CN105969802B - 家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用 - Google Patents

家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用。获得包含丝素轻链基因启动子、18s rRNA基因启动子、His 6序列、DDDDK、丝素轻链蛋白信号肽基因、丝素轻链基因polyA、家蚕肌动蛋白基因A3启动子、EGFP基因和SV40的3’序列，然后再构建质粒，第一表达框包括A3启动子、EGFP基因和SV40的3’序列，第二表达框包括丝素轻链基因启动子、18s rRNA基因启动子、丝素轻链蛋白信号肽、His 6序列、DDDDK和丝素轻链基因polyA，且含有ApaI和NheI两个酶切位点。本发明质粒减少了构建转基因家蚕donor质粒的构建工作量，提高了家蚕生物反应器工作效率，提高了外源蛋白的表达量。

Description

家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法 和应用
技术领域
本发明涉及了一种质粒及其构建方法与应用，尤其是涉及了一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用。
背景技术
piggyBac转座子最初是从粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)TN-368细胞株的基因组中分离得到的，是目前发现的转座活性最高的DNA转座子。piggyBac转座系统是一种非病毒载体，转座效率较高。与sleeping beauty相比，piggyBac载体容量较大，可携带18kb,可以实现多基因的共表达。
piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器的研究开展了十几年，世界各国的科学家致力于外源基因的表达，已经建成了以丝素蛋白轻链启动子(Fib-LPromoter)、丝素蛋白重链启动子(Fib-H Promoter)和丝胶蛋白1启动子(Ser1Promoter)表达外源蛋白的转基因家蚕丝腺生物反应器。
由于piggyBac载体多数含有两个表达框，具有较多的元件和相同的酶切位点，所以，每次表达不同的外源基因时，需要从头构建质粒，组装启动子、信号肽、外源基因、polyA等结构，费时费力，工作效率低下。
另一方面，纵观十几年来国内外家蚕生物反应器的研究结果，转基因家蚕丝腺生物反应器的外源蛋白表达效率都很低，不管是丝胶启动子驱动表达的外源基因，还是丝素启动子驱动表达的外源基因，极大多数实验的表达量都没有在茧层量的1％左右，远远没有达到科学家们期望的象表达蚕丝蛋白那样的高效表达水平。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提出了一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒及其构建方法和应用，具体是利用常规构建质粒的生物技术方法构建一种除目的基因外的、拥有包含其它所有必需元件的高效通用型质粒。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
一、一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒：
所述的质粒为pBac[A3-EGFP-SV40]-[FL692promoter-18s rRNA-promoter-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA]，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂之间的两个功能表达框。
一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3Promoter–EGFP-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白轻链基因启动子、18s rRNA、丝素蛋白轻链基因信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即Fibroin L chain Promoter-18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA。
所述的DDDDK-FLPA之间含有专一性的ApaI和NheI的两个酶切位点，两个酶切位点用于将质粒特异性切开连接外源基因后形成有功能的质粒。
二、一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒的构建方法：
1)将3×P3、DsRed、SV40、FL 692、GFP和SV40的多个功能基因相依次连接获得包含3×P3-DsRed-SV40--FL 692-GFP-SV40功能元件的piggyBac质粒piggy-7801；
2)以piggyBac质粒piggy-7801为模板，piggyBac质粒piggy-7801的碱基序列如SEQ ID NO.1，以如SEQ ID NO.2的ggtacctttagtggtctgttatgtgaccaatcg序列1和如SEQ IDNO.3的gaattccttaagcgcatattggacatcccttttc序列2为引物，采用PCR扩增获得丝素轻链基因启动子，该启动子5’端带有EcoRI和AflII两个酶切位点，3’端带有KpnI酶切位点，片段长度为700bp，该启动子的碱基序列如SEQ ID NO.4；
