CN113474457A - 基因疗法dna载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程，并且可在生物技术、医学和农业中用于制造基因疗法药物产品。提出了基于选自包含BMP‑2、BMP‑7、OPG、PDGFA、PDGFB基因的组的靶基因的携带基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，以提高人和动物中该靶基因的表达水平。其中，基因疗法DNA载体VTvaf17‑BMP‑2、或VTvaf17‑BMP‑7、或VTvaf17‑OPG、或VTvaf17‑PDGFA、或VTvaf17‑PDGFB分别具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的核苷酸序列。基因疗法DNA不包含病毒起源的核苷酸序列并且没有抗生素抗性基因，这为其在人和动物中的基因疗法提供了安全使用的可能性。还提出了生产特定载体的方法、使用载体的方法、携带特定载体的大肠杆菌菌株以及工业规模上生产特定载体的方法。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程，可用于生物技术、医药和农业中制造基因治疗产品。
背景技术
基因疗法是医学中的创新方法，旨在通过将新的遗传物质递送到患者的细胞中以补偿或遏制突变基因的功能和/或治疗遗传障碍来治疗遗传性和获得性疾病。基因表达的终产物可以是RNA分子或蛋白质分子。然而，体内的大多数生理学过程都与蛋白质分子的功能性活性有关，而RNA分子或是蛋白质合成的中间产物，或是进行调节功能。因此，在大多数情况下，基因疗法的目标是向生物体注入基因，所述基因提供由这些基因编码的蛋白质分子的转录和进一步翻译。在本发明的描述中，基因表达是指产生具有由该基因编码的氨基酸序列的蛋白质分子。
BMP-2、BMP-7、PDGFA、PDGFB和OPG基因在人和动物生物体的多个过程中起着关键作用。在某些情况下，证明了在某些情况下这些蛋白质的低/不足浓度与各种人类疾病之间的相关性，其通过在编码这些蛋白质的正常基因表达中的干扰证实。因此，选自BMP-2、BMP-7、PDGFA、PDGFB和OPG基因的组的基因表达的基因疗法上调具有纠正人和动物中的各种病症的潜力。
OPG基因(别名TNFRSF11B)编码骨保护素蛋白(OPG)，其是由于竞争性RANKL结合而产生的骨诱裂发生(osteoclastogenesis)的抑制剂。RANK受体与RANKL配体的相互作用启动了一个信号传导级联，其导致破骨细胞祖细胞分化和成熟为具有骨吸收能力的活性破骨细胞。许多向钙激素和细胞因子，包括维生素D3、甲状旁腺素、前列腺素E2和白细胞介素-11，通过抑制OPG产生和刺激RANKL产生的双重作用刺激骨诱裂发生。另一方面，雌激素抑制RANKL产生和RANKL刺激的骨诱裂发生。RANK/RANKL/OPG范例对破骨细胞的分化和激活提供了新的理解，为开发以过度骨吸收为特征的疾病的可能治疗开辟了新的可能性。除骨诱裂发生外，OPG还可通过与TRAIL、糖胺聚糖或蛋白聚糖相互作用，促进细胞迁移的存活和增殖。许多体外、非临床和临床研究显示OPG参与心血管疾病、骨骼疾病、免疫系统疾病以及肿瘤疾病。
将含Fc片段的OPG重组蛋白局部注射到大鼠实验性机械性牙齿松动处促成正常状态的恢复，并且这种策略可用于正牙学(Schneider DA et al.//Orthod CraniofacRes.2015Apr；18Suppl 1:187-95)。这些数据得到了其他研究小组的证实。(Fernández-González FJ et al.//Eur J Orthod.2016Aug；38(4)：379-85；Hudson JB et al.//Calcif Tissue Int.2012Apr；90(4)：330-42)。使用基因治疗方法也获得了类似的结果(Zhao N et al.//Am J Orthod Dentofacial Orthop.2012Jan；141(1)：30-40)。
显示了由携带OPG基因的质粒载体所致的OPG基因表达升高抑制了体内骨诱裂发生，并抑制了大鼠实验性牙周炎引起的牙槽骨高度的降低。因此，提高OPG基因表达的基因治疗方法可用于开发预防牙周骨渐进性流失的工具(Tang H et al.//J PeriodontalRes.2015Aug；50(4)：434-43.)。
在小鼠促炎性幼年骨质疏松症的实验模型中，显示使用含有Fc片段的重组OPG蛋白促进正常成骨细胞/破骨细胞平衡的恢复，并防止骨骼生长障碍(Del Fattore A etal.//Osteoporos Int.2014Feb；25(2)：681-92)。
在胶原诱导性关节炎模型中，使用表达OPG基因的重组腺相关病毒载体对大鼠关节具有保护作用(Bao L et al.//Joint Bone Spine.2012Oct；79(5)：482-7)。
用表达OPG基因的重组腺病毒载体转导的细胞的预防性局部注射导致大鼠中钛植入物的骨整合和稳定性的改善(Yin G et al.//Gene Ther.2015Aug；22(8)：636-44)。使用膝关节成形术的鼠模型在由钛微粒的存在引起的并发症中获得了类似的结果(Zhang L etal.//Gene Ther.2010Oct；17(10)：1262-9)。
