CN113994005A - 基于基因疗法dna载体vtvaf17的基因疗法dna载体 - Google Patents
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Abstract
携带选自COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因的组的靶基因的基于VTvaf17基因疗法DNA载体的基因疗法DNA载体，以便于提高在人和动物中该靶基因的表达水平。此外，基因疗法DNA载体VTvaf17‑COL1A1、或VTvaf17‑COL1A2、或VTvaf17‑P4HA1、或VTvaf17‑P4HA2、或VTvaf17‑COL7A1、或VTvaf17‑CLCA2、或VTvaf17‑ELN、或VTvaf17‑PLOD1分别具有核苷酸序列SEQ ID No.SEQ ID No.3、或SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或SEQ ID No.8。DNA载体不含病毒起源的核苷酸序列和抗生素抗性基因，这提供了其安全用于人和动物中基因疗法的可能性。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程，并且可在生物技术、医学和农业中用于制造基因疗法产品。
背景技术
基因疗法是医学中的创新方法，旨在通过将新的遗传物质递送到患者的细胞中以补偿或遏制突变基因的功能和/或治疗遗传障碍来治疗遗传性和获得性疾病。基因表达的终产物可以是RNA分子或蛋白质分子。然而，体内的大多数生理学过程都与蛋白质分子的功能性活性有关，而RNA分子或是蛋白质合成的中间产物，或是进行调节功能。因此，在大多数情况下，基因疗法的目标是向生物体注入基因，所述基因提供由这些基因编码的蛋白质分子的转录和进一步翻译。在本发明的描述中，基因表达是指产生具有由该基因编码的氨基酸序列的蛋白质分子。
一组基因中包含的COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因在人和动物生物体的若干过程中起关键作用。这些基因参与皮肤和其他器官细胞外基质的形成，以及许多其他过程。
真皮细胞外基质的主要成分是弹性纤维、胶原和蛋白聚糖(27)。弹性纤维由富含微纤维蛋白的微纤维、糖蛋白、弹性蛋白和一些其他蛋白质(13)组成。真皮的细胞外基质的成分通过透明质酸相互连接，从而形成真皮网络(27)。由I型和III型胶原形成的长胶原纤维缠绕，与VII型胶原形成锚定在真皮和表皮边缘的皮内网络(12)。
在主要由于内在机制的皮肤老化期间，真皮中的胶原和弹性纤维形成细胞结构(22)。在由外部因素引起的老化过程中，诸如例如在紫外线辐射下，I型、III型和最重要的是VII型胶原蛋白正在丢失(3；30)。此外，长胶原纤维、弹性纤维、糖蛋白和糖胺聚糖失去了它们形成真皮细胞外基质的功能网络的能力，相反，它们在真皮中形成非结构化片段(22)。由于炎症或暴露于紫外线照射而迁移到真皮层的嗜中性粒细胞产生的弹性蛋白酶活性(14)，以及基质金属蛋白酶的激活，加剧了ECM中的这些变化。
除了在大多数情况下是一个自然过程的皮肤老化外，真皮细胞外基质可能参与各种疾病的发病机制，疾病的形成可能与参与其形成的不同基因的表达直接或间接相关。此外，由于大多数细胞外基质分子参与了不限于皮肤的各种生物过程，因此由许多基因的表达不足引起的生物体的病理和有害状态可能表现为皮肤结构损伤，但不限于该组织。例如，胶原蛋白家族参与了身体许多组织的结构组织和新陈代谢，包括软骨、骨骼、肌腱、皮肤和眼白(巩膜)。发现了编码胶原蛋白(例如I型、III型或V型)或胶原蛋白修饰酶(例如赖氨酰羟化酶、胶原酶)的基因的个体突变会导致不同形式的Ehlers-Danlos综合征，这些综合征影响支持皮肤、骨骼、血管和其他器官的结缔组织(结缔组织的全身性发育不良)。这种疾病的症状和体征变化范围很广。主要症状包括关节过动、病理性疤痕形成和伤口愈合受损、血管无力和绒毛状过度伸展皮肤(velvety hyperextensible skin)。
I型胶原是人类最常见的胶原形式。I型胶原由两条前-α1(I)链和一条前-α2(I)链组成。COL1A1基因编码前-α1(I)链，COL1A2基因编码前-α2(I)。
描述了导致婴儿皮层骨肥厚(cortical hyperostosis)或卡菲病(Caffeydisease)的COL1A1基因突变。这种病况的特点是软组织水肿(例如肌肉)、疼痛和新骨组织的过度形成(骨肥厚)。骨骼异常主要影响颚骨、根锁骨(clavicles)、(锁骨(collarbones))和四肢长骨的骨干。
另一种遗传性疾病是脆骨病(brittle bone disease)，它是由于胶原基因的突变所致的并且引起弥漫性异常骨脆，有时伴有感音神经性听力损失(sensorineural hearingloss)、蓝色硬结(blue scleros)、牙质发育不全和关节过动。90％患有主要疾病类型之一的人在COL1A1或COL1A2基因中具有突变。基因疗法的方法被认为是治疗该综合征的有希望的方向之一。也描述了一个实验性治疗的临床病例，其中将表达正常胶原基因的骨髓间充质干细胞注射到脆骨病患者中，产生了显著的治疗效果(18)。
VII型胶原是皮肤中主要的结构成分，其包括在锚定原纤维中。这些原纤维位于构成位于表皮和真皮之间的双层膜的区域。胶原原纤维将两层皮肤维系在一起，连接表皮基膜和真皮。
COL7A1基因编码VII型胶原。三条前-α1(VII)链缠绕在一起形成三链前胶原分子。前胶原分子由细胞分泌，由酶加工以从末端移除额外的蛋白质片段。一旦这些分子被加工，它们就会排列成成熟的VII型胶原的细长束。
COL7A1基因突变导致营养不良性大疱性表皮松解症(dystrophic epidermolysisbullosa)。水疱最常发生在轻微受伤的部位，如肘部伸肌面和手足背。愈合导致疤痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多(hyperpigmentation)。有些患者有指甲营养不良。皮肤外表现，包括泌尿道和胃肠道损伤，外眼膜，慢性贫血，骨质疏松和生长迟缓经常发生。大疱性表皮松解症患者具有很高的癌症风险，特别是形成侵袭性鳞状细胞癌。根据DEBRAInternational的数据，世界上每5-10万人中就产生一名患者。
治疗大疱性表皮松解症的基因疗法方法包括不同的实验性治疗。在COL7A1基因突变纠正的若干研究中，成功地使用了离体基因组编辑技术(20)、编码COL7A1基因的线性DNA分子的微量注射(19)、使用整合酶的cDNA整合(23)、慢病毒载体的皮内注射(34)、基于TALEN核酸酶的突变修复技术(24)，以及使注射自体细胞，即用各种反转录病毒载体修饰的成纤维细胞或角质形成细胞(11，6，7)。目前，这些方法的临床试验处于不同的研究阶段(NCT01263379，NCT02810951)。
胶原分子生成和稳定的一个重要步骤是翻译后修饰，即为稳定胶原三螺旋所必需的脯氨酸羟基化，以及在胶原纤维组装过程中为随后胶原分子之间的共价键结合所必需的赖氨酸羟基化。参与这些修饰过程的酶分别是脯氨酰4-羟化酶和赖氨酰5-羟化酶。
脯氨酰4-羟化酶由2个α亚基和2个β亚基组成。α亚基指的是数种类型，由P4HA1和P4HA2基因编码。P4HA1基因的突变可以导致上述Ehlers-Danlos综合征的形式之一。也描述了人类P4HA1基因的突变，该突变导致一种独特的病理表型，其特征是早期关节过动、关节挛缩、肌肉无力和骨发育不良以及近视(35)。据报道吸烟引起P4HA1基因表达抑制。这项研究的作者将这种现象与吸烟者血管壁胶原代谢障碍(disorder)的诱导联系起来，从而导致动脉粥样硬化频率上升和动脉瘤(25)。P4HA2基因突变导致近视(21)。P4HA2基因转录抑制也发生在淋巴样细胞，这可能与肿瘤疾病的发病机制有关(9)。P4HA1表达的变化被提出作为筛选来自植物材料的抗衰老化妆品制剂功效的方法之一(28)。
大量的弹性蛋白，即ELN基因编码的蛋白质，与胶原一起包含于结缔组织的细胞外基质中。弹性蛋白在经受恒定延伸和压缩的器官中发挥重要功能，例如在动脉、肺、皮肤、肌腱和各种括约肌(39)中。弹性蛋白和胶原纤维帮助器官在延伸后恢复其原始大小，例如，在皮肤挤压或膀胱排空后(38)。纤维之间的交联形成量不足或根本没有形成，正常弹性蛋白形式的形成减少。因此，弹性组织的抗拉强度下降，出现变薄、肌肉松弛、延伸等现象，即失去弹性性能。这些障碍在临床上表现为心血管改变(动脉瘤和主动脉破裂，心脏瓣膜缺损)，频繁的肺炎和肺气肿(36)。如果ELN基因突变导致体内弹性蛋白合成障碍，则发生主动脉瓣上狭窄(supra-aortic stenosis)(5)。此外，使用表达ELN基因的病毒载体的基因工程方法被成功地应用于修饰细胞用于旨在修复实验动物软组织损伤的细胞治疗(16)。
PLOD1基因编码赖氨酰羟化酶1。这种酶修饰赖氨酸，产生羟赖氨酸。胶原分子中的羟赖氨酸是胶原纤维之间形成交联所必需的。像以前大多数与细胞外基质合成和形成相关的基因一样，PLOD1基因的突变与Ehlers-Danlos综合征的发展相关(33)。也有证据表明该基因的多态性可能与骨密度和骨质疏松的风险相关(31)。
CLCA2基因编码Ca通道的调节因子，并在各种上皮组织(皮肤、角膜上皮、食管、喉和阴道上皮)中表达(2)。对大鼠的实验表明，紫外线照射下皮肤角质形成细胞中该基因的表达明显减少(1)。研究人员在研究特应性皮炎发病机制时发现，此基因对于保护角质形成细胞免于在高渗休克(由水量不足引起)下的凋亡以及CLCA2被抑制时表皮中的粘附缺少是必需的。因此，CLCA2基因对于上皮细胞在不充分水分条件下的适应和生存是必需的(29)。
因此，本发明的背景技术表明，COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因中的突变或由这些基因编码的蛋白质的表达不足与一系列疾病的发展相关，包括但不限于，皮肤和其他器官的细胞外基质构造(organisation)中的障碍相关的遗传性和获得性病理状况，导致病理过程和有害状况，这些过程落入普遍接受的标准限度内，但可以得到改善，并且是涉及与细胞外基质不直接相关的过程。这就是COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因被归入本专利的原因。提供由COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因编码的蛋白质表达的遗传构建体可用于开发预防和治疗不同疾病以及病理和不利状况的药物。
此外，这些数据表明，在一组基因中包含的COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因编码的蛋白质的表达不足不仅与病理状况有关，而且与它们发展的易感性有关。此外，这些数据表明，这些蛋白质的表达不足可能不以现有临床实践标准(例如，使用ICD代码)框架内可以明确描述的病理学形式明确出现，但同时导致对人和动物不利并与生活质量恶化有关的状况。
对提高治疗性基因表达的方法的分析意味着使用不同基因疗法载体的可行性。
将基因疗法载体分为病毒、细胞和DNA载体(8)。最近，基因疗法越来越重视非病毒基因递送系统的开发，其中质粒载体位居榜首。质粒载体没有细胞和病毒载体固有的限制。在靶细胞中，它们作为附加体存在，没有整合到基因组中，而产生它们相当便宜，并且没有施用质粒载体而引起的免疫反应或副作用，这使得它们成为遗传疾病的基因疗法和预防(DNA疫苗接种)的便捷工具(15)。
然而，在基因疗法中质粒载体使用的局限性是：1)用于在细菌菌株中生产构建体的抗生素抗性基因的存在；2)由病毒基因组序列所代表的各种调控元件的存在；3)决定载体递送至靶细胞的效率的治疗性质粒载体的长度。
众所周知，欧洲药品管理局认为有必要避免将抗生素抗性标记基因添加到用于基因疗法的新工程化的质粒载体中(关于开发过程中基因疗法药物产物的设计修改的读后报告(Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinalproducts during development)/2011年12月14日EMA/CAT/GTWP/44236/2009先进疗法委员会(Committee for advanced therapies))。该建议主要与DNA载体渗透或水平抗生素抗性基因转移到体内存在的细菌细胞中的潜在危险有关，这些细菌是正常或机会性微生物群落的一部分。此外，抗生素抗性基因的存在显著增加了DNA载体的长度，这降低了其渗透到真核细胞的功效。
值得注意的是，抗生素抗性基因也对DNA载体的生产方法做出了根本性的贡献。如果存在抗生素抗性基因，那么用于产生DNA载体的菌株通常在含有选择性抗生素的培养基中培养，这会在未经充分纯化的DNA载体制剂中造成抗生素痕量的风险。因此，没有抗生素抗性基因的用于基因疗法的DNA载体的生产与菌株的生产有关，其中此类菌株具有独特的特征，例如在无抗生素的培养基中治疗性DNA载体稳定扩增的能力。
此外，欧洲药品管理局建议避免在治疗性质粒载体中存在构成各种病毒的基因组核苷酸序列的提高治疗性基因表达的调控元件(启动子、增强子、翻译后调控元件)(关于基因疗法药物产品的质量、非临床和临床方面的指南草案(Draft Guideline on thequality,non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinalproducts)，http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2015/05/WC500187020.pdf)。尽管这些序列可以提高治疗性转基因的表达水平，但是它们造成了与野生型病毒的遗传物质重组和整合到真核基因组中的风险。此外，疗法用的特定基因的过表达的相关性仍然是悬而未决的问题。
疗法载体的大小也是必需的。众所周知，现代质粒载体通常具有不必要的非功能性位点，这些位点会显著增加其长度(Mairhofer J,Grabherr R.//MolBiotechnol.2008.39(2):97-104)。例如，pBR322系列载体中的氨苄青霉素抗性基因，通常由至少1000bp组成，占载体本身长度的20％以上。观察到载体长度与其渗入真核细胞的能力之间的反向关系；具有小长度的DNA载体有效渗入人和动物细胞中。例如，在关于用383-4548bp DNA载体转染HELA细胞的一系列实验中，显示渗入功效的差异可高达两个数量级(100倍差异)(10)。
因此，为了安全和最大效率的原因在选择DNA载体时，应优先考虑到如下那些构建体，它们不包含抗生素抗性基因，病毒来源的序列，并且其长度允许有效渗入到真核细胞中。以对于基因疗法目的足够的量生产此类DNA载体的菌株应确保使用无抗生素的营养培养基进行稳定的DNA载体扩增的可能性。
用于基因疗法的重组DNA载体的使用实例是产生用于遗传免疫的重组载体的方法(专利号US 9550998 B2)。质粒载体是超螺旋的质粒DNA载体，其用于人和动物细胞中克隆基因的表达。载体包含复制起点，含有人巨细胞病毒启动子和增强子的调控元件，以及来自人T-细胞嗜淋巴细胞病毒的调节序列。
利用噬菌体，通过插入菌株中的sacB基因的反义互补，将载体在无抗生素的专用大肠杆菌菌株中积累。该发明的缺点是在DNA载体组成中存在构成病毒基因组的序列的调控元件。
以下描述的专利和申请可以被认为是本发明的原型。
申请号WO2001042285A2描述了一种用于恢复细胞外基质并防止其降解的方法，其包括基因疗法方法和表达基因的载体，所述基因含有选自在细胞外基质形成和维持期间表达的序列组(SEQ1-SEQ21)的序列。该发明的缺点是在发明中选择序列的方法不是基于由这些基因编码的蛋白质的生理功能，而是基于不同序列的转录分析。此外，该发明没有提供用于基因疗法的特定载体的功效和安全性的理由。
申请号JPH0823979A描述了一种改善细胞外基质形成的基因疗法方法，其包括表达在胶原纤维形成期间提供生化反应的胶原和/或脯氨酰羟化酶。该发明的缺点是仅通过胶原分子中脯氨酸的羟基化反应来调节细胞外基质形成的有限方式，该发明的另一个缺点是使用杆状病毒载体。
申请号WO2002094876A2描述了使用提供CLCA2表达的基因疗法构建体来控制肺组织中粘蛋白表达的方法。该发明的缺点是对载体的有限使用和模糊的安全要求。
因此，在本发明的技术背景下，需要一种有效和安全的基因疗法方法的发明，该方法允许提高参与细胞外基质形成的基因的表达，其中考虑直接结构分子(如胶原和弹性蛋白)和提供其翻译后修饰的酶。
发明内容
本发明的目的是构建基因疗法DNA载体，以便于在人和动物生物体中提高COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因的组的表达水平，所述基因疗法载体结合以下特性：
I)基因疗法DNA载体的效率，以便于提高真核细胞中治疗性基因的表达水平。
II)由于基因疗法DNA载体中不存在代表病毒基因组核苷酸序列的调控元件，因此在人类和动物的基因疗法中安全使用的可能性。
III)由于基因疗法DNA载体中不存在抗生素抗性基因，在人类和动物的基因疗法中安全使用的可能性。
IV)在工业规模上基因疗法DNA载体的可生产性和可构建性。
根据国家监管机构对基因疗法药物的建议，并且特别是欧洲药品管理局的要求，即避免将抗生素抗性标记基因添加到用于基因疗法的新工程化的质粒载体中(关于开发过程中基因疗法药物产物的设计修改的读后报告/2011年12月14日EMA/CAT/GTWP/44236/2009先进疗法委员会)，以及避免将病毒基因组添加到用于基因疗法的新工程化的质粒载体中(关于基因疗法药物产品的质量、非临床和临床方面的指南/2015年3月23日，EMA/CAT/80183/2014，先进疗法委员会)，在本文中提供了II和III项。
本发明的目的还包括构建携带这些基因疗法DNA载体的菌株，在工业规模上开发和生产这些基因疗法DNA载体。
通过使用基于基因疗法DNA载体VTvaf17产生的基因疗法DNA载体来实现特定目的，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多，其中所述基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1包含克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的COL1A1治疗性基因编码区，具有核苷酸序列SEQ ID No.1；基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2包含克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的COL1A2治疗性基因的编码区，具有核苷酸序列SEQ ID No.2；基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1包含克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的P4HA1治疗性基因的编码区，具有核苷酸序列SEQ ID No.3；基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2包含克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的P4HA2治疗性基因的编码区，具有核苷酸序列SEQ ID No.4；基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1包含克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的COL7A1治疗性基因的编码区，具有核苷酸序列SEQ ID No.5；基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2包含克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的CLCA2治疗性基因的编码区，具有核苷酸序列SEQ ID No.6；基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN包含克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的ELN治疗性基因的编码区，具有核苷酸序列SEQ ID No.7；基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1包含克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的PLOD1治疗性基因的编码区，具有核苷酸序列SEQ ID No.8。
由于VTvaf17载体部分不超过3200bp的有限大小，构建的基因疗法DNA载体中的每一种，即VTvaf17-COL1A1、或VTvaf17-COL1A2、或VTvaf17-P4HA1、或VTvaf17-P4HA2、或VTvaf17-COL7A1、或VTvaf17-CLCA2、或VTvaf17-ELN、或VTvaf17-PLOD1具有有效渗入人和动物细胞并表达克隆到其中的COL1A1、或COL1A2、或P4HA1、或P4HA2、或COL7A1、或CLCA2、或ELN、或PLOD1治疗性基因的能力。
所构建的基因疗法DNA载体中的每一种，即VTvaf17-COL1A1、或VTvaf17-COL1A2、或VTvaf17-P4HA1、或VTvaf17-P4HA2、或VTvaf17-COL7A1、或VTvaf17-CLCA2、或VTvaf17-ELN、或VTvaf17-PLOD1使用如下核苷酸序列作为结构元件，所述核苷酸序列不是抗生素抗性基因、病毒基因，或病毒基因组的调控元件，这确保其安全用于人和动物的基因疗法。
还开发了携带COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN、PLOD1治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的生产方法，所述方法涉及如下获得基因疗法DNA载体中的每一种：VTvaf17-COL1A1或VTvaf17-COL1A2或VTvaf17-P4HA1或VTvaf17-P4HA2或VTvaf17-COL7A1或VTvaf17-CLCA2或VTvaf17-ELN或VTvaf17-PLOD1：将COL1A1、或COL1A2、或P4HA1、或P4HA2、或COL7A1、或CLCA2、或ELN、或PLOD1治疗性基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17中，并且分别获得基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1，SEQ IDNo.1；或VTvaf17-COL1A2，SEQ ID No.2；或VTvaf17-P4HA1，SEQ IDNo.3；或VTvaf17-P4HA2，SEQ IDNo.4；或VTvaf17-COL7A1，SEQ IDNo.5；或VTvaf17-CLCA2，SEQ IDNo.6；或VTvaf17-ELN，SEQ ID No.7；或VTvaf17-PLOD1，SEQ ID No.8，其中所述COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN、PLOD1治疗性基因的编码区通过如下获得：通过从人生物学组织样本分离总RNA，随后使用所获得的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增，并通过相应的限制性内切核酸酶切割扩增产物，其中由NheI和HindIII、或BamHI-KpnI、或BamHI-SalI、或SalI-EcoRI、或BamHI-EcoRI限制位点进行对基因疗法DNA载体VTvaf17的克隆，其中在无抗生素的情况下选择，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、SEQID No.1生产过程中用于反转录反应和PCR扩增：