3)用EcoRⅠ和KpnI双酶切pUC19质粒得到包含Amp抗性基因长度为2670bp的片段，连接包含Amp抗性基因长度为2670bp的片段和步骤2)获得的丝素轻链基因启动子，得到包含丝素轻链基因启动子和Amp抗性基因的piggyBac质粒piggy-3378；
4)用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切包含丝素轻链蛋白信号肽和六聚组氨酸的piggyBac质粒piggy-2767，piggyBac质粒piggy-2767的碱基序列如SEQ ID NO.5，得到长度为80bp包含FLSP-his的片段，FLSP-his的碱基序列如SEQ ID NO.6；
5)用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切步骤3)获得的piggyBac质粒piggy-3378，得到长度为3372bp的包含丝素轻链基因启动子和Amp抗性基因片段，连接包含丝素轻链基因启动子和Amp抗性基因片段和步骤4)获得的包含FLSP-His6的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸(FL692-FLSP-His 6)和Amp抗性基因的质粒piggy-3452；
6)体外合成肠激酶酶切位点的两条DDDDK单链，其碱基序列如SEQ ID NO.7，通过在94℃退火处理后形成双链，用SalⅠ和PstⅠ双酶切步骤5)获得的质粒piggy-3452，得到长度为3442bp的包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸(FL 692-FLSP-His 6)和Amp抗性基因的片段；
连接DDDDK双链与包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸和Amp抗性基因的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点DDDDK序列(FL 692-FLSP-His6-DDDDK)和Amp抗性基因的质粒piggy-3480；
7)将丝素轻链基因启动子、丝素轻链蛋白信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点、人血清白蛋白基因和丝素轻链polyA的功能基因依次连接，获得包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点-人血清白蛋白基因-丝素轻链polyA(FL 692-FLSP-His 6-DDDDK-HSA-FLPA)的质粒piggy-8449，质粒piggy-8449的碱基序列如SEQ ID NO.8，以质粒piggy-8449为模板，以如SEQ ID NO.9的CTGCAGATAAGAACTGTAAATAATGTATATA序列3和如SEQ ID NO.10的AAGCTTAGATCTGTGTGACTGCTTCGGACTAC ATTCT序列4为引物，通过PCR扩增获得家蚕丝素蛋白轻链3’序列FLPA，其碱基序列如SEQ ID NO.11，该序列的5’端带有Pst酶切位点，3’端带有B glII和HindⅢ两个酶切位点，片段长614bp；
用PstⅠ和HindⅢ双酶切步骤6)获得的质粒piggy-3480，得到长度为3472bp的包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列(FL 692-FLSP-His 6-DDDDK)和Amp抗性基因的片段；
连接家蚕丝素蛋白轻链3’序列FLPA与包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列和Amp抗性基因的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列(FL 692-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)和Amp抗性基因的piggy-4096质粒；
8)将丝素轻链基因启动子、18s rRNA基因启动子、丝素轻链蛋白信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点和丝素轻链polyA的功能基因依次连接，获得包含丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点-丝素轻链polyA(FL 692-18s rRNA-FLSP-His6-DDDDK-FLPA)的质粒piggy-8869，质粒piggy-8869的碱基序列如SEQ ID NO.13，以质粒piggy-8869为模板，以如SEQ ID NO.13的ggtaccACCTTCACCTCGTGAAGGCAG序列5和如SEQ ID NO.14的ggatccAGCTCTCTTTTTCGTTAGCTCG序列6为引物，通过PCR扩增获得18s rRNA基因启动子，其碱基序列如SEQ ID NO.15，该启动子的5’端带有KpnI酶切位点，在3’端加带BamHI酶切位点，片段长1176bp；
用KpnI和BamHI双酶切步骤7)获得的piggy-4096质粒，得到长度为4081bp的包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列(FL 692-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)和Amp抗性基因的片段；
连接18s rRNA基因启动子与包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列和Amp抗性基因的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列(FL 692-18s rRNA-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA)和Amp抗性基因的质粒piggy-5257；
