CN102453729B

CN102453729B - 一种快速高通量生产重组蛋白的平台

Info

Publication number: CN102453729B
Application number: CN201010527331.2A
Authority: CN
Inventors: 王学刚; 占新祥
Original assignee: NINGBO ANKE BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: NINGBO ANKE BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2030-10-29
Also published as: CN102453729A

Abstract

本发明涉及一种快速高通量生产重组蛋白的方法，包括以下步骤：构建含有编码EBN病毒的EBNA基因OriP复制子的重组载体；获得含有病毒的CHO-K1细胞株；将培养的CHO-K1细胞株与聚乙烯亚胺储液混合，得到转染试剂，于多联细胞发酵罐中培养；将转染试剂与带有目的基因的质粒混合转染培养；收集纯化培养的细胞；用Elisa鉴定收集纯化细胞培养物并用亲和层析纯化方法纯化蛋白。本发明的有益效果是：转染并随机整合了EBV病毒蛋白编码基因，使细胞内含OriP的动物细胞表达载体复制2～3代，增加了1倍以上的表达时间；采用多联细胞发酵罐提高了通量，能够快速高通量地生产毫克到克级的蛋白，并且效率高，结果准确。

Description

一种快速高通量生产重组蛋白的平台

技术领域

本发明涉及一种蛋白生产平台，尤其涉及一种快速高通量的生产重组蛋白的平台，属于基因工程领域。

背景技术

基因工程蛋白的表达从上世纪80年代在国外兴起，迄今已经接近30年，并被广泛应用于生物学研究、医药研究与生产及化妆品保健品行业。尤其由于生物医药行业特别是以治疗单抗为产品的生物技术公司在90年代后异军突起，使得该行业每年以超过50％的复合增长率高速发展。随着本世纪初，人类基因组计划的成功完成，人们的目光迅速转移到各个功能基因的研究，在这些功能基因中占绝大部分均为蛋白表达序列。后基因组时代，各个研究机构、生物制药公司将要对成千上万的蛋白进行功能研究和筛选，但这么多蛋白又不可能在短时间内完全由单个独立的单位来完成，因此也孕育了一个巨大的为生物制药公司和研究单位提供这方面服务的市场。每个蛋白都需要毫克到克级水平，同时又要具有与天然蛋白几乎完全一样的功能和结构，所以谁能够在短时间内具有更大的生产能力无疑就是这个市场的胜利者。在这个方面最近几年一直有更新的技术出现。据美国有关机构估计，该市场在未来5年将从目前的30亿左右猛增至50-55亿美金，市场复合增长率在50-60％间。

国内做蛋白表达服务的公司与平台很多，但大多数均基于以大肠杆菌为代表的原核生物作为宿主来表达，得到的蛋白没有糖基化修饰以及可能的结构丧失，从而使蛋白产物没有或很少活性；还有少数公司以细胞表达作为平台，但由于没有高效的表达载体以及合适的细胞株，培养基和设备系统，通常得到克级的蛋白需要耗费数月时间与数十万资金。国外在最近几年随着动物细胞培养与表达技术的发展，已经出现了以LifeTehnologies公司为代表的一些试剂公司开发出用于快速生产以哺乳动物细胞为宿主表达重组蛋白的表达载体，CHO及293细胞株及培养基，但最高表达量在30-50mg/L之间徘徊，并且其培养基及转染试剂极其昂贵。其他公司大多以293细胞为主，存在一定的局限性，主要表现为70％以上的医药公司均选择CHO为宿主用于治疗蛋白生产，也就是说以293细胞为宿主表达的蛋白作功能研究的起点，由于其糖基化修饰和CHO细胞的差异依然存在误导结果可能。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种快速高通量的重组蛋白的平台，以使生产的重组蛋白达到毫克到克级的水平，生产方法快速、高通量，节约成本，并且效率高、结果准确。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种快速高通量生产重组蛋白的平台，包括以下步骤：

1)构建含有编码EBN病毒的EBNA基因OriP复制子的重组载体；

2)将重组载体转化入CHO-K1细胞菌株中，筛选得到稳定表达EBNA蛋白的CHO-K1细胞株；

3)在培养基中培养CHO-K1细胞株，并用0.2～0.5X10⁶个细胞/mL的接种密度扩大至多联细胞发酵罐中，搅拌转速维持80-100rpm，溶氧控制下限30～35％，pH维持6.8～7.2，进行培养；