在具有放射治疗诱导的退行性骨改变的患者中重组OPG蛋白(AMGN-0007,AmgenCorp.)的临床I期研究证实了其作为治疗骨吸收的治疗剂的潜力(Body JJ et al.//Cancer.2003Feb 1；97(3Suppl)：887-92)。
在对肿瘤疾病OPG潜能的研究中，显示了将表达含有Fc片段的OPG基因的修饰重组腺病毒载体注射到实验动物抑制了转移性前列腺癌细胞并减缓了肿瘤的进展(Cody JJ etal.//Lab Invest.2013Mar；93(3)：268-78)。
就心血管疾病而言，注射表达OPG基因的细胞减少了OPG基因表达缺陷的小鼠的动脉粥样硬化斑块的大小，并减少了血管硬化(Callegari A et al.//Arterioscler ThrombVasc Biol.2013Nov；33(11)：2491-500)。
BMP-2和BMP-7基因分别编码骨形态发生蛋白2和7。BMP是属于主要存在于骨组织中的TGF家族的细胞因子。名称“BMP”仅描述一种特定功能，但实际上，这些蛋白质对身体有许多其他作用，即：软骨化、内脏器官的发育，即形态发生、增殖、凋亡和细胞分化。此外，BMP还阻断肌生成和脂肪生成。包括BMP-2、BMP-4和BMP-7在内的一些BMP参与来自胚胎中胚层的造血组织的特化。它们调节成人和新生儿的人造血细胞的增殖和分化。到目前为止，已鉴定出20种类型的BMP蛋白。与骨和软骨修复相关的研究最深入的是BMP-2和BMP-7。已知它们能够诱导骨生长，即诱导四种类型细胞的增殖和分化，即成骨细胞、破骨细胞、成软骨细胞和软骨细胞。在体外，BMP-2、-4、-7和-3有助于成骨细胞和骨细胞衍生物的生长。BMP的定位位点是含有骨祖细胞和间充质细胞的结缔组织的胞外基质。证明了BMP于骨膜成骨层细胞中沿骨组织胶原纤维分布；它们以适中的量存在于板层骨细胞中，并且过量存在于牙齿组织中。BMP由成骨细胞、软骨细胞及其前体合成。观察到BMP在胫骨生长部位(骨骺、干骺端、软骨)的活性提高。除骨骼外，BMP还在骨外生物组织中表达。在前列腺和胎盘中发现了高含量的BMP(Paralkar V et al.//J.Biol.Chem.-1998.-Vol.273,N 22.-P.13760-13767)。
许多研究者指出在不同组织库中产生的同种异体骨移植物的极不稳定或低骨诱导指数。同种异体或异种骨移植物的骨诱导性的生物学优化或激活可以通过添加骨诱导蛋白或其它生长因子的去矿化来实现。与在大鼠实验中使用自体骨与去矿化骨基质的组合时相比，BMP-2显示类骨质形成增加(Schwartz Z et al.//J.Periodontol.-1998.-Vol.69,N12.-P.1337-1345)。在对狗的实验中，通过在同种异体骨移植物中添加BMP-7比使用自体骨获得更高的骨愈合百分比(Lewandrowski K.//Spine J.-2007.-Vol.7J5.-P.609-614)。对间充质干细胞的成骨分化和诸如以下材料的碱性磷酸酶活性进行了影响比较：去矿化骨基质(DBM)、添加BMP-7的去矿化骨基质(DBM+BMP-7)、骨胶原+BMP-7、骨胶原、冷冻骨移植物、具有BMP-7的冷冻骨移植物。发现DBM+BMP-7在更大程度上刺激了间充质干细胞的成骨分化和碱性磷酸酶的激活(Tsiridis E.et al.//J.Orthop.Res.-2007.-Vol.25,N 11.-P.1425-1437)。
BMP-7在脊椎病理学中用于实现骨愈合的效率与自体骨材料的效率相当或略高于自体骨材料的效率(Johnsson R et al.//Spin.-2002.-Vol.27.-P.2654-2661)。这项研究包括9名年龄在21至24岁之间的具有骨不连合风险因素(肾上腺功能不全、高血压、长期吸烟、肥胖症、甲状腺机能亢进、类风湿性关节炎)的患者，揭示了BMP-7对于脊柱融合是安全有效的(Govender S et al.//J.Bone Jt Surg.-2002.-Vol.84A.-P.2123-2134)。Vaccaro等人对36名进行退行性腰椎脊椎滑脱合并椎管狭窄的手术治疗的患者进行了检查。将含有rhBMP-7的骨移植物糊剂与来自髂嵴的自体移植物一起施用于患者的一部分(主要组)，对另一部分仅施用来自髂嵴的自体移植物(对照组)。观察1年后，主要组骨中发现的愈合率为病例的86％，在对照组中—在73％的病例中，在4年后—分别为69％和50％(VaccaroA.R.et al.//Eur.Spine J.-2005.-Vol.14.-P.623-629)。Govender等人报道了在胶原载体上rhBMP-7的临床应用，剂量分别为0.75mg/ml(总剂量6mg)和1.50mg/ml(总剂量12mg)。这项研究包括来自11个国家的450名胫骨开放性骨折患者。对所有患者进行用钛钉的髓内接骨术。74％的患者在没有重复干预的情况下实现骨折愈合。该研究的数据促成欧洲医药产品评估机构(European Agency for the Evaluation of Medicinal Products，EMEA)在2002年以及在2004年美国食品和药品管理局(FDA)批准rhBMP-7/ACS在通过髓内接骨术治疗胫骨开放性骨折中的应用(Govender S et al.//J.Bone Jt Surg.-2002.-Vol.84A.-P.2123-2134)。