Col1A1_F CCAGCTAGCGTCTAGGGTCTAGACATGTTC，
Col1A1_R TATAAGCTTCTACAGGAAGCAGACAGGGCCAAC，
并且通过NheI和HindIII限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将COL1A1基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2、SEQID No.2生产过程中用于反转录反应和PCR扩增：
Col1A2_F CCAGCTAGCGTCTAAGTGCTAGACATGCTC，
Col1A2_R CGAAGCTTTTATTTGAAACAGACTGGGCCA，
并且通过NheI和HindIII限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将COL1A2基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1、SEQID No.3生产过程中用于反转录反应和PCR扩增：
P4HA1_F AGGATCCACCATGATCTGGTATATATTAATTATAGG，
P4HA1_R TTCGGTACCTATTCCAATTCTGACAACGTACAAG，
并且通过BamHI和KpnI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将P4HA1基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2、SEQID No.4生产过程中用于反转录反应和PCR扩增的：
P4HA2_F AGGATCCACCATGAAACTCTGGGTGTCTGCA，
P4HA2_R CTTGTCGACTTAGTCAACTTCTGTTGATCCACA，
并且通过BamHII和SalI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将P4HA2基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、SEQID No.5生产过程中用于反转录反应和PCR扩增：
COL7A1_F ATCGTCGACCACCATGACGCTGCGGCTTCTGGT，
COL7A1_R ATAGAATTCAGTCCTGGGCAGTACCTGTC，
并且通过SalI和EcoRI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将COL7A1基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、SEQID No.6生产过程中用于反转录反应和PCR扩增：
CLCA2_F AGGATCCACCATGACCCAAAGGAGCATTGC，
CLCA2_RATAGAATTCATAATAATTTTGTTCCATTCTCTTTC，
并且通过BamHI和EcoRI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将CLCA2基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN、SEQ IDNo.7生产过程中用于反转录反应和PCR扩增：
ELN_F TTTGTCGACCACCATGGCGGGTCTGACGGCGG，
ELN_R TTTTTGAATTCTCATTTTCTCTTCCGGCCACAAGCTT，
并且通过SalI和EcoRI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将ELN基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1、SEQID No.8生产过程中用于反转录反应和PCR扩增：
PLOD1_F GGATCCACCATGCGGCCCCTGCTGCTACT，
PLOD1_R ATAGAATTCAGGGATCGACGAAGGAGACT，
并且通过BamHII和EcoRI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将PLOD1基因的编码区克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17。
开发了使用携带COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多的方法，所述方法涉及用从基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的所构建的基因疗法DNA载体的组选择的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体，或选择的若干种基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体转染患者或动物器官和组织的细胞；和/或将通过从基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的所构建的基因疗法DNA载体选择的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体或选择的若干种基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体转染的所述患者或动物的自体细胞注射到相同患者或动物的器官和组织；和/或将从基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的所构建的基因疗法DNA载体的组选择的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体或选择的若干种基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体注射到相同患者或动物的器官和组织，或所指示的方法的组合。
开发了用于构建基因疗法DNA载体的菌株的生产方法，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多，所述方法涉及制备大肠杆菌株SCS110-AF的电感受态细胞，并用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1对这些细胞进行电穿孔。之后，将细胞倒入含有选择性培养基的琼脂板(培养皿)，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖、和10μg/ml氯霉素，并且作为结果，获得大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1。
要求保护大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1供其生产，在基因疗法DNA载体生产过程中允许无抗生素选择；或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2供其生产，在基因疗法DNA载体生产过程中允许无抗生素选择；或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1供其生产，在基因疗法DNA载体生产过程中允许无抗生素选择；或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2供其生产，在基因疗法DNA载体生产过程中允许无抗生素选择；或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1供其生产，在基因疗法DNA载体生产过程中允许无抗生素选择；或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2供其生产，在基因疗法DNA载体生产过程中允许无抗生素选择；或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN供其生产，在基因疗法DNA载体生产过程中允许无抗生素选择；或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1供其生产，在基因疗法DNA载体生产过程中允许无抗生素选择，用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多。
开发在工业规模上生产携带COL1A1、或COL1A2、或P4HA1、或P4HA2、或者COL7A1、或CLCA2、或者ELN、或PLOD1治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的方法，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多，所述方法涉及通过以下来产生基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1、或基因疗法DNA载体ДНК-векторVTvaf17-P4HA2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1：用选自大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1的种子培养物对含有制备的培养基的培养烧瓶接种，然后将细胞培养物在培养箱摇床上孵育并转移到工业发酵罐中，然后培养到稳定期，然后提取含有靶DNA产物的级份，进行多级过滤，并通过色谱法纯化。
附图说明
本发明的实质在以下图中进行解释，其中：
图1
显示携带选自COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因的组的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17的结构，其构成能够在大肠杆菌细胞中自主性复制的环状双链DNA分子。
图1显示对应于以下各项的结构：
A-基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1，
B-基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2，
C-基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1，
D-基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2，
E-基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1，
F-基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2，
G-基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN，
H-基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1。
将载体的以下结构元件以如下结构指示：
EF1a-人延长因子EF1A的启动子区域，含有基因的第一个内含子中包含的内在增强子。它确保重组基因在大多数人组织中的高效转录，
分别对应于COL1A1基因(图1A)、COL1A2基因(图1B)、P4HA1基因(图1C)、P4HA2基因(图1D)、COL7A1基因(图1E)、CLCA2基因(图1F)、ELN基因(图1G)、PLOD1基因(图1H)的编码区的治疗性基因的阅读框；
hGH TA-人生长因子基因的转录终止子和聚腺苷酸化位点，
ori-用于自主性复制的复制起点，具有单核苷酸取代以增加大多数大肠杆菌菌株细胞中的质粒产生，
RNA out-在使用大肠杆菌菌株SCS110-AF的情况下，允许无抗生素阳性选择的转座子Tn10的调控元件RNA-out。
标记独特的限制位点。
图2
显示在HDFa原代人真皮成纤维细胞培养物(ATCC PCS-201-01)中，在用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1转染这些细胞之前和转染后48小时，治疗性基因(即COL1A1基因)的cDNA扩增子累积的图，以便于评价渗入真核细胞的能力和功能性活性，即在mRNA水平上的治疗性基因的表达。
在反应过程中，将扩增子累积的以下曲线显示在图2中，对应于：
1-在用DNA载体VTvaf17-COL1A1转染前，HDFa原代人皮肤成纤维细胞培养物中COL1A1基因的cDNA，
2-在用DNA载体VTvaf17-COL1A1转染后，HDFa原代人皮肤成纤维细胞培养物中COL1A1基因的cDNA，
3-在用DNA载体VTvaf17-COL1A1转染前，HDFa原代人皮肤成纤维细胞培养物中B2M基因的cDNA，
4-在用DNA载体VTvaf17-COL1A1转染后，HDFa原代人皮肤成纤维细胞培养物中B2M基因的cDNA。
将GenBank数据库中，编号NM 004048.2下列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因用作参考基因。
图3
显示在HDFa原代人真皮成纤维细胞培养物(ATCC PCS-201-01)中，在用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2转染这些细胞之前和转染后48小时，治疗性基因(即COL1A2基因)的cDNA扩增子累积的图，以便于评价渗入真核细胞的能力和功能性活性，即在mRNA水平上的治疗性基因的表达。
在反应过程中，将扩增子累积的以下曲线显示在图3中，对应于：
1-在用DNA载体VTvaf17-COL1A2转染前，HDFa原代人皮肤成纤维细胞培养物中COL1A2基因的cDNA，
2-在用DNA载体VTvaf17-COL1A2转染后，HDFa原代人皮肤成纤维细胞培养物中COL1A2基因的cDNA，
3-在用DNA载体VTvaf17-COL1A2转染前，HDFa原代人皮肤成纤维细胞培养物中B2M基因的cDNA，
4-在用DNA载体VTvaf17-COL1A2转染后，HDFa原代人皮肤成纤维细胞培养物中B2M基因的cDNA。
将GenBank数据库中，编号NM 004048.2下列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因用作参考基因。
图4
显示在Hs27人原代包皮成纤维细胞系(ATCC CRL-1634)中，在用基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1转染这些细胞之前和转染后48小时，治疗性基因(即P4HA1基因)的cDNA扩增子累积的图，以便于评价渗入真核细胞的能力和功能性活性，即在mRNA水平上的治疗性基因的表达。
在反应过程中，将扩增子累积的以下曲线显示在图4中，对应于：
1-在用DNA载体VTvaf17-P4HA1转染前，Hs27人原代包皮成纤维细胞系中P4HA1基因的cDNA，
2-在用DNA载体VTvaf17-P4HA1转染后，Hs27人原代包皮成纤维细胞系中P4HA1基因的cDNA，
3-在用DNA载体VTvaf17-P4HA1转染前，Hs27人原代包皮成纤维细胞系中B2M基因的cDNA，
4-在用DNA载体VTvaf17-P4HA1转染后，Hs27人原代包皮成纤维细胞系中B2M基因的cDNA。
将GenBank数据库中，编号NM 004048.2下列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因用作参考基因。
图5
显示在Hs27人原代包皮成纤维细胞系(ATCC CRL-1634)中，在用基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2转染这些细胞之前和转染后48小时，治疗性基因(即P4HA2基因)的cDNA扩增子累积的图，以便于评价渗入真核细胞的能力和功能性活性，即在mRNA水平上的治疗性基因的表达。
在反应过程中，将扩增子累积的以下曲线显示在图5中，对应于：
1-在用DNA载体VTvaf17-P4HA2转染前，Hs27人原代包皮成纤维细胞系中P4HA2基因的cDNA，
2-在用DNA载体VTvaf17-P4HA2转染后，Hs27人原代包皮成纤维细胞系中P4HA2基因的cDNA，
3-在用DNA载体VTvaf17-P4HA2转染前，Hs27人原代包皮成纤维细胞系中B2M基因的cDNA，
4-在用DNA载体VTvaf17-P4HA2转染后，Hs27人原代包皮成纤维细胞系中B2M基因的cDNA。
将GenBank数据库中，编号NM 004048.2下列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因用作参考基因。
图6
显示在HT 297.T成纤维细胞培养物(
CRL-7782TM)中，在用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1转染这些细胞之前和转染后48小时，治疗性基因(即COL7A1基因)的cDNA扩增子累积的图，以便于评价渗入真核细胞的能力和功能性活性，即在mRNA水平上的治疗性基因的表达。
在反应过程中，将扩增子累积的以下曲线显示在图6中，对应于：
1-在用DNA载体VTvaf17-COL7A1转染前，HT 297.T成纤维细胞培养物中COL7A1基因的cDNA，
2-在用DNA载体VTvaf17-COL7A1转染后，HT 297.T成纤维细胞培养物中COL7A1基因的cDNA，
3-在用DNA载体VTvaf17-COL7A1转染前，HT 297.T成纤维细胞培养物中B2M基因的cDNA，
4-在用DNA载体VTvaf17-COL7A1转染后，HT 297.T成纤维细胞培养物中B2M基因的cDNA。
将GenBank数据库中，编号NM 004048.2下列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因用作参考基因。
图7
显示在HT 297.T成纤维细胞培养物(
CRL-7782TM)中，在用基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2转染这些细胞之前和转染后48小时，治疗性基因(即CLCA2基因)的cDNA扩增子累积的图表，以便于评价渗入真核细胞的能力和功能性活性，即在mRNA水平上的治疗性基因的表达。
在反应过程中，将扩增子累积的以下曲线显示在图7中，对应于：
1-在用DNA载体VTvaf17-CLCA2转染前，HT 297.T成纤维细胞培养物中CLCA2基因的cDNA，
2-在用DNA载体VTvaf17-CLCA2转染后，HT 297.T成纤维细胞培养物中CLCA2基因的cDNA，
3-在用DNA载体VTvaf17-CLCA2转染前，HT 297.T成纤维细胞培养物中B2M基因的cDNA，
4-在用DNA载体VTvaf17-CLCA2转染后，HT 297.T成纤维细胞培养物中B2M基因的cDNA。
将GenBank数据库中，编号NM 004048.2下列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因用作参考基因。
图8
显示在HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物(ATCC PCS-200-011)中，在用基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN转染这些细胞之前和转染后48小时，治疗性基因(即ELN基因)的cDNA扩增子累积的图，以便于评价渗入真核细胞的能力和功能性活性，即在mRNA水平上的治疗性基因的表达。
在反应过程中，将扩增子累积的以下曲线显示在图8中，对应于：
1-在用DNA载体VTvaf17-ELN转染前，HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物中ELN基因的cDNA，
2-在用DNA载体VTvaf17-ELN转染后，HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物中ELN基因的cDNA，
3-在用DNA载体VTvaf17-ELN转染前，HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物中B2M基因的cDNA，
4-在用DNA载体VTvaf17-ELN转染后，HEKa原代人表皮角质形成细胞培养物中B2M基因的cDNA。
将GenBank数据库中，编号NM 004048.2下列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因用作参考基因。
图9
显示在HEMa原代人表皮黑色素细胞培养物(
PCS-200-013TM)中，在用基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1转染这些细胞之前和转染后48小时，治疗性基因(即PLOD1基因)的cDNA扩增子累积的图表，以便于评价渗入真核细胞的能力和功能性活性，即在mRNA水平上的治疗性基因的表达。
在反应过程中，将扩增子累积的以下曲线显示在图9中，对应于：
1-在用DNA载体VTvaf17-PLOD1转染前，HEMa原代人表皮黑色素细胞培养物中PLOD1基因的cDNA，
2-在用DNA载体VTvaf17-PLOD1转染后，HEMa原代人表皮黑色素细胞培养物中PLOD1基因的cDNA，
3-在用DNA载体VTvaf17-PLOD1转染前，HEMa原代人表皮黑色素细胞培养物中B2M基因的cDNA，
4-在用DNA载体VTvaf17-PLOD1转染后，HEMa原代人表皮黑色素细胞培养物中B2M基因的cDNA。
将GenBank数据库中，编号NM 004048.2下列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因用作参考基因。