4)将的CHO-K1培养至细胞密度为0.8～1X10⁶个细胞/mL等待转染；

5)将转染试剂PEI与1～5μg的带有目的基因的质粒混合，震荡摇匀后，于室温孵育5～15分钟，转入细胞培养物，同时于20～50rpm的低转速培养3～6小时后，再上升到60～100rpm的转速培养；

6)培养5～7天后收集并纯化，同时准备下一批转染直到所有3批结束，将收集的3批纯化合并；

7)用Elisa鉴定收集纯化的细胞培养物上清或细胞裂解物得到表达产量，并用亲和层析纯化方法纯化，得到产物蛋白。

所述目的基因质粒按常规分子生物学方法获得。

本发明的有益效果是：转染并随机整合了EBV病毒蛋白编码基因，使细胞内含OriP的动物细胞表达载体复制2～3代，增加了1倍以上的表达时间；采用多联细胞发酵罐提高了通量，能够快速高通量地生产毫克到克级的蛋白，并且效率高，结果准确。

在上述技术方案的基础上，本实用新型还可以做如下改进。

进一步，所述步骤1)中的重组载体为pcDNA3.1载体。

进一步，所述步骤3)中的培养基为无血清培养基。

采用上述进一步方案的有益效果是：无血清，非动物源性可达到1X10⁷cells/mL的细胞密度和峰值80mg/L在CHO-K1细胞中的表达量，增加了产量为普通培养基的2～5倍，同时去除了转染后换液的步骤。

进一步，所述步骤3)中的多联细胞发酵罐为8联罐，所述发酵罐体的体积为0.5～2L。

采用上述进一步方案的有益效果是：将国产5L左右的发酵罐体通过设计改小到0.5～2L，并将1台主机控2台罐扩容到8台，其他配置不变，通量提高了4倍。

进一步，所述步骤3)中的多联反应器还设有控制单元、主机和罐体集成平台，所述控制单元对细胞发酵罐进行数据传输，所述控制单元至少设有一个，所述主机用于对控制单元进行数据传输，所述罐体集成平台用于支撑细胞发酵罐。

进一步，所述步骤3)中的所述CHO-K1细胞株的接种为0.2X10⁶个细胞/mL，溶氧控制下限为35％，pH为7.0。

所述步骤4)中PEI储液的浓度为1mgPEI/mL，由25Kda的线性聚阳离子PEI与多肽以1：1的摩尔比混合而成，所述多肽的序列为序列表中SEQIDNO:1的序列。

进一步，所述步骤步骤5)中1-5μg带有目的基因的质粒含有10⁶个细胞。

进一步，所述步骤步骤5)中将转染试剂与2.5μg的带有目的基因的质粒混合，震荡摇匀后，于室温孵育10分钟，转入细胞培养物，同时于30rpm的低转速培养4小时后，再上升到80rpm的转速培养。

采用上述进一步方案的有益效果是：可达到最高70％转染效率，相对单纯的聚阳离子转染试剂提高了30％左右的效率。

所述步骤步骤6)中三批转染完成所有的时间为20～30天。

附图说明

图1本发明所述的快速高通量的生产重组蛋白的平台的表达载体的结构简图；

图2本发明所述的快速高通量的生产重组蛋白的平台的的多联反应器结构示意图；

图3为本发明所述的快速高通量的生产重组蛋白的平台的表达纯化的HER-2/ErbB2蛋白的SDS-PAGE电泳结果图，图中1’为标准蛋白(蛋白MARK)，2’为表达纯化的HER-2/ErbB2蛋白；

图4为本发明所述的快速高通量的生产重组蛋白的平台的表达纯化的EGFR蛋白的SDS-PAGE电泳结果图，图中3为蛋白MARK，4为表达纯化的EGFR蛋白；

图5为本发明所述的快速高通量的生产重组蛋白的平台的表达纯化的NGF蛋白的SDS-PAGE电泳结果图，图中5为蛋白MARK，6为表达纯化的NGF蛋白。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，实施例中的方法如无特别说明，均为本领域的常规试验技术。