9)将A3基因启动子、绿色荧光蛋白基因、SV40(A3-GFP-SV40)和Amp抗性基因依次连接获得包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40(A3-GFP-SV40)和Amp抗性基因的质粒piggy-6212，其碱基序列如SEQ ID NO.16，用AflII和BglII双酶切质粒piggy-6212，得到长度为5870bp的包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40(A3-GFP-SV40)的片段；
用AflII和BglII、ScaI酶切步骤8)获得的质粒piggy-5257，得到长度为2610bp的包含丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列(FL 692-FLSP-His6-DDDDK-FLPA)的片段；
连接包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40的片段与包含丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列的片段，得到包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40-丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列([A3-EGFP-SV40]-[FL692promoter-18s rRNA-promoter-FLSP-His-DDDDK-FLPA])的质粒piggy-8480作为本发明所述的质粒，质粒piggy-8480其碱基序列如SEQ ID NO.17。
三、本发明质粒用于构建表达各种外源基因的donor质粒的应用。
本发明先设计引物，用PCR的方法，分别获得丝素轻链启动子、18s rRNA启动子、丝素轻链polyA。体外合成丝素轻链信号肽-六聚组氨酸和肠激酶位点的序列；再分别用限制性内切酶酶切相应的片段，电泳得到目的条带后，切胶回收，用T4连接酶将相应的片段相连，使所需的元件(Fibroin L chain Promoter-18s rRNA promoter-Fibroin L chainsignal peptide-His6-DDDDK-Fibroin L chain PolyA)依次连接；将piggy-6212质粒中的标记基因与上述元件整合到同一个质粒，得到含有双启动子的通用型质粒，最终如图1所示。
本发明的有益效果是：
本发明的质粒能够只经一次酶切连接就完成表达各种外源基因donor质粒的构建，减少了每次从头构建donor质粒的工作量，提高家蚕后部丝腺生物反应器工作效率，并且可利用双启动子的作用，提高外源蛋白的表达量。
附图说明
图1是本发明FL和18s rRNA双启动子通用型质粒的组成示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明的实施例如下：
(1)设计引物，以piggy-7801质粒(SEQ ID NO.1)为模板，PCR扩增获得丝素轻链启动子(SEQ ID NO.4)。引物在启动子5’端增加EcoRI和AflII两个酶切位点，在3’端增加KpnI一个酶切位点。用EcoRⅠ和KpnI双酶切PCR产物，得到700bp的片段，即带有酶切位点的启动子序列，回收700bp分子量的凝胶；用EcoRⅠ和KpnI双酶切pUC19质粒，得到2670bp的片段，回收2670bp分子量的凝胶；将所得到的2个片段连接。连接后的质粒命名为piggy-3378。
(2)用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切piggy-2767质粒(SEQ ID NO.5)，得到80bp的目的片段，即FLSP-His 6(SEQ ID NO.6)的序列，回收80bp分子量的凝然；用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切piggy-3378质粒，得到3372bp的目的片段，回收3372bp分子量的凝胶；将两个片段连接，所得的产物命名为piggy-3452。
(3)体外合成两条DDDDK单链(SEQ ID NO.7)，94℃退火后形成双链，用SalⅠ和PstⅠ双酶切piggy-3452质粒，得到3442bp的目的片段，回收3442bp分子量的凝胶；连接DDDDK和3442bp两个目的片段，连接后的质粒命名为piggy-3480。
(4)以piggy-8449质粒(SEQ ID NO.8)为模板设计引物(SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10)，上游引物端加上PstⅠ酶切位点，下游引物端加上BglII和HindⅢ酶切位点，PCR扩增获得FLPA，产物的序列结构为PstⅠ-FLPA-BglII-HindⅢ，用PstⅠ和HindⅢ双酶切FLPA PCR产物，得到624bp的目的片段(SEQ ID NO.11)，回收624bp分子量的凝胶；用PstⅠ和HindⅢ双酶切piggy-3452质粒，得到3472bp的目的片段，回收3472bp分子量的凝胶；连接上述两个目的片段，连接后的质粒命名为piggy-4096。
(8)设计引物，以piggy-8869质粒(SEQ ID NO.12)为模板，PCR扩增获得18s rRNA启动子(SEQ ID NO.15)。并在启动子5’端加KpnI酶切位点，在3’端加BamHI酶切位点。用KpnI和BamHI双酶切PCR产物，得到1176bp的目的片段，胶回收；用KpnI和BamHI双酶切piggy-4096质粒，得到4081bp的目的片段，胶回收；连接两个目的片段，连接后的质粒命名为piggy-5257。
