅａｅ）によって起こる淋病、トレポネー
マ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕ
ｍ）によって起こる梅毒、およびクラミジア・トラコマ
チス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）
によって起こる性病と眼の感染症を制御するワクチンが
挙げられる。グループＡとグループＢの両者からのスト
レプトコッシー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の種の、
例えば咽喉炎もしくは心臓疾患を起こす種であるナイセ
リア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅ
ｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、マイコプラズマ・ニューモニ
エ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、
へモフィルス・インフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ
ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂ
ｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、マイコバク
テリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウ
ム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａ
ｅ）、ボルデテラ・アビウム（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ａｖｉｕｍ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、ストレプトコッ
カス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃ
ｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、パスツレラ・ヘモリチカ
（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、
ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、
シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の種、およびレジオネラ・
ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏ
ｐｈｉｌａ）は、遺伝子を得ることができる本発明の範
囲内に含まれる細菌の追加例である。インフルエンザウ
イルスに対して産生されるようなウイルスワクチンも本
発明に含まれる。ウイルスワクチンとしては、他のウイ
スルであるＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルスに対
するものも調製することができる。これらのウイルスと
しては、例えば、パポバウイルス、アデノウイルス、ヘ
ルペスウイルス、ポックスウイルス、パルボウイルス、
レオウイルス、ピコルナウイルス、ミクソウイルス、パ
ラミクソウイルス、またはレトロウイルスが挙げられ
る。病原性の真菌、原性動物、および寄生体による感染
に対して防御するワクチンも、本発明に期待することが
できる。
【００７１】別の態様において、ワクチンの免疫原性成
分が宿主のアレルゲンである場合、このようなワクチン
は、アレルギー性宿主を特異的に脱感作するよう設計さ
れた暴露養生法（ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｒｅｇｉｍｅｎ）
に利用される。
【００７２】１つの実施態様として、本発明は、病原性
微生物の生存している無発病性誘導体を含有する脊椎動
物の免疫化用ワクチンについて説明し得る。この誘導体
は、機能性のアデニル酸シクラーゼとＡＭＰ受容体タン
パクとを実質的に産生できないが、そのときこの誘導体
は前記動物の病原体である微生物か、または前記動物の
アレルゲンを産生する微生物由来の組換え遺伝子を発現
し得る。
【００７３】さらにもう１つの実施態様においては、本
発明の無発病性微生物は、種々の宿主タンパクの合成の
ためのベクターとして使用され得る。本発明の無発病性
微生物は、宿主に導入された後、この微生物は、ＧＡＬ
Ｔ、腸間膜リンパ節、および脾臓を包含する様々な免疫
適格（担当）構造をトラバース（ｔｒａｖｅｒｓｅ）す
ることができるので、このような微生物は種々の免疫調
節産物を標的とするために使用しうる。従って、免疫調
節タンパクあるいはペプチドをコードする１種またはそ
れ以上の遺伝子が、組換えによって無発病性微生物に導
入され得る。そのため、無発病性微生物が適当な免疫適
格組織中に存在する場合、この微生物は宿主における免
疫反応を抑制、増大あるいは改変させる組換え産物を発
現し得る。免疫調節分子の例には次のものがあげられる
が、これらには限定されない：コロニー刺激因子（マク
ロファージ、顆粒球、あるいはこれらの混合物）、マク
ロファージ・ケモトキシン、マクロファージ抑制因子、
白血球抑制因子、リンホトキシン、芽球化因子、インタ
ーフェロン、およびインターロイキン。
【００７４】本発明のこれらの実施態様における各々の
語句を以下の記述において分析する。
【００７５】ワクチンとは、生存する生物の免疫系を刺
激して、将来の害に対して保護がなされるようにするの
に使用される試薬を意味する。免疫化とは、高いレベル
での抗体および/または細胞の免疫反応が持続すること
を誘発する工程を示す。この反応において、Ｔリンパ球
は生物内において病原体を殺し得る、および/または他
の細胞（例えば、食細胞）を活性化して病原体を殺し得
る。この免疫化は、生物が以前にさらされたことのある
病原体あるいは抗原に対して行われる。「免疫系」とい
う語句は、異物の存在に対する単細胞生物の反応、例え
ば、インターフェロン産生も包括しうるが、本発明にお
いては、この語句は、多細胞生物が、生物の細胞あるい
は生物の細胞外液に侵入する抗原性物質に対して、抗体
を産生する解剖学的特徴および機構に限定される。その
ようにして産生される抗体は、免疫グロブリンＡ、Ｄ、
Ｅ、Ｇ、またはＭのような免疫学的クラスのいずれかに
属し得る。特に興味深いのは、免疫グロブリンＡ（Ｉｇ
Ａ）の産生を刺激するワクチンである。この理由は、Ｉ
ｇＡが温血動物の分泌系によって産生される主要な免疫
グロブリンであるからである。しかし、本発明のワクチ
ンは、ＩｇＡの産生を刺激するものに限定されるわけで
はない。例えば、ここで述べる天然のワクチンは、Ｉｇ
Ａ形成に加えて広範囲の他の免疫反応、例えば細胞性免
疫および体液性免疫を生じさせると考えられる。抗原に
対する免疫反応は充分に検討され、広範に報告されてい
る。免疫学の概観は、Ｂａｒｒｅｔｔ Ｊａｍｅｓ
Ｔ．、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
第４版（Ｃ．Ｖ．Ｍｏｓｂｙ Ｃｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ、ＭＯ、１９８３）に示されている。
【００７６】脊椎動物は、魚類、両生類、は虫類、鳥
類、および哺乳類を含む脊索動物門の主要な門である脊
椎動物亜門のいずれかに属する。前記のすべての類は分
節骨性あるいは軟骨脊柱によって特徴付けられる。すべ
ての脊椎動物は機能性免疫系を有し、抗体を産生するこ
とによって抗原に反応する。従って、すべての脊椎動物
はワクチンに対して反応することができる。ワクチン
は、最も一般的にはヒトまたはイヌのような哺乳類に与
えられる（狂犬病ワクチン）が、ここで述べる性質を有
するワクチンであれば、魚類および鳥類のような商業的
に飼育される他のクラスの脊椎動物に対するワクチン
も、本発明の範囲内である。
【００７７】本発明の実施態様の１つとして、病原性微
生物の無発病性誘導体が使用される。この誘導体は、病
原体あるいはアレルゲンに対する抗体反応を刺激するた
めに使用される遺伝子産物のキャリアーとして、ＧＡＬ
ＴあるいはＢＡＬＴに向かって進む。無発病性とは、そ
の属または種の微生物が全く病原体として機能し得ない
ということを意味するのではなく、使用される特定微生
物が処理される特定動物に関して無発病性であることを
意味している。この微生物は、通常病原性である属、あ
るいはさらに種に属することもあり得るが、無発病性で
ある菌株に属していなければならない。病原性とは、疾
病をひき起こす、あるいは正常な生理的機能を損傷する
能力を有することを意味する。無発病性菌株は、通常そ
の毒性の病原性相対菌株に関連する疾病に完全に適合し
た症状を誘発する能力を持たない。ここで使用される微
生物には、細菌、原生動物、および単細胞真菌が含まれ
る。
【００７８】第１の生物から第２の生物（通常は第１の
生物と遺伝物質を交換しない）に遺伝物質を移入するた
めの技術は、急速に発達している組換えＤＮＡ技術の結
果として、最近広く使用されるようになってきた。本発
明において、１つの生物から第２の生物に、この第２の
生物の生殖により同じ遺伝物質を含む子孫を生じるよう
に、移入された遺伝物質は、組換え遺伝子と称される。
遺伝子という語句は、ここではその最も広い意味で使用
され、遺伝の生物学的単位のいずれもを表す。その組換
え遺伝子は、親生物中に存在していたような完全な遺伝
子である必要はない。この遺伝子は、高分子、例えば機
能性ポリペプチドを産生する能力、またはこの産生を調
節する能力を有していた。必要なのは、その遺伝子が抗
原性産物の産生における誘導装置として使用される鋳型
として働く能力を有することだけである。この抗原性産
物は、親生物中に正確な形状では見出されなかったもの
であってもよい。例えば、１００のアミノ酸残基を含有
するポリペプチド抗原をコードする機能性遺伝子は、キ
ャリアー微生物中に部分的に移入され得る。このため、
宿主細胞の細胞機構によって、７５あるいは１０のアミ
ノ酸残基しか含有しないペプチドが産生される。しかし
ながら、この遺伝子産物が親生物中に存在する類似の抗
原に対して抗体形成を引きおこさせる抗原である場合に
は、その遺伝子は本発明において定義される遺伝子とい
う語句の範囲内であるとみなされる。その代わりに、特
定抗原あるいはその断片のアミノ酸配列が周知であれ
ば、自動遺伝子シンセサイザーなどを用いて、ＤＮＡ断
片あるいはその類似体を化学的に合成し得、そしてこの
ＤＮＡ配列を適当な発現ベクターに導入することが可能