图10
显示在HDFa原代人真皮成纤维细胞(ATCC PCS-201-01)中，在用DNA载体VTvaf17-COL1A1转染这些细胞后，细胞裂解物中COL1A1蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性，即基于细胞裂解物中COL1A1蛋白质浓度变化的蛋白质水平上的表达。
将以下元件指示在图10中：
培养物A-用无质粒DNA的水性树枝状聚合物(dendrimer)溶液(参考)转染的HDFa人真皮成纤维细胞培养物，
培养物B-用DNA载体VTvaf17转染的HDFa人真皮成纤维细胞培养物，
培养物C-用DNA载体VTvaf17-COL1A1转染的HDFa人真皮成纤维细胞培养物。
图11
显示在HDFa原代人真皮成纤维细胞培养物(ATCC PCS-201-01)裂解物中，在用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2转染这些细胞后，COL1A2蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性(即蛋白质水平上的治疗性基因表达)以及通过携带COL1A2治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白质表达水平的可能性。
将以下元件指示在图11中：
培养物A-用无质粒DNA的水性树枝状聚合物溶液(参考)转染的HDFa人真皮成纤维细胞培养物，
培养物B-用DNA载体VTvaf17转染的HDFa人真皮成纤维细胞培养物，
培养物C-用DNA载体VTvaf17-COL1A2转染的HDFa人真皮成纤维细胞培养物。
图12
显示在Hs27人原代包皮成纤维细胞系(ATCC CRL-1634)的裂解物中，在用基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1转染这些细胞后，P4HA1蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性(即蛋白质水平上的治疗性基因表达)以及通过携带P4HA1治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白质表达水平的可能性。
将以下元件指示在图12中：
培养物A-用无质粒DNA的水性树枝状聚合物溶液(参考)转染的Hs27人原代包皮成纤维细胞培养物，
培养物B-用DNA载体VTvaf17转染的Hs27人原代包皮成纤维细胞培养物，
培养物C-用DNA载体VTvaf17-P4HA1转染的Hs27人原代包皮成纤维细胞培养物。
图13
显示在Hs27人原代包皮成纤维细胞系(ATCC CRL-1634)的裂解物中，在用DNA载体VTvaf17-P4HA2转染这些细胞后，P4HA2蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性(即在蛋白质水平上的治疗性基因表达)以及通过携带P4HA2治疗性基因的基于基因疗法载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白质表达水平的可能性。
将以下元件指示在图13中：
培养物A-用无质粒DNA的水性树枝状聚合物溶液(参考)转染的Hs27人原代包皮成纤维细胞培养物，
培养物B-用DNA载体VTvaf17转染的Hs27人原代包皮成纤维细胞培养物，
培养物C-用DNA载体VTvaf17-P4HA2转染的Hs27人原代包皮成纤维细胞培养物。
图14
显示在HT297.T人成纤维细胞(
CRL-7782TM)的裂解物中，在用DNA载体VTvaf17-COL7A1转染这些细胞后，COL7A1蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性，即基于细胞裂解物中COL7A1蛋白浓度变化的蛋白质水平上的表达。
将以下元件指示在图14中：
培养物A-用无质粒DNA的水性树枝状聚合物溶液(参考)转染的HT297.T人成纤维细胞培养物，
培养物B-用DNA载体VTvaf17转染的HT297.T人成纤维细胞培养物，
培养物C-用DNA载体VTvaf17-COL7A1转染的HT297.T人成纤维细胞培养物。
图15
显示在HT297.T人成纤维细胞(
CRL-7782TM)的裂解物中，在用DNA载体VTvaf17-CLCA2转染这些细胞后，CLCA2蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性，即基于细胞裂解物中CLCA2蛋白浓度变化的蛋白质水平上的表达。
将以下元件指示在图15中：
培养物A-用无质粒DNA的水性树枝状聚合物溶液(参考)转染的HT297.T人成纤维细胞培养物，
培养物B-用DNA载体VTvaf17转染的HT297.T人成纤维细胞培养物，
培养物C-用DNA载体VTvaf17-CLCA2转染的HT297.T人成纤维细胞培养物。
图16
显示在HEKa人表皮角质形成细胞培养物(ATCC PCS-200-011)的裂解物中，在用DNA载体VTvaf17-ELN转染这些细胞后，ELN蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性，即基于细胞裂解物中ELN蛋白浓度变化的蛋白质水平上的表达。
将以下元件指示在图16中：
培养物A-用无质粒DNA的水性树枝状聚合物溶液(参考)转染的HEKa人表皮角质形成细胞培养物，
培养物B-用DNA载体VTvaf17转染的HEKa人表皮角质形成细胞培养物，
培养物C-用DNA载体VTvaf17-ELN转染的HEKa人表皮角质形成细胞培养物。
图17
显示在HEMa原代人表皮黑色素细胞培养物(
PCS-200-013TM)的裂解物中，在用DNA载体VTvaf17-PLOD1转染这些细胞后，PLOD1蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性，即基于细胞裂解物中PLOD1蛋白浓度变化的蛋白质水平上的表达。
将以下元件指示在图17中：
培养物A-用无质粒DNA的水性树枝状聚合物溶液(参考)转染的HEMa原代人表皮黑色素细胞培养物，
培养物B-用DNA载体VTvaf17转染的HEMa原代人表皮黑色素细胞培养物，
培养物C-用DNA载体VTvaf17-PLOD1转染的HEMa原代人表皮黑色素细胞培养物。
图18
显示在将基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2注射到三名患者的皮肤后，这些患者的皮肤生检标本中P4HA2蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性(即在蛋白质水平上的治疗性基因的表达)以及使用携带P4HA2治疗性基因的基于基因疗法载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，提高蛋白质表达水平的可能性。
将以下元件指示在图18中：
P1I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2的注射区域中进行的患者P1皮肤生检，
P1II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中进行的患者P1皮肤生检，
P1III-来自完整部位的患者P1皮肤生检，
P2I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2的注射区域中进行的患者P2皮肤生检，
P2II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中进行的患者P2皮肤生检，
P2III-来自完整部位的患者P2皮肤生检，
P3I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2的注射区域中进行的患者P3皮肤生检，
P3II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区进行的患者P3皮肤生检，
P3III-来自完整部位的患者P3皮肤生检。
图19
显示在将基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1注射到三名患者的皮肤后，这些患者的皮肤生检标本中P4HA1蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性(即在蛋白质水平上的治疗性基因的表达)以及使用携带P4HA1治疗性基因的基于基因疗法载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，提高蛋白质表达水平的可能性。
将以下元件指示在图19中：
P1I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1的注射区域中进行的患者P1皮肤生检，
P1II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中进行的患者P1皮肤生检，
P1III-来自完整部位的患者P1皮肤生检，
P2I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1的注射区域中进行的患者P2皮肤生检，
P2II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中进行的患者P2皮肤生检，
P2III-来自完整部位的患者P2皮肤生检，
P3I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1的注射区域中进行的患者P3皮肤生检，
P3II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区进行的患者P3皮肤生检，
P3III-来自完整部位的患者P3皮肤生检。
图20
显示在将基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN和基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1联合注射到三名患者的皮肤后，这些患者的皮肤生检标本中COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1蛋白浓度的图，以便于评价功能性活性(即，在蛋白质水平上治疗性基因的表达)以及使用携带COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，提高蛋白质表达水平的可能性。
将以下元件指示在图20中：
P1I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN和基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的混合物的注射区域中进行的患者P1皮肤生检，
P1II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中进行的患者P1皮肤生检，
P1III-来自完整部位的患者P1皮肤生检，
P2I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN和基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的混合物的注射区域中进行的患者P2皮肤生检，
P2II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区域中进行的患者P2皮肤生检，
P2III-来自完整部位的患者P2皮肤生检，
P3I-在基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN和基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的混合物的注射区域中进行的患者P3皮肤生检，
P3II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射区进行的患者P3皮肤生检，
P3III-来自完整部位的患者P3皮肤生检。
图21
显示在皮下注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2转染的自体成纤维细胞培养物后，人皮肤生检样本中COL1A2蛋白浓度的图，以便于表明通过注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2转染的自体细胞的使用方法。
将以下元件指示在图21中：
P1C-在用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2转染的患者自体成纤维细胞培养物的注射区域中进行的患者P1皮肤生检，
P1B-在用基因疗法DNA载体VTvaf17转染的患者自体成纤维细胞的注射区域中进行的患者P1皮肤生检，
P1A-来自完整部位的患者P1皮肤生检。
图22
显示在用以下基因疗法DNA载体：VTvaf17-COL7A1、VTvaf17-CLCA2、VTvaf17-P4HA1和VTvaf17-P4HA2联合注射到三只大鼠的皮肤后，三只大鼠皮肤生检样本中COL1A1、COL1A2、P4HA1和P4HA2蛋白浓度的图，以便于评价它们的功能性活性(即，蛋白质水平上的治疗性基因表达)以及通过携带COL1A1、COL1A2、P4HA1和P4HA2治疗性基因的基于基因疗法载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白质表达水平的可能性。
将以下元件指示在图22中：
K1I-在基因疗法DNA载体：VTvaf17-COL1A1、VTvaf17-COL1A2、VTvaf17-P4HA1和VTvaf17-P4HA2的混合物的注射部位中的大鼠K1皮肤生检样本，
K1II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射部位中的大鼠K1皮肤生检样本，
K1III-在参考完整部位的大鼠K1皮肤生检样本，
K2I-在基因疗法DNA载体：VTvaf17-COL1A1、VTvaf17-COL1A2、VTvaf17-P4HA1和VTvaf17-P4HA2的混合物的注射部位中的大鼠K2皮肤生检样本，
K2II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射部位中的大鼠K2皮肤生检样本，
K2III-在参考完整部位的大鼠K2皮肤生检样本，
K3I-在基因疗法DNA载体：VTvaf17-COL1A1、VTvaf17-COL1A2、VTvaf17-P4HA1和VTvaf17-P4HA2的混合物的注射部位中的大鼠K3皮肤生检样本，
K3II-在基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射部位中的大鼠K3皮肤生检样本，
K3III-在参考完整部位的大鼠K3皮肤生检样本。
图23
显示牛真皮成纤维细胞(ScienCell，Cat.#B2300)中，在用DNA载体VTvaf17-ELN转染这些细胞前和转染后48小时，ELN治疗性基因的cDNA扩增子累积的图，以便于表明通过在动物中注射基因疗法DNA载体的使用方法。
在反应过程中，将扩增子累积的以下曲线显示在图23中，对应于：
1-在用基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN转染前，牛真皮成纤维细胞中ELN基因的cDNA，
2-在用基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN转染后，牛真皮成纤维细胞中ELN基因的cDNA，
3-在用基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN转染前，牛真皮成纤维细胞中ACT基因的cDNA，
4-在用基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN转染后，牛真皮成纤维细胞中ACT基因的cDNA。
将GenBank数据库中编号AH001130.2下列出的公牛/牛肌动蛋白基因(ACT)用作参考基因。
具体实施方式
基于3165bp的DNA载体VTvaf17，构建了携带人治疗性基因的基因疗法DNA载体，设计为提高人和动物组织中这些治疗性基因的表达水平。每种携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的产生方法是将治疗性基因的蛋白质编码序列克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17的多接头，所述治疗性基因选自以下基因的组：人COL1A1基因(编码COL1A1蛋白)、人COL1A2基因(编码COL1A2蛋白)、人P4HA1基因(编码P4HA1蛋白)、人P4HA2基因(编码P4HA2蛋白)、人COL7A1基因(编码COL7A1蛋白)、人CLCA2基因(编码CLCA2蛋白)、人ELN基因(编码ELN蛋白)、人PLOD1基因(编码PLOD1蛋白)。众所周知，DNA载体渗入真核细胞的能力主要取决于载体的大小。尺寸最小的DNA载体具有更高的渗透能力。因此，优选载体中不存在不承担功能负载，但同时增加载体DNA大小的元件。在携带选自COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因的组的治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的生产过程中，考虑了DNA载体的这些特征，其中载体中没有大的非功能性序列和抗生素抗性基因，除了技术优势和安全使用外，允许携带治疗性基因(选自COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因的组)的所产生的基因疗法DNA载体VTvaf17的尺寸显著减小。因此，所获得的基因疗法DNA载体渗入真核细胞的能力是由于其长度小所致。
将以下基因疗法DNA载体中的每一种：VTvaf17-COL1A1、或VTvaf17-COL1A2、或VTvaf17-P4HA1、或VTvaf17-P4HA2、或VTvaf17-COL7A1、或VTvaf17-CLCA2、或VTvaf17-ELN、或VTvaf17-PLOD1如下生产：将治疗性基因COL1A1、或COL1A2、或P4HA1、或P4HA2、或COL7A1、或CLCA2、或ELN、或PLOD1的编码区克隆到DNA载体VTvaf17中，并且分别获得基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1，SEQ ID No.1；或VTvaf17-COL1A2，SEQ ID No.2；或VTvaf17-P4HA1，SEQID No.3；或VTvaf17-P4HA2，SEQ ID No.4；或VTvaf17-COL7A1，SEQ ID No.5；或VTvaf17-CLCA2，SEQ ID No.6；或VTvaf17-ELN，SEQ ID No.7；或VTvaf17-PLOD1，SEQ ID No.8。通过从生物学正常组织样本提取总RNA产生COL1A1基因(4410bp)、或COL1A2基因(4116bp)、或P4HA1基因(1607bp)、或P4HA2基因(1605bp)、或COL7A1基因(8838bp)、或CLCA2基因(2833bp)、或ELN基因(2068bp)、或PLOD1基因(2185bp)的编码区。将反转录反应用于人COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因的第一链cDNA的合成。使用出于此目的通过化学合成方法产生的寡核苷酸进行扩增。通过考虑到用于进一步克隆的最佳程序的特定限制性内切核酸酶切割扩增产物，并且通过位于VTvaf17载体多接头中的BamHI、EcoRI和HindIII限制位点进行克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17。限制位点的选择是以这样的方式进行的，即克隆片段进入载体VTvaf17表达盒的阅读框，而蛋白质编码序列不含所选核酸内切酶的限制位点。该领域的专家认识到基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或VTvaf17-COL1A2、或VTvaf17-P4HA1、或VTvaf17-P4HA2、或VTvaf17-COL7A1、或VTvaf17-CLCA2、或VTvaf17-ELN、或VTvaf17-PLOD1产生的方法学实现可以在已知的分子基因克隆方法的选择框架内变化，并且这些方法包括在本发明的范围内。例如，可以将不同的寡核苷酸序列用于扩增COL1A1、或COL1A2、或P4HA1、或P4HA2、或COL7A1、或CLCA2、或ELN、或PLOD1基因，不同的限制性内切核酸酶或实验室技术(例如不依赖于连接的基因克隆)。
基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或VTvaf17-COL1A2、或VTvaf17-P4HA1、或VTvaf17-P4HA2、或VTvaf17-COL7A1、或VTvaf17-CLCA2、或VTvaf17-ELN、或VTvaf17-PLOD1分别具有核苷酸序列SEQ ID No.1、或SEQ ID No.2、或SEQ ID No.3、或SEQ ID No.4、或SEQID No.5、或SEQ ID No.6、或SEQ ID No.7、或SEQ ID No.8。同时，遗传密码的简并性是本领域专家已知的，并且这意味着本发明的范围还包括核苷酸序列的变体，不同之处在于核苷酸的插入、缺失或替换，它们不导致由治疗性基因编码的多肽序列的变化，和/或不导致VTvaf17载体调控元件的功能性活性的丧失。同时，遗传多态性是本领域专家已知的，并且意味着本发明的范围还包括来自COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因的组的基因的核苷酸序列的变体，所述变体也编码COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1蛋白的氨基酸序列的不同变体，它们在生理条件下的其功能性活性上与列出的那些没有区别。
