CN112359066B

CN112359066B - 脂结合小肽ssip1在介导其融合蛋白进入细胞中的应用

Info

Publication number: CN112359066B
Application number: CN202011285678.0A
Authority: CN
Inventors: 李晓云; 盘诗雨; 陈容钦
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2020-10-09
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2040-11-17
Also published as: CN112359066A

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及脂结合小肽SSIP1在介导其融合蛋白进入细胞中的应用，经实验研究发现，用脂质体预包埋SSIP1‑GFP后，滴加进培养的原生质体或培养的动物细胞中，SSIP1及其融合蛋白可以进入植物细胞或者动物细胞中；将脂质体预包埋后的SSIP‑GFP滴加于拟南芥花器官柱头，可观察到不同程度的绿色荧光表达于花粉导管，在长出来的果柄和果皮也可以观察到绿色荧光，说明SSIP1可作为导肽载体，在不改变基因组的情况下，可快速引导目的蛋白进入胚胎细胞。

Description

脂结合小肽SSIP1在介导其融合蛋白进入细胞中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及脂结合小肽SSIP1在介导其融合蛋白进入细胞中的应用。

背景技术

脂质体是一种优质的药物载体，类似于生物膜，由磷脂双分子定向排列而成超细纳米微囊，可将药物分子包裹在微囊中，改变给药途径，避免药物分子过快被分解掉，使药物具有靶向性和缓释性，具有提高和延长疗效，改变给药途径等特点。目前，脂质体已经广泛应用于包埋功能性多肽和蛋白质。例如，包埋乳铁蛋白,脂肪酶，霉菌蛋白酶，风味蛋白酶，辅酶Q，蛋白清抗氧化肽，花生短肽、谷胱甘肽，抗氧化肽，人表皮生长因子(hEGF)等，提高了蛋白的利用率，稳定酶活及肽活性。

SSIP1小肽来源于拟南芥，在拟南芥中单一拷贝，全长74个氨基酸，相对分子质量为8.9KD(与脂结合后为17-25KD)，目前其功能及是否存在受体尚不清楚。研究表明，在芥菜，胡萝卜，甘薯，花生等双子叶植物中发现有SSIP1的同源基因，但单子叶水稻和玉米中没有发现其同系物。故其在玉米和水稻等单子叶的育种、观赏花卉培养中具有潜在的应用价值，但受转基因农作物的法律规制，转基因农作物的安全性和风险性仍不清楚，推广应用仍受限制。

因此，有必要在不改变基因组的情况下，将SSIP1小肽应用于玉米和水稻等单子叶的育种、观赏花卉培养中。目前，尚未有关于利用SSIP1介导其融合蛋白进入细胞中的报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了脂结合小肽SSIP1在介导其融合蛋白进入细胞中的应用，提出了一种脂质体包埋SSIP1肽瞬转原生质体或植株的方法，该方法在不改变基因组的情况下，通过脂质体包埋的方法，由SSIP1介导其融合蛋白进入细胞或体内。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供SSIP1在介导其融合蛋白进入细胞中的应用。

本发明涉及源于拟南芥植物的小肽(基因ID号AT2G36440，命名为SSIP1)，其CDS序列和蛋白序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明经研究表明，SSIP1具有亲脂性，与脂滴结合后可以移动，母系遗传，即移动的小肽会累积在胚胎细胞，并可遗传至下一代,具有导肽载体的潜在应用价值。

优选地，所述融合蛋白包括但不限于GFP。

本发明还提供一种导肽载体，该导肽载体包括SSIP1。

优选地，还包括脂质体。

进一步的，所述脂质体为脂质体2000。

具体的，所述脂质体为(20-50)％脂质体(即质量浓度百分数为20％-50％的脂质体)。更具体的，所述脂质体为25％脂质体。

本发明还提供上述的导肽载体在介导SSIP1的融合蛋白进入细胞中的应用。

SSIP1与脂结合后可与细胞膜融合并进入细胞，SSIP1具有母系遗传的特点，即SSIP1会移动并累积于早期的胚胎细胞。根据此特点，将SSIP1及其融合蛋白包埋于脂质体后，可将与其融合的蛋白导入胚胎细胞。SSIP1可作为导肽载体，可快速引导目的蛋白进入胚胎细胞，该方法不涉及改变基因组即可以短暂改变一些农艺性状。

本发明还提供上述导肽载体的制备方法，即将SSIP1预包埋于脂质体中。

具体的，将SSIP1预包埋于脂质体中的方法为：用PBS将脂质体进行稀释后(20-50％)，与经原核诱导并纯化得到的蛋白SSIP1等体积混合(来回轻柔颠倒10-20次)。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提出了脂结合小肽SSIP1在介导其融合蛋白进入细胞中的应用，经实验研究发现，用脂质体预包埋SSIP1-GFP后，滴加进培养的原生质体或培养的动物细胞中，SSIP1及其融合蛋白可以进入植物细胞或者动物细胞中；将脂质体预包埋后的SSIP-GFP滴加于拟南芥花器官柱头，可观察到不同程度的绿色荧光表达于花粉导管，在长出来的果柄和果皮也可以观察到绿色荧光，说明SSIP1可作为导肽载体，在不改变基因组的情况下，可快速引导目的蛋白进入胚胎细胞。