である。スペクトルのもう一方の端にはいくつかの遺伝
子産物をコードするＤＮＡの長い区間があって、その遺
伝子産物の１つまたは全部は、抗原性であり得る。従っ
て、ここで定義し、請求の範囲に記載された遺伝子は、
抗原を産生することのできるいずれかの遺伝子単位であ
る。この遺伝子は、染色体、プラスミド、あるいはウイ
ルス由来のものであってもよい。
【００７９】遺伝子が免疫反応を誘発する上で有効であ
るためには、その遺伝子は発現されなければならない。
遺伝子の発現とは、その遺伝子の構造（ＤＮＡ塩基の配
列）に固有の情報が、遺伝子の位置する細胞の生化学機
構によってＲＮＡ分子、ポリペプチド、あるいは他の生
物学的分子の形状で物理的産物中に形質転換されること
を意味する。このようにして産生された生物学的分子を
遺伝子産物と称する。ここで使用する時の遺伝子産物と
いう語句は、遺伝子の制御下で生じる生化学反応の結果
として産生される生物学的産物のいずれもを示す。遺伝
子産物は、例えばＲＮＡ分子、ペプチド、あるいは、酵
素または遺伝子の初期産物である他の分子の制御下で産
生される産物、すなわち代謝産物であってもよい。例え
ば、遺伝子は最初にリボソームの作用によって酵素内に
翻訳されるＲＮＡ分子の合成を制御し得る。この酵素
は、遺伝子が見出された最初の細胞の外部環境において
グリカンの形成を制御する。このＲＮＡ分子、酵素、お
よびグリカンは、すべて遺伝子産物であり、この語句は
ここで使用される。これらのいずれか、ならびに糖タン
パクおよび多糖類のような多くの他のタイプの遺伝子産
物は、動物の免疫系に導入されると抗原として作用す
る。糖タンパクおよびリポタンパクを含有するタンパク
遺伝子産物は、ワクチン中で抗原として使用するのに好
ましい遺伝子産物である。
【００８０】ワクチンが抗体を産生する上で有効である
ためには、ワクチン接種された動物の抗体産生機構が作
用し始め得るように、抗原性物質が放出されなければな
らない。従って、遺伝子産物の微生物キャリアーが動物
内に導入されなければならない。前述したようにＧＡＬ
ＴおよびＢＡＬＴ細胞の好ましい反応を刺激するために
は、腸または気管支内に微生物あるいは遺伝子産物を直
接導入することが好ましい。例えば、経口投与、胃内挿
管あるいはエアロゾルの形状によって導入される。静
脈、筋肉内、皮下注射、あるいは乳房内、陰茎内または
膣投与のような、他のワクチン投与の方法も可能であ
る。
【００８１】無発病性微生物をキャリアー微生物として
使用し、一旦そのキャリアー微生物が動物中に存在する
場合、その抗原が動物の免疫系にとって有効なものとな
る必要がある。これは、キャリアー微生物が死亡する場
合に達成され得、このため抗原分子が放出される。もち
ろん、溶解しない周縁細胞質の内容物を放出する「漏
出」無発病性変異体の使用も可能である。その代わり、
細胞の死滅前にキャリアー細胞によって外部環境に有効
な抗原の産生を制御する遺伝子が選択され得る。
【００８２】ａｓｄ変異とＡｓｄ+クローニングベクタ
ーの偶発的喪失による無発病性菌株を使用すると、各世
代（実施例参照）の間に約１％の細菌の溶解によって細
胞内容物が放出される。このため、コロニー形成および
病原性抗原を含む、放出された細胞内容物に対しての免
疫反応が刺激される。
【００８３】他の病原体からＧＡＬＴあるいはＢＡＬＴ
に抗原を送達するために病原体を使用することは、もし
かかる病原体が、パイエル板あるいはＢＡＬＴに侵入す
る能力を保持しながら無発病性になり得るという事実が
なければ、不適切であろう。
【００８４】組換え遺伝子が誘導される生物は、ワクチ
ン接種された動物の何らかの病原体、あるいは動物のア
レルゲンまたは他の抗原を産生する微生物であってもよ
い。アレルゲンは、この場合にはアレルゲンに対するワ
クチン接種が行われる動物においてアレルギー反応を生
じさせる物質である。動物のふけや花粉のように、多く
の異なる物質はアレルゲンであり得る。そして、個々の
動物のアレルギー反応は特定アレルゲンのいずれもに対
して異なる。通常アレルギー反応を示す動物において、
アレルゲンに対する耐性を誘発することは可能である。
耐性を誘発する方法は周知であり、この方法は一般には
アレルゲンを漸次増量しながら動物に投与することを包
含する。耐性誘発についてのさらに詳細な解説は、前記
に引用したＢａｒｒｅｔｔのＴｅｘｔｂｏｏｋに示され
ている。最後に、免疫調節遺伝子がベクターによって発
現される場合には、宿主生物自体が遺伝子物質源として
の役割を果たし得る。
【００８５】上記に開示したタイプの生ワクチンの動物
への投与は、公知の方法あるいは標準的方法のいずれか
で実施することができる。それらの方法は、経口摂取、
胃内揮管、あるいは気管支鼻内噴霧を包含する。これら
の方法はすべて、生ワクチンを容易にＧＡＬＴあるいは
ＢＡＬＴ細胞に到達させて、抗体形成を誘発することが
できる。これらの方法は、好ましい投与方法である。静
脈注射のように、キャリアー微生物を動物の血流に到達
させることのできる他の投与方法も許容されうる。静
脈、筋肉あるいは乳房内注射も、後述するように、本発
明の他の実施態様に関して許容される。
【００８６】好ましい投与方法は経口摂取、エアロゾル
噴霧および胃内挿管であるので、好ましいキャリアー微
生物は、ワクチン接種されている動物の腸あるいは気管
支のリンパ上皮構造のいずれかに好んで向かっていく種
に属するものである。これらの菌株は、腸病原性菌株の
遺伝子操作によって産生される、腸病原性菌株の無発病
性誘導体であることが好ましい。パイエル板に向かって
進み、このためＩｇＡの産生を直接刺激する菌株が最も
好ましい。動物においては、これらの菌株には、パイエ
ル板に向かって進むサルモネラの特定菌株およびサルモ
ネラ−イー・コリのハイブリッドが包含される。
【００８７】組換えＤＮＡ技術は、現在、ルーチンワー
クであると考えられるほど十分に周知なものであり、広
く行きわたっている。非常に一般的かつ広い意味で、こ
の方法は、１つの生物の遺伝的物質あるいはより多くの
場合遺伝的物質の一部が、第２の生物に移入されること
からなり、そして移入された遺伝的物質は、移入される
生物の遺伝的物質の不変部分となる（組換わる）。この
方法は通常、最初に、プラスミドまたは親染色体のいず
れかから、親生物からのＤＮＡ小片を得ることからな
る。プラスミド（染色体外因子とも呼ばれる）は、細胞
の染色体から物理的に離れている遺伝性単位である。Ｄ
ＮＡはどんな大きさでもよく、これはしばしば特定の塩
基対部位でＤＮＡ分子を分割するのに作用する制限エン
ドヌクレアーゼ酵素の作用によって得られる。プラスミ
ド、ファージあるいはコスミドベクターに連結して組換
え分子を形成した後、形質転換（カルシウムイオンのよ
うな種々の化学的試薬の存在によって人工的に誘発する
ことができる、外部環境からのむき出しのＤＮＡの取込
み）のような様々な手段によって、その組換え分子が宿
主細胞内に移入され得る。形質導入のようなその他の方
法も適している。この場合、組換えＤＮＡは、形質導入
ファージあるいはコスミドベクターのようなファージ内
にパッケージされている。一旦組換えＤＮＡがキャリア
ー細胞内に入ると、このＤＮＡは分離された小片として
存在し続け得る（一般に、完全伝達されたプラスミドが
これにあたる）か、あるいはこのＤＮＡが宿主細胞の染
色体内に挿入されて、細胞分裂中に染色体によって再生
産され得る。
【００８８】無発病性微生物の誘導体は本発明の範囲内
であると考えられる。誘導体とは、無発病性菌株の変異
体の有性または無性的に誘導される子孫、ならびに、単
数または複数の塩基の置換、欠失、挿入あるいは逆転を
含む変異体を意味し、これらは自然界に存在する病原性
プラスミドを有するかもしくは有しておらず、機能性ア
デニル酸シクラーゼおよびＡＭＰ受容タンパクを産生す
る能力を欠除したままである。例えば、χ４０６２およ
びχ４０６４のような菌株は、ここでは都合のよいマー
カーとして使用されるナリジクス酸耐性を付与するｇｙ
ｒＡ変異を有している。しかしながら、薬剤耐性はワク
チンとして使用する菌株にとって望ましい特性ではな
い。このため、ｇｙｒＡ変異は、近接して連結したＴｎ
１０の遺伝形質について選択し、次にフザリン酸耐性に
ついて選択してＴｎ１０を除去することにより、ｇｙｒ
Ａ+（ナリジクス酸に対する感受性を付与する）遺伝子
を菌株に形質導入することによって、容易に除去するこ
とができる（実施例を参照）。
【００８９】その必要用量は遺伝子産物の抗原性によっ
て変化し、既存のワクチンの代表的な免疫反応を誘発す
るのに十分な量であればよい。ルーチンの実験により必
要量を容易に確立することができる。典型的なワクチン
の初期用量は０.００１〜０.１ｍｌ抗原/ｋｇ体重であ
り、必要に応じて量を増加するか投与回数を増やして所
望する保護レベルを提供することができよう。
【００９０】ワクチンが懸濁あるいは溶解している薬理
学的キャリアーは、接種される動物に対して毒性がな
く、キャリアー生物あるいは抗原性遺伝子産物と適合性
である、いかなる溶媒あるいは固体、あるいは物質中に
被包されたものであり得る。適当な薬理学的キャリアー
には、通常生理食塩溶液および生理的濃度またはそれに
近い他の非毒性食塩溶液のような液体キャリアー、なら
びにタルクあるいはショ糖のようなヒトには使用され
ず、家畜の飼料にも使用されない固体キャリアーが含ま
れる。必要に応じて、抗原性を高めるためにアジュバン
トを添加し得る。ワクチンが気管支投与に使用される場
合、このワクチンはエアロゾルの形状であることが好ま
しい。
【００９１】病原体から誘導した遺伝子産物による免疫
化も、病原体からの組換え遺伝子によって特定される遺
伝子産物を発現するためのキャリアーとして作用する、
病原性微生物の無発病性誘導体による事前免疫化と組み
合わせて使用することができる。そのような非経口的免
疫化により、一旦その病原体誘導の遺伝子産物に対する
分泌免疫系が、病原体誘導の遺伝子産物を発現するキャ
リアー微生物での免疫化により初回免疫されると、その
分泌免疫反応の発現を高めるための追加免疫として作用
し、ＧＡＬＴあるいはＢＡＬＴのリンパ系細胞を刺激す
ることができる。発現を高められた反応は、二次反応、
追加免疫反応、あるいは既往反応として知られ、宿主の
長期的な免疫保護をもたらす。追加免疫の免疫化は、有
用な結果を得るために何度も操り返され得る。
【００９２】上記の開示は本発明を一般的に述べてい
る。より完全な理解が以下の特定の実施例を参照するこ
とにより、得られるであろう。これらの実施例は例証の
みを目的として、ここに示されるものであり、特に記載
がない限り限定するつもりはない。
【００９３】本発明の実施に有用な菌株の寄託 以下の菌株の生物学的に純粋な培養物を、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、