渗入真核细胞并表达功能性活性的能力，即表达所获得的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或VTvaf17-COL1A2、或VTvaf17-P4HA1、或VTvaf17-P4HA2、或VTvaf17-COL7A1、或VTvaf17-CLCA2、或VTvaf17-ELN、或VTvaf17-PLOD1的治疗性基因的能力通过将所获得的载体注射到真核细胞，并随后分析特异性mRNA的表达和/或治疗性基因的蛋白质产物得到证实。注射了基因疗法DNA载体DNA载体VTvaf17-COL1A1、或VTvaf17-COL1A2、或VTvaf17-P4HA1、或VTvaf17-P4HA2、或VTvaf17-COL7A1、或VTvaf17-CLCA2、或VTvaf17-ELN、或VTvaf17-PLOD1的细胞中特异性mRNA的存在显示所获得的载体渗入真核细胞并表达治疗性基因的mRNA的能力。此外，该领域的专家知道mRNA基因的存在是强制性条件，但不是治疗性基因编码的蛋白质翻译的证据。因此，为了证实基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或VTvaf17-COL1A2、或VTvaf17-P4HA1、或VTvaf17-P4HA2、或VTvaf17-COL7A1、或VTvaf17-CLCA2、或VTvaf17-ELN、或VTvaf17-PLOD1在注射了基因疗法DNA载体的真核细胞中在蛋白质水平上表达治疗性基因的特性，使用免疫学方法进行由治疗性基因编码的蛋白质浓度的分析。COL1A1、或COL1A2、或P4HA1、或P4HA2、或COL7A1、或CLCA2、或ELN、或PLOD1蛋白的存在证实真核细胞中治疗性基因表达的功效，以及使用携带治疗性基因(选自COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因的组)的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，增加蛋白质浓度的可能性。
因此，为了证实携带治疗性基因，即COL1A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、携带治疗性基因，即COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2、携带治疗性基因，即P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1、携带治疗性基因，即P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2、携带治疗性基因，即COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、携带治疗性基因，即CLCA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、携带治疗性基因，即ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN、携带治疗性基因，即PLOD1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的表达功效，使用以下方法：
A)实时PCR，即在用基因疗法DNA载体转染不同的人和动物细胞系后，人和动物细胞裂解物中治疗性基因的mRNA累积的变化，
B)酶联免疫吸附测定，即在用基因疗法DNA载体转染不同的人细胞系后，人细胞裂解物中治疗性蛋白质的定量水平的变化，
C)酶联免疫吸附测定，即在将基因疗法DNA载体注射到这些组织后，人和动物组织生检标本的上清液中治疗性蛋白质的定量水平的变化，
D)酶联免疫吸附测定，即在用基因疗法DNA载体转染的该人的自体细胞注射这些组织后，在人组织生检的上清液中治疗性蛋白质的定量水平的变化。
为了证实使用构建的携带治疗性基因，即COL1A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、携带治疗性基因，即COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2、携带治疗性基因，即P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1、携带治疗性基因，即NP4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2、携带治疗性基因，即COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、携带治疗性基因，即CLCA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、携带治疗性基因，即ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN、携带治疗性基因，即PLOD1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的可行性，进行以下：
A)用基因疗法DNA载体转染不同的人和动物细胞系，
B)将基因疗法DNA载体注射到不同的人和动物组织，
C)将基因疗法DNA载体的混合物注射到人和动物组织，
D)将用基因疗法DNA载体转染的自体细胞注射到人组织。
如由基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1(分别为SEQ ID No.1、或SEQ ID No.2、或SEQ ID No.3、或SEQ ID No.4、或SEQ ID No.5、或SEQ ID No.6、或SEQ ID No.7、或SEQ ID No.8)的核苷酸序列中缺乏与病毒基因组同源的区域和抗生素抗性基因所证实，由于基因疗法DNA载体中缺少构成病毒基因组核苷酸序列的调控元件并且基因疗法DNA载体中缺少抗生素抗性基因，这些使用方法缺少针对人和动物的基因疗法的潜在风险。
本领域技术人员已知，使用基因疗法DNA载体中的抗生素抗性基因，通过在含有选择性抗生素的营养培养基中增加细菌生物质来获得制备量的这些载体。在本发明的框架内，为了确保携带COL1A1、或COL1A2、或P4HA1、或P4HA2、或COL7A1、或CLCA2、或ELN、或PLOD1治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17的安全使用，使用含有抗生素的选择性营养培养基是不可能的。提出了基于大肠杆菌菌株SCS110-AF获得用于生产这些基因疗法载体的菌株的方法，作为用于获得携带治疗性基因(选自COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因的组)的基因疗法DNA载体VTvaf17的技术解决方案，以便于在工业规模上扩大基因疗法载体的生产。大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1产生的方法涉及大肠杆菌菌株SCS110-AF的感受态细胞的产生，其中使用对于本领域的专家熟知的转化(电穿孔)方法，将基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或DNA载体VTvaf17-COL1A2、或DNA载体VTvaf17-P4HA1、或DNA载体VTvaf17-P4HA2、或DNA载体VTvaf17-COL7A1、或DNA载体VTvaf17-CLCA2、或DNA载体VTvaf17-ELN、或DNA载体VTvaf17-PLOD1分别注射到这些细胞。将所获得的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1用于分别产生基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或VTvaf17-COL1A2、或VTvaf17-P4HA1、或VTvaf17-P4HA2、或VTvaf17-COL7A1、或VTvaf17-CLCA2、或VTvaf17-ELN、或VTvaf17-PLOD1，允许使用无抗生素培养基。
为了证实大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌菌株对菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1的构建，进行转化、选择、随后生物质生长以及提取质粒DNA。
为了证实携带治疗性基因，即COL1A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或携带该治疗性基因，即COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2、或携带该治疗性基因，即P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1、或携带该治疗性基因，即NP4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2、或携带该治疗性基因，即COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、或携带该治疗性基因，即CLCA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、或携带该治疗性基因，即ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN、或携带该治疗性基因，即PLOD1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的可生产性、可构建性和到工业规模的生产扩大，在工业规模上对各自含有携带治疗性基因(即COL1A1、或COL1A2、或P4HA1、或P4HA2、或COL7A1、或CLCA2、或ELN、或PLOD1基因基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1进行发酵。
将细菌团的生产扩大至工业规模用于分离携带治疗性基因(选自COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因的组)的基因疗法DNA载体VTvaf17的方法涉及在提供合适的生物质累积动态的无抗生素营养培养基中孵育大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1、或大肠杆菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1的种子培养物。在对数生长期达到足够量的生物质后，将细菌培养物转移至工业发酵罐，并然后使其培养至稳定期，然后提取含有治疗性DNA产物(即基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或DNA载体VTvaf17-COL1A2、或DNA载体VTvaf17-P4HA1、或DNA载体VTvaf17-P4HA2、或DNA载体VTvaf17-COL7A1、或DNA载体VTvaf17-CLCA2、或DNA载体VTvaf17-ELN、或DNA载体VTvaf17-PLOD1)的级份，多级过滤，并且通过色谱方法进行纯化。该领域的专家已知，菌株的培养条件、营养培养基的组成(除了无抗生素)、所使用的设备、和DNA纯化方法可以在随特定生产线在标准操作程序的框架内变化，但是使用大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1的扩大、工业生产、和DNA载体的纯化的已知方法落入本发明的范围。
在以下实施例中解释了本发明的本质。
实施例1.
携带治疗性基因，即COL1A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1的产生。
由NheI和HindIII限制位点将COL1A1基因编码区(4410bp)克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17来构建基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1。通过从生物学人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen,Russia)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒
高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得COL1A1基因编码区(4410bp)：
Col1A1_F CCAGCTAGCGTCTAGGGTCTAGACATGTTC，
Col1A1_R TATAAGCTTCTACAGGAAGCAGACAGGGCCAAC。
通过整合源自不同来源的DNA的6个片段构建基因疗法DNA载体VTvaf17；
(a)复制起点由具有点突变的可商购质粒pBR322区域的PCR扩增产生；
(b)EF1a启动子区由人基因组DNA的位点的PCR扩增产生；
(c)hGH-TA转录终止子由人基因组DNA位点的PCR扩增产生；
(d)转座子Tn10的RNA-OUT调控位点由寡核苷酸合成；
(e)卡那霉素抗性基因由可商购的人质粒pET-28的位点的PCR扩增产生；
(f)多接头通过使两个合成寡核苷酸退火而产生。
按照制造商的说明，使用市售试剂盒
高保真DNA聚合酶(New EnglandBiolabs,USA)进行PCR扩增。这些片段具有重叠的区域，允许它们在随后的PCR扩增合并。片段(a)和(b)使用寡核苷酸Ori-F和EF1-R进行整合，片段(c)、(d)和(e)使用寡核苷酸hGH-F和Kan-R进行整合。之后，所产生的片段通过以位点BamHI和Ncoi限制性，随后连接来整合。这形成仍然缺少多接头的质粒。为了添加它，通过BamHI和EcoRI位点切割质粒，然后与片段(f)连接。因此，构建了4182bp的卡那霉素抗性基因载体，该载体侧翼携带SpeI限制位点。然后用SpeI酶切位点切割该基因，并将剩余片段与自身连接。这形成重组的3165bp的基因疗法DNA载体VTvaf17，并允许无抗生素选择。
通过NheI和HindIII限制性内切核酸酶(New England Biolabs,USA)切割COL1A1基因编码区的扩增产物和DNA载体VTvaf17。
这形成具有核苷酸序列SEQ ID No.1的7563bp的DNA载体VTvaf17-COL1A1，一般结构如图1A所示。
实施例2.
携带治疗性基因，即COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2的产生。
由NheI和HindIII限制位点将COL1A2基因的编码区(4116bp)通过克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17来构建基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2。从生物人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen，Russia)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒
高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得COL1A2基因编码区(4116bp)：
Col1A2_F CCAGCTAGCGTCTAAGTGCTAGACATGCTC，
Col1A2_R CGAAGCTTTTATTTGAAACAGACTGGGCCA；
通过限制性内切核酸酶NheI和HindIII(New England Biolabs,USA)切割扩增产物和DNA载体VTvaf17。
这形成具有核苷酸序列SEQ ID No.2的7269bp的DNA载体VTvaf17-COL1A2，并且一般结构如图1B所示。
如实施例1所述构建基因疗法DNA载体VTvaf17。
实施例3.
携带治疗性基因，即人P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1的产生。
通过由BamHI和KpnI限制位点将P4HA1基因编码区(1607bp)克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17来构建基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1。从生物人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen，Russia)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒
高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得P4HA1基因编码区(1607bp)：
P4HA1_F AGGATCCACCATGATCTGGTATATATTAATTATAGG，
P4HA1_R TTCGGTACCTATTCCAATTCTGACAACGTACAAG；
通过BamHI和KpnI限制性内切核酸酶(New England Biolabs,USA)切割扩增产物和DNA载体VTvaf17。
这形成具有核苷酸序列SEQ ID No.3的4754bp的DNA载体VTvaf17-P4HA1，并且一般结构如图1C所示。
如实施例1所述构建基因疗法DNA载体VTvaf17。
实施例4.
携带治疗性基因，即P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2的产生。
通过由BamHII和SalI限制位点将P4HA2基因编码区(1605bp)克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17来构建基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2。从生物人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒
高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得P4HA2基因编码区(1605bp)：
P4HA2_F AGGATCCACCATGAAACTCTGGGTGTCTGCA，
P4HA2_R CTTGTCGACTTAGTCAACTTCTGTTGATCCACA；
通过BamHII和SalI限制性内切核酸酶(New England Biolabs,USA)切割扩增产物和DNA载体VTvaf17。
这形成具有核苷酸序列SEQ ID No.4的4704bp的DNA载体VTvaf17-P4HA2，并且其一般结构如图1D所示。
如实施例1所述构建基因疗法DNA载体VTvaf17。
实施例5.
携带治疗性基因，即COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1。
通过由SalI和EcoRI限制位点将COL7A1基因编码区(8838bp)克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17来构建基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1。从生物人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen，Russia)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒
高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得COL7A1基因编码区(8838bp)：
COL7A1_F ATCGTCGACCACCATGACGCTGCGGCTTCTGGT，
COL7A1_R ATAGAATTCAGTCCTGGGCAGTACCTGTC；
通过限制性内切核酸酶SalI和EcoRI(New England Biolabs,USA)切割扩增产物和DNA载体VTvaf17。
这形成具有核苷酸序列SEQ ID No.5的11990bp的DNA载体VTvaf17-COL7A1，并且其一般结构如图1E所示。
如实施例1所述构建基因疗法DNA载体VTvaf17。
实施例6.
携带治疗性基因，即人CLCA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2的产生。
通过由BamHI和EcoRI酶切位点将CLCA2基因2833bp的编码区克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17来构建基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2。从生物人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen，Russia)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒
高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得CLCA2基因编码区(2833bp)：
CLCA2_F AGGATCCACCATGACCCAAAGGAGCATTGC，
CLCA2_R ATAGAATTCATAATAATTTTGTTCCATTCTCTTTC；
通过限制性内切核酸酶BamHI和EcoRI(New England Biolabs,USA)切割扩增产物和DNA载体VTvaf17。
这形成具有核苷酸序列SEQ ID No.6的5974bp的DNA载体VTvaf17-CLCA2，并且一般结构如图1F所示。
如实施例1所述构建基因疗法DNA载体VTvaf17。
实施例7.
携带治疗性基因，即ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN的产生。
通过由SalI和EcoRI限制位点将ELN基因编码区(2068bp)克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17来构建基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN。通过从生物人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen)进行反转录反应，并且使用以下寡核苷酸和市售试剂盒
高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得ELN基因的编码区(2068bp)：
ELN_F TTTGTCGACCACCATGGCGGGTCTGACGGCGG，
ELN_R TTTTTGAATTCTCATTTTCTCTTCCGGCCACAAGCTT；
通过限制性内切核酸酶SalI和EcoRI(New England Biolabs,USA)切割扩增产物和DNA载体VTvaf17。
这形成具有核苷酸序列SEQ ID No.7的5257bp的DNA载体VTvaf17-ELN，并且一般结构如图1G所示。
如实施例1所述构建基因疗法DNA载体VTvaf17。
实施例8.