与使用来自髂嵴的自体移植物的情况相比，在胶原海绵上使用rhBMP-7时观察到椎体骨愈合的频率相同或更高。事实上，据报道，当使用rhBMP-7时，100％的患者中出现骨愈合(SchwenderJ.D.et al.//J.Spin.Disord.Tech.-2005.-Vol.18.-P.S1-S6)。不存在自体骨的手术取样特征性的并发症。
rhBMP-7以胶原蛋白糊的形式用于治疗胫骨开放性骨折患者，有助于较大百分比的病例中的骨折愈合，并降低了重复手术干预的频率(Fricdlaender G.et al.//J.BoneJt Surg.-2001.-Vol.83A.-P.S151-S158)。当与自体骨或同种异体去矿化骨基质联合使用时，与仅使用自体骨的相同程序相比，显示骨折愈合时间缩短(Bilic R et al.//Int.Orthop.-2006.-Vol.30.-P.128-134)。
重组BMP的使用进展为许多使用基因治疗方法的研究提供了机会。因此，病毒、质粒和细胞载体已成功地用于在骨缺损再生的各种研究中表达BMP基因(Schwabe P etal.//ScientificWorldJournal.2012；2012：560142；Wegman F et al.//Eur CellMater.2011Mar 15；21：230-42；discussion 242；Wang CJ et al.//Arthroscopy.2010Jul；26(7)：968-76；Heggeness MH.//Spine J.2015Nov 1；15(11)：2410-1；Wu G et al.//J Craniofac Surg.2015Mar 15；26(2)：378-81；Loozen LD etal.//Tissue Eng Part A.2015May；21(9-10)：1672-9)。研究之一显示，联合使用BMP-2和BMP-7基因的基因治疗方法比单独使用这些基因中的每一种具有更明显的治疗效果(KohJT et al.//J Dent Res.2008Sep；87(9)：845-9)。
除了BMP蛋白用于再生骨和软骨损伤的应用之外，还显示BMP-7基因表达的上调促进伤口愈合和防止组织纤维化的形成(Tandon A et al.//PLoS One.2013Jun 14；8(6)：e66434；19；Zhong et al.//Int J Med Sci.2013；10(4)：441-50.)。另外，表达BMP-7基因的腺病毒载体在眼损伤再生过程中对上皮细胞具有调节作用(Saika S et al.//Am JPhysiol Cell Physiol.2006Jan；290(1)：C282-9)。事实上，已经显示表达BMP-7的腺病毒载体可以对大鼠实验性溃疡性结肠炎的病程具有有益的影响(Hao Z et al.//J GeneMed.2012Jul；14(7)：482-90)。
PDGFA和PDGFB基因编码血小板生长因子(血小板衍生生长因子-PDGF)A和B(PDGFA和PDGFB)，这些因子在骨组织修复早期由血小板分泌。它们的特征为对成骨细胞和祖细胞的促有丝分裂活性。此外，还发现PDGFA和PDGFB参与血管生成。近年来，已经将血小板生长因子应用于牙科以优化骨缺损的再生。180名患者的随机安慰剂对照试验显示，缺损在3个月内被小梁骨组织填充。该方法也在手术治疗后使用。此外，将生长因子直接递送至骨移植物使用领域显著改善了软组织的恢复(Nevins et al.//J.Periodontol.-2005.-Vol.76.-P.2205-2215)。
使用表达PDGFB基因的质粒载体的基因治疗方法已经成功地应用于大鼠的颅骨再生。研究结果显示，经过4周的监测后，在颅骨愈合方面观察到了明显的积极效果(Elangovan S et al.//Biomaterials.2014Jan；35(2)：737-47)。
在对小鼠和大鼠心脏的离体实验研究中，显示表达PDGFB基因的腺病毒载体有助于预测移植成功的标记物概况的改变(Tuuminen R et al.//Transplantation.2016Feb；100(2)：303-13)。在对兔和仔猪的研究中，特别表达PDGFB基因的重组腺相关病毒载体促进了新血管形成并改善了心肌功能参数(Kupatt C et al.//J Am Coll Cardiol.2010Jul27；56(5)：414-22)。
还证明了使用表达PDGFB基因的构建体的基因治疗方法促进了大鼠韧带损伤的愈合(Nakamura N et al.//Gene Ther.1998Sep；5(9)：1165-70)。
在伤口愈合和再生的研究中，使用表达PDGFB基因的腺病毒载体有助于取得显著的治疗效果(Chandler LA et al.//Mol Ther.2000Aug；2(2)：153-60)。
使用表达PDGFA基因的成纤维细胞在脊柱和脊髓颈部的术后愈合中有明显的积极效果(Ijichi A et al.//Gene Ther.1996May；3(5)：389-95)。
使用表达PDGFA和PDGFB基因的质粒载体的基因治疗方法也证明在治愈兔子的皮肤创伤中是有效的(Tyrone JW et al.//J Surg Res.2000Oct；93(2)：230-6)。
给定的数据显示，由于使用PDGFA和PDGFB基因的基因治疗方法能够刺激骨组织和周围软组织两者的再生，它们是再生医学的一个有前途的方向。