本发明实施例所述的快速高通量生产重组蛋白的平台的多联反应器设有控制单元1、数据处理器2和细胞发酵罐3，所述控制单元1对细胞发酵罐3进行数据传输，所述控制单元1设有4个，所述数据处理器2用于对控制单元1进行数据传输，所述数据处理器包括主机201和数据采集端202，所述细胞发酵罐3设于罐体集成平台4上，所述细胞发酵罐3为8个，所述细胞发酵罐3的体积为0.5～2L。

实施例1

1.构建含有HER-2/ErbB2基因的OriP复制子的重组载体

本发明所要表达的共4个目的重组蛋白，具体如表1所示；首先对所要表达4个蛋白的基因序列合成和测序，当得到的测序结果无误后利用限制性内切酶BamHI和NheI切下带有亲和标签(组氨酸标签或Fc)的目的基因，同时用此两种限制性内切酶切表达载体，在利用胶纯化去除冗余片段后，用T4DNA连接酶将目的基因插入载体，并将此完整质粒转化感受态大肠杆菌DH5a，利用传统发酵方法发酵培养转化后的质粒，并用碱裂解法和上柱纯化得到毫克级左右的带有目的基因的质粒，现以HER-2/ErbB2基因为例具体说明。

表1克隆表达的4个目的蛋白

克隆表达的蛋白	GenebankID	序列编码
			Beta-NGF	Accession#CAA36832	SEQ ID NO:2
NGF R/TNFRSF16	Accession#P08138	SEQ ID NO:3
			EGF R	Accession#P00533	SEQ ID NO:4
ErbB2	Accession#NP_004439	SEQ ID NO:5

(1)人HER-2/ErbB2基因的获取

a.按照TRIZOLReagent(Invitrogen)的使用说明，将生长状态良好的MCF-7细胞约2X10⁷个，离心去上清，将细胞均匀弹起。加入1.5mLTRIZOL反复吹打使细胞裂解充分，震荡5分钟后，加入0.3mL氯仿，震荡15S，室温放置2～3分钟，2～8℃，12000r/分钟离心15分钟，取上清于另一新管中，加500μL异丙醇混匀后室温放置10分钟，2～8℃，12000RPM离心10分钟，75％乙醇洗涤沉淀，干燥后，用20μL无RNA酶的去离子水溶解沉淀。

b.RT-PCR：以总RNA为模板，以oligodT为下游引物，按照SuperscriptII反转录酶(Invitrogen)产品的使用说明进行反转录。以反转录产物为模板，按照设计的上下游引物进行PCR反应。反应条件为：95℃变性5分钟，然后94℃1分钟，65℃1分钟，72℃2.5分钟，进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。然后回收PCR产物，按照说明书连入pGEM-T载体中。

引物为：

HER-2上游引物：5′ATGGAGCTGGCGGCCTT3′

HER-2下游引物：5′TCACACTGGCACGTCCAGA3′

(2)T载体中HER-2/ErbB2基因的测序确认

将培养24小时左右的细菌3～5mL，高速离心去上清，按照质粒提取的标准操作提取质粒，最终用50μLddH2O溶解DNA沉淀。取其中10μL用于测序。测序在PE公司的310型DNA自动测序仪上完成。经过BLAST比对，测序结果与Pubmed数据库上公布的人ErbB2序列完全一致。

2.HER-2/ErbB2基因构建至瞬时表达载体的构建

(1)HER-2/ErbB2基因构建至瞬时表达载体中

本发明采用的瞬时表达载体以商品化的pcDNA3.1(Invitrogen)为基础，在载体上引入oriP的基因，此载体配合瞬时表达细胞系上引入的EBNA-1高效表达基因，构建成含有EBNA基因OriP复制子的重组载体，如图1所示，以实现重组蛋白产品的高效表达。人ErbB2基因的PCR产物分别用NdeI和XhoI(TAKARA)酶切，在30μL体系中加入3μL10XHbuffer，ErbB2PCR纯化产物20μL，XhoI2μL，NdeI3μL，补加ddH₂O至30μL。此反应体系在37℃下酶切1小时。酶切产物用Promega公司生产的PCRclean-upSystems纯化试剂盒进行纯化。使用同样的酶切体系和方法对表达载体进行酶切，并电泳进行大片段胶回收。使用TAKARA公司生产的DNALigationKitV2.1试剂盒将ErbB2片段插入到表达载体中，并在C端连接插入6Xhis的编码基因。