携带治疗性基因，即PLOD1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的产生。
通过由BamHII和EcoRI限制位点将PLOD1基因2185bp的编码区克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17来构建基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1。从生物人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒
高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得PLOD1基因编码区(2185bp)：
PLOD1_F GGATCCACCATGCGGCCCCTGCTGCTACT，
PLOD1_R ATAGAATTCAGGGATCGACGAAGGAGACT；
通过限制性内切核酸酶BamHII和EcoRI(New England Biolabs,USA)切割扩增产物和DNA载体VTvaf17。
这形成具有核苷酸序列SEQ ID No.8的5326bp的DNA载体VTvaf17-PLOD1，并且一般结构如图1H所示。
如实施例1所述构建基因疗法DNA载体VTvaf17。
实施例9.
携带治疗性基因，即COL1A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性的证据。本实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
在HDFa原代人真皮成纤维细胞培养物(ATCC PCS-201-01)中，在用携带人COL1A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1转染后48h，对COL1A1治疗性基因mRNA累积的变化进行评价。通过实时PCR中cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。
将HDFa原代人真皮成纤维细胞培养物用于评价治疗性COL1A1 mRNA累积的变化。使用无血清成纤维细胞生长试剂盒(
PCS-201-040)，将HDFa细胞培养物在标准条件(37℃，5％CO2)下培养。在培养过程中，每48小时更换生长培养基。
为达到90％的汇合，在转染前24小时，将细胞接种到24孔板中，每孔5x104个细胞。根据制造商的建议，使用Lipofectamine 3000(Thermfisher Scientificial,USA)，用表达人COL1A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1进行转染。在试管1中，将1μL DNA载体VTvaf17-COL1A1溶液(浓度500ng/μL)和1μL试剂P3000加入25μL培养基Opti-MEM(Gibco,USA)。将制备物通过轻轻的摇晃进行混合。在试管2中，将1μLLipofectamine 3000溶液加到25μL培养基Opti-MEM(Gibco,USA)中。将制备物通过轻轻的摇晃进行混合。将来自试管1的内容物加入到试管2的内容物中，并且将混合物在室温下孵育5分钟。将所得溶液以40μl的体积逐滴添加至细胞中。
将用缺少插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(在用缺少插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染之前和之后，COL1A1基因的cDNA未显示在图中)转染的HDFa细胞用作参考。按上述方法制备用于转染的参考载体VTvaf17。
根据制造商的建议，使用Trizol试剂(Invitrogen,USA)，从HDFa细胞提取总RNA。将1ml Trizol试剂加入至含有细胞的孔中，均化，并在65℃下加热5分钟。将样本在14000g下离心10分钟，然后在65℃下再次加热10分钟。然后，加入200μL氯仿，将混合物轻轻搅拌，以14000g离心10分钟。然后分离水相，并与1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和等体积的异丙醇混合。将样本在-20℃孵育10分钟，然后在14000g离心10分钟。将沉淀的RNA在1ml 70％乙醇中冲洗，风干，并且溶于10μL无核酸酶的水中。通过评价由实时PCR的cDNA扩增子的累积动态来测定转染后COL1A1 mRNA的表达水平。对于针对人COL1A1基因特异的cDNA的产生和扩增，使用以下COL1A1_SF和COL1A1_SR寡核苷酸：
Col1A1_SF TGACCTCAAGATGTGCCACT，
Col1A1_SR CAGACATGCCTCTTGTCCTTG
扩增产物长度为195bp。
使用针对实时PCR的SYBR GreenQuantitect RT-PCR试剂盒(Qiagen,USA)进行反转录反应和PCR扩增。反应在20μL的体积中进行，其含有：25μL的QuantiTect SYBR GreenRT-PCRMaster Mix，2.5mM氯化镁，每个引物0.5μm和5μL RNA。在以下条件下使用CFX96扩增仪(Bio-Rad,USA)：在42℃下反转录30min，98℃变性15min，94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。使用GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因作为参考基因。阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含COL1A1和B2M基因cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。阴性对照包括去离子水。采用Bio-Rad CFX Manager 2.1软件(Bio-Rad,USA)，进行COL1A1和B2M基因cDNA扩增子的累积动态的实时定量。分析结果如图2所示。
图2显示由于基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1转染HDFa原代人成纤维细胞培养物，人COL1A1基因的特异性mRNA水平大幅提高，证实了该载体渗入真核细胞并在mRNA水平上表达COL1A1基因的能力。呈现的结果还证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1以便于提高在真核细胞中COL1A1基因的表达水平的可行性。
实施例10.
携带治疗性基因，即COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性的证据。本实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
在用携带人COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2转染后48h，在HDFa原代人真皮成纤维细胞(ATCC PCS-201-01)中，对COL1A2治疗性基因mRNA积累的变化进行评价。通过实时PCR中cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。
在无血清成纤维细胞生长试剂盒(
PCS-201-040)中，在标准条件(37℃，5％CO2)下培养HDFa原代人真皮成纤维细胞培养物。为达到90％的汇合，在转染前24小时，将细胞接种到24孔板中，每孔5x104个细胞的量。Lipofectamine3000(ThermoFisherScientific,USA)用作转染试剂。根据实施例9中所述的程序，用表达人COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2进行转染。使用GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因作为参考基因。将用缺少治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(在用缺少插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染之前和之后，COL1A2基因的cDN未显示在图中)转染的HDFa细胞培养物作为参考。如实施例9中所述进行RNA分离、反转录反应、和实时PCR，除了与实施例9具有不同的序列的寡核苷酸。对于针对人COL1A2基因特异的cDNA的扩增，使用以下COL1A2_SF和COL1A2_SR寡核苷酸：
COL1A2_SF TGAACTTGTTGCTGAGGGCA，
COL1A2_SR CCAGTTCTTGGCTGGGATGT
扩增产物长度为195bp。
阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含COL1A2和B2M基因cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。阴性对照包括去离子水。用Bio-Rad CFX Manager2.1软件(Bio-Rad,USA)，进行PCR产物，即通过扩增得到的COL1A2和B2M基因cDNA进行实时定量。分析结果如图3所示。
图3显示由于基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2转染的HDFa人成纤维细胞培养物，人COL1A2基因的特异性mRNA的水平大幅提高，证实了该载体渗入真核细胞并在mRNA水平上表达COL1A2基因的能力。呈现的结果还证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2以便于提高在真核细胞中COL1A2基因的表达水平的可行性。
实施例11.
携带治疗性基因，即P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性的证据。本实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
在用携带人P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1转染48小时后，在Hs27人包皮成纤维细胞系(ATCC CRL-1634)中，对P4HA1治疗性基因mRNA积累的变化进行评价。通过实时PCR中cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。
在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中在标准条件(37℃，5％CO2)下培养Hs27人包皮成纤维细胞系(
30-2020TM)，所述培养基中添加10％牛血清(
30-2020TM)。为达到90％的汇合，在转染前24小时，将细胞接种到24孔板中，每孔5x104个细胞的量。Lipofectamine3000(ThermoFisher Scientific,USA)用作转染试剂。根据实施例9所述的程序，用表达人P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1进行转染。使用GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因作为参考基因。将用缺少治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(在用缺少插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染之前和之后，P4HA1基因的cDNA未显示在图中)转染的Hs27细胞系用作参考。如实施例9中所述进行RNA分离、反转录反应、和实时PCR，除了与实施例9具有不同的序列的寡核苷酸。对于针对人P4HA1基因特异的cDNA的扩增，使用以下P4HA1_SF和P4HA1_SR寡核苷酸：
P4HA1_SF AAAAGTGCCTGGCTCTCTGG，
P4HA1_SR TGGCTCATCTTTCCGTGCAA
扩增产物长度为171bp。
阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含P4HA1和B2M基因的cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。阴性对照包括去离子水。用Bio-Rad CFX Manager2.1软件(Bio-Rad,USA)，进行PCR产物，即通过扩增得到的P4HA1和B2M基因cDNA的实时定量。分析结果如图4所示。
图4显示由于用基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1转染的Hs27人包皮成纤维细胞系，人P4HA1基因的特异性mRNA的水平大幅提高，证实了该载体渗入真核细胞并在mRNA水平上表达P4HA1基因的能力。呈现的结果还证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1以便于提高在真核细胞中P4HA1基因的表达水平的可行性。
实施例12.
携带治疗性基因，即P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性的证据。本实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
在用携带人P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2转染48小时后，在Hs27人包皮成纤维细胞系(ATCC CRL-1634)中，对P4HA2治疗性基因mRNA积累的变化进行评价。通过实时PCR中cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。
在标准条件(37℃，5％CO2)下，在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(
30-2020TM)中培养Hs27人包皮成纤维细胞系(
30-2020TM)，所述培养基中添加10％牛血清。为达到90％的汇合，在转染前24小时，将细胞接种到24孔板中，每孔5x104个细胞的量。Lipofectamine3000(ThermoFisher Scientific,USA)用作转染试剂。根据实施例9所述的程序，用表达人P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2进行转染。将用缺少治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(在用缺少插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染之前和之后，P4HA2基因的cDNA未显示在图中)转染的Hs27细胞培养物用作参考。如实施例9中所述进行RNA分离、反转录反应、和实时PCR，除了与实施例9具有不同的序列的寡核苷酸。对于针对人P4HA2基因特异的cDNA的扩增，使用以下P4HA2_SF和P4HA2_SR寡核苷酸：
P4HA2_SF AGGTACCACCATGGCAACAG，
P4HA2_SR GTCTTGGGATCACGAACGGT
扩增产物长度为179bp。
阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含P4HA2和B2M基因cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。使用GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因作为参考基因。阴性对照包括去离子水。用Bio-Rad CFX Manager2.1软件(Bio-Rad,USA)，进行PCR产物，即通过扩增获得的P4HA2和B2M基因cDNA的实时定量。分析结果如图5所示。
图5显示由于用基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2转染Hs27人包皮成纤维细胞系，人P4HA2基因的特异性mRNA的水平大幅提高，证实了该载体在mRNA水平上渗入真核细胞并表达P4HA2基因的能力。呈现的结果还证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2以便于提高在真核细胞中P4HA2基因的表达水平的可行性。
实施例13.
携带治疗性基因，即COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性的证据。本实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
在用携带人COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1转染后48小时，在HT297.T人真皮成纤维细胞(
CRL-7782)培养物中，对COL7A1治疗性基因的mRNA积累的变化进行评价。通过实时PCR中的cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。
在标准条件(37℃，5％CO2)下，在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(
30-2020TM)中培养HT 297.T人真皮成纤维细胞培养物，所述培养基中添加10％牛血清(
30-2020TM)。为达到90％的汇合，在转染前24小时将细胞接种到24孔板中，每孔5x104个细胞的量。Lipofectamine3000(ThermoFisher Scientific,USA)用作转染试剂。根据实施例9所述的程序，用表达人COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1进行转染。使用GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因作为参考基因。将用缺少治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(在用缺少插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染之前和之后，COL7A1基因的cDNA未显示在图中)转染的Hs27细胞培养物用作参考。如实施例9中所述进行RNA分离、反转录反应、和实时PCR，除了与实施例9具有不同的序列的寡核苷酸。对于针对人COL7A1基因特异的cDNA的扩增，使用以下COL7A1_SF和COL7A1_SR寡核苷酸：
COL7A1_SF CAAAGGAGAGATGGGGGAGC，
COL7A1_SR ATCATTTCCACTGGGGCCTG
扩增产物长度为184bp。
阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含COL7A1和B2M基因cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。阴性对照包括去离子水用Bio-Rad CFX Manager2.1软件(Bio-Rad,USA)，进行PCR产物，即通过扩增得到的COL7A1和B2M基因cDNA的实时定量。分析结果如图6所示。
图6显示由于用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1转染HT 297.T人真皮成纤维细胞培养物，人COL7A1基因的特异性mRNA的水平大幅提高，证实了该载体在mRNA水平上渗入真核细胞并表达COL7A1基因的能力。呈现的结果还证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1以便于提高在真核细胞中COL7A1基因的表达水平的可行性。
实施例14.
携带治疗性基因，即CLCA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性的证据。本实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
在用携带人CLCA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2转染后48小时，在HT297.T人真皮成纤维细胞(
CRL-7782)培养物中，对CLCA2治疗性基因的mRNA积累的变化进行评价。通过实时PCR中的cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。
在标准条件(37℃，5％CO2)下，在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(
30-2002TM)中培养HT 297.T人真皮成纤维细胞培养物，所述培养基中添加10％牛血清(
30-2020TM)。为达到90％的汇合，在转染前24小时将细胞接种到24孔板中，每孔5x104个细胞的量。Lipofectamine3000(ThermoFisher Scientific,USA)用作转染试剂。根据实施例9所述的程序，用表达人CLCA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2进行转染。使用GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因作为参考基因。将用缺少治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(在用缺少插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染之前和之后，CLCA2基因的cDNA未显示在图中)转染的HT 297.T细胞系用作参考。如实施例9中所述进行RNA分离、反转录反应、和实时PCR，除了与实施例9具有不同的序列的寡核苷酸。对于针对人CLCA2基因特异的cDNA的扩增，使用以下CLCA2_SF和CLCA2_SR寡核苷酸：
CLCA2_SF GGAGGCTCCTTTTCAGTGCT,
CLCA2_SR GTAGCCTGGCCCTGATCAAA
扩增产物长度为155bp。
阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含CLCA2和B2M基因cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。阴性对照包括去离子水。用Bio-Rad CFX Manager2.1软件(Bio-Rad,USA)，进行PCR产物，即通过扩增得到的CLCA2和B2M基因cDNA的实时定量。分析结果如图7所示。
图7显示由于用基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2转染HT 297.T人真皮成纤维细胞培养物，人CLCA2基因的特异性mRNA的水平大幅提高，证实了该载体在mRNA水平上渗入真核细胞并表达CLCA2基因的能力。呈现的结果还证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2以便于提高在真核细胞中CLCA2基因的表达水平的可行性。
实施例15.
携带治疗性基因，即ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性的证据。本实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
在用携带人ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN转染后48小时，在HEKa人表皮角质形成细胞(ATCC PCS-200-011)培养物中，对ELN治疗性基因的mRNA积累的变化进行评价。通过实时PCR中的cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。
在标准条件(37℃，5％CO2)下，在角质形成细胞生长试剂盒(
PCS-200-040TM)中培养HEKa人表皮角质形成细胞培养物。为达到90％的汇合，在转染前24小时将细胞接种到24孔板中，每孔5x104个细胞的量。转染试剂为Lipofectamine 3000(ThermoFisherScientific,USA)。根据实施例9所述的程序，用表达人ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN进行转染。将用缺少治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(在用缺少插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染之前和之后，ELN基因的cDNA未显示在图中)转染的HEKa细胞培养物用作参考。如实施例9中所述进行RNA分离、反转录反应、和实时PCR，除了与实施例9具有不同的序列的寡核苷酸。对于针对人ELN基因特异的cDNA的扩增，使用以下ELN_SF和ELN_SR寡核苷酸：
ELN_SF CCAGTTTGGCCTAGTGGGAG，
ELN_SR ATGGGAGACAATCCGAAGCC
扩增产物长度为159bp。
阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含ELN和B2M基因cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。使用GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因作为参考基因。阴性对照包括去离子水。用Bio-Rad CFX Manager 2.1软件(Bio-Rad,USA)，进行PCR产物，即通过扩增得到的ELN和B2M基因cDNAs的实时定量。分析结果如图8所示。
图8显示由于用基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN转染HEKa人表皮角质形成细胞培养物，人ELN基因特异性mRNA的水平大幅提高，证实了该载体在mRNA水平上渗入真核细胞并表达ELN基因的能力。呈现的结果还证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN以便于提高在真核细胞中ELN基因的表达水平的可行性。
实施例16.