附图说明

图1为纯化SSIP1-GFP蛋白的SDS-PAGE电泳检测图；

图2为SSIP1-GFP蛋白或空载GFP蛋白与不同溶剂的包埋效果；

图3为脂质体包埋后的SSIP-GFP蛋白进入原生质体后的状态图；

图4为脂质体包埋后的SSIP-GFP蛋白进入动物细胞后的状态图；

图5为脂质体包埋后的SSIP-GFP蛋白可进入动物细胞的WB检测图；

图6为脂质体包埋后的SSIP-GFP蛋白在花器官中的移动和累积情况。

图5中，CT为正常培养组，PCT为25％脂质体孵育组，sPP20+为25％脂质体预包埋SSIP1(20ng/mL)组细胞，sPP20-为25％脂质体预包埋白蛋白(20ng/mL)组细胞。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。

实施例1 SSIP1-GFP蛋白的获取

1、SSIP1-GFP(Green fluorescent protein，绿色荧光蛋白)原核表达载体的构建

采用Trizol法提取14d拟南芥叶片总RNA，以1μg RNA为模板，按照TaKaRa PrimeScript RT reagent kit with DNA Eraser试剂盒说明书反转录合成cDNA。以拟南芥cDNA为模板，设计引物对SSIP1的CDS序列进行PCR扩增(94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；68℃，40s(回至第1步：33个循环)；72℃，5min，16℃，forever)，上游引物SSIP1-F:5′-AAGCTTGATATCGAATTCATGAGCGGCAAAACATCG-3′(下划线处为EcoRⅠ酶切位点)，下游引物SSIP1-R:5′-TTATCTAGAACTAGTGGATCCTTATTTCTTCTGTTCGTCATCTTCT-3′(下划线处为BamHI酶切位点)，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后胶回收。用EcoRⅠ和BamHI对空载体pGreen0229IT进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳胶回收后，与PCR产物进行连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素(50mg/L)的LB平板上，经菌落PCR验证为阳性的克隆，进行测序鉴定。将测序正确的重组质粒pGreen0229IT-SSIP1转化大肠杆菌表达菌株Rosseta感受态细胞，涂布在含卡那霉素(50mg/L)和氯酶素(34mg/L)的LB平板上培养12-24h，挑取单菌落接种于1mL含氨苄青霉素(50mg/L)的LB液体培养基中，37℃、150rpm振荡培养12-24h，直至OD₆₀₀为0.6左右，-80℃保菌备用，得到SSIP1-GFP原核表达载体。

2、SSIP1-GFP蛋白的诱导表达及纯化

将重组菌pGreen0229IT-SSIP1(Rosseta)接种于LB液体培养基(50mg/L氨苄青霉素，50mg/L卡那霉素，34mg/L氯酶素)中，37℃、150rpm振荡培养12-24h，按1∶100的比例进行扩培后培养至OD₆₀₀为0.5，加入IPTG(0.5mmol/L)，16℃、150rpm诱导10-14h，12000rpm离心10min收集菌体，用5mL Binding buffer[50mL PBS(pH 8.0)，1mmol/LPMSF(苯甲基磺酰氟)，10mmol/L咪唑，0.25g/L溶菌酶，50mmol/L巯基乙醇，1％Triton-100]重悬菌体，冰上静置30min后，超声波破碎10min，功率为15w，间隔时间为10s，破碎至溶液清亮，12000rpm、4℃离心5min，收集上清。用Binding buffer平衡His磁珠，将上清与His磁珠于1.5mL离心管中4℃混匀2-4h，用1mLwash buffer[50ml PBS(pH 8.0),20mmol/L咪唑]冲洗2次，用150μLwash buffer[50ml PBS(pH 8.0),150mmol/L咪唑]洗脱3次，SDS-PAGE电泳检测融合蛋白纯化效果，得到纯化的SSIP1-GFP蛋白(如图1所示)。

实施例2脂质体包埋SSIP1-GFP蛋白进原生质体或细胞实验

将上述经原核诱导得到的纯化SSIP1-GFP或空载GFP蛋白通过与不同溶剂(1×PBS、5mM葡萄糖、10％甘油、25％脂质体2000、20％脂质体2000、125mM CaCl₂)混合。如图2所示的，发现SSIP1-GFP可以完全融解于1×PBS及5mM的葡萄糖中，微包埋于10％甘油中，可全部包埋于25％的脂质体(PEG)中，在125mM CaCl₂中完全沉淀，而在20％PEG中形成较大的脂滴。

同时发现，SSIP1-GFP可较好的包埋于25％的脂质体2000中，形成分散的脂滴，而空的GFP蛋白不能较好的包埋于脂质体2000中。另外，在125mM CaCl₂溶液中，SSIP1-GFP和空载GFP均形成沉淀。故由于植物原生质体的培养液(W5)中含有125mM CaCl₂成分，因此直接加入纯化的SSIP1-GFP或空载GFP均能快速形成沉淀，限制了它们进入细胞。