１２３０１ メリーランド州ロックビル、パークローン
ドライブ）に寄託した。生存確認試験の後、示された受
託番号が割り当てられ、必要な費用が支払われた。この
培養物については、特許出願係属中において、米国特許
法施行規則第１.１４条および米国特許法第１２２条の
規定によりその権限を有する局長の決定した者が入手し
得る。この培養物が一般に入手し得るということについ
てのすべての制限は、本願に基づく特許の認可時におい
て、取消し不能なものとして取り除かれる。さらに、指
示された寄託物は、寄託の日から３０年間、もしくは寄
託物に関する最新の請求から５年間または米国特許の有
効期間のいずれか長い方の期間の間、保存される。万一
培養物が生育不能となるか、あるいは偶発的に破壊され
た場合、あるいはプラスミド含有菌株の場合にそのプラ
スミドが喪失した場合には、同じ分類上の種類の生存し
ている培養物と交換される。 菌株 寄託日 ＡＴＣＣ番号 ｐＹＡ２３２含有χ６０９７ １９８７年１０月６日 ６７,５３７ χ２９７８ １９８７年１０月６日 ５３,６７９ χ３５２０ １９８７年１０月６日 ５３,６８１ ｐＹＡ２４８含有χ４０７２ １９８７年１０月６日 ６７,５３８ χ３００８ １９８７年１０月６日 ５３,６８０ χ２１０８ １９８７年１０月６日 ５３,６７８ ｐＹＡ２９２含有χ６０９７ １９８８年９月２６日 ６７,８１３ 以下に述べるのは、本発明の実施例であり、それらは例
証目的のためにのみ示すものであって、本発明の範囲を
限定するものではない。本開示の見地から、特許請求の
範囲内での多くの実施態様が当業者にとって明白であろ
う。
【００９４】
【実施例】１．ａｓｄ-変異体の単離 ＤＡＰの存在下でホモセリンまたはトレオニン、および
メチオニンの栄養素要求性である変異体を単離する。
（生合成経路を図１に示す。β−アスパラギン酸セミア
ルデヒドをホモセリンに転換する能力を持つ２つの異な
るホモセリンデヒドロゲナーゼを特定する２つの遺伝子
がある。二重の変異は極めてまれであるので、すべての
ホモセリン要求変異体はａｓｄ遺伝子における特異的欠
失を生じさせる単一の変異のために、常にＤＡＰも要求
する。ホモセリン要求変異体を選択する工程は、変異誘
発におけるＤＡＰの存在下および選択培地では、ホモセ
リンおよびその産物であるメチオニンとトレオニンの除
去を可能にし、変異体におけるタンパク合成の停止を引
き起こして、この変異体を細胞壁合成を阻害する抗生物
質に対して非感受性にするという発見に基づいている。
これに対して、野生型細胞はタンパク合成を続けるの
で、これらの抗生物質に対して感受性である。
【００９５】原栄養菌株であるイー・コリＫ−１２株、
χ２８９、および野生型原栄養菌株であるエス・ティフ
ィムリウム株、χ３０００のブロス増殖培養物を、エネ
ルギー源として０.５％グルコースを補充した無機塩類
培地を含む別々のフラスコ内に接種する。Ｍｉｌｌｅｒ
（１９７２）がその処方を述べている最小培地のいずれ
かで十分である。通気しながら培養物を約５×１０8細
胞/ｍｌの密度に増殖させる。
【００９６】ａｓｄ-変異体の頻度を高めるために培養
物を変異誘発する。変異誘発は、亜硝酸を用いるような
化学的方法か、あるいは紫外線照射によって行う。どち
らのタイプの手法もＭｉｌｌｅｒ（１９７２）によって
述べられている。あるいは、トランスポゾン誘発性の変
異誘発を使用してもよい。変異誘発のためのトランスポ
ゾン手法はＫｌｅｃｋｎｅｒら（１９７７）が検討して
いる。変異誘発が完了した時、培地にＬ−ホモセリン６
０μｇ/ｍｌおよびメソ−ＤＡＰ５０μｇ/ｍｌを補充す
る。培養中の細胞を通気下で約１０世代増殖させ、全て
の変異細胞が変異遺伝子型に関して同質になり、変異体
の表現型を十分に発現するようになる。各々の変異誘発
された細胞から合計１.０×１０8細胞を、予め湿らせた
滅菌ミリポアフィルター（孔径０.４５ミクロン）上で
の濾過によって採集する。濾過の間、フィルターを乾燥
させないようにする。その後ＤＡＰを含む予め加湿し
た、ゼラチンを含有する緩衝食塩水（ＢＳＧ）で数回洗
浄する。
【００９７】フィルターを取り、各々をメソ−ＤＡＰ５
０μｇ/ｍｌと０.５％グルコースを補充した合成無機塩
類培地２０ｍｌ中に置く。２５０ｍｌエルレンマイヤー
フラスコに入れたこの培養物を回転振盪によって通気し
ながら３７℃でインキュベートする。培養物を、ａｓｄ
-変異体がホモセリン及びその誘導体アミノ酸であるト
レオニンとメチオニンの内部供給を枯渇させるのに十分
な時間、すなわち約１時間増殖させる。この１時間の増
殖の間に、培養物は約５×１０6細胞/ｍｌから約１×１
０7細胞/ｍｌに変化する。野生型細胞が選択工程中に溶
解してトレオニンとメチオニンを放出し、それらが変異
ａｓｄ-細胞におけるタンパク合成の基質として作用し
得るので、細胞をより高い密度まで増殖させてはならな
い。しかしながら、１０7細胞から放出されるアミノ酸
の濃度は、これらの変異体を増殖させるには不十分であ
る。
【００９８】変異体に関しての選択はＤ−サイクロセリ
ンとアンピシリンの存在下で行う。ｐＨ８.０のリン酸
緩衝液中で５０ｍｇ/ｍｌに調製したＤ−サイクロセリ
ン（Ｃｕｒｔｉｓｓら、１９６５）および無菌水中で５
０ｍｇ/ｍｌに調製したアンピシリンを培養物２０ｍｌ
に加え、Ｄ−サイクロセリンとアンピシリンの最終濃度
を各々１００μｇ/ｍｌと５０μｇ/ｍｌにする。培養物
を通気下３７℃で約３時間増殖させる。この時間中、Ｄ
−サイクロセリンとアンピシリンは、増殖細胞において
は細胞壁合成を阻害し、非増殖細胞においては阻害しな
いように相乗的に働く。次に生存細胞を予め湿らせた滅
菌ミリポアフィルター（孔径０.４５ミクロン）上に採
集し、ＤＡＰを含む予め加湿したＢＳＧによって、抗生
物質を含まないように洗浄する。フィルターを、ホモセ
リン、ＤＡＰおよびグルコースを補充した無機塩類培地
２０ｍｌを含むフラスコに移し、回転振盪装置中３７℃
で一晩増殖させる。アンピシリン−サイクロセリン集積
工程は反復することができる。両方の一連の選択工程
後、細菌懸濁液の適当な希釈溶液を、炭素源としてグル
コースを含み、ホモセリンとＤＡＰを補充した無機塩類
培地上、もしくはＤＡＰ５０μｇ/ｍｌを補充した、Ｌ
寒天またはペナセイ（Ｐｅｎｎａｓｓａｙ）寒天の複合
寒天培地上のいずれかにプレーティングする。プレート
あたり１００〜２００コロニーを生じるように培養物の
希釈溶液を選択する。コロニーが直径２〜３ｍｍになる
までプレートをインキュベートする。通常は一晩インキ
ュベートすれば十分である。そして次に、その上ではａ
ｓｄ-変異体が生育しない、ＤＡＰを欠いた寒天培地で
レプリカプレーティングする。マスタープレートでは生
育するがレプリカプレートでは生育しないコロニーを採
取して精製し、ＤＡＰを含む培地に接種して約１０8細
胞/ｍｌまで増殖させる。推定上の変異体を、ＤＡＰと
ホモセリン、あるいはＤＡＰとメチオニンとトレニオン
についての栄養素要求性に関して試験する。さらに、Ｌ
−リシンによって供給することのできないＤＡＰの絶対
要求に関して変異体を試験する。上に述べた工程を用い
て、イー・コリのａｓｄ-変異株χ２１０８（表１）お
よびエス・ティフィムリウムａｓｄ-変異株χ３００８
（表３）を単離する。上記の工程によって誘発され、分
離された変異体は、点変異あるいは欠失変異のいずれか
を含み得る。
【００９９】２．ａｓｄ-変異体の遺伝的安定性の評価 ａｓｄ遺伝子における欠失変異は本質的に非可逆性であ
り、一方点変異は可逆性である。実施例１の工程によっ
て単離した変異体の遺伝的安定性を次のように評価す
る。
【０１００】変異細胞を２０ｍｌの培養物中で増殖さ
せ、約２×１０9細胞/ｍｌの密度にする。培養物を遠心
分離によって約５０倍に濃縮し、希釈しないものと、１
０-1、１０-2、１０-3の希釈溶液の各々１００μｌを寒
天上に、すなわちグルコースを含み、ＤＡＰを欠くペナ
セイまたはＬ寒天あるいは無機塩類寒天上にプレーティ
ングする。１組のプレートを３７℃で２日間インキュベ
ートし、変異体の自然復帰を測定する。他の１組のプレ
ートに約１.５ジュール/ｍ2の紫外線を照射し、次に暗
所で２日間インキュベートして、紫外線誘発の復帰を測
定する；暗所でのインキュベーションは紫外線誘発変異
の光回復を防止する。復帰は、ＤＡＰについて、および
ホモセリンまたはトレオニンとメチオニンについての栄
養素要求性の喪失によって測定する。
【０１０１】上記の工程を用いて、イー・コリのａｓｄ
変異株、χ２１０８が本質的に非可逆性であることが測
定された；従ってこの菌株は欠失変異を含む。これに対
して、エス・ティフィムリウムａｓｄ変異株であるχ３
００８は、その点変異の結果として復帰する。
【０１０２】３．エス・ティフィムリウムにおけるＴｎ
１０挿入物のライブラリーの構築 Ｔｎ１０は９.２ｋｂの大きさであり、従ってそれほど
必須ではないファージ遺伝子が欠失したバクチオリファ
ージトランスポゾンを挿入したベクターにおいてしか適
応できない。その１つの例が、Ｋｌｅｃｋｎｅｒら（１
９７７）が構築したバクテリオファージλＴｎ１０トラ
ンスポゾンベクター、ＮＫ５６１である。エス・ティフ
ィムリウムは天然には、λバクテリオファージに耐性で
ある。しかしながら、エス・ティフィムリウムは、λ付
着のための外膜タンパクレセプターをコードするイー・
コリＫ−１２ｌａｍＢ遺伝子の挿入によって、ならびに
リポ多糖の除去により粗雑な外皮を生じさせるｇａｌＥ
変異の包含によって、感受性を与えられることができ
る。そこで、エス・ティフィムリウムの染色体における
無作為のＴｎ１０挿入物のトランスポゾンライブラリー
は、次の工程を用いて、ＤＢ４６７３あるいはχ３４７
７のいずれかをλ−ＮＫ５６１で感染させることによっ
て調製することができる（両菌株の説明および由来につ
いては表３および４を参照）。
【０１０３】菌株を一晩培養したものを、λブロスある
いはグルコースを欠くが、０.２％マルトースを含むＬ
−ブロス中で増殖させ、ｌａｍＢの発現を誘発する。培
養物が約３×１０8細胞/ｍｌとなった時、λ−ＮＫ５６
１を１.０×１０9ファージ/ｍｌの濃度で、すなわち細
菌あたり約３ファージの感染多重度で添加する。λファ
ージはエス・ティフィムリウムにおいては複製せず、従
って、λ感染は感染したエス・ティフィムリウム細胞を
死亡させないので、イー・コリにおけるよりも高い感染
多重度が使用できる。Ｔｎ１０がλファージゲノムから
エス・ティフィムリウムゲノムの種々の部位に転移する
のに十分な時間、一般に６０〜９０分間、３７℃でイン
キュベータした後、希釈していないものと１０倍に希釈
した懸濁液の一部を、テトラサイクリン１２.５μｇ/ｍ
ｌを含むＬ寒天あるいはペナセイ寒天上に直接プレーテ
ィングする。プレートを３７℃で一晩インキュベート
し、約１０プレートの各々に、ブロス１〜２ｍｌを添加
する。滅菌ガラススプレッダーを用いてコロニーを再懸