携带治疗性基因，即PLOD1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性证明的证据。本实施例还表明使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
在用携带人PLOD1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1转染48小时后，在HEMa表皮黑色素细胞培养物(
PCS-200-013)中，PLOD1治疗性基因mRNA积累的变化进行评价。通过实时PCR中cDNA扩增子的累积动态测定mRNA的量。
在标准条件(37℃，5％CO2)下，使用真皮细胞基础培养基(
PCS-200-030TM)培养HEMa原代人表皮黑素细胞培养物，所述培养基添加成人黑素细胞生长试剂盒(
PCS-200-042TM)。为达到90％的汇合，在转染前24小时，将细胞接种到24孔板中，每孔5x104个细胞的量。Lipofectamine3000(ThermoFisher Scientific,USA)用作转染试剂。根据实施例9所述的程序，用表达人PLOD1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1进行转染。将用缺少治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(在用缺少插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染之前和之后，PLOD1基因的cDNA未显示在图中)转染的HEMa细胞培养物用作参照。如实施例9中所述进行RNA分离、反转录反应、和实时PCR，除了与实施例9具有不同的序列的寡核苷酸。对于针对人PLOD1基因特异的cDNA的扩增，使用以下PLOD1_SF和PLOD1_SR寡核苷酸：
PLOD1_SF GCCTCCACCTTCACCATCAA，
PLOD1_SR AAGGAGACTGCGATGTAGCG
扩增产物长度为197bp。
阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含PLOD1和B2M基因的cDNA序列的、处于已知浓度的质粒代表。使用GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因作为参考基因。阴性对照包括去离子水。使用Bio-Rad CFXManager 2.1软件(Bio-Rad,USA)，进行PCR产物，即通过扩增得到的PLOD1和B2M基因cDNA的实时定量。分析结果如图9所示。
图9显示由于用基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1转染HEMa表皮黑色素细胞培养物，人PLOD1基因的特异性mRNA的水平大幅提高，证实了该载体渗入真核细胞并在mRNA水平上表达PLOD1基因的能力。呈现的结果还证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1以便于提高在真核细胞中PLOD1基因的表达水平的可行性。
实施例17.
使用携带COL1A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1以便于提高哺乳动物细胞中COL1A1蛋白表达的功效和可行性。
在用携带人COL1A1基因的DNA载体VTvaf17-COL1A1转染HDFa人真皮成纤维细胞(ATCC PCS-201-01)后，对这些细胞的裂解物中的COL1A1蛋白浓度的变化进行评价。
如实施例9所述，使HDFa人真皮成纤维细胞培养物生长。
为达到90％的汇合，在转染前24小时，将细胞接种到24孔板中，每孔5x104个细胞的量。采用第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)进行转染。将无DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少COL1A1基因的cDNA的DNA载体VTvaf17作为参考，并且将携带人COL1A1基因的DNA载体VTvaf17-COL1A1(C)用作转染剂。根据制造商的程序(QIAGEN，SuperFect Transfection Reagent Handbook,2002)，伴随一些修改，制备DNA-树枝状聚合物。在24孔板的1个孔中的细胞转染，将培养物培养基添加至溶解于TE缓冲液中的1μg DNA载体，至终体积为60μL，然后添加5μLSuperFect转染试剂，并通过移液5次轻轻混合。该复合物在室温下孵育10-15分钟。然后将培养物培养基从孔取出，将所述孔用1ml的PBS缓冲液冲洗。将350μL含10μg/ml庆大霉素的培养基加入到所得到的复合物中，轻轻混合，然后添加至细胞。将细胞与复合物在37℃和5％CO2下孵育2-3h。
然后小心移去培养基，并且将活细胞基质用1ml PBS缓冲液冲洗。然后，添加庆大霉素浓度为10μg/ml的培养基，在37℃，5％CO2存在下孵育24-48h。
转染后，将细胞用PBS冲洗细胞3次，然后向细胞中加入1ml PBS并进行3次冷冻/融化。然后将悬浮液在15000rpm离心15分钟，并收集上清液用于治疗性蛋白的定量和测定。
根据制造商的方法，使用人COL1A1/Collagen IAlpha 1ELISA试剂盒(SandwichELISA)(LifeSpan BioSciences,LS-F22003-1)，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定COL1A1蛋白，使用ChemWell Automatic EIA和Chemistry Analyser(AwarenessTechnology Inc.,USA)进行光密度检测。
为了测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的COL1A1蛋白的参考样本构建。灵敏性为188pg/ml，测量范围为313pg/ml-20000pg/ml。用R-3.0.2对结果进行统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。分析结果如图10所示。
图10显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1转染HDFa人真皮成纤维细胞导致COL1A1蛋白浓度提高，证实了载体渗入真核细胞并在蛋白水平表达COL1A1基因的能力。呈现的结果还证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1以便于提高在真核细胞中COL1A1基因的表达水平的可行性。
实施例18.
使用携带COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2以便于提高哺乳动物细胞中COL1A2蛋白表达的功效和可行性的证据。
在用携带人COL1A2基因的DNA载体VTvaf17-COL1A2转染HDFa人真皮成纤维细胞(ATCC PCS-201-01)后，对这些细胞裂解物中COL1A2蛋白浓度的变化进行评价。如实施例10所述使细胞生长。
将第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)用于转染。将无DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少COL1A2基因cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且将携带人COL1A2基因的DNA载体VTvaf17-COL1A2(C)用作转染剂。根据实施例17所述的程序，进行DNA树枝状聚合物的制备和HDFa细胞的转染。
转染后，将0.1ml 1N HCl添加至0.5ml培养物肉汤，充分混合，并且在室温下孵育10min。然后，加入0.1ml 1.2M NaOH/0.5M HEPES(pH7-7.6)中和混合物，并充分搅拌。收集上清，并用于治疗性蛋白的测定。根据制造商的方法，使用人COL1A2/Collagen Iα2ELISA试剂盒(Sandwich ELISA)(LifeSpan Biosciences,LS-F26740)，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定COL1A2蛋白，其中使用ChemWell Automatic EIA和Chemistry Analyser(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。
为了测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的COL1A2蛋白的参考样本构建。灵敏性至少为100pg/ml，测量范围为500pg/ml-10000pg/ml。用R-3.0.2用于对结果进行统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。分析结果如图11所示。
图11显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2转染HDFa原代人真皮成纤维细胞培养物导致COL1A2蛋白浓度增加，这证实了载体渗入真核细胞并在蛋白水平表达COL1A2基因的能力。呈现的结果还证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2以便于提高在真核细胞中COL1A2的表达水平的可行性。
实施例19.
使用携带P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1以便于提高哺乳动物细胞中P4HA1蛋白表达的功效和可行性的证据。
在用携带人P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1转染Hs27人包皮成纤维细胞系(ATCC-CRL-1634)后，对这些细胞的裂解物中P4HA1蛋白浓度的变化进行评价。如实施例11所述培养细胞。
将第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)用于转染。将无DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少P4HA1基因cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且将携带人P4HA1基因的DNA载体VTvaf17-P4HA1(C)用作转染剂。根据实施例17中所述的程序，进行DNA树枝状聚合物的制备和Hs27细胞的转染。
转染后，将0.1ml 1N HCl添加至0.5ml培养物肉汤，充分混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，通过添加0.1ml 1.2M NaOH/0.5M HEPES(pH7-7.6)中和混合物，并充分搅拌。收集上清，并用于治疗性蛋白的测定。根据制造商的方法，使用人P4HA1 ELISA试剂盒(Sandwich ELISA)(LifeSpan BioSciences,LS-F12242-1)通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定P4HA1蛋白，其中使用ChemWell Automated EIA和Chemistry Analyser(AwarenessTechnology Inc.,USA)进行光密度检测。
为测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的P4HA1蛋白的参考样本构建。灵敏性至少为625pg/ml，测量范围为625pg/ml-40000pg/ml。将R-3.0.2用于对结果进行统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。分析结果如图12所示。
图12显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1转染Hs27人包皮成纤维细胞系导致P4HA1蛋白浓度增加，这证实了载体渗入真核细胞并在蛋白水平表达P4HA1基因的能力。呈现的结果还证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1以便于提高在真核细胞中P4HA1基因的表达水平的可行性。
实施例20.
使用携带P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2以便于提高哺乳动物细胞中P4HA2蛋白表达的功效和可行性的证据。
在用携带人P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2转染Hs27人包皮成纤维细胞系(ATCC-CRL-1634)后，对这些细胞的裂解物中P4HA2蛋白浓度的变化进行评价。如实施例12所述培养细胞。
将第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)用于转染。将无DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少P4HA2基因cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且将携带人P4HA2基因的DNA载体VTvaf17-P4HA2(C)用作转染剂。根据实施例17中所述的程序，进行DNA树枝状聚合物的制备和Hs27细胞的转染。
转染后，将0.1ml 1N HCl添加至0.5ml培养物肉汤，充分混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，通过添加0.1ml 1.2M NaOH/0.5M HEPES(pH7-7.6)中和混合物，并充分搅拌。收集上清，并用于治疗性蛋白的测定。
使用人P4HA2 ELISA试剂盒(Sandwich ELISA)(LifeSpan BioSciences,LS-F33689-1)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定P4HA2蛋白，其中使用ChemWell AutomatedEIA和Chemistry Analyser(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。
为测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的P4HA2蛋白的参考样本构建。灵敏性至少为469pg/ml，测量范围为780pg/ml-50000pg/ml。将R-3.0.2用于对结果进行统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。分析结果如图13所示。
图13显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2转染Hs27人包皮成纤维细胞系导致P4HA2蛋白浓度增加，这证实了载体渗入真核细胞并在蛋白水平表达P4HA2基因的能力。呈现的结果还证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2以便于提高在真核细胞中P4HA2基因的表达水平的可行性。
实施例21.
使用携带COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1以便于提高哺乳动物细胞中COL7A1蛋白表达的功效和可行性的证据。
在用携带人COL7A1基因的DNA载体VTvaf17-COL7A1转染HT 297.T人成纤维细胞(
CRL-7782TM)后，对这些细胞的裂解物中COL7A1蛋白浓度的变化进行评价。如实施例13所述培养细胞。
将第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)用于转染。将无DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少COL7A1基因cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且将携带人COL7A1基因的DNA载体VTvaf17-COL7A1(C)用作转染剂。根据实施例17中所述的程序，进行DNA树枝状聚合物的制备和HT 297.T细胞的转染。
转染后，将0.1ml 1N HCl添加至0.5ml培养物肉汤，充分混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，通过添加0.1ml 1.2M NaOH/0.5M HEPES(pH7-7.6)中和混合物，并充分搅拌。收集上清，并用于治疗性蛋白的测定。根据制造商的方法，使用人COL7A1/Collagen VIIELISA试剂盒(Sandwich ELISA)(LifeSpan BioSciences,LS-F11164-1)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定COL7A1蛋白，其中使用ChemWell Automated EIA和ChemistryAnalyser(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。
为测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的COL7A1蛋白的参考样本构建。灵敏性至少为156pg/ml，测量范围为156pg/ml-10000pg/ml。将R-3.0.2用于对结果进行统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。分析结果如图14所示。
图14显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1转染HT 297.T人成纤维细胞导致COL7A1蛋白浓度增加，这证实了载体渗入真核细胞并在蛋白水平表达COL7A1基因的能力。呈现的结果还证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1以便于提高在真核细胞中COL7A1基因的表达水平的可行性。
实施例22.
使用携带CLCA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2以便于提高哺乳动物细胞中CLCA2蛋白表达的功效和可行性的证据。
在用携带人CLCA2基因的DNA载体VTvaf17-CLCA2转染HT 297.T人成纤维细胞(
CRL-7782TM)后，对这些细胞的裂解物中CLCA2蛋白浓度的变化进行评价。如实施例14所述培养细胞。
将第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)用于转染。将无DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少CLCA2基因cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且将携带人CLCA2基因的DNA载体VTvaf17-CLCA2(C)用作转染剂。根据实施例17中所述的程序，进行DNA树枝状聚合物的制备和HT 297.T细胞的转染。
转染后，将0.1ml 1N HCl添加至0.5ml培养物肉汤，充分混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，通过添加0.1ml 1.2M NaOH/0.5M HEPES(pH7-7.6)中和混合物，并充分搅拌。收集上清，并用于治疗性蛋白的测定。根据制造商的方法，使用人钙激活氯通道调节剂2(CLCA2)ELISA试剂盒(MyBioSource,MBS7242681)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定CLCA2蛋白，其中使用ChemWell Automated EIA和Chemistry Analyser(AwarenessTechnology Inc.,USA)进行光密度检测。
为测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的CLCA2蛋白的参考样本构建。灵敏性至少为1pg/ml，测量范围为50pg/ml-1000pg/ml。将R-3.0.2用于对结果进行统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。分析结果如图15所示。
图15显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2转染HT 297.T人成纤维细胞导致CLCA2蛋白浓度增加，这证实了载体渗入真核细胞并在蛋白水平表达CLCA2基因的能力。呈现的结果还证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2以便于提高在真核细胞中CLCA2基因的表达水平的可行性。
实施例23.
使用携带ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN以便于提高哺乳动物细胞中ELN蛋白表达的功效和可行性的证据。
在用携带人ELN基因的DNA载体VTvaf17-ELN转染HEKa表皮角质形成细胞培养物(ATCC PCS-200-011)后，对这些细胞的裂解物中ELN蛋白浓度的变化进行评价。如实施例15所述培养细胞。
将第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)用于转染。将无DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少ELN基因cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且将携带人ELN基因的DNA载体VTvaf17-ELN(C)用作转染剂。根据实施例17中所述的程序，进行DNA树枝状聚合物的制备和HEKa细胞的转染。
转染后，将0.1ml 1N HCl添加至0.5ml培养物肉汤，充分混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，通过添加0.1ml 1.2M NaOH/0.5M HEPES(pH7-7.6)中和混合物，并充分搅拌。收集上清，并用于治疗性蛋白的测定。
根据制造商的方法，使用弹性蛋白ELISA试剂盒(Reddot Biotech,RD-ELN-Ra)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定ELN蛋白，其中使用ChemWell Automated EIA和Chemistry Analyser(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。
为测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的ELN蛋白的参考样本构建。灵敏性至少为12.7pg/ml，测量范围为31.25pg/ml-2000pg/ml。将R-3.0.2用于对结果进行统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。分析结果如图16所示。
图16显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN转染HEKa表皮角质形成细胞培养物导致ELN蛋白浓度增加，这证实了载体渗入真核细胞并在蛋白水平表达ELN基因的能力。呈现的结果还证实了利用基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN以便于提高在真核细胞中ELN基因的表达水平的可行性。
实施例24.
使用携带PLOD1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1以便于提高哺乳动物细胞中PLOD1蛋白表达的功效和可行性的证据。
在用携带人PLOD1基因的DNA载体VTvaf17-PLOD1转染HEMa表皮黑色素细胞培养物(
PCS-200-013)后，对这些细胞的裂解物中PLOD1蛋白浓度的变化进行评价。如实施例16所述培养细胞。
将第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)用于转染。将无DNA载体的水性树枝状聚合物溶液(A)和缺少PLOD1基因cDNA的DNA载体VTvaf17(B)用作参考，并且将携带人PLOD1基因的DNA载体VTvaf17-PLOD1(C)用作转染剂。根据实施例17中所述的程序，进行DNA树枝状聚合物的制备和HEMa细胞的转染。
转染后，将0.1ml 1N HCl添加至0.5ml培养物肉汤，充分混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，通过添加0.1ml 1.2M NaOH/0.5M HEPES(pH7-7.6)中和混合物，并充分搅拌。收集上清，并用于治疗性蛋白的测定。
根据制造商的方法，使用人PLOD/PLOD1 ELISA试剂盒(Sandwich ELISA)(LifeSpan BioSciences,LS-F9705-1)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定PLOD1蛋白，其中使用ChemWell Automated EIA和Chemistry Analyser(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。
为测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的PLOD1蛋白的参考样本构建。灵敏性至少为66pg/ml，测量范围为156pg/ml-10000pg/ml。将R-3.0.2用于对结果进行统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。分析结果如图17所示。
图17显示与参考样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1转染HEMa人表皮黑色素细胞培养物导致PLOD1蛋白浓度增加，这证实了载体渗入真核细胞并在蛋白水平表达PLOD1基因的能力。呈现的结果还证实了利用基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1以便于提高在真核细胞中PLOD1基因的表达水平的可行性。
实施例25.