根据上述的研究，用25％脂质体将SSIP1-GFP或GFP预包埋后，滴加于培养的拟南芥原生质中，如图3所示的共聚焦显微镜观察发现，SSIP1-GFP可以较好的进入原生质体，而空的脂质体包埋的空GFP蛋白可靠近原生质体但不能进入细胞内。

将SSIP1肽通过25％的脂质体包埋后，缓慢滴加于培养的L6细胞(太鼠成肌细胞)中，培养24h去培养液，并用PBS洗3次，多聚甲醛固定后进行细胞免疫荧光观察，绿色为SSIP颗粒，红色为GAPDH，蓝色为细胞核。如图4所示，SSIP1-GFP或SSIP1可以较好的进入动物细胞中。同时，收集固定后的细胞提取总蛋白进行WB检测(免疫印迹)，如图5所示，表明脂质体预包埋SSIP1小肽可进入L6细胞内，而没有预包埋的SSIP1小肽滴加至L6细胞中，WB几乎检测不到SSIP1。

根据上述研究可知，用25％脂质体(高于50％的脂质体容易形成大团的脂复合物沉淀，不利于进入细胞，低于20％的脂质体不能很好的预包埋)预包埋的SSIP1或SSIP1-GFP，滴加进培养的原生质体或培养的动物细胞中，SSIP1-GFP或SSIP1均可以进入植物细胞或者动物细胞中。但溶解于PBS或5mmM葡萄，或沉淀于125mM CaCl₂中的SSIP1小肽，很难进入原生质体。在20％PEG脂滴中的SSIP1小肽只有少部分可以进入原生质体，但不能进入动物细胞，并且20％PEG对动物细胞有损害作用。因此，25％的脂质体作为本说明的包埋载体，对SSIP1-GFP小肽进行包埋可以促进其进入细胞。

实施例3 SSIP1-GFP蛋白进入胚胎细胞实验

将SSIP-GFP小肽(2.5ug/mL)通过25％的脂质体包埋后，打开刚露白的未完成受精的花器官(拟南芥花苞)，缓慢滴加于柱头，完成后将花瓣合上，如图6所示，24-48h可见不同程度的绿色荧光表达于花粉导管，在长出来的荚果的果柄和果皮也可以观察到绿色荧光，表明SSIP-GFP融合蛋白可在体内移动和向胚胎累积。说明SSIP1可作为导肽载体，可快速引导目的蛋白进入胚胎细胞，且该方法不涉及基因组的改变。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 华南师范大学

<120> 脂结合小肽SSIP1在介导其融合蛋白进入细胞中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 225

<212> DNA

<213> SSIP1的CDS序列(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atgagcggca aaacatcgat cactagcagg tcagacgaat ttcaaaggca gatagatcat 60

aaagagatgc ctcgagatca ccaaattgaa aggcacactc atattcacac gacgcgttac 120

cgagggggca gtctagttga ggaggtcatc gagaagcttg agagattcaa agtacgtacg 180

gttaacatct tggtgggagg agaagatgac gaacagaaga aataa 231

<210> 2

<211> 74

<212> PRT

<213> SSIP1的蛋白序列(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

Met Ser Gly Lys Thr Ser Ile Thr Ser Arg Ser Asp Glu Phe Gln Arg

1 5 10 15

Gln Ile Asp His Lys Glu Met Pro Arg Asp His Gln Ile Glu Arg His

20 25 30

Thr His Ile His Thr Thr Arg Tyr Arg Gly Gly Ser Leu Val Glu Glu

35 40 45

Val Ile Glu Lys Leu Glu Arg Phe Lys Val Arg Thr Val Asn Ile Leu

50 55 60

Val Gly Gly Glu Asp Asp Glu Gln Lys Lys

65 70

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> SSIP1-F(人工序列)

<400> 3

aagcttgata tcgaattcat gagcggcaaa acatcg 36

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> SSIP1-R(人工序列)

<400> 4

ttatctagaa ctagtggatc cttatttctt ctgttcgtca tcttct 46

Claims

1.SSIP1小肽在介导其融合蛋白进入细胞中的应用，其特征在于，所述SSIP1小肽的CDS序列和蛋白序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述应用为非疾病诊断或非治疗目的的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述融合蛋白为GFP，所述应用为非疾病诊断或非治疗目的的应用。

3.一种导肽载体，其特征在于，包括SSIP1小肽和脂质体，所述SSIP1小肽预包埋于脂质体中，所述SSIP1的CDS序列和蛋白序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的一种导肽载体，其特征在于，所述脂质体为脂质体2000。

5.根据权利要求4所述的一种导肽载体，其特征在于，所述脂质体为（20-50）%脂质体。

6.根据权利要求5所述的一种导肽载体，其特征在于，所述脂质体为25%脂质体。

7.权利要求3-6任一项所述的导肽载体的制备方法，其特征在于，用PBS将脂质体进行稀释后与蛋白SSIP1等体积混合。