濁させる。懸濁液中の細胞を遠心分離によって採集し、
洗浄して、１％ペプトン＋５％グリセロール中に再懸濁
させる。ライブラリーを−７０℃で保存する。
【０１０４】４．Ｔｎ１０トランスポゾンライブラリー
のファージＰ２２溶解産物の調製 エス．ティフィムリウムにおいてトランスポゾンを移動
するには、一般に普遍形質導入型のサルモネラ属ファー
ジ、Ｐ２２を使用することが必要である。実施例３で述
べたように、ＤＢ４６７３およびχ３４７７において構
築されたＴｎ１０トランスポゾンライブラリーに関し
て、高頻度の形質導入ファージ、Ｐ２２ＨＴｉｎｔの溶
解産物を以下のように調製する。
【０１０５】ＤＢ４６７３およびχ３４７７におけるト
ランスポゾンライブラリーを一晩培養したものをルリア
ブロス中で増殖させる。各培養物をルリアブロス中で１
００倍に希釈し、通気下３７℃で２〜３時間増殖させ
て、約３×１０8細胞/ｍｌの指数増殖培養物を得る。Ｐ
２２ＨＴ ｉｎｔを３ファージ/細胞の感染多重度で添
加し、混合物を通気下、回転振盪により３７℃で９０分
間インキュベートする。そのあと、細胞懸濁液に少量の
クロロホルムを添加して、残りの生きている細胞の溶解
および/あるいは死亡を促進する。さらに１０分間、通
気下３７℃でインキュベートした後、溶解産物をソルボ
ール低温遠心分離機において７,０００ＲＰＭで１０分
間遠心分離し、溶解していない細菌と細菌デブリを除去
する。上清を静かに傾瀉し、数滴のクロロホルムを存在
下、４℃で保存する。
【０１０６】５．Ｔｎ１０がａｓｄ遺伝子に近接してい
るエス．ティフィムリウム株の生成および選択 Ｔｎ１０がａｓｄ遺伝子に近接している菌株は、δ−ａ
ｓｄ変異体の調製に有用であり、以下のようにして調製
され、単離され得る。δ−ａｓｄ変異体の生成について
のフローチャートを図２に示す。図中、変異体の生成に
使用され得る菌株を括弧内に示している。
【０１０７】ａｓｄＡ１５点変異を含むエス．ティフィ
ムリウム株、χ３００８を、ＤＡＰ５０μｇ/μｌを含
有するルリアブロス中、３７℃で一晩インキュベートす
る。一晩培養したものを新鮮培地中で１００倍に希釈
し、３×１０8細胞/ｍｌの力価に達するまで（一般に２
〜３時間）インキュベートする。実施例４で述べたよう
に、ＤＢ４６７３あるいはχ３４７７において調製した
Ｔｎ１０ライブラリーを保有するエス．ティフィムリウ
ムに増殖させたＰ２２ＨＴ ｉｎｔを、約０.３の感染
重度（すなわち１.０×１０8ファージ/ｍｌの力価）で
添加する。これを２０分間インキュベートしてファージ
を付着、注入させた後、希釈していない細胞懸濁液、１
０倍希釈および１００倍希釈の細胞懸濁液の１００μｌ
を、ＤＡＰを欠き、テトラサイクリン１２.５μｇ/μｌ
を含むペナセイまたはＬ寒天上のいずれかにプレーティ
ングする。プレートを３７℃で一晩インキュベートす
る。
【０１０８】非常にまれにＴｃrＡｓｄ+形質導入体が認
められる。これらの形質導入体は、２つの独立した事象
のいずれかから生じる。すなわち、Ａｓｄ-のＡｓｄ+へ
の形質導入と別の染色体部位におけるＴｎ１０の形質導
入、あるいは、Ｔｎ１０がａｓｄ+遺伝子に隣接して形
質導入される単一事象である。単一事象は二つの事象よ
りもはるかに頻繁に起こる；従って、大多数のＴｃrＡ
ｓｄ+形質導入体はａｓｄ遺伝子に近接したＴｎ１０を
持つことになる。いくつかのＴｃrＡｓｄ+コロニーを採
取し、コロニーを精製して培養物を調製する。
【０１０９】実施例４中の培養物をＴｃrＡｓｄ+培養物
に置き換えたこと以外は、実施例４で述べた方法を使用
して、Ｐ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物を各々ＴｃrＡｓｄ+形
質導入体上に増殖させる。次に各溶解産物を使用して、
ＤＡＰ５０μｇ/ｍｌを補足したルリアブロス中で増殖
するχ３００８の培養物に形質導入する。形質導入した
菌株を、ＤＡＰを欠くか、あるいはＤＡＰとテトラサイ
クリン１２.５μｇ/ｍｌを含む、いずれかのペナセイ寒
天上にプレーティングする。前者の場合には、Ａｓｄ+
形質導入体が選択される；後者の場合には、Ｔｎ１０を
受け継ぐＴｃr形質導入体について選択が行なわれる。
各々の選択から約５０の形質導入体を採取し、その他の
形質の同時導入に関して評価する。Ｔｎ１０とａｓｄ+
が連結していれば、高頻度のＡｓｄ+形質導入体はテト
ラサイクリン耐性であるはずであり、逆もまた同様であ
る。同時形質導入の頻度はＴｎ１０とａｓｄ+遺伝子と
の距離を評価するために使用できる。
【０１１０】この工程を使用してχ３０１３を単離した
（図２）。χ３０１３はχ３００８のＴｃrＡｓｄ+形質
導入体である（表３参照）。
【０１１１】６．Ｔｎ１０生成δ−ａｓｄ遺伝子を有す
るエス．ティフィムリウム株の生成および単離 細胞へのＴｎ１０の挿入は、フザリン酸感受性ならびに
テトラサイクリン耐性を生じさせる。まれに発生するＴ
ｎ１０を喪失した細胞は、フザリン酸に対して耐性とな
る。Ｔｎ１０の喪失は隣接ＤＮＡにおける欠失を生じさ
せる。従って、ａｓｄ+の近くに挿入されたＴｎ１０の
喪失は、しばしばａｓｄ遺伝子における欠失を生じさせ
る。
【０１１２】ＴｃrＡｓｄ+形質導入体であるχ３０１３
（図２参照）を一晩培養したものを調製し、８〜１０ｍ
ｌ中の細胞を、７,０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し
てペレット化し、Ｌ−ブロス２００μｌ中に懸濁する。
種々の希釈溶液を、ＤＡＰ５０μｇ/ｍｌ、フザリン酸
６μｇ/ｍｌ、および加圧滅菌したクロロテトラサイク
リン１２μｇ/ｍｌを含む栄養寒天培地中にプレーティ
ングする。３７℃で一晩インキュベートした後、単離し
たコロニーを採取し、ＤＡＰおよびフザリン酸を含む培
地上で精製する。精製した菌株から小さな培養物を調製
し、各々を、ＤＡＰ不在下での増殖不能性に関して、お
よびテトラサイクリンに対する感受性に関して試験す
る。
【０１１３】Ｔｎ１０のすべての痕跡が喪失しているこ
と、およびＤＡＰ要求が非可逆性欠失変異によるもので
あることは、ＴｃsＡｓｄ-変異体がＴｃrあるいはＡｓ
ｄ+のいずれかに復帰することができるかどうかを検査
することによって確認される。これは次のようにして達
成され得る。
【０１１４】ＤＡＰを含むＬ−ブロス中の培養物の１０
〜２０ｍｌを通気下で高密度に増殖させ、遠心分離によ
って細胞を５０倍に濃縮し、適当な希釈溶液を、ＤＡＰ
を欠くペナセイ寒天、あるいはＤＡＰとテトラサイクリ
ン１２.５μｇ/ｍｌを含むペナセイ寒天培地の何れかに
プレーティングする。プレートを３７℃で１〜２日間イ
ンキュベートする。Ｔｃ2あるいはＡｓｄ+コロニーが不
在であれば、その菌株にＴｎ１０およびａｓｄ遺伝子配
列の欠失があることの推定証拠である。これらの必要条
件を満たす代表的菌株はχ３０２１である（図２および
表３参照）。
【０１１５】７．δ−ａｓｄ遺伝子に隣接したＴｎ１０
を有するエス・ティフィムリウム株の生成および分離 δ−ａｓｄ遺伝子に隣接するるＴｎ１０を持つ菌株を使
用することによって、欠失を他の菌株内に移動させるこ
とができる。
【０１１６】ＴｃrＡｓｄ+形質導入体の選択の前にχ３
０２１を受容体として使用すること以外は、その菌株を
実施例５に述べたようにして構築する。図２を参照。Ｔ
ｎ１０の挿入部、ｚｈｆ−３：：Ｔｎ１０およびｚｈｆ
−４：：Ｔｎ１０を各々保有する菌株χ３５３７（表
５）およびχ３５３６（表４）をこの方法によって構築
した。
【０１１７】Ｔｎ１０がδ−ａｓｄＡ１変異に結合して
いることを確認した時点で、テトラサイクリン耐性であ
るが、ＤＡＰ要求性を維持している形質導入体を回収す
ることができる。１つの例が菌株χ３５２０（表４）で
あり、これはδ−ａｓｄＡ１変異を有する。
【０１１８】χ３５２０（表４）において増殖させたＰ
２２をχ４０６４（表６）に形質導入した後、ＤＡＰ存
在下でのテトラサイクリン耐性に関して選択し、菌株χ
４０７０（表６）を生成した（図２参照）。
【０１１９】フザリン酸耐性に関する選択によってχ４
０７０からｚｈｆ−４：：Ｔｎ１０を除去すると、Ｔｃ
sａｓｄ-株が生じた。その１つがχ４０７２である。
【０１２０】その代わりに、χ３０００（表３）のよう
なＴｃs原栄養株において増殖させたファージＰ２２Ｈ
Ｔｉｎｔを用いて形質導入し、次いでフザリン酸耐性に
関して選択することにより、トランスポゾンの喪失をひ
き起こすことができる。
【０１２１】上に述べた工程は反復することができ、χ
３５３６およびχ３５３７中に存在するＴｎ１０遺伝子
欠失に関連したａｓｄ遺伝子の新しい欠失が単離でき
る。このようにして単離した、フザリン酸耐性のＴｃs
δ−ａｓｄ変異体株がχ３６２８とχ３６４７である。
【０１２２】８．ａｓｄ遺伝子の欠失およびａｓｄ遺伝
子に連結したＴｎ１０トランスポゾンを有するイー・コ
リ株の単離および特性付け これらの菌株の単離および特性付けの工程は、エス・テ
ィフィムリウムのＡｓｄ-変異体の生成について述べた
工程と同様である。ただし、サプレッサー遺伝子を持た
ない原栄養株χ２８４２を感染させるのにλ−ＮＫ５６
１トランスポゾンベクターを使用する。λベクターは、
ＤＮＡ精製のためのＯおよびＰ遺伝子におけるアンバー
突然変異のため、χ２８４２中で複製することができな
い。従って、Ｔｃr生存菌を産生することのできる唯一
の方法は、λ−ＮＫ５６１ゲノムからイー・コリＫ−１
２染色体へのＴｎ１０の転移によるものである。
【０１２３】Ｔｎ１０ライブラリーを使用して普遍形質
導入型ファージＰ１Ｌ４を増殖させ、次にこのファージ
を使用してχ２６３７（表１）のようなイー・コリ菌株
に形質導入する。ＴｃrおよびＡｓｄ+である形質導入体
を選択する；このタイプの形質導入体の例がχ２９７８
（表１）である。
【０１２４】Ｔｎ１０がδ−ａｓｄ遺伝子に隣接してい
る菌株も単離することができる。例えば、Ｔｎ１０をχ
２６３７中のδ−ａｓｄＡ４変異に隣接挿入して、菌株
χ２９７９（表１）を得た。
【０１２５】χ２９８１（表２）由来のｚｈｆ−２：：
Ｔｎ１０に連結したδ−ａｓｄＡ４変異を、Ｐ１Ｌ４形
質導入によってＪＭ８３（表２）のような他の菌株に移
し、χ６０９６（表２）を産生することができる。その
あと、フザリン酸選択によりＴｎ１０を除外し、新しい
δ−ａｓｄ株を得る。この工程を用いて、χ６０９７
（表２）を単離した。
【０１２６】９．δ−ａｓｄ変異をイー・コリおよびエ
ス・ティフィムリウム菌株に導入する代替手段 ａｓｄ+遺伝子に隣接するＴｎ１０の欠失性喪失に関し
ての選択によって（χ３０２１（表３）においてδ−ａ
ｓｄＡ１変異を精製するのに使用したように）、あるい
はδ−ａｓｄＡ１のような特異的ａｓｄ変異を、ｚｈｆ
−４：：Ｔｎ１０のような近接したＴｎ１０との同時形
質導入により移動させることによって（χ３５２０から