因此，本发明的背景提出BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因具有纠正一系列偏差的潜力，所述偏差包括但不限于骨和周围软组织中的损伤和退行性变化(包括牙周病、牙周炎和骨质疏松症)、心血管疾病、自身免疫性疾病、癌症、遗传性和获得性病理状况(如结缔组织损伤)以及其他过程。这就是BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因分类在本专利内的原因。提供由来自BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB组的基因编码的蛋白表达的遗传构建体可用于开发预防和治疗不同疾病和病理状况的药物。
此外，这些数据表明，在一组基因中包含的BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因编码的蛋白质的表达不足不仅与病理状况有关，而且与它们发展的易感性有关。此外，这些数据表明，这些蛋白质的表达不足可能不以现有临床实践标准(例如，使用ICD代码)框架内可以明确描述的病理学形式明确出现，但同时导致对人和动物不利并与生活质量恶化有关的状况。
对提高治疗性基因表达的方法的分析意味着使用不同基因疗法载体的可行性。
将基因疗法载体分为病毒、细胞、和DNA载体(关于基因疗法药物产物的质量、非临床和临床方面的指南EMA/CAT/80183/2014)。最近，基因疗法越来越重视非病毒基因递送系统的开发，其中质粒载体位居榜首。质粒载体没有细胞和病毒载体固有的限制。在靶细胞中，它们作为附加体存在，没有整合到基因组中，而产生它们相当便宜，并且没有施用质粒载体而引起的免疫反应或副作用，这使得它们成为遗传疾病的基因疗法和预防(DNA疫苗接种)的便捷工具(Li L,Petrovsky N.//Expert Rev Vaccines.2016；15(3):313-29)。
然而，在基因疗法中质粒载体使用的局限性是：1)用于在细菌菌株中生产构建体的抗生素抗性基因的存在；2)由病毒基因组序列所代表的各种调控元件的存在；3)决定载体递送至靶细胞的效率的治疗性质粒载体的长度。
众所周知，欧洲药品管理局认为有必要避免将抗生素抗性标记基因添加到用于基因疗法的新工程化的质粒载体中(关于开发过程中基因疗法药物产物的设计修改的读后报告(Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinalproducts during development)/2011年12月14日EMA/CAT/GTWP/44236/2009先进疗法委员会(Committee for advanced therapies))。该建议主要与DNA载体渗透或水平抗生素抗性基因转移到体内存在的细菌细胞中的潜在危险有关，这些细菌是正常或机会性微生物群落的一部分。此外，抗生素抗性基因的存在显著增加了DNA载体的长度，这降低了其渗透到真核细胞的功效。
值得注意的是，抗生素抗性基因也对DNA载体的生产方法做出了根本性的贡献。如果存在抗生素抗性基因，那么用于产生DNA载体的菌株通常在含有选择性抗生素的培养基中培养，这会在未经充分纯化的DNA载体制剂中造成抗生素痕量的风险。因此，没有抗生素抗性基因的用于基因疗法的DNA载体的生产与菌株的生产有关，其中此类菌株具有独特的特征，例如在无抗生素的培养基中治疗性DNA载体稳定扩增的能力。
此外，欧洲药品管理局建议避免在治疗性质粒载体中存在构成各种病毒的基因组核苷酸序列的提高治疗性基因表达的调控元件(启动子、增强子、翻译后调控元件)(关于基因疗法药物产品的质量、非临床和临床方面的指南草稿(Draft Guideline on thequality,non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinalproducts)，http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guidel ine/2015/05/WC500187020.pdf)。尽管这些序列可以提高治疗性转基因的表达水平，但是它们造成了与野生型病毒的遗传物质重组和整合到真核基因组中的风险。此外，疗法用的特定基因的过表达的相关性仍然是悬而未决的问题。
疗法载体的大小也是必需的。众所周知，现代质粒载体通常具有不必要的非功能性位点，这些位点会显著增加其长度(Mairhofer J,Grabherr R.//MolBiotechnol.2008.39(2):97-104)。例如，pBR322系列载体中的氨苄西林抗性基因，通常由至少1000bp组成，占载体本身长度的20％以上。观察到载体长度与其渗入真核细胞的能力之间的反向关系；具有小长度的DNA载体有效渗入人和动物细胞中。例如，在关于用383-4548bp DNA载体转染HELA细胞的一系列实验中，显示渗入功效的差异可高达两个数量级(100倍差异)(Hornstein BD等人//PLoS ONE.2016；11(12):e0167537.)。
因此，为了安全和最大效率的原因在选择DNA载体时，应优先考虑到如下那些构建体，它们不包含抗生素抗性基因，病毒来源的序列，并且其长度允许有效渗入到真核细胞中。以对于基因疗法目的足够的量生产此类DNA载体的菌株应确保使用无抗生素的营养培养基进行稳定的DNA载体扩增的可能性。