使用携带P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2以便于提高哺乳动物细胞中P4HA2蛋白表达的功效和可行性的证据。
为证实携带治疗性基因，即P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2的功效及其使用的可行性，在注射携带人P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2后，对人皮肤中P4HA2蛋白浓度的变化进行评价。
为分析P4HA2蛋白浓度的变化，将携带P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2注射到三名患者的前臂皮肤，其中同时注射的安慰剂是缺少P4HA2基因的cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17。
患者1，女性，44岁(P1)；患者2，女性，61岁(P2)；患者3，男性，50岁(P3)。将聚乙烯亚胺转染试剂cGMP级体内jetPEI(Polyplus Transfection,France)用作转运系统。将含有P4HA2基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2和用作安慰剂的不含P4HA2基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17溶解于无菌的无核酸酶的水中。为获得基因构建体，根据制造商的建议制备DNA-cGMP级体内-JetPEI复合物。
对于每种遗传构建体，以1mg的量，使用通道方法(其中30G针至3mm深度)，注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2。对于每种遗传构建体，基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2的可注射的体积是0.3ml。每个遗传构建体的注射点位于前臂部位的8至10cm间隔处。
在注射基因疗法DNA载体的遗传构建体后，在第2天取生检样本。使用皮肤生检装置Epitheasy 3.5(Medax SRL,Italy)，从注射携带P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2(I)；基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)(II)的部位的患者皮肤处以及从完整皮肤(III)取生检样本。将生检部位中的患者皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小为大约10mm3，并且重量为大约11mg。将样本放置于含有50mM Tris-HCl(pH 7.6)、100mM NaCl、1mM EDTA、和1mM苯甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并且匀化以获得匀化的悬浮液。然后将悬浮液以14,000g离心10分钟。收集上清液，并使用人P4HA2 ELISA试剂盒(Sandwich ELISA)(LifeSpan BioSciences,LS-F33689-1)根据制造商的方法，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)用于测定治疗性蛋白质，其中使用ChemWell Automated EIA和Chemistry Analyser(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。
为测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的P4HA2蛋白的参考样本构建。灵敏性至少为469pg/ml，测量范围为780pg/ml-50000pg/ml。将R-3.0.2用于对结果进行统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。分析结果如图18所示。
图18显示与缺少人P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射部位中的P4HA2蛋白浓度相比，在携带人P4HA2治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2的注射部位中所有三名患者的皮肤中P4HA2蛋白浓度增加，表明基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2的功效并且证实其使用的可行性(特别是在人组织中皮内注射基因疗法DNA载体后)。
实施例26.
使用携带P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1以便于提高哺乳动物细胞中P4HA1蛋白表达的功效和可行性的证据。
为证实携带P4HA1治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1的功效及其使用的可行性，在注射携带治疗性基因，即人P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1后，对人皮肤中P4HA1蛋白浓度的变化进行评价。
为分析P4HA1蛋白浓度的变化，将携带P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1与转运分子一起注射到三名患者的皮肤，其中同时注射的安慰剂是缺少P4HA1基因的cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17与转运分子。
患者1，男性，59岁(P1)；患者2，女性，56岁(P2)；患者3，男性，58岁(P3)。将聚乙烯亚胺转染试剂cGMP级体内jetPEI(Polyplus Transfection,France)用作转运系统；根据制造商的建议，进行样品制备。
对于每种遗传构建体，以1mg的量，使用通道方法(其中30G针至约1mm深度)，注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1。对于每种遗传构建体，基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1的可注射的体积是0.3ml。每个遗传构建体的注射点位于彼此的5cm处。
在注射基因疗法DNA载体的遗传构建体后，在第2天取生检样本。使用皮肤生检装置，从注射携带P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1(I)；基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)(II)的部位的患者皮肤处以及从完整皮肤(III)取生检样本。将生检部位中的患者皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小为大约10mm3，并且重量为大约11mg。将样本放置于含有50mM Tris-HCl(pH 7.6)、100mM NaCl、1mMEDTA、和1mM苯甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并且匀化以获得匀化的悬浮液。然后将悬浮液以14,000g离心10分钟。收集上清液并用于治疗性蛋白的测定。
根据制造商的方法，使用P4HA1 ELISA试剂盒(Sandwich ELISA)(LifeSpanBioSciences,LS-F12242-1)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)用于测定治疗性蛋白质，其中使用ChemWell Automated EIA和Chemistry Analyser(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。灵敏性为0.625ng/ml，测量范围为0.625ng/ml-40ng/ml。
为测量浓度的数值，使用校正曲线，所述校正曲线使用来自试剂盒，具有已知浓度的P4HA1蛋白的参考样本构建。灵敏性至少为625pg/ml，测量范围为625pg/ml-40000将R-3.0.2用于对结果进行统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。分析结果如图19所示。
图19显示与缺少人P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射部位中的P4HA1蛋白浓度相比，在携带治疗性基因(即人P4HA1基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1的注射部位中所有三名患者的皮肤中P4HA1蛋白浓度增加，表明基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1的功效并且证实其使用的可行性(特别是在人组织中皮内注射基因疗法DNA载体后)。
实施例27.
联合使用携带COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、携带CLCA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、携带ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN和携带PLOD1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1用于提高人组织中COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1蛋白的表达水平的功效和可行性的证据。
为证明携带COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、携带CLCA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、携带ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN和携带PLOD1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的功效及其使用的可行性，对用同时注射携带COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、携带CLCA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、携带ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN和携带PLOD1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的混合物的人皮肤中COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1蛋白浓度的变化进行评价。
为分析COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1蛋白浓度的变化，将携带COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、携带CLCA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、携带ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN和携带PLOD1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的混合物注射到三名患者的前臂皮肤中，其中同时注射的安慰剂是缺少COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因的cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17。
患者1，女性，38岁(P1)；患者2，男性，48岁(P2)；患者3，男性，52岁(P3)。将聚乙烯亚胺转染试剂cGMP级体内jetPEI(Polyplus Transfection,France)用作转运系统。将携带COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、携带CLCA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、携带ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN、携带PLOD1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的混合物(以1:1:1:1的比率)和用作安慰剂的基因疗法DNA载体VTvaf17(不包含COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因的cDNA)，各自溶解于无菌的无核酸酶的水中。为获得基因构建体，根据制造商的建议制备DNA-cGMP级体内jetPEI复合物。
对于每种遗传构建体，以4mg的量，使用通道方法(其中30G针至3mm深度)，注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)以及基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN和基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的混合物。对于每种遗传构建体，基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)以及基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN和基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的混合物的可注射的体积是1.2ml。每个遗传构建体的注射点位于前臂皮肤位点处的8至10cm间隔处。
在注射基因疗法DNA载体后第2天取生检样本。使用皮肤生检装置Epitheasy 3.5(Medax SRL,Italy)，从注射携带COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、携带CLCA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、携带ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN和携带PLOD1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的混合物(I)、基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)(II)的部位的患者皮肤，以及从完整皮肤(III)取生检样本。将生检部位中的患者皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小为大约10mm3，并且重量为大约11mg。将样本放置于含有50mM Tris-HCl(pH 7.6)、100mM NaCl、1mMEDTA、和1mM苯甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并且匀化以获得匀化的悬浮液。然后将悬浮液以14,000g离心10分钟。收集上清液，并用于测定治疗性蛋白，如实施例21(COL7A1蛋白的定量)、实施例22(CLCA2蛋白的定量)、实施例23(ELN蛋白的定量)和实施例24(PLOD1蛋白的定量)所述。
为了测量浓度数值，使用校正曲线，所述校正曲线由使用来自每种试剂盒，具有已知浓度的COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1蛋白的参考样本构建。将R-3.0.2用于对结果进行统计学处理并进行数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的图显示在图20中。
图20显示与缺少人COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因的基因基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射部位中的COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1蛋白浓度相比，携带COL7A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、携带CLCA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2，携带ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN，和携带人PLOD1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的混合物的注射部位中在所有三名患者的皮肤中COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1蛋白浓度的增加，这表明基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN、基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1的功效，并且证实其使用的可行性(特别是在人组织皮内注射基因疗法DNA载体后)。
实施例28.
通过注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2转染的自体成纤维细胞，携带COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2的功效及其提高人组织中COL1A2蛋白的表达水平的使用的可行性的证据。
为证实携带COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2的功效及其使用的可行性，在注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2转染的相同患者的自体成纤维细胞培养物后，对患者皮肤中的COL1A2蛋白浓度的变化进行评价。
将用携带COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2转染的适合的自体成纤维细胞培养物注射到患者的前臂皮肤中，同时注射用不携带COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染的自体成纤维细胞培养物形式的安慰剂。
从患者皮肤生检样本中分离人原代成纤维细胞培养物。使用皮肤生检装置Epitheasy 3.5(Medax SRL,Italy)，从受紫外线保护的区域，即耳后或肘部内侧的皮肤取生检样本。生检样本为大约10mm和约11mg。将患者的皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。在37℃，5％CO2存在下，将原代细胞培养物在含10％胎牛血清和100U/ml氨苄青霉素的DMEM培养基中培养。每2天进行培养物培养基的传代和更换。培养物生长的总持续时间不超过25-30天。然后从细胞培养物中取出5×104个细胞的等分试样。将患者的成纤维细胞培养物用携带COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2和安慰剂(即不携带COL1A2治疗性基因的VTvaf17载体)转染。
根据制造商的说明书，使用阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺JETPEI(Polyplustransfection,France)进行转染。细胞培养72小时，然后注射到患者体内。使用通道方法(其中13mm长的30G针至大约3mm的深度)，在前臂中进行用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2转染的患者的自体成纤维细胞培养物和用基因疗法DNA载体VTvaf17转染的患者的自体成纤维细胞培养物(作为安慰剂)的注射。在注射的悬浮液中经修饰的自体成纤维细胞的浓度为大约5ml的细胞/1ml悬浮液，所注射的细胞的剂量不超过15mln。自体成纤维细胞培养物的注射点位于8至10cm间隔处。
在注射用携带治疗性基因，即COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2和安慰剂转染的自体成纤维细胞培养物后，在第4天取生检样本。使用皮肤生检装置Epitheasy 3.5(Medax SRL,Italy)，从注射用携带治疗性基因，即COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2转染的自体成纤维细胞培养物(C)、用不携带COL1A2治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染的自体成纤维细胞培养物(安慰剂)(B)得部位的患者皮肤、以及从完整皮肤部位(A)取生检。将生检部位中的患者皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本量约为10mm3，并且重量约11mg。将样本置于含有50mM Tris-HCl(pH7.6)、100mM NaCl、1mM EDTA和1mM苯甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并均化以获得均化的悬浮液。然后将悬浮液以14000g离心10分钟。收集上清液，并用于测定治疗性COL1A2蛋白，如实施例18所述。
分析结果如图21所示。
图21显示与用不携带COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)转染的自体成纤维细胞培养物的注射部位中的COL1A2蛋白浓度相比，用携带COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2转染的自体成纤维细胞培养物的注射部位中患者皮肤的区域中COL1A2蛋白浓度增加，这表明基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2的功效，以便于提高人体组织中COL1A2的表达水平的可行性(特别是在向皮肤注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2转染的自体成纤维细胞后)。
实施例29.
联合使用携带COL1A1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、携带COL1A2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2、携带P4HA1基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1、携带P4HA2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2以便于提高哺乳动物组织中COL1A1、COL1A2、P4HA1和P4HA2蛋白表达水平的功效和可行性的证据。
将基因疗法载体的混合物注射到3只大鼠后，对大鼠皮肤中COL1A1、COL1A2、P4HA1和P4HA2蛋白浓度的变化进行评价。
将聚乙烯亚胺转染试剂cGMP级体内jetPEI(Polyplus Transfection,France)用作转运系统。将等摩尔的基因疗法DNA载体的混合物溶于无核酸酶的无菌水中。为了获得基因构建体，根据制造商的建议制备DNA-cGMP级体内-JetPEI复合物。可注射的体积为0.05ml，其中DNA总量为100μg。采用隧道法(其中33G针至0.5mm深度)，将溶液注射到初步去毛的大鼠皮肤部位。
在注射基因疗法DNA载体后第2天，取生检样本。使用皮肤生检装置Epitheasy 3.5(Medax SRL)，从携带基因COL1A1、COL1A2、P4HA1和P4HA2的基因疗法DNA载体的混合物(位点I)、基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)(位点II)的注射部位的肌肉位点处，以及从动物的皮肤完整位点(位点III)取生检样本。将生检样本位点用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本量约为10mm3，并且重量约11mg。将每个样本置于含有50mMTris-HCl(pH7.6)、100mM NaCl、1mM EDTA和1mM苯甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并均化以获得均化的悬浮液。然后将悬浮液以14000g离心10分钟。收集上清液，并用于测定治疗性蛋白，如实施例17(COL1A1蛋白的定量)、实施例18(COL1A2蛋白的定量)、实施例19(P4HA1蛋白的定量)和实施例20(P4HA2蛋白的定量)中所述的。分析结果如图22所示。
图22显示，与位点II(安慰剂部位)和位点III(完整部位)相比，在注射携带COL1A1治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、携带COL1A2治疗性基因的治疗DNA载体VTvaf17-COL1A2、携带P4HA2治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2、携带P4HA2治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2的混合物的所有大鼠皮肤位点(位点I)中，COL1A1、COL1A2、P4HA1和P4HA2蛋白浓度提高。结果表明，基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2、基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1和基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2的联合使用的功效及其用于提高哺乳动物组织中治疗性蛋白表达水平的可行性。
实施例30.
携带ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN的功效及其使用以便于提高哺乳动物细胞中ELN蛋白的表达水平的可行性的证据。
为证实携带ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN的功效，在用携带人ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN转染BDF后48小时，对牛真皮成纤维细胞(ScienCell，Cat.#b2300)中ELN治疗性基因mRNA积累的变化进行评价。
在FM-2培养基(ScienCell，Cat.#2331)中培养牛真皮成纤维细胞BDF。如实施例15所述，进行携带人ELN基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN和不携带人ELN基因的DNA载体VTvaf17(参考)的转染、RNA提取、反转录反应、PCR扩增和数据分析。以GenBank数据库中以编号AH001130.2列出的公牛/牛肌动蛋白基因(ACT)作为参考基因。阳性对照包括来自在基质上的PCR的扩增子，所述基质由包含ELN和ACT基因序列的、处于已知浓度的质粒代表。阴性对照包括去离子水。用Bio-Rad CFX Manager 2.1软件(Bio-Rad,USA)，进行PCR产物，即通过扩增得到的ELN和ACT基因cDNA的实时定量。
分析结果如图23所示。
图23显示由于用基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN转染牛真皮成纤维细胞BDF，人ELN基因的特异性mRNA水平大幅提高，证实了该载体渗入真核细胞并在mRNA水平上表达ELN基因的能力。呈现的结果证实使用基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN以便于提高在哺乳动物细胞中ELN基因的表达水平的可行性。
实施例31.
携带基因疗法DNA载体的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1及其产生方法。
构建用于在工业规模上生产携带治疗性基因(选自下列基因的组：COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1)的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的菌株，即分别携带基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或VTvaf17-COL1A2、或VTvaf17-P4HA1、或VTvaf17-P4HA2、或VTvaf17-COL7A1、或VTvaf17-CLCA2、或VTvaf17-ELN、或VTvaf17-PLOD1的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1，供其生产，允许无抗生素选择，涉及制备大肠杆菌菌株SCS110-AF的电感受态细胞，并用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1对这些细胞进行电穿孔。然后，将细胞倒入具有选择性培养基的琼脂板(培养皿)，所述选择性培养基含有酵母素、蛋白胨、6％蔗糖和10μg/ml氯霉素。同时，产生大肠杆菌菌株SCS110-AF以生产基因疗法DNA载体VTvaf17或基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，允许无抗生素阳性选择，这涉及构建包含允许无抗生素阳性选择的转座子Tn10的调控元件RNA-IN的64bp线性DNA片段；1422bp的果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因sacB，其产物确保在含蔗糖的培养基中进行选择、选择发生同源重组的菌株克隆需要的763bp氯霉素抗性基因catR，和两个同源序列329bp和233bp，确保与基因失活同时的基因recA的区域中的同源重组，然后通过电穿孔转化大肠杆菌细胞，并且选择在含有10μg/ml氯霉素的培养基中存活的克隆。
用于生产的所获得的菌株按以下保藏号包括于国家生物资源中心(NationalBiological Resource Centre)-俄罗斯国家工业微生物保藏中心(Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms)(NBRC RNCIM)，英国的RF和NCIMB专利保藏服务的收藏中：
大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1-登记在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，编号B-13165下，保藏日期2018年5月11日；国际保藏单位(INTERNATIONAL DEPOSITARYAUTHORITY)编号NCIMB 43033，保藏日期2018年4月20日，
大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2-登记在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，编号为B-13164下，保藏日期2018年5月11日；国际保藏单位(INTERNATIONALDEPOSITARY AUTHORITY)编号NCIMB 43035，保藏日期2018年4月20日，
大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1-登记在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，编号为B-13384下，保藏日期2018年12月14日；国际保藏单位(INTERNATIONALDEPOSITARY AUTHORITY)编号NCIMB 43311，保藏日期2018年12月13日，
大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2-登记在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，编号B-13388下，保藏日期2018年12月14日；国际保藏单位(INTERNATIONAL DEPOSITARYAUTHORITY)编号NCIMB 43312，保藏日期2018年12月13日，
大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2-登记在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，编号B-13385下，保藏日期2018年12月14日；国际保藏单位(INTERNATIONAL DEPOSITARYAUTHORITY)编号NCIMB 43308，保藏日期2018年12月13日，
大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN-登记在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，编号B-13341下，保藏日期2018年11月22日；国际保藏单位(INTERNATIONAL DEPOSITARYAUTHORITY)编号NCIMB 43281，保藏日期2018年11月22日，
大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1登记在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，编号B-13387下，保藏日期2018年12月14日；国际保藏单位(INTERNATIONAL DEPOSITARYAUTHORITY)编号NCIMB 43313，保藏日期2018年12月13日。
实施例32.