χ４０７０を構築するのに使用したように、表６参
照）、ａｓｄ欠失を産生することに加えて、δ−ａｓｄ
-変異を導入するための第三の方法も可能である。図２
のボックス参照。この方法では、ａｓｄに連結したＴｎ
１０を標的受容体に形質導入し、Ｔｃr形質導入体を単
離する。ａｓｄに連結するＴｎ１０は、ｚｈｆ−１：：
Ｔｎ１０、ｚｈｆ−３：：Ｔｎ１０、あるいはｚｈｆ−
４：：Ｔｎ１０である。Ｔｎ１０を含む新しい菌株を、
δ−ａｓｄ変異を保有する菌株に繁殖させたファージ溶
解産物で形質導入し、ＤＡＰの存在下でフザリン酸耐性
である形質導入体を選択する。このステップで使用する
ファージ溶解産物は、δ−ａｓｄＡ１、あるいはδ−ａ
ｓｄＡ１３、あるいはδ−ａｓｄＡ１４を有する菌株に
おいて増殖させることができる。ブロス増殖培養物中に
は細胞あたりいくつかのＴｎ１０のコピーがある。フザ
リン酸耐性の完全な形質発現の前に、Ｔｎ１０のすべて
のコピーの喪失が必要である。従って、形質導入された
受容菌を、ＤＡＰ、フザリン酸、および加圧滅菌したク
ロロテトラサイクリンを含有する選択寒天培地にプレー
ティングする前に、数世代増殖させなければならない。
しかし、この工程は、極めて能率的であり、１ステップ
で、Ｔｎ１０を、充分に特性付けられた欠失変異に置き
換えることができる。テトラサイクリン耐性を与えるｚ
ｈｆ：：Ｔｎ１０挿入物の形質導入による置換は、Ｔｎ
１０挿入物の自然喪失が約１０-8の頻度で起こるのに対
し、１０-4から１０-5の頻度で発生することを強調して
おかねばならない。従って形質導入後、自然的に発生す
る新しいδ−ａｓｄＡ変異を生じるよりも、特定のδ−
ａｓｄＡ変異を挿入する確率の方が１,０００〜１０,０
００倍高い。
【０１２７】１０．エス．ミュータンス由来のａｓｄ+
遺伝子を含むクローニングベクターの構築 δ−ａｓｄ変異体を含めた、イー・コリおよびエス・テ
ィフィムリウムのＤＡＰ要求Ａｓｄ-変異体は、エス．
ミュータンス由来のａｓｄ+遺伝子を含むプラスミドで
形質転換することにより、Ａｓｄ+表現型に転換するこ
とができる。この遺伝子をち、非相同ポリペプチドをコ
ードする所望の遺伝子を挿入することのできるクローニ
ングベクターは、以下のようにして合成される（図３な
らびに図４ａおよび４ｂ参照）。
【０１２８】特に指示がない限り、以下の構築において
は組換えＤＮＡ技術についての標準的手法、例えばＭａ
ｎｉａｔｉｓ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ
（１９８２）および「ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ」（１９
８２）で述べられているような標準的手法を使用する。
本文中で使用するプラスミドの一部の由来、特性、およ
び遺伝子型を表７に示す。制限酵素についての略語、お
よびＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩについてのＤＮＡリン
カーを表８に示す。
【０１２９】
【表７】
【０１３０】
【表８】
【０１３１】１０．Ａ．ｐＹＡ２３５およびその誘導体
の構築 プラスミドｐＹＡ２３５はエス．ミュータンス由来の誘
導体ａｓｄ+遺伝子を含み、そのＥｃｏＲＩ部位は天然
遺伝子から除去されている。
【０１３２】ｐＹＡ６３１由来のＢｇｌＩＩからＡｖａ
Ｉまでの断片（ＣａｒｄｉｎｅａｕおよびＣｕｒｔｉｓ
ｓ、１９８７）は、ａｓｄ+遺伝子のプロモーター配列
を含めたエス．ミュータンスａｓｄ+遺伝子を含んでお
り、この断片はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を
用いて充填され、ｐＵＣ１８のＨｉｎｃＩＩ部位にクロ
ーン化された。この断片はＴｃr遺伝子も含む。生じる
結果的に得られるプラスミドはｐＹＡ２２０である。逆
方向のａｓｄ遺伝子による構築は不安定である。
【０１３３】Ｔｃr遺伝子の大部分、ならびに制限酵素
についての多くの開裂部位を次のようにしてｐＹＡ２２
０から欠失させた。プラスミドをＳａｍＩで消化し、次
にＢａｌ３１で消化して、クレノウ断片で処理して突出
部を充填し、連結した。得られたプラスミドはｐＹＡ２
２４であった。
【０１３４】ｐＹＡ２２４のａｓｄ遺伝子のＥｃｏＲＩ
部位をＥｃｏＲＩで部分消化して取り除き、次にクレノ
ウ断片で処理して再連結した。得られるプラスミド、ｐ
ＹＡ２２７は、δ−ａｓｄ変異細胞のＡｓｄ-表現型を
補足しない。この処理は４個の塩基の挿入を引き起こ
し、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＩｌｅｕをコードするＴ
ＧＧ、ＡＡＴ、ＴＣＡ、ＡＣＴ配列を、Ｔｒｐ、Ａｓｎ
および翻訳終止シグナルをコードするＴＧＧ、ＡＡＴ、
ＴＡＡ、ＴＴＣ配列に変換する。
【０１３５】ｐＹＡ２２７のａｓｄ-遺伝子を、遺伝子
内での抑制、すなわち正しい読み取り枠を回復する塩基
対の欠失により、ａｓｄ+遺伝子に変換した。ｐＹＡ２
２７を、δ−ａｓｄ変異を有するχ６０９６（表２）に
形質転換した。形質転換体をＤＡＰの存在下で高密度に
増殖させ、ゼラチンを含む緩衝生理食塩水中で濃縮し、
ＤＡＰを欠くＬ寒天プレート上でプレーティングした。
Ａｓｄ+であるコロニーは１０-9の頻度で発生したが、
これらのコロニーはＥｃｏＲＩ部位も回復していた。１
０-10の頻度で生じた１つのコロニーを単離した。この
コロニーはＡｓｄ+であるがＥｃｏＲＩ部位を回復して
いなかった。このコロニーから単離したプラスミドをｐ
ＹＡ２３３と命名した。
【０１３６】ｐＹＡ２３３中に残存するＥｃｏＲＩ部位
をＥｃｏＲＩで消化して除去し、次にクレノウ断片で処
理して再連結した。得られたプラスミド、ｐＹＡ２３５
はＥｃｏＲＩ部位を欠いていた。
【０１３７】ｐＹＡ２３５のａｓｄ遺伝子におけるＢａ
ｍＨＩおよび/あるいはＰｓｔＩ配列も、既知の手法を
使用して除去することができる。
【０１３８】１０．Ｂ．ｐＹＡ２３７の構築 Ｐｔｒｃプロモーター、非相同遺伝子をクローニングす
ることができる制限酵素部位、エス．ミュータンスａｓ
ｄ+遺伝子、およびｒｒｎＢ終止シグナルを含む発現ベ
クターｐＹＡ２３７を次のようにして構築した（図４ａ
および４ｂ参照）。
【０１３９】ｐＫＫ２３３−２プラスミド発現ベクター
（ＡｍａｎｎおよびＢｒｏｓｉｕｓ（１９８５））をＰ
ｓｔＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し
て、連結の前にＳｓｔＩリンカー（表８）を添加した。
生じたプラスミド、ｐＹＡ９９を単離した。
【０１４０】ｐＹＡ９９のＥｃｏＲＩ部位をＢｂｌＩＩ
部位に置換した。ｐＹＡ９９をＥｃｏＲＩで消化し、ク
レノウ断片で充填して、連結の前にＢｇｌＩＩリンカー
（表８）を添加した。生じたプラスミド、ｐＹＡ２２３
を単離した。
【０１４１】ＥｃｏＲＩリンカー、ｄ（ｐＣＣＧＧＡＡ
ＴＴＣＣＧＧ）（表８）を、（クレノウ断片で充填後）
ＮｃｏＩ部位でｐＹＡ２２３に挿入した。生じたプラス
ミド、ｐＹＡ２２８を単離した。ここで、このベクター
のＥｃｏＲＩ部位は、δ−ｇｔｌｌにおけるＥｃｏＲＩ
部位と同じ読み取り枠特異性を有している。
【０１４２】ｐＵＣ８−２のＨａｅＩＩ断片をｐＹＡ２
２８のＳｓｔＩ部位（Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理
した）にクローニングした。プラスミド、ｐＹＡ２２９
を単離した。このプラスミドは、ｌａｃプロモーターお
よびｌａｃＺ（α）をコードする配列を持つ。
【０１４３】ｐＹＡ２２９をＥｃｏＲＩで消化して、ｌ
ａｃプロモーターを含むＥｃｏＲＩ断片を除去した。生
じたプラスミド、ｐＹＡ２３０をＭ８３（表２）に形質
転換した。ｐＹＡ２３０を含む細胞は、β−ガラクトシ
ダーゼについての色素産生Ｘ−ｇａｌ基質を含む寒天培
地上で淡青色であった。
【０１４４】ｐＹＡ２３０のｌａｃＺ（α）を含むＨｉ
ｎｄＩＩＩ断片を、ｐＹＡ２３５（実施例１０．Ａ）由
来のエス．ミュータンスａｓｄ+遺伝子を特定するＨｉ
ｎｄＩＩＩ断片によって置換し、ｐＹＡ２３７を得た。
【０１４５】ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を欠くエ
ス．ミュータンスａｓｄ遺伝子を含み、ＥｃｏＲＩ、Ｂ
ａｍＨＩおよびＰｓｔＩ部位を持たない、ｐＹＡ２３５
の誘導体由来のその他のＨｉｎｄＩＩＩ断片も、ｐＹＡ
２３０のｌａｃＺ（α）を置換するように挿入される。
【０１４６】プラスミドｐＹＡ２３７は、χ６０９７/
ｐＹＡ２３２およびχ６０６０（表７参照）において安
定に保持されるが、χ６０９６およびＬＥ３９２におい
ては不安定である。
【０１４７】１０．Ｃ．ｐＹＡ２４８の構築 クローニングベクターｐＹＡ２４８は、ＥｃｏＲＩ、Ｓ
ｍａＩ、ＳｐｈＩ、およびＳａｌＩ制限酵素を用いて、
クローニングしたＤＮＡ断片の挿入を可能にする。これ
を次のようにして構築した。
【０１４８】ｐ１５Ａレプリコンは、全体が１.０ｋｂ
ＨｉｎｃＩＩ断片上に含まれている。この断片を、Ｂｇ
ｌＩＩリンカーを使用して、ＰｔｒｃＭＣＳ ａｓｄ+
ｒｒｎＢ配列を含む、ｐＹＡ２３７（図４ａおよび４
ｂ）由来のＳｓｐＩ断片と連結した。得られたプラスミ
ドは、３.０ｋｂのクローニングベクター、ｐＹＡ２４
８である。このベクターの重要な特徴を図５に示す。
【０１４９】ａｓｄ遺伝子内のＢａｍＨＩおよびＰｓｔ
Ｉ部位を除去することにより（実施例１０．Ａ参照）、
ｐＹＡ２４８の相似クローニングベクターが構築され
る。これらの部位を除去することによって、これらの酵
素をクローニングに使用することができる。
【０１５０】ｐＹＡ２４８におけるＰｔｒｃプロモータ
ーのヌクレオチド配列および多くのクローニング部位を
図６に示す。
【０１５１】１１．ａｓｄ+遺伝子およびβ−ガラクト
シダーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターの構築 ｌａｃＺを含む、ｐＳＧＭＵ３７由来のＳａｌＩ断片
（３.１ｋｂ）をｐＹＡ２４８のＳａｌＩ部位に挿入し
た。得られたプラスミドはｐＹＡ２６０である。ｐＹＡ
２６０の重要な特徴を図７に示す。
【０１５２】１２．エス・ティフィムリウムおよびイー
・コリのａｓｄ-変異体における、β−ガラクトシダー
ゼおよびＡＳＤをコードする遺伝子の発現 Ａｓｄ-株であるχ３１１５、χ４０７２、およびχ２
９８４をｐＹＡ２６０あるいはｐＹＡ２４８で形質転換
し、タンパク合成が可能な条件下で、ＤＡＰを含有しな
い培地において増殖させる。さらに、χ２９８４をｐＹ
Ａ２６０およびｐＹＡ２３２で同時形質転換する。ｐＹ
Ａ２３２の重要な特徴を図８に示す；このプラスミドは
ｌａｃＩqリプレッサーを特定する。
【０１５３】形質転換した細胞と対照細胞によって合成