用于基因疗法的重组DNA载体的使用实例是产生用于遗传免疫的重组载体的方法(专利号US 9550998 B2)。质粒载体是超螺旋的质粒DNA载体，其用于人和动物细胞中克隆基因的表达。载体包含复制起点，含有人巨细胞病毒启动子和增强子的调控元件，以及来自人T-细胞嗜淋巴细胞病毒的调节序列。
利用噬菌体，通过插入菌株中的sacB基因的反义互补，将载体在无抗生素的专用大肠杆菌菌株中积累。该发明的缺点是在DNA载体组成中存在构成病毒基因组的序列的调控元件。
以下申请是本发明关于使用基因治疗方法以提高来自BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因的组的基因表达水平的原型。
专利号US5942496A描述了通过将选自包括BMP-2和BMP-7基因的基因的组的基因导入细胞或人和动物生物体中来进行骨组织再生和治疗与骨组织相关疾病的方法。该发明的缺点是对表达这些基因的载体的性质的要求模糊。
专利号US6300127B1描述了使用表达OPG基因的载体用于骨组织再生的方法。该发明的缺点是应用于所用载体的安全要求的缺乏。
专利号EP1017421B1描述了使用重组腺病毒载体在哺乳动物组织中使损伤再生的方法，所述重组腺病毒载体表达选自特别包括PDGFA和PDGFB基因的基因的组的基因。该发明的缺点是使用携带病毒起源序列的载体。
发明内容
本发明的目的是构建基因疗法DNA载体，以提高BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因在人和动物生物体中的表达水平，其结合了以下性质：
I)基因疗法DNA载体的效率，以便于提高真核细胞中治疗性基因的表达水平；
II)由于基因疗法DNA载体中不存在代表病毒基因组核苷酸序列的调控元件，因此在人类和动物的基因疗法中安全使用的可能性；
III)由于基因疗法DNA载体中不存在抗生素抗性基因，在人类和动物的基因疗法中安全使用的可能性；
IV)在工业规模上基因疗法DNA载体的可生产性和可构建性。
根据国家监管机构对基因疗法药物的建议，并且特别是欧洲药品管理局的要求，即避免将抗生素抗性标记基因添加到用于基因疗法的新工程化的质粒载体中(关于开发过程中基因疗法药物产物的设计修改的读后报告/2011年12月14日EMA/CAT/GTWP/44236/2009先进疗法委员会)，以及避免将病毒基因组添加到用于基因疗法的新工程化的质粒载体中(关于基因疗法药物产品的质量、非临床和临床方面的指南/2015年3月23日，EMA/CAT/80183/2014，先进疗法委员会)，在本文中提供了II和III项。
本发明的目的还包括构建携带这些基因疗法DNA载体的菌株，在工业规模上开发和生产这些基因疗法DNA载体。
通过使用基于基因疗法DNA载体VTvaf17生产的基因疗法DNA载体达到特定的目的，所述基因疗法DNA载体用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生，其中所述基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2包含克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的BMP-2治疗性基因的编码区，其具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；包含克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的BMP-7治疗性基因编码区的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7，其具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列；包含克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的OPG治疗性基因编码区的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG，其具有SEQ ID NO.3的核苷酸序列；包含克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的PDGFA治疗性基因编码区的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA，其具有SEQ ID NO.4的核苷酸序列；包含克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的PDGFB治疗性基因编码区的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB，其具有SEQ ID NO.5的核苷酸序列。
每种构建的基因疗法DNA载体，即VTvaf17-BMP-2、或VTvaf17-BMP-7、或VTvaf17-OPG、或VTvaf17-PDGFA、或VTvaf17-PDGFB由于VTvaf17载体部分不超过3200bp的有限大小而具有有效渗入人和动物细胞并表达克隆至其中的BMP-2、或BMP-7、或OPG、或PDGFA或PDGFB治疗性基因的能力。