用于将携带治疗性基因(选自COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1的组)的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体VTvaf17扩大至工业规模的方法。
为了证实基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1(SEQ ID No.1)、或VTvaf17-COL1A2(SEQ ID No.2)、或VTvaf17-P4HA1(SEQ ID No.3)、或VTvaf17-P4HA2(SEQ ID No.4)、或VTvaf17-COL7A1(SEQ ID No.5)、或VTvaf17-CLCA2(SEQ ID No.6)、或VTvaf17-ELN(SEQ IDNo.7)、或VTvaf17-PLOD1(SEQ ID No.8)在工业规模上的可生产性和可构建性，对大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌菌株菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1(各自含有携带治疗性基因(即COL1A1、或COL1A2、或P4HA1、或P4HA2、或COL7A1、或CLCA2、或ELN、或PLOD1)的区域的基因疗法DNA载体VTvaf17)进行大规模发酵。每种大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1基于大肠杆菌菌株SCS110-AF(Cell and Gene Therapy LLC,United Kingdom)通过如下方法产生，如实施例31所述的：用携带治疗性基因(即COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1)的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或VTvaf17-COL1A2、或VTvaf17-P4HA1、或VTvaf17-P4HA2、或VTvaf17-COL7A1、或VTvaf17-CLCA2、或VTvaf17-ELN、或VTvaf17-PLOD1对该菌株的感受态细胞进行电穿孔，其中将转化的细胞在具有选择性培养基的琼脂板(培养皿)中进一步接种，并且选择个别克隆，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、和6％蔗糖。
将携带基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1的大肠杆菌SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1菌株在10L发酵罐中进行发酵，然后提取基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1。
对于大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1的发酵，制备了每10L体积含有以下成分的培养基：胰蛋白胨100g和酵母浸膏50g(Becton Dickinson,USA)；然后将培养基用水稀释至8800ml，在121℃下高压蒸汽处理20分钟，然后加入50％(w/v)蔗糖1200ml。之后，将大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1的种子培养物接种到100ml体积的培养烧瓶中。将培养物在30℃的摇床恒温箱中孵育16小时。将种子培养物转移至Techfors S生物反应器(Infors HT,Switzerland)中，并使其生长至稳定期。通过测量培养物在600nm处的光密度来控制该过程。将细胞在5000-10000g下沉淀30分钟。除去上清液，将细胞沉淀重新悬浮于10％(按体积计)的磷酸盐缓冲盐水中。细胞以5000-10000g再次离心30分钟。去除上清液，加入20mM TrisCl,1mM EDTA,200g/L蔗糖(pH 8.0)的溶液以体积1000mL添加至细胞沉淀中，并且将混合物充分搅拌至均化的悬浮液。然后加入卵溶菌酶溶液至终浓度100μg/ml。将混合物在冰上孵育20分钟，同时轻轻搅拌。然后添加0.2M NaOH 2500ml，10g/L十二烷基硫酸钠(SDS)，在冰上将混合物孵育10分钟，同时轻轻搅拌，然后加入3M醋酸钠2M醋酸3500ml(pH5-5.5)，并将混合物在冰上孵育10分钟，同时轻轻搅拌。将所得样本以15,000g或更大的值离心20-30分钟。将溶液小心倾析，通过粗滤器(滤纸)除去残余沉淀。然后，加入RNase A(Sigma,USA)至终浓度20μg/ml，将溶液在室温下孵育16小时过夜。然后将溶液以15,000g离心20-30分钟，并通过0.45μm膜过滤器((Millipore,USA)。然后，用100kDa膜(Millipore,USA)进行超滤，并用25mM TrisCl缓冲溶液(pH7.0)将混合物稀释到初始体积。这种操作进行了三至四次。将溶液施加到含有250ml DEAE Sepharose HP(GE,USA)的柱上，用25mM TrisCl平衡，pH7.0。上样后，用三体积相同的溶液洗涤柱，然后用25mM TrisCl(pH7.0)平衡，上样后，将柱用三倍体积的相同溶液洗涤，并然后使用25mM TrisCl(pH 7.0)的线性梯度洗脱基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1，以获得25mM TrisCl(pH7.0)，1M NaCl的溶液，为柱体积的5倍。通过测量流出液在260nm处的光密度来控制洗脱过程。将含有基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1的色谱级份结合在一起，并用Superdex 200(GE,USA)进行凝胶过滤。将柱用磷酸盐缓冲盐水平衡。通过测定流出液在260nm处的光密度来控制洗脱过程，并用琼脂糖凝胶电泳分析级份。将含有基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1的级份结合在一起，在-20℃下储存。为了评价工艺的再生产性，将指定的操作重复五次。以类似的方式进行针对大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1的所有处理操作。
终产物产量的处理再生产性和定量特性证实了基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或VTvaf17-COL1A2、或VTvaf17-P4HA1、或VTvaf17-P4HA2、或VTvaf17-COL7A1、或VTvaf17-CLCA2、或VTvaf17-ELN、或VTvaf17-PLOD1在工业规模上的可生产性和可构建性。
因此，所产生的含有治疗性基因的基因疗法DNA载体可用于将其递送至经历由该基因编码的蛋白质表达减少或不足的人和动物的细胞中，从而确保所希望的治疗效果。
本发明设定的目的，即构建基因疗法DNA载体，以提高COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因的表达水平，结合以下性质：
I)由于所获得的基因疗法载体具有有限大小的载体部分，因此提高真核细胞中治疗性基因表达的功效，
II)由于基因疗法DNA载体中缺乏代表病毒基因组核苷酸序列的调控元件和抗生素抗性基因，因此在人类和动物的基因疗法中安全使用的可能性，III)在工业规模上菌株的可生产性和可构建性，
IV)以及实现用于产生这些基因疗法DNA载体的携带这些基因疗法DNA载体的菌株的构建目的，这由以下实施例支持：
对于I-实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30；
对于II-实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30；
对于III-实施例1、2、3、4、5、6、7、8、31、32；
对于IV-实施例31、32。
工业实用性
以上列出的所有实施例证实了所提出的携带治疗性基因(选自COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1基因的组)的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体以提高这些治疗性基因的表达水平，携带基因疗法DNA载体的大肠杆菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1、或大肠杆菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1，及其在工业规模上的生产方法的工业实用性。
缩略语表：
VTvaf17-缺少病毒基因组和抗生素抗性标记物(无病毒-抗生素治疗性载体)序列的基因疗法载体
DNA：脱氧核糖核酸
cDNA：互补脱氧核糖核酸
RNA：核糖核酸
mRNA：信使核糖核酸
bp：碱基对
PCR：聚合酶链式反应
ml：毫升，μl：微升
mm3：立方毫米
l：升
μg：微克
mg：毫克
g：克
μM：微摩尔
mM：毫摩尔
min：分钟
s：秒
rpm：每分钟转数
nm：纳米
cm：厘米
mW：毫瓦特
RFU：相对荧光单位
PBS：磷酸盐缓冲盐水
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Claims (22)
1.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多脱发，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的COL1A1治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列SEQ ID No.1的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1。
2.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多脱发，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的COL1A2治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列SEQ ID No.2的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2。
3.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多脱发，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的P4HA1治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列SEQ ID No.3的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1。
4.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多脱发，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的P4HA2治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列SEQ ID No.4的基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2。
5.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多脱发，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的COL7A1治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列SEQ ID No.5的基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1。
6.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多脱发，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的CLCA2治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列SEQ ID No.6的基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2。
7.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多脱发，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的ELN治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列SEQ ID No.7的基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN。
8.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多脱发，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的PLOD1治疗性基因的编码区，产生具有核苷酸序列SEQ ID No.8的基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1。
9.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，其携带COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN或PLOD1治疗性基因，所述基因疗法DNA载体由于如下实情是独特的，即每种构建的基因疗法DNA载体：根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的VTvaf17-COL1A1、或VTvaf17-COL1A2、或VTvaf17-P4HA1、或VTvaf17-P4HA2、或VTvaf17-COL7A1、或VTvaf17-CLCA2、或VTvaf17-ELN、或VTvaf17-PLOD1由于VTvaf17载体部分不超过3200bp的有限大小而具有有效渗入人和动物细胞并表达克隆到其上的COL1A1、或COL1A2、或P4HA1、或P4HA2、或COL7A1、或CLCA2、或ELN、或PLOD1治疗性基因的能力。
10.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，其携带COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN或PLOD1治疗性基因，所述基因疗法DNA载体由于如下实情是独特的，即每种构建的基因疗法DNA载体：根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的VTvaf17-COL1A1、或VTvaf17-COL1A2、或VTvaf17-P4HA1、或VTvaf17-P4HA2、或VTvaf17-COL7A1、或VTvaf17-CLCA2、或VTvaf17-ELN、或VTvaf17-PLOD1使用核苷酸序列作为结构元件，所述核苷酸序列不是抗生素抗性基因、病毒基因，或病毒基因组调控元件，这确保其安全用于人和动物的基因疗法。
11.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的携带COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的产生方法，所述方法涉及如下获得基因疗法DNA载体中的每一种：VTvaf17-COL1A1、或VTvaf17-COL1A2、或VTvaf17-P4HA1、或VTvaf17-P4HA2、或VTvaf17-COL7A1、或VTvaf17-CLCA2、或VTvaf17-ELN、或VTvaf17-PLOD1：将根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的COL1A1、或COL1A2、或P4HA1、或P4HA2、或COL7A1、或CLCA2、或ELN、或PLOD1治疗性基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17，并且分别获得基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1，SEQ ID No.1；或VTvaf17-COL1A2，SEQ ID No.2；或VTvaf17-P4HA1，SEQ ID No.3；或VTvaf17-P4HA2，SEQ ID No.4；或VTvaf17-COL7A1，SEQ ID No.5；或VTvaf17-CLCA2，SEQ IDNo.6；或VTvaf17-ELN，SEQ ID No.7；或VTvaf17-PLOD1，SEQ ID No.8，其中所述COL1A1、或COL1A2、或P4HA1、或P4HA2、或COL7A1、或CLCA2、或ELN、或PLOD1治疗性基因的编码区如下获得：通过从人生物组织样本中分离总RNA，然后使用获得的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增，并通过相应的限制性内切核酸酶切割扩增产物，其中通过NheI和HindIII限制位点进行对基因疗法DNA载体VTvaf17的克隆，其中在无抗生素的情况下进行选择，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1，SEQ IDNo.1生产过程中用于所述反转录反应和PCR扩增：
Col1A1_F CCAGCTAGCGTCTAGGGTCTAGACATGTTC，
Col1A1_R TATAAGCTTCTACAGGAAGCAGACAGGGCCAAC，
并且通过NheI和HindIII限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将COL1A1基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2，SEQ IDNo.2生产过程中用于所述反转录反应和PCR扩增：
Col1A2_F CCAGCTAGCGTCTAAGTGCTAGACATGCTC，
Col1A2_R CGAAGCTTTTATTTGAAACAGACTGGGCCA，
并且通过NheI和HindIII限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将COL1A2基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1，SEQ IDNo.3生产过程中用于所述反转录反应和PCR扩增：
P4HA1_F AGGATCCACCATGATCTGGTATATATTAATTATAGG，
P4HA1_R TTCGGTACCTATTCCAATTCTGACAACGTACAAG，
并且通过BamHI和KpnI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将P4HA1基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2，SEQ IDNo.4生产过程中用于所述反转录反应和PCR扩增：
P4HA2_F AGGATCCACCATGAAACTCTGGGTGTCTGCA，
P4HA2_R CTTGTCGACTTAGTCAACTTCTGTTGATCCACA，
并且通过BamHII和SalI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将P4HA2基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1，SEQ IDNo.5生产过程中用于所述反转录反应和PCR扩增：
COL7A1_F ATCGTCGACCACCATGACGCTGCGGCTTCTGGT，
COL7A1_R ATAGAATTCAGTCCTGGGCAGTACCTGTC，
并且通过SalI和EcoRI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将COL7A1基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2，SEQ IDNo.6生产过程中用于所述反转录反应和PCR扩增：
CLCA2_F AGGATCCACCATGACCCAAAGGAGCATTGC，
CLCA2_R ATAGAATTCATAATAATTTTGTTCCATTCTCTTTC，
并且通过BamHI和EcoRI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将CLCA2基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN，SEQ ID No.7的生产过程中用于所述反转录反应和PCR扩增：
ELN_F TTTGTCGACCACCATGGCGGGTCTGACGGCGG，
ELN_R TTTTTGAATTCTCATTTTCTCTTCCGGCCACAAGCTT，
并且通过SalI和EcoRI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将ELN基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，
其中，出于此目的产生的以下寡核苷酸在基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1，SEQ IDNo.8的生产过程中用于所述反转录反应和PCR扩增：
PLOD1_F GGATCCACCATGCGGCCCCTGCTGCTACT，
PLOD1_R ATAGAATTCAGGGATCGACGAAGGAGACT，
并且通过BamHII和EcoRI限制性内切核酸酶进行扩增产物的切割和将PLOD1基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中。
12.使用根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的携带COL1A1、COL1A2、P4HA1、P4HA2、COL7A1、CLCA2、ELN和PLOD1治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的方法，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多，所述方法涉及用从基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的所构建的基因疗法DNA载体的组选择的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体，或选择的若干种基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体转染患者或动物器官和组织的细胞；和/或将通过从基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的所构建的基因疗法DNA载体选择的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体或选择的若干种基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体转染的所述患者或动物的自体细胞注射到相同患者或动物的器官和组织；和/或将从基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的所构建的基因疗法DNA载体的组选择的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体或选择的若干种基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体注射到相同患者或动物的器官和组织，或所指示的方法的组合。
13.用于构建根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的基因疗法DNA载体的菌株的生产方法，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多，所述方法涉及制备大肠杆菌菌株SCS110-AF的电感受态细胞，并用基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1对这些细胞进行电穿孔，然后将所述细胞倒入含有选择性培养基的琼脂板(培养皿)，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖和10μg/ml氯霉素，并且作为结果，获得大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1。
14.根据权利要求13获得的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1供其生产，在基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多。
15.根据权利要求13获得的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2供其生产，在基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多。
16.根据权利要求13获得的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1供其生产，在基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多。
17.根据权利要求13获得的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2供其生产，在基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多。
18.根据权利要求13获得的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1供其生产，在基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多。
19.根据权利要求13获得的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2供其生产，在基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多。
20.根据权利要求13获得的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN供其生产，在基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多。
21.根据权利要求13获得的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1供其生产，在基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多。
22.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的携带COL1A1、或COL1A2、或P4HA1、或P4HA2、或COL7A1、或CLCA2、或ELN、或PLOD1治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体在工业规模上的生产方法，所述基因疗法DNA载体用于治疗与皮肤和其他器官的细胞外基质形成障碍、皮肤结构、伤口愈合障碍相关的疾病，用于预防由内部和外部因素引起的皮肤老化，用于治疗遗传性和获得性结缔组织疾病，包括Ehlers-Danlos综合征、大疱性表皮松解症、卡菲病、成骨不全症、病理性瘢痕形成、瘢痕形成、浅表表皮囊肿和色素沉着过多，所述方法涉及如下生产基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL1A2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-P4HA2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-COL7A1、或基因疗法DNA载体VTvaf17-CLCA2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-ELN、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PLOD1：通过用选自大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL1A2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-P4HA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-COL7A1、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-CLCA2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-ELN、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PLOD1的种子培养物对含有所制备的培养基的培养烧瓶接种，然后将细胞培养物在培养箱摇床中孵育，并转移至工业发酵罐，然后培养至稳定期，然后提取含有靶DNA产物的级份，多级过滤，并且通过色谱方法进行纯化。
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