された産物を、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙを参照）が述べているようにＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析す
る。分離された産物を含むゲルの写真を図９に示す。
【０１５４】ｐＹＡ２６０で形質転換したχ３１１５、
χ４０７２、およびχ２９８４は、Ａｓｄタンパクとβ
−ガラクトシダーゼの両方を合成する。しかしながら、
ｐＹＡ２６０およびｐＹＡ２３２で同時形質転換したχ
２９８４は、ｐＹＡ２３２によって特定されるｌａｃＩ
qリプレッサーのためβ−ガラクトシダーゼを合成しな
い。Ａｓｄタンパクは、ｐＹＡ２４８またはｐＹＡ２６
０のいずれかで形質転換されるすべてのδ−ａｓｄ菌株
により非常に豊富に生産される。
【０１５５】１３．ａｓｄ遺伝子およびｓｐａＡ遺伝子
を含む発現ベクターの構築 主要な抗原決定基を表示したエス．ミュータンスｓｐａ
Ａ遺伝子の構造を図１０に示す。
【０１５６】ｐＹＡ２４８のＤＮＡはＥｃｏＲＩ処理に
よって線形化される。ＤＮＡの両末端をクレノウ断片お
よび細菌性アルカリホスファターゼで処理する。ｓｐａ
Ａ遺伝子を含む、ｐＹＡ１７７のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片をクレノウ断片で処理する。２つのＤＮＡをＴ
4リガーゼで連結してｐＹａ２６１を得る。ＳｐａＡタ
ンパクの主要抗原決定基は主としてＳｓｔＩ断片上に位
置するので（図１０参照）、ｐＹＡ２６１のＳｓｔＩ断
片を精製し、ｐＹＡ２６１の残りの部分に連結して、ｓ
ｐａＡ遺伝子の読み取り枠を保持しながら、その領域の
縦列反復を作製した。ＳｓｔＩ断片の３角縦列反復を含
むプラスミドｐＹＡ２６２を得た。ｐＹＡ２６１および
ｐＹＡ２６２を図１１に示す。
【０１５７】１４．χ４０７２におけるｐＹＡ２６０、
ｐＹＡ２６１およびｐＹＡ２６２のインビトロでの安定
性 χ４０７２におけるｐＹＡ２６０（白丸、黒丸）、ｐＹ
Ａ２６１（白三角、黒三角）、およびｐＹＡ２６２（白
四角、黒四角）のインビトロでの安定性は、ＤＡＰの存
在下（黒い記号）あるいは不在下（白い記号）でＬ−ブ
ロス中で細胞をインキュベートし、子孫世代においてＡ
ｓｄ+ ＬａｃＺ+およびＳｐａ+である細胞の割合を測定
することにより決定される。図１２にその結果を示すよ
うに、ｐＹＡ２６０の喪失の自然発生率は１％/細菌/世
代であり、より小さなプラスミドであるｐＹＡ２６１お
よびｐＹＡ２６２はより安定である。
【０１５８】１５．ｐＹＡ２６１およびｐＹＡ２６２由
来のＳｐａＡ抗原の発現 χ４０７２は、マウスに経口給餌した場合に高度に免疫
原性である、エス・ティフィムリウムの無発病性誘導体
である（ＣｕｒｔｉｓｓおよびＫｅｌｌｙ（１９８７）
およびＮａｋａｙａｍａら（１９８８）参照）。ｐＹＡ
２６１およびｐＹＡ２６２をχ４０７２に形質転換す
る。ＳｐａＡタンパクの産生は、ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動プロフィールのクマシーブルー染色、
ならびに抗ＳｐａＡ血清を使用したウエスタンブロット
分析（図１３参照）の両方により明らかである。δ−ｃ
ｙａ δ−ｃｒｐ菌株がＳｐａＡタンパクを非常に多量
に産生することは明白であり、これは、イー・コリＫ−
１２の組換え菌株および他の無発病性サルモネラ属ワク
チン株によるＳｐａＡタンパクの産生量を上回る。
【０１５９】ＳｐａＡタンパクはエス．ミュータンス細
胞表面上の主たる表面タンパクであり、エス．ミュータ
ンスが歯表面の唾液タンパクに付着するのに必要である
（Ｃｕｒｔｉｓｓ（１９８５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐ
ｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１８：２５３〜２７７）。エ
ス．ミュータンスのＳｐａＡ欠失変異体は無発病性ラッ
トにコロニー形成することができず、従ってう食（ｄｅ
ｎｔａｌ ｃａｒｉｅｓ）を誘発することができない。
それゆえＳｐａＡ抗原のＧＡＬＴへの送達は、エス．ミ
ュータンスのコロニー形成を防ぐ、粘膜の免疫反応を刺
激する。
【０１６０】最後に、ｐＹＡ２６２を含むχ４０７２で
免疫したマウスをショ糖含有の食餌を与え、次に病原性
エス．ミュータンス菌株（ＵＡＢ６６）で攻撃すること
ができる。まず、ＵＡＢ６６が歯にコロニー形成する能
力を調べ、次にう食を防ぐ効果を検討する。コロニー形
成は攻撃後１週間または２週間評価し、一方う食防止は
攻撃後６〜１２週間目に評価する。
【０１６１】１６．χ４０７２におけるｐＹＡ２６２の
インビボでの安定性 ｐＹＡ２６２を含むχ４０７２細胞をＢａｌｂ ｃマウ
スに経口給餌した。これらの細胞はＧａｌｔに付着し、
侵入し、残存する。表９のデータが示すように、マウス
の初期接種後３週間目までに得られたχ４０７２分離株
の１００％がＡｓｄ+であり、ＳｐａＡタンパクを生産
し続けた。このことは、δ−ａｓｄ変異を有するχ４０
７２のような無発病性菌株におけるＡｓｄ+ベクターの
使用は、外因性の選択的圧力のない環境において組換え
遺伝子を安定に保持するようになるという主張を証明し
ている。ｐＹＡ２６２を含有するχ４０７２でこのよう
に免疫したマウスは、ＳｐａＡタンパクに対して、唾液
中の分泌型ＩｇＡおよび血清ＩｇＧを発現し、そして、
後足蹠に注入したＳｐａＡタンパクに対して遅延型過敏
性（ＤＴＨ）を示す。各世代でプラスミドを喪失する、
ｐＹＡ２６１あるいはｐＹＡ２６２を含有するχ４０７
２細胞の小画分は、ＤＡＰ欠乏のために死亡に至り、そ
の細胞内容物を放出して動物宿主の免疫化を促進する。
これは本発明の好ましい特性である。
【０１６２】
【表９】
【０１６３】１７．エス・ティフィムリウムａｓｄ+遺
伝子のクローニングおよびｐＹＡ２７２、ｐＹＡ２７
５、ｐＹＡ２７７の構築 エス・ティフィムリウムＳＲ１１（χ３３０６）ＤＮＡ
のＤＮＡライブラリーを、ＤＮＡおよびクローニングベ
クターを消化する種々の制限酵素を用いて構築した。エ
ス・ティフィムリウムのａｓｄ+遺伝子を、最初にいく
つかのコスミドライブラリーにおいて同定し、ｐＵＣ１
８におけるＰｓｔＩクローニングでこれらの組換え体の
１つを消化し、χ６０９７におけるＡｓｄ+形質転換体
に関して選択して、ｐＹＡ２７２を作製した。ＥｃｏＲ
Ｉによるサブクローニングを実施してｐＹＡ２７５を作
製した（図１４）。Ｔｎ１０００変異誘発はｐＹＡ２７
５内に多くの挿入部をもたらし、これらをχ３６３０に
移入させて、挿入されたａｓｄ遺伝子の不活化に関して
スクリーニングした。変異誘発およびスクリーニングは
基本的にＧｕｙｅｒ（１９８３）が述べているように実
施した。これらの結果に基づき、エス・ティフィムリウ
ムａｓｄ+遺伝子を含む１.７５ｋｂのＥｃｏＲＩからＳ
ｓｔＩまでの断片をｐＵＣ１８にサブクローニングし
て、ｐＹＡ２７７を作製した（図１４）。
【０１６４】１８．ｐＹＡ２８０の構築 エス・ティフィムリウムａｓｄ+遺伝子を有するクロー
ニングベクターの構築を容易にするために、ベクターｐ
ＹＡ２８０（図１５）を構築した。このベクターはエス
・ティフィムリウムａｓｄ+遺伝子をカセットとして含
む。ｐＹＡ２８０は、エス・ティフィムリウムａｓｄ+
遺伝子を含む１.７５ｋｂのＥｃｏＲＩからＰｓｔＩま
での断片をｐＹＡ２７７から取り、取り出した断片を精
製し、ＳｓｔＩ部位で５’側突出を除去し、ＥｃｏＲＩ
部位で３’側突出に充填し、さらに平滑末端連結によっ
てＢｇｌＩＩリンカーを付加することにより構築され
た。得られたＤＮＡ断片を、予めＰｓｔＩ部位がＢｇｌ
ＩＩ部位に転換されている、ｐＵＣ−４Ｋの誘導体にク
ローニングした。得られた組換えベクターがｐＹＡ２８
０であり、これをχ６０９７に導入した。エス・ティフ
ィムリウムａｓｄ+遺伝子は、制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｂ
ａｍＨＩ、ＳａｌＩあるいはＢｇｌＩＩを使用すること
により、ｐＹＡ２８０からカセットとして取り出すこと
ができる。
【０１６５】１９．ｐＹＡ２９２の構築 クローニングベクターｐＹＡ２９２（図１６）を、標準
的ＤＮＡクローニング手法を用いる多くのステップによ
って構築した。ｐＹＡ２９２は、ｒｒｎＢ転写ターミネ
ーターおよびｐＹＡ２４８由来のｐ１５Ａ複製起点（図
５参照）ならびにＨｉｎｄＩＩＩ部位までのＰｔｒｃプ
ロモーター（図６参照）を含む。エス・ティフィムリウ
ムａｓｄ+遺伝子を含む、１.７５ｋｂ ＢｇｌＩＩ断片
をｐＹＡ２８０（図１５）から誘導した。ｐＹＡ２３０
（図４ａおよび４ｂ参照）から誘導した、ｌａｃＺαコ
ード配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ断片を添加することによ
って、ｐＹＡ２９２を含むχ６０９７を、色素産生基質
Ｘ−ｇａｌ含有培地でプレーティングした場合、青色の
発現によって選択することができる。ｐＹＡ２９２内の
いずれか１つの潜在的クローニング部位へＤＮＡ断片を
挿入することによって、通常β−ガラクトシドを加水分
解する能力が喪失し、これらのプレーティング条件下で
白色のコロニーを生成する。しかしながら、このβ−ガ
ラクトシドを加水分解する能力の喪失は、挿入物が、酵
素的に活性なβ−ガラクトシダーゼ融合タンパクの合成
を可能にする場合には生じない。
【０１６６】ｐＹＡ２９２におけるクローニング部位に
は、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、お
よびＰｓｔＩについての制限酵素部位が含まれる。
【０１６７】２０．ａｓｄ+遺伝子およびＭ．レプラ抗
原をコードする遺伝子を含む発現ベクターの構築 ２０．Ａ．λ−ｇｔ１１ライブラリー由来の、Ｍ．レプ
ラ抗原をコードするクローンの単離 λ−ｇｔ１１におけるＭ．レプラ抗原の細胞は、ミコバ
クテリアのポリペプチドがβ−ガラクトシダーゼを含む
融合タンパクとして産生されるように、Ｍ．レプラのＤ
ＮＡを任意に剪断し、ベクターのＥｃｏＲＩ部位にその
ＤＮＡをクローニングすることによって調製される。β
−ガラクトシダーゼライブラリーの発現は、発現がイソ
プロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
によって誘発され得るように、ｌａｃオペロンの制御下
で行われる。
【０１６８】λ−ｇｔ１１：：Ｍ．レプラライブラリー
をイー・コリＹ１０９０にプラーク形成させ、プレート
あたり約５,０００のプラークを生成する。プレートを
４２℃で２時間インキュベートし、バクテリオファージ
を誘発させる。次にプラークにニトロセルロース膜をか
ぶせ、１０ｍＭ ＩＰＴＧに浸漬し、３７℃でさらに２
時間インキュベートする。ニトロセルロース膜を、０.