每种构建的基因疗法DNA载体，即VTvaf17-BMP-2、或VTvaf17-BMP-7、或VTvaf17-OPG、或VTvaf17-PDGFA、或VTvaf17-PDGFB使用核苷酸序列作为结构元件，所述核苷酸序列不是抗生素抗性基因、病毒基因或病毒基因组调控元件，从而确保其安全用于人和动物的基因疗法。
还开发了携带BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA或PDGFB治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的生产方法，所述方法涉及如下获得基因疗法DNA载体中的每一种：VTvaf17-BMP-2、或VTvaf17-BMP-7、或VTvaf17-OPG、或VTvaf17-PDGFA、或VTvaf17-PDGFB：将BMP-2、或BMP-7、或OPG、或PDGFA、或PDGFB治疗性基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，分别获得基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2，SEQ ID No.1、或VTvaf17-BMP-7，SEQ ID No.2、或VTvaf17-OPG，SEQ ID No.3、或VTvaf17-PDGFA，SEQ ID No.4、或VTvaf17-PDGFB，SEQ ID No.5，其中所述BMP-2、或BMP-7、或OPG、或PDGFA、或PDGFB治疗性基因的编码区通过如下获得：通过从人生物组织样本中分离总RNA，然后使用获得的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增，并用相应的限制性内切酶切割扩增产物，其中通过NheI和HindIII、或SalI和KpnI、或BamHI和EcoRI限制性位点进行对所述基因疗法DNA载体VTvaf17的克隆，其中在无抗生素的情况下进行选择，
其中，在基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2，SEQ ID No.1产生过程中使用以下为此目的产生的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增：
BMP2_F ACAGCTAGCCTCCTAAAGGTCCACCATGGT，
BMP2_R TATAAGCTTCTAGCGACACCCACAACCCT，
并用NheI和HindIII限制性内切酶进行扩增产物的切割和将BMP-2基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，
其中，在基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7，SEQ ID No.2产生过程中使用以下为此目的产生的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增：
BMP7_F TCAGCTAGCGTAGAGCCGGCGCGATGCA，
BMP7_R TATAAGCTTCTAGTGGCAGCCACAGGC，
并用NheI和HindIII限制性内切酶进行扩增产物的切割和将BMP-7基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，
其中，在基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG，SEQ ID No.3产生过程中使用以下为此目的产生的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增：
OPG_F AGGATCCACCATGAACAACTTGCTGTGCTGC，
OPG_R ATAGAATTCATAAGCAGCTTATTTTTACTGATTG，
并用BamHI和EcoRI限制性内切酶进行扩增产物的切割和将OPG基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，
其中，在基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA，SEQ ID No.4产生过程中使用以下为此目的产生的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增：
PDGFA_F AGGATCCACCATGAGGACCTTGGCTTGCCT，
PDGFA_R TATGAATTCACCTCACATCCGTGTCCTCT，
并用BamHII和EcoRI限制性内切酶进行扩增产物的切割和将PDGFA基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，
其中，在基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB，SEQ ID No.5产生过程中使用以下为此目的产生的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增：
PDGFB_F TATGTCGACCACCATGAATCGCTGCTGGGCGCT，
PDGFB_R TATGGTACCTAGGCTCCAAGGGTCTCCTTC，