(9)用AflII和BglII、ScaI酶切piggy-5257质粒，得到2610bp的目的片段，胶回收；用AflII和BglII双酶切piggy-6212质粒(SEQ ID NO.16)，得到5870bp的目的片段，胶回收；连接两个目的片段，连接后的质粒命名为piggy-8480(SEQ ID NO.17)。即为包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40-丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列([A3-EGFP-SV40]-[FL692prom oter-18s rRNA-promoter-FLSP-His-DDDDK-FLPA])的通用型质粒。
(10)用ApaI和NheI双酶切piggy-8480质粒，得到长度为8478bp的包含[A3-EGFP-SV40]-[FL692promoter-18s rRNA promoter-FLSP-His6-DDDDK-FLPA和Amp抗性基因的基因序列。将上游端带有ApaI酶切粘性末端序列、下游端带有NheI酶切粘性末端序列的T4连接酶基因与上述片段连接，构建成家蚕后部丝腺生物反应器表达T4连接酶基因的质粒piggyBac-10004，该质粒包含的表达框序列为[A3-EGFP-SV40]-[FL692promoter-18s rRNApromoter-FLSP-His6-DDDDK-T4Ligase-FLPA]。
上述结果说明，利用家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒piggy-8480，仅仅一步就能够得到在家蚕后部丝腺表达T4连接酶基因的质粒。
采用转基因家蚕技术将该双启动子质粒导入家蚕基因组，获得的转基因家蚕的T4连接酶基因表达量，比用单个丝素轻链启动子启动的T4连接酶基因表达量高10％，结果差异达到显著水平。
说明利用本发明的家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒构建转基因家蚕的donor质粒，操作程序简单，工作效率高，而且外源基因的表达量也有显著提高。

Claims (3)

1.一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒，其特征在于：所述的质粒为pBac[A3-EGFP-SV40]-[FL692 promoter-18s rRNA -promoter-FLSP-His-DDDDK-FLPA]，是以piggyBac转座子为基础并带有Amp抗性基因，包括piggyBac转座子的两个转座臂PBL和PBR以及两个转座臂之间的两个功能表达框；
一个功能表达框是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框，即A3 Promoter–EGFP-SV40，另一个功能表达框是包含家蚕丝素蛋白轻链基因启动子、18s rRNA启动子、丝素蛋白轻链基因信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点和家蚕丝素蛋白轻链基因3’末端的表达框，即Fibroin L chain Promoter-18s rRNA promoter-Fibroin L chain signal peptide-His6- DDDDK- Fibroin L chain PolyA；
所述的DDDDK-FLPA之间含有专一性的ApaI和NheI的两个酶切位点，两个酶切位点用于将质粒特异性切开连接外源基因后形成有功能的质粒。
2.一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒的构建方法，其特征在于该方法的步骤如下：
1）将3×P3、DsRed、SV40、FL 692、GFP和SV40的多个功能基因相依次连接获得包含3×P3-DsRed-SV40--FL 692-GFP-SV40功能元件的piggyBac质粒piggy-7801；
2）以piggyBac质粒piggy-7801为模板，以如SEQ ID NO.2的ggtacctttagtggtctgttatgtgaccaatcg序列1和如SEQ ID NO.3的gaattccttaagcgcatattggacatcccttttc序列2为引物，获得丝素轻链基因启动子；
3）用EcoRⅠ和KpnI双酶切pUC19质粒得到包含Amp抗性基因长度为2670 bp的片段，连接包含Amp抗性基因长度为2670 bp的片段和步骤2）获得的丝素轻链基因启动子，得到包含丝素轻链基因启动子和Amp抗性基因的piggyBac质粒piggy- 3378；
4）用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切包含丝素轻链蛋白信号肽和六聚组氨酸的piggyBac质粒piggy-2767，piggyBac质粒piggy-2767的碱基序列如SEQ ID NO.5，得到长度为80bp包含FLSP-His 6的片段，其碱基序列如SEQ ID NO.6；
5）用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切步骤3）获得的piggyBac质粒piggy- 3378，得到长度为3372bp的包含丝素轻链基因启动子和Amp抗性基因片段，连接包含丝素轻链基因启动子和Amp抗性基因片段和步骤4）获得的包含FLSP-His6的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸（FL 692-FLSP-His 6）和Amp抗性基因的质粒piggy-3452；