５％ツイーン８０を含むｐＨ８.０のＴｒｉｓ緩衝液中
で洗浄し、同じ緩衝液中０.２５％ＢＳＡ＋０.２５％ゼ
ラチンでブロックする。使用したＭ．レプラ患者からの
血清はＴｈｏｍａｓ Ｈ．Ｒａｅ博士より寄贈された。
２１人の患者からの血清をプールし、この血清は、イー
・コリＹ１０９０由来の全細胞および音波抽出物に広範
に吸収される。音波抽出物を、臭化シアン活性化セファ
ロース４Ｂに連結させ、そしてニトロセルロース膜にス
ポットして、交叉活性抗体を除去するために使用する。
プラークを含むニトロセルロースフィルターを、ＬＬ血
清の１：１,０００希釈液でインキュベートし、洗浄し
て、次にアルカリホスファターゼに接合した抗ヒト抗体
と共にインキュベートし、ニトロブルーテトラゾリウム
（ＮＢＴ）とブロモクロロインドリルホスフェート（Ｂ
Ｃ１Ｐ）の色素産生基質混合物を使用することによりそ
の反応性を評価する。陽性シグナルを生じるプラークを
同様にして３回単離して精製する。この方法を用いて、
合計２０の組換えクローンを同定する。異なるクローン
は、ＬＬ血清に対する反応強度に関して異なる反応性を
示す。
【０１６９】ライブラリーを、次のものを用いて発現産
物の反応性に関してスクリーニングする：Ｍ．レプラ６
５ｋＤａタンパクに対するモノクローナル抗体（Ｂｕｃ
ｈａｎａｎら（１９８７））；らい腫形態の疾患（Ｌ
Ｌ）および結節形態の疾患（ＴＴ）を有する患者由来の
血清。産物はウエスタンブロット分析によっても同定さ
れる。
【０１７０】２つのクローン、３−２および７−８の免
疫反応性を表１０に示す。
【０１７１】
【表１０】
【０１７２】２０．Ｂ．ａｓｄおよびＭ．レプラ抗原を
コードする遺伝子を含む発現ベクターの構築 実施例２０．Ａ．の中で述べた、λ−ｇｔ１１クローン
３−２および７−８からの精製ＥｃｏＲＩ挿入物を、図
１７および図１８のフローチャートに示すようにして、
ｐＹＡ２４８に挿入する。生じる組換えベクターは、ク
ローン３−２からの挿入物を含むｐＹＡ１０９０および
ｐＹＡ１０９１、そしてクローン７−８からの挿入物を
含むｐＹＡ１０９２およびｐＹＡ１０９３である。これ
らのベクターの特徴およびそれらのＭ．レプラ発現産物
を表１１に示す。ｐＹＡ１０９０およびｐＹＡ１０９２
はＰｔｒｃプロモーターに関して正しい方向性を持ち、
患者の血清と反応するポリペプチドを発現する。
【０１７３】
【表１１】
【０１７４】２１．ｐＹＡ１０９０およびｐＹＡ１０９
２を含むワクチン株の有効性 アデニル酸シクラーゼおよび環状ＡＭＰ受容タンパク質
を欠く欠失変異体であり、さらにａｓｄ内に欠失変異を
含む、無発病性のＳ．ティフィムリウムχ４０７２株
（表６）を、ｐＹＡ１０９０およびｐＹＡ１０９２で形
質転換することにより、ワクチン株が構築される。
【０１７５】Ｍ．レプラはマウスの後足蹠においてゆっ
くり複製する。微生物に対するワクチンヘの免疫反応
は、免疫後に足蹠においてＭ．レプラが複製する能力が
ないことを測定するか、あるいは免疫したマウスの後足
蹠に死滅したＭ．レプラ抽出物を注入した後の遅延型過
敏症（ＤＴＨ）の徴候によってモニターすることができ
る。Ｓｈｅｐａｒｄら（１９８０）。
【０１７６】マウスを、上に述べたように経口で与えた
１０9個の形質転換体−−すなわちＳ．ミュータンスＳ
ｐａＡタンパクを発現するｐＹＡ２６１およびｐＹＡ２
６２を含むχ４０７２についての形質転換体で免疫化す
る。Ｍ．レプラ抗原に対する唾液中のＩｇＡおよび血清
中のＩｇＧを、免疫化後毎週１回定量する。免疫化の１
か月後に、数匹のマウスに適量の死滅Ｍ．レプラ抽出物
を２つの後足蹠のいずれかに注射する。緩衝化生理食塩
水をもう一方の後足蹠に対照として注射する。細胞性免
疫反応を、Ｍ．レプラ抽出物を注射した後、足蹠の腫脹
として発現されるＤＴＨ反応によって検出する。もう１
群の免疫化マウスは、一方の後足蹠に１０4個の生存
Ｍ．レプラ細胞を接種する。６〜９か月後に、顕微鏡検
査あるいはＭ．レプラ特異的ＤＮＡプローブの使用によ
ってＭ．レプラ細胞の力価を測定する。有効な免疫のな
いマウスは約１０6個のＭ．レプラ細胞（接種物中の１
００倍増加）を示すはずである。有効な免疫を有するマ
ウスは、１０4細胞、あるいはＭ．レプラがマクロファ
ージによって死滅し、破壊されていればさらに低い数を
示す。
【０１７７】この工程は、ＬＬおよびＴＴ患者からの血
清中の抗体との反応によって同定される、異なるＭ．レ
プラ抗原を発現する数多くのχ４０７２誘導体について
反復することができる。最後に、抗らいワクチンとして
最良の抗原候補は、アルマジロ、次にヒトにおいて選択
し、評価することができる。
【０１７８】１８．ワクチン株においてナリジクス酸耐
性を与えるｇｙｒＡ１８１６対立遺伝子の除去 ＥＰＡ、ＵＳＤＡおよびＦＤＡは、生ワクチンとして使
用される菌株中に抗生物質耐性についての遺伝子が存在
することを許容しない。ｇｙｒＡ１８１６変異を、マウ
スを使用する実験室の実験においてそのような菌株の生
存を容易に追跡し、定量できる手段として、多くの無発
病性Ｓ．ティフィムリウム変異体に導入した。そのよう
な菌株を認可されうるワクチンとして使用する前に、ｇ
ｙｒＡ１８１６変異を除去することが不可欠である。こ
れは、ｇｙｒＡ+遺伝子との共形質導入によって９５％
結合しているｚｅｈ−４：：Ｔｎ１０を持つＤＢ９０３
１株（表４）を利用することにより実施されうる。
【０１７９】ＤＢ９０３１においてｐ２２ＨＴｉｎｔを
増殖させ、上に述べた方法によって形質導入溶解産物を
作製する。細菌デブリの除去後、溶解産物をクロロホル
ム上４℃で保存する。ＤＢ９０３１に増殖したｐ２２Ｈ
Ｔｉｎｔ溶解産物は、約０.３の感染多重度を用いて、
χ４０７２（表６）のようなｇｙｒＡ１８１６対立遺伝
子を持つ菌株を感染させるために使用することができ
る。χ４０７２は、もちろん、ジアミノピメリン酸を補
足したルリアブロス中での増殖を必要とする。吸着と注
入のために２０分置いた後、適当な希釈液を、ＤＡＰお
よび１２.５μｇ/ｍｌのテトラサイクリンを含むペナセ
イ寒天上にプレートする。これらのプレートを一晩イン
キュベートする。
【０１８０】１０のテトラサイクリン耐性形質導入体を
採取して精製し、ナリジクス酸（５μｇ/ｍｌ）に対し
て感受性となり、同時にワクチン株中に存在する他の変
異に関連する他のすべての表現型特性を保持しているか
どうかを見るために試験する。
【０１８１】テトラサイクリン耐性でありナリジクス酸
感受性の分離菌を採取し、菌株χ３０００に増殖させた
ｐ２２ＨＴｉｎｔで形質導入する。細胞が遺伝子型およ
び表現型の発現に関して均質となるように数世代増殖さ
せた後、フザリン酸６μｇ/ｍｌおよびクロロテトラサ
イクリン（加圧滅菌済）、およびＤＡＰのような付加的
に必要とされる補足物を含む栄養寒天培地に細胞をプレ
ートする。３７℃で一晩インキュベートした後、単離し
たコロニーを採取して精製し、上に述べたようにしてテ
トラサイクリン耐性の欠失について試験を行う。Ｔｎ１
０の痕跡が存在しないことの付加的な証拠として、高濃
度の細菌を、テトラサイクリン耐性に変異する能力の欠
如に関して評価する。
【０１８２】いくつかの特定の実施態様により本発明を
上記のように例示したが、これらの特定の実施例によ
り、添付の特許請求の範囲に述べるような本発明の範囲
を制限することを意図してはいない。
【０１８３】産業における利用 組換え二価無発病性サルモネラ属菌株による有効な免疫
は、無発病性微生物が、免疫化された個体の腸管関連リ
ンパ系組織（ＧＡＬＴまたはパイエル板）中に一定期間
残存することを必要とする。連続的なコロニー形成およ
び/または他の病原体由来の遺伝子によって特定される
毒性抗原の連続的な産生が、病原体に対する高レベルの
保護免疫を誘発する上で必要とされる。抗生物質耐性マ
ーカーを持つ従来の発現ベクターを用いた以前の研究に
おいては、免疫化した動物から分離した無発病性サルモ
ネラ菌の大半が、１週間目までに、免疫抗原をコードす
る組換えプラスミドを喪失し、従って、もはや病原体に
対する保護免疫を誘発することができなくなっているこ
とが示された。δ−ａｓｄ変異を含むサルモネラ属の無
発病性菌株、およびＳ．ミュータンスまたはＳ．ティフ
ィムリウムのａｓｄ +遺伝子を含む発現ベクターの使用
は、クローン化された遺伝子の安定な保持を保証する。
この点に関して、ｐＹＡ２６２を有するχ４０７２はＢ
ａｌｂｃマウスにおいて、１０4〜１０5のＳｐａＡ産生
細胞の力価が経口免疫後１週間保持されるように、ＧＡ
ＬＴにコロニー形成する。これらの力価はＳ．ティフィ
ムリウムχ４０６４（χ４０７２のａｓｄ+δ−ｃｙａ
δ−ｃｒｐ親菌株、表６参照）によって得られるもの
に等しい。ａｓｄ+を含むベクターを喪失した細胞が時
おり溶解することは、所望の抗原を放出し、したがって
その抗原に対する免疫反応を高めるので、有用である。
【０１８４】遺伝的に操作された微生物によって合成さ
れる、極めて多様な商業的価値のある副産物の生産が、
バイオテクノロジー産業において達成された。遺伝的に
操作された微生物の、培養増殖条件下での安定な保持
が、ａｓｄ+遺伝子を選択マーカーとして有する細胞
へ、δ−ａｓｄ変異およびポリヌクレオチド挿入物が挿
入された細胞のような、本発明の細胞の使用によって促
進されるであろう。増殖し、タンパクを発現することが
できる唯一の細胞は、所望の抗原をコードする細胞であ
る。このようにして、所望の産物の収率が高められる。
【０１８５】本発明の細胞は、環境汚染物の破壊、害虫
の撲滅、あるいは植物種への何らかの恩恵提供のために
環境中に放出することができる微生物としても有用であ
る。あらゆる場合において、本発明は、その生存性が所
望のクローン化遺伝子産物の発現に結びついている細胞
を生成する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 アミノ酸のアスパラギン酸類の生合成を示す
フローチャートである。
【図２】 サルモネラのδ−ａｓｄ変異体の創製を示す
フローチャートである。
【図３】 ｐＹＡ２３５の創製に使用されるプラスミド
の重要な特徴を示すフローチャートである。
【図４ａ】 ｐＹＡ２２９の構築に使用されるプラスミ
ドの重要な特徴を示すフローチャートである（図４ｂに
つづく）。
【図４ｂ】 ｐＹＡ２２９の構築に使用されるプラスミ
ドの重要な特徴を示すフローチャートである（図４ａか
らつづく）。
【図５】 クローニングベクターｐＹＡ２４８の重要な
特徴を示す地図である。
【図６】 ｐＹＡ２４８のＰｔｒｃプロモーターと多重
クローニング部位のヌクレオチド配列を示す。
【図７】 組換えベクターｐＹＡ２６０の重要な特徴を
示す地図である。
【図８】 ｐＹＡ２３２の重要な特徴を示す地図であ
る。
【図９】 ｐＹＡ２６０またはｐＹＡ２４８で形質転換
したＡｓｄ-株、またはｐＹＡ２６０およびｐＹＡ２３
２で共形質転換したＡｓｄ-株の発現産物を示すポリア
クリルアミドゲルの写真である。
【図１０】 Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ｓｐａＡ遺伝子の構造
を示す地図であり、主な抗原決定基を示す。
【図１１】 ｐＹＡ２６１およびｐＹＡ２６２の重要な
特徴を示す地図である。
【図１２】 Ａｓｄ-株からｐＹＡ２６０、ｐＹＡ２６
１、およびｐＹＡ２６２が自然発生的に消失する割合を
示すグラフである。
【図１３】 Ａｓｄ+プラスミドｐＹＡ２４８、ｐＹＡ
２６１、およびｐＹＡ２６２を含むＳ．ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ χ４０７２の全細胞タンパクの、クマシーブ
ルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥのプロフィール（左）
およびウエスタンブロット（右）を示すゲルの写真であ
る。
【図１４】 ｐＹＡ２７２、ｐＹＡ２７５（Ｔｎ１００
０挿入物を有する、および有していない）、およびｐＹ
Ａ２７７の構築および性質を示すチャートである。
【図１５】 ｐＹＡ２８０の重要な特徴を示す地図であ
る。
【図１６】 ｐＹＡ２９２の重要な特徴を示す地図であ
る。
【図１７】 Ｍ．ｌｅｐｒａｅ ＤＮＡ挿入物を有する
ｐＹＡ１０９０およびｐＹＡ１０９１の構築を示すフロ
ーチャートである。
【図１８】 Ｍ．ｌｅｐｒａｅ ＤＮＡ挿入物を有する
ｐＹＡ１０９２およびｐＹＡ１０９３の構築を示すフロ
ーチャートである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の生合成
    における工程を触媒する酵素１を欠くことに起因する表
    現型を有する細菌株を補完するに有用な組換えプラスミ
    ドであって、ＤＡＰの生合成において酵素１と同じ工程
    を触媒する酵素２をコードする第１の組換え遺伝子を含
    み、そして所望の産物をコードする第２の組換え遺伝子
    が挿入され得る制限酵素部位を含む、組換えプラスミ
    ド。
  2. 【請求項２】 前記酵素１および前記酵素２がアスパラ
    ギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｓｄ）であ
    る、請求項１に記載の組換えプラスミド。
  3. 【請求項３】 前記第１の組換え遺伝子が、Ｓ．ｍｕｔ
    ａｎｓ、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
    ｍ由来である、請求項１に記載の組換えプラスミド。
  4. 【請求項４】 前記プラスミドが、ｐＹＡ２４８および
    その変異体、またはｐＹＡ２９２およびその変異体であ
    る、請求項３に記載の組換えプラスミド。
  5. 【請求項５】 以下により特徴付けられる組換えプラス
    ミド： （ａ）酵素２をコードする第１の組換え遺伝子が存在す
    ること、ここで、該酵素２は、ジアミノピメリン酸（Ｄ
    ＡＰ）の生合成における工程を触媒し、そしてＤＡＰの
    生合成における同じ工程を触媒する酵素を不活化する増
    殖中の細菌宿主株の染色体変異を補完する、（ｂ）所望
    の遺伝子産物をコードする第２の組換え遺伝子が存在す
    ること；および（ｃ）該第１の組換え遺伝子と該第２の
    組換え遺伝子との間の物理的連結、ここで、生存のため
    に該第１の組換え遺伝子の発現を必要とする環境内にあ
    る場合、該第１の組換え遺伝子の喪失は該細菌宿主細胞
    を溶解させる。
  6. 【請求項６】 前記プラスミドが、前記第２の組換え遺
    伝子の存在を選択的に維持するために使用され得る遺伝
    情報であって、前記酵素２をコードする第１の組換え遺
    伝子以外の遺伝情報の不在によってさらに特徴付けられ
    る、請求項５に記載のプラスミド。
  7. 【請求項７】 前記酵素２が、アスパラギン酸セミアル
    デヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｓｄ）である、請求項６に
    記載の組換えプラスミド。
  8. 【請求項８】 請求項１から７のいずれかに記載のプラ
    スミドで形質転換された、細菌株。
  9. 【請求項９】 前記細菌株が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
    ｒｉａｃｅａｅの種である、請求項８に記載の細菌株。
  10. 【請求項１０】 次のａ、ｂ、ｃにより特徴付けられる
    組換えプラスミド： （ａ）酵素２をコードする第１の組換え遺伝子が存在す
    ること、ここで、該酵素２は、ジアミノピメリン酸（Ｄ
    ＡＰ）の生合成における工程を触媒し、そしてＤＡＰの
    生合成における同じ工程を触媒する酵素１を不活化する
    染色体変異を補完する、（ｂ）所望の遺伝子産物をコー
    ドする第２の組換え遺伝子が存在すること；および
    （ｃ）該第１の組換え遺伝子と該第２の組換え遺伝子と
    の間の物理的連結、ここで、生存のために該第１の組換
    え遺伝子の発現を必要とする環境内にある場合、該第１
    の組換え遺伝子の喪失は宿主細胞を溶解させる。
  11. 【請求項１１】 前記プラスミドが、前記第２の組換え
    遺伝子の存在を選択的に維持するために使用され得る遺
    伝情報であって、前記酵素２をコードする前記第１の組
    換え遺伝子以外の遺伝情報の不在によってさらに特徴付
    けられる、請求項１０に記載のプラスミド。
  12. 【請求項１２】 前記酵素２が、アスパラギン酸セミア
    ルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｓｄ）である、請求項１
    ０に記載の組換えプラスミド。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0556333T3 (da) * 1990-11-09 2003-07-14 Univ Washington Avirulente Salmonella mikrober, der omfatter en mutation i cdt genet, og anvendelser deraf