并用SalI和KpnI限制性内切酶进行扩增产物的切割和将PDGFB基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中。
开发了使用携带BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生的方法，所述方法涉及用从基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的构建的基因疗法DNA载体的组选择的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体或选择的几个基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体转染患者或动物器官和组织的细胞；和/或将通过从基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的构建的基因疗法DNA载体选择的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体或选择的几个基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体转染的所述患者或动物的自体细胞注射入相同患者或动物的器官和组织；和/或将从基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的构建的基因疗法DNA载体的组选择的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体或选择的几个基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体注射入相同患者或动物的器官和组织，或所指示的方法的组合。
用于构建基因疗法DNA载体的菌株的生产方法，所述基因疗法DNA载体用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生，所述方法涉及制备大肠杆菌菌株SCS110-AF的电感受态细胞，并用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7、或基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB对这些细胞进行电穿孔。然后将所述细胞倒入具有选择性培养基的琼脂平板(培养皿)，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖和10μg/ml氯霉素，因此得到大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB。
请求保护大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2以供其生产，在所述基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7以供其生产，在所述基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG以供其生产，在所述基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA以供其生产，在所述基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB以供其生产，在所述基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，以用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，以改善牙科学中骨缺损的再生。
开发了携带BMP-2、或BMP-7、或OPG、或PDGFA、或PDGFB治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体在工业规模上的生产方法，所述基因疗法DNA载体用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生，所述方法涉及如下生产基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7、或基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB：通过用选自大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB的种子培养物对含有制备的培养基的培养烧瓶接种，然后将细胞培养物在培养箱摇床中孵育并转移到工业发酵罐中，然后培养到稳定期，然后提取含有靶DNA产物的级份，多级过滤，并通过色谱法纯化。
附图说明
在附图中解释了本发明的本质，其中：
图1
示出了携带选自BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因的组的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17的结构，其构成了能够在大肠杆菌细胞中自主复制的环状双链DNA分子。
图1示出了对应于以下的结构：