6）体外合成肠激酶酶切位点的两条DDDDK单链，其碱基序列如SEQ ID NO.7，通过在94℃退火处理后形成双链，用SalⅠ和PstⅠ双酶切步骤5）获得的质粒piggy-3452，得到长度为3442 bp的包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸和Amp抗性基因的片段；
连接DDDDK双链与包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸和Amp抗性基因的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点DDDDK序列和Amp抗性基因的质粒piggy-3480；
7）将丝素轻链基因启动子、丝素轻链蛋白信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点、人血清白蛋白基因和丝素轻链polyA的功能基因依次连接，获得包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点-人血清白蛋白基因-丝素轻链polyA的质粒piggy-8449，以质粒piggy-8449为模板，以如SEQ ID NO.9的CTGCAGATAAGAACTGTAAATAATGTATATA序列3和如SEQ ID NO.10的AAGCTTAGATCTGTGTGACTGCTTCGGACTACATTCT序列4为引物，获得家蚕丝素蛋白轻链3’序列FLPA；
用PstⅠ和HindⅢ双酶切步骤6）获得的质粒piggy-3480，得到长度为3472 bp的包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列（FL 692-FLSP-His 6-DDDDK）和Amp抗性基因的片段；
连接家蚕丝素蛋白轻链3’序列FLPA与包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列和Amp抗性基因的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列（FL692-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA）和Amp抗性基因的piggy-4096质粒；
8）将丝素轻链基因启动子、18s rRNA基因启动子、丝素轻链蛋白信号肽、六聚组氨酸、肠激酶酶切位点和丝素轻链polyA的功能基因依次连接，获得包含丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点-丝素轻链polyA的质粒piggy-8869，其碱基序列如SEQ ID NO.12，以质粒piggy-8869为模板，以如SEQ IDNO.13的ggtaccACCTTCACCTCGTGAAGGCAG序列5和如SEQ ID NO.14的ggatccAGCTCTCTTTTTCGTTAGCTCG序列6为引物，获得18s rRNA基因启动子，其碱基序列如SEQ ID NO.15；
用KpnI和BamHI双酶切步骤7）获得的piggy-4096质粒，得到长度为4081 bp的包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列和Amp抗性基因的片段；
连接18s rRNA基因启动子与包含丝素轻链基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列和Amp抗性基因的片段，得到包含丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列和Amp抗性基因的质粒piggy-5257；
9）将A3基因启动子、绿色荧光蛋白基因、SV40（A3-GFP-SV40）和Amp抗性基因依次连接获得包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40的3’序列（A3-GFP-SV40）和Amp抗性基因的质粒piggy-6212，用AflII和BglII双酶切质粒piggy-6212，得到长度为5870 bp的包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40（A3-GFP-SV40）的片段；
用AflII和BglII、ScaI酶切步骤8）获得的质粒piggy-5257，得到长度为2610 bp的包含丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列的片段；
连接包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40的3’序列的片段与包含丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列的片段，得到包含A3基因启动子-绿色荧光蛋白基因-SV40-丝素轻链基因启动子-18s rRNA基因启动子-丝素轻链蛋白信号肽-六聚组氨酸-肠激酶酶切位点序列-家蚕丝素蛋白轻链3’序列（[A3-EGFP-SV40]-[FL692 promoter-18s rRNA -promoter-FLSP-His 6-DDDDK-FLPA]）的质粒piggy-8480，其碱基序列如SEQ ID NO.17。
3.一种家蚕后部丝腺生物反应器双启动子通用型质粒的应用，其特征在于：权利要求1所述的质粒用于构建表达各种外源基因的donor质粒。
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