(2)对ErbB2瞬时表达载体进行测序

将培养24小时左右的细菌3～5mL，高速离心去上清，按照质粒提取的标准操作提取质粒，最终用50μLddH₂O溶解DNA沉淀。取其中10μL用于测序。测序在PE公司的310型DNA自动测序仪上完成。经过比对，测序结果与预想的构建序列完全一致，这表明完成了对ErbB2瞬时表达载体的构建过程。

(3)质粒及PEI制备

将所得到的重组质粒转化DH5α感受态大肠杆菌，涂布LB琼脂平板后置于37℃静置培养箱中培养2天，然后挑生长良好克隆菌落于盛有3～5mLLB培养基的试管中，置于37℃摇床培养箱中过夜培养。次日，将上述试管培养物接种到盛有100mLLB的3个500mL三角瓶中继续培养，直至OD600达到4以上，收获菌液，用50mL离心管5000g离心10分钟，弃去上清，用碱裂解法提取质粒并用DEAE离子交换柱进一步纯化，去除内毒素，并以800ug/mL的浓度用去离子水稀释并过滤除菌分装到1.5mL的EP管中(1mL每管)，共得到5个，然后置于-20℃冰箱保存。

3.CHO-K1细胞株的培养

将含有EBNA的CHO-K1冻存细胞从液氮中取出复苏于装有10mLTF293无血清培养基的T25培养瓶中，置于37℃，有CO₂的培养箱中培养；当细胞活力恢复到95％以上后，转接125mL摇瓶培养此时培养基体积为25mL；当细胞密度达到1.8X10⁶cells/mL后，以1：6的传代比例，传到3个250mL摇瓶中(每瓶的终培养体积为50mL)；将摇瓶继续置于37℃培养，直至细胞密度达到1.7X10⁶cells/mL时，将所有培养物转至盛有800mLTF293无血清培养基的反应器中总体积946mL继续培养，此时细胞密度为2.6X10⁵cells/mL，如图2所示，所述反应器为多联细胞发酵罐，多联细胞发酵罐为8联罐，发酵罐体的体积为1L。

将反应器条件设为温度34℃，60rpm,DO30％,pH6.8，通气流量为10sccm(-0.01vvm)，细胞缓慢生长，当密度达到0.8X10⁶cells/mL进行转染操作，整个细胞培养过程耗时约2周。由于在实验过程中随时都保持有一定数量的种子培养，此过程基本与进行质粒构建过程平行进行，当质粒制备完成，实际转染操作已经可以开始。

以上试验过程耗时共2周。

4.转染与表达

称取适量的25Kda的线性聚阳离子聚乙烯亚胺(PEI)和蛋白质序列为SEQIDNO:1的序列的合成多肽，按1：1摩尔比配制成1mg/mLPEI浓度的储液，过滤除菌分装于1.5mL的EP管中(1mL每管)置于-20℃冰箱备用。

按1μgDNA/10⁶cells的量准备质粒，共需1040μg质粒(1.3mL)，PEI则为2080μg(2.08mL)；将2.08mLPEI加入90mL的150mMNaCl溶液中，然后用1mL枪头分2次吸入1.3mL质粒溶液边震荡边滴加至PEI溶液中,继续震荡30秒后置于室温5分钟。然后，无菌连接到反应器上缓慢滴加入培养液中，同时将搅拌速度降低至20rpm，2小时后恢复60rpm.转染后每24小时取样用HPLC监测上清表达量。当细胞培养至转后第6天时，细胞活力降至53％，活细胞密度0.8X10⁶cells/mL遂停止培养，收液。

5.纯化及鉴定

将1LCHO-K1细胞培养液(表达量30mg/L)，于4000g离心10分钟,上清经过0.22u过滤澄清去除细胞碎片。澄清的细胞培养液中加入1/25(v/v)500mM咪唑，使用XK26/10IMACSepharoseFF50mL金属敖合层析分离纯化。IMAC金属敖合层析柱使用20mMPB500mMNaCl20mM咪唑pH7.0以13mL/分钟流速平衡5个柱体积，然后进样分离，分别以100mM、300mM和500mM咪唑阶段洗脱，收集300mM咪唑的洗脱部分作为目标蛋白洗脱峰。IMAC洗脱峰约90mL,加入硫酸铵固体至终浓度1.3M，然后使用XK16/20phenylSepharoseHP进行精细纯化，流速5mL/分钟，使用20mMPBpH7.1洗脱目标蛋白并收集进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示，得到高纯度共18mg的his标签的HER-2/ErbB2蛋白(用凝胶薄层扫描，纯度大于95％)，纯化过程共耗时共2天。