JP3078312B2 (ja) * 1990-11-22 2000-08-21 協和醗酵工業株式会社 物質の製造法
US6566121B1 (en) * 1991-06-13 2003-05-20 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Insertional mutations in mycobacteria
DE69333669T2 (de) * 1992-03-16 2006-03-09 Wohlstadter, Jacob N. Mutagenese und selektionsmethoden in den selben wirtszellen
WO1996040947A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Washington University Recombinant bacterial system with environmentally limited viability
US7045336B1 (en) 1995-09-06 2006-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Bacterial delivery system
US5824538A (en) * 1995-09-06 1998-10-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Shigella vector for delivering DNA to a mammalian cell
US5922583A (en) * 1995-10-17 1999-07-13 Biostar Inc. Methods for production of recombinant plasmids
ZA97452B (en) * 1996-01-25 1997-08-15 Trinity College Dublin Streptococcus equi vaccine.
US6221364B1 (en) * 1996-11-12 2001-04-24 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Recombinant mycobacteria auxotrophic for diaminopimelate
US6537558B2 (en) 1997-03-31 2003-03-25 Megan Health, Inc. Methods of producing and using virulence attenuated poxR mutant bacteria
CA2243730C (en) * 1997-07-29 2009-12-22 Akzo Nobel N.V. Streptococcus equi vaccine
US6074825A (en) * 1997-07-31 2000-06-13 Maine Medical Center Stable encapsulated reference nucleic acid and method of making
US6024961A (en) 1997-11-14 2000-02-15 Washington University Recombinant avirulent immunogenic S typhi having rpos positive phenotype
EP0972838B1 (en) * 1998-07-15 2004-09-15 Roche Diagnostics GmbH Escherichia coli host/vector system based on antibiotic-free selection by complementation of an auxotrophy
US6291245B1 (en) * 1998-07-15 2001-09-18 Roche Diagnostics Gmbh Host-vector system
US6713073B1 (en) * 1998-07-24 2004-03-30 Megan Health, Inc. Method of vaccination of newly hatched poultry
US6413768B1 (en) 1998-12-02 2002-07-02 University Of Maryland Expression plasmids
US8076130B2 (en) * 1998-12-02 2011-12-13 University Of Maryland, Baltimore Plasmid maintenance system for antigen delivery
ES2286905T3 (es) * 1998-12-02 2007-12-01 University Of Maryland, Baltimore Sistema de estabilizacion de plasmidos para el suministro de antigenos.
US7026155B2 (en) 1999-02-02 2006-04-11 Regents Of The University Of California Method of reducing bacterial proliferation
BR9917493B1 (pt) 1999-09-20 2012-09-18 antena de nìveis múltiplos.
US6780405B1 (en) 2000-04-28 2004-08-24 Avant Immunotherapeutics, Inc. Regulated antigen delivery system (RADS)
US6872547B1 (en) 2000-10-11 2005-03-29 Washington University Functional balanced-lethal host-vector systems
US20040137003A1 (en) * 2001-04-30 2004-07-15 Curtiss Iii Roy Regulated antigen delivery system (rads)
US7541043B2 (en) 2002-01-16 2009-06-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine for protection against Shigella sonnei disease
EP1499191B1 (en) 2002-04-15 2012-05-09 Washington University in St. Louis Regulated attenuation of live vaccines to enhance cross protective immunogenicity
JP5415763B2 (ja) * 2005-10-06 2014-02-12 ドムペ・ファ．ル．マ・ソチエタ・ペル・アツィオーニ 新規選択系
WO2007106073A2 (en) 2006-03-02 2007-09-20 University Of Massachusetts Modified pathogens for use as vaccines
US8287855B2 (en) * 2007-04-24 2012-10-16 Celldex Therapeutics, Inc. V. cholerae hyperexpressing recombinant cholera toxin B subunit showing dual immunogenicity
EP2150616A4 (en) 2007-05-10 2011-07-27 Univ Arizona REGULATED ANTIGEN SYNTHESIS AND / OR REGULATED ATTENUATION FOR IMPROVING VACCINATE IMMUNOGENICITY AND / OR SAFETY
EP2152883A4 (en) * 2007-05-10 2010-10-27 Univ Arizona RECOMBINANT BACTERIA COMPRISING VECTORS FOR THE EXPRESSION OF NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING ANTIGENS
WO2009046449A1 (en) 2007-10-05 2009-04-09 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against enteric pathogens
WO2010045620A1 (en) 2008-10-17 2010-04-22 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against streptococcus pneumoniae
US9163219B2 (en) 2009-04-14 2015-10-20 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Single expression vector for generation of a virus with a segmented genome
WO2010135563A1 (en) 2009-05-22 2010-11-25 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium and methods of antigen and nucleic acid delivery
US9045742B2 (en) 2009-05-29 2015-06-02 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant Edwardsiella bacterium
US9062297B2 (en) 2010-01-13 2015-06-23 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Yersinia pestis vaccine
US8889121B2 (en) 2010-01-22 2014-11-18 The Arizona Board Of Regents For An On Behalf Of Arizona State University Bacterium comprising a regulated rfaH nucleic acid
US9598697B2 (en) 2010-05-28 2017-03-21 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium to decrease tumor growth
US9255283B2 (en) 2010-07-02 2016-02-09 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Compositions and methods for bacterial lysis and neutral lipid production
BRPI1003750A2 (pt) * 2010-07-22 2012-04-10 Univ Sao Paulo microrganismos recombinantes, métodos de preparação de linhagens vacinais, antìgenos, composições vacinais vetorizadas, seus usos, anticorpos, kit de diagnóstico e métodos de tratamento e/ou profilaxia
US9303264B2 (en) 2012-05-18 2016-04-05 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Photosynthetic microorganisms expressing thermostable lipase
US9580718B2 (en) 2013-06-17 2017-02-28 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Attenuated live bacteria with increased acid resistance and methods of use thereof
BR112017025923A2 (pt) 2015-06-04 2018-08-14 Basf Se molécula de ácido nucleico recombinante, molécula de aminoácido recombinante, construto de expressão recombinante, vetor recombinante, micro-organismo recombinante, composição, métodos para produção de um micro-organismo recombinante e para cultivo e crescimento de um micro-organismo geneticamente modificado, uso de uma molécula de ácido nucleico recombinante, e, processo para produção fermentativa de um composto.
MX2017016109A (es) 2015-06-12 2018-04-20 Basf Se Microorganismo recombinante para la produccion mejorada de productos quimicos finos.
WO2017142993A1 (en) * 2016-02-16 2017-08-24 Manus Biosynthesis, Inc. Secondary metabolite screening system
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4190495A (en) * 1976-09-27 1980-02-26 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same
CA1338705C (en) * 1981-10-22 1996-11-12 Roy Curtiss Iii Vaccines obtained from antigenic gene products of recombinant genes
IT1217303B (it) * 1984-02-01 1990-03-22 Enterovax Res Pty Ltd Ceppi batterici particolarmente utili per la produzione di vaccini per il trattamenmto di malattie intestinali e simili e metodo di ingegneria gentica per la produzione dei detti vaccini
DK594084A (da) * 1984-12-12 1986-06-13 Novo Industri As Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning
CA1340903C (fr) * 1986-08-05 2000-02-22 Transgene S.A. Procede de stabilisation d'un plasmide contenu dans une soche bacterienne et souche obtenue
US5294441A (en) * 1987-06-04 1994-03-15 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: salmonella typhi
US5387744A (en) * 1987-06-04 1995-02-07 Washington University Avirulent microbes and uses therefor: Salmonella typhi

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DE3853683T2 (de) 1995-08-31
CA1339412C (en) 1997-09-02

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