A-基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2，
B-基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7，
C-基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG，
D-基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA，
E-基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB。
在结构中指出了载体的下列结构元素：
EF1a-人延伸因子EF1A的启动子区，其具有基因的第一内含子中含有的内在增强子。它保证了重组基因在大多数人体组织中的有效转录，
分别对应于BMP-2基因(图1A)、或BMP-7基因(图1B)、或BMP-7OPG(图1C)、或PDGFA(图1D)、或PDGFB(图1E)的编码区的治疗性基因的阅读框，
hGH-TA-人生长因子基因的转录终止子和多聚腺苷酸化位点，
ori-用于自主性复制的复制起点，具有单核苷酸取代以增加大多数大肠杆菌菌株细胞中的质粒产生，
RNA-out-在使用大肠杆菌菌株SCS 110-AF的情况下，允许无抗生素阳性选择的转座子Tn 10的调控元件RNA-out。
标记独特的限制性位点。
图2
示出了在HOb人成骨细胞培养物(Cell Applications,Inc Cat.406-05a)中，用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2转染前和转染这些细胞48小时后，治疗性基因，即BMP-2基因的cDNA扩增子积累图，以评估渗入真核细胞的能力和功能活性，即治疗性基因在mRNA水平上的表达。
反应过程中扩增子的积累曲线如图2所示，对应于：
1-在用DNA载体VTvaf17-BMP-2转染前HOb人成骨细胞培养物中BMP-2基因的cDNA，
2-在用DNA载体VTvaf17-BMP-2转染后HOb人成骨细胞培养物中BMP-2基因的cDNA，
3-在用DNA载体VTvaf17-BMP-2转染前HOb人成骨细胞培养物中B2M基因的cDNA，
4-在用DNA载体VTvaf17-BMP-2转染后HOb人成骨细胞培养物中B2M基因的cDNA。
以GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因为参考基因。
图3
示出了在MG-63人骨肉瘤培养物(
CRL-1427TM)中，用DNA载体VTvaf17-BMP-7转染前和转染这些细胞48小时后，治疗性基因，即BMP-7基因的cDNA扩增子积累图，以评估渗入真核细胞的能力和功能活性，即治疗性基因在mRNA水平的表达。
反应过程中扩增子的积累曲线如图3所示，对应于：
1-DNA载体VTvaf17-BMP-7转染前MG-63人骨肉瘤培养物中BMP-7基因的cDNA，
2-DNA载体VTvaf17-BMP-7转染后MG-63人骨肉瘤培养物中BMP-7基因的cDNA，
3-DNA载体VTvaf17-BMP-7转染前MG-63人骨肉瘤培养物中B2M基因的cDNA，
4-DNA载体VTvaf17-BMP-7转染后MG-63人骨肉瘤培养物中B2M基因的cDNA。
以GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因为参考基因。
图4
示出了在HGF-1人牙龈成纤维细胞系(
CRL-2014TM)中，用基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG转染前和转染这些细胞48小时后，治疗性基因，即OPG基因的cDNA扩增子积累图，以评估渗入真核细胞的能力和功能活性，即治疗性基因在mRNA水平的表达。
反应过程中扩增子的积累曲线如图4所示，对应于：
1-DNA载体VTvaf17-OPG转染前HGF-1人牙龈成纤维细胞系OPG基因的cDNA，
2-DNA载体VTvaf17-OPG转染后HGF-1人牙龈成纤维细胞系OPG基因的cDNA，
3-DNA载体VTvaf17-OPG转染前HGF-1人牙龈成纤维细胞系B2M基因的cDNA，
4-DNA载体VTvaf17-OPG转染后HGF-1人牙龈成纤维细胞系B2M基因的cDNA。
以GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因为参考基因。
图5
示出了在人软骨细胞培养物(HC)(Cell Applications,Inc Cat.402K-05a)中，用基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA转染前和转染这些细胞48小时后，治疗性基因，即PDGFA基因的cDNA扩增子积累图，以评估渗入真核细胞的能力和功能活性，即治疗性基因在mRNA水平的表达。
反应过程中扩增子的积累曲线如图5所示，对应于：
1-DNA载体VTvaf17-PDGFA转染前人软骨细胞培养物(HC)中PDGFA基因的cDNA，
2-DNA载体VTvaf17-PDGFA转染后人软骨细胞培养物(HC)中PDGFA基因的cDNA，
3-DNA载体VTvaf17-PDGFA转染前人软骨细胞培养物(HC)中B2M基因的cDNA，
4