HER-2/ErbB2的表达与纯化，前后共耗时22天。24个蛋白，不同的蛋白表达量从5mg/L到50mg/L不等，得到所有24个蛋白一共耗时38天(计算进中间并行环节)。

实施例2

1.构建含有编码EBN病毒的EGFR基因的OriP复制子的重组载体，同实施例1。

2.表达EGFR蛋白瞬时表达载体的构建通实施例1

3.CHO-K1细胞株的培养

将含有EBNA的CHO-K1冻存细胞从液氮中取出复苏于装有10mLTF293无血清培养基的T25培养瓶中，置于37℃，有CO₂的培养箱中培养；当细胞活力恢复到95％以上后，转接125mL摇瓶培养此时培养基体积为25mL；当细胞密度达到2.1X10⁶cells/mL后，以1：6的传代比例，传到3个250mL摇瓶中(每瓶的终培养体积为50mL)；将摇瓶继续置于37℃培养，直至细胞密度达到1.5X10⁶cells/mL时，将所有培养物转至盛有800mLTF293无血清培养基的反应器中总体积941mL继续培养，此时细胞密度为2.3X10⁵cells/mL，如图2所示，所述反应器为多联细胞发酵罐，多联细胞发酵罐为8联罐，发酵罐体的体积为1L。

将反应器条件设为温度35℃，100rpm,DO35％,pH7.0，通气流量为10sccm(-0.01vvm)，细胞缓慢生长，当密度达到0.95X10⁶cells/mL进行转染操作，整个细胞培养过程耗时约2周。由于在实验过程中随时都保持有一定数量的种子培养，此过程基本与进行质粒构建过程平行进行，当质粒制备完成，实际转染操作已经可以开始。

以上试验过程耗时共2周。

4.转染与表达

按1μgDNA/10⁶cells的量准备质粒，共需950μg质粒(1.0mL)，PEI则为1900μg(1.90mL)；将1.9mLPEI加入90mL的150mMNaCl溶液中，然后用1mL枪头分2次吸入1.3mL质粒溶液边震荡边滴加至PEI溶液中,继续震荡30秒后置于室温10分钟。然后，无菌连接到反应器上缓慢滴加入培养液中，同时将搅拌速度降低至40rpm，2小时后恢复100rpm.转染后每24小时取样用HPLC监测上清表达量。当细胞培养至转后第6天时，细胞活力降至49％，活细胞密度0.61X10⁶cells/mL遂停止培养，收液。

5.纯化及鉴定(方法同实施例1)，结果如图4所示。获得15.2毫克his标签的EGFR纯化蛋白，纯度95％以上，共耗时23天。

实施例3

1.构建含有编码NGF基因的OriP复制子的重组载体，方法同实施例1。

2.表达NGF蛋白瞬时表达载体的构建，方法同实施例1。

3.CHO-K1细胞株的培养

将含有EBNA的CHO-K1冻存细胞从液氮中取出复苏于装有10mLTF293无血清培养基的T25培养瓶中，置于37℃，有CO₂的培养箱中培养；当细胞活力恢复到95％以上后，转接125mL摇瓶培养此时培养基体积为25mL；当细胞密度达到1.7X10⁶cells/mL后，以1：6的传代比例，传到3个250mL摇瓶中(每瓶的终培养体积为50mL)；将摇瓶继续置于37℃培养，直至细胞密度达到1.55X10⁶cells/mL时，将所有培养物转至盛有800mLTF293无血清培养基的反应器中总体积963mL继续培养，此时细胞密度为2.2X10⁵cells/mL，如图2所示，所述反应器为多联细胞发酵罐，多联细胞发酵罐为8联罐，发酵罐体的体积为1L。

将反应器条件设为温度37℃，120rpm,DO40％,pH7.2，通气流量为10sccm(-0.01vvm)，细胞缓慢生长，当密度达到1.19X10⁶cells/mL进行转染操作，整个细胞培养过程耗时约2周。由于在实验过程中随时都保持有一定数量的种子培养，此过程基本与进行质粒构建过程平行进行，当质粒制备完成，实际转染操作已经可以开始。

以上试验过程耗时共2周。

4.转染与表达

按1μgDNA/10⁶cells的量准备质粒，共需1000μg质粒(1.1mL)，PEI则为2000μg(2.00mL)；将2.0mLPEI加入90mL的150mMNaCl溶液中，然后用1mL枪头分2次吸入1.3mL质粒溶液边震荡边滴加至PEI溶液中,继续震荡30秒后置于室温15分钟。然后，无菌连接到反应器上缓慢滴加入培养液中，同时将搅拌速度降低至50rpm，2小时后恢复120rpm.转染后每24小时取样用HPLC监测上清表达量。当细胞培养至转后第6天时，细胞活力降至47％，活细胞密度0.71X10⁶cells/mL遂停止培养，收液。

5.纯化及鉴定(方法同实施例1)，结果如图5所示。获得3.8毫克his标签的NGFR/TNFRSF16纯化蛋白，纯度95％以上，共耗时23天。

其他蛋白的生产操作过程与上述蛋白的制备过程相似，在此不再一一赘述，以表2所示，叙述4个目的蛋白的表达情况。

表24个目的蛋白的表达情况

从表2可以看出，本发明的生产方法所获得的重组蛋白均为毫克级以上的，并且纯度高，耗时少，说明其生产效率高，通量高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

Claims

1.一种快速高通量生产重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建含有编码EBN病毒的EBNA基因OriP复制子的重组载体；

3)在培养基中培养CHO-K1细胞株，并用0.2～0.5X10⁶个细胞/mL的接种密度扩大至多联反应器的细胞发酵罐中，搅拌转速维持80rpm,溶氧控制30～40％，温度34～37度，pH维持6.8～7.2，进行培养；所述多联反应器的细胞发酵罐为8联罐，所述细胞发酵罐的体积为0.5～2L；

4)将培养至细胞密度为0.8～1.2X10⁶个细胞/mL的CHO-K1细胞株进行转染；

5)将转染试剂PEI储液与1～5μg的带有目的基因的质粒混合，震荡摇匀后，于室温孵育5～15分钟，转入细胞培养物，同时于20～50rpm的低转速培养3～6小时后，再上升到60～120rpm的转速培养；所述PEI储液的浓度为1mgPEI/mL，由25Kda的线性聚阳离子PEI与多肽以1：1的摩尔比混合而成，所述多肽的序列为序列表中SEQIDNO:1的序列；

7)用Elisa鉴定经过步骤6)收集纯化的细胞培养物上清或细胞裂解物得到表达产量，并用亲和层析纯化方法纯化，得到产物蛋白。

2.根据权利要求1所述的快速高通量生产重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤1)中的重组载体为pcDNA3.1载体。

3.根据权利要求1所述的快速高通量生产重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤3)中的培养基为无血清培养基。

4.根据权利要求3所述的快速高通量生产重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤3)中的多联反应器还设有控制单元、主机和罐体集成平台，所述控制单元对细胞发酵罐进行数据传输，所述控制单元至少设有一个，所述主机用于对控制单元进行数据传输，所述罐体集成平台用于支撑细胞发酵罐。

5.根据权利要求1所述的快速高通量生产重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤3)中的所述CHO-K1细胞株的接种为0.2X10⁶个细胞/mL，溶氧控制为30～35％，pH为6.8～7.0。

6.根据权利要求1所述的快速高通量生产重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤4)中培养至细胞密度为0.8～1X10⁶个细胞/mL的CHO-K1细胞株待转染。

7.根据权利要求1所述的快速高通量生产重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤5)中将转染试剂与2.5μg的带有目的基因的质粒混合，震荡摇匀后，于室温孵育10分钟，转入细胞培养物，同时于20～50rpm的低转速培养4小时后，再上升到60～100rpm的转速培养。

8.根据权利要求1所述的快速高通量生产重组蛋白的方法，其特征在于，所述步骤6)中三批转染完成所有的时间为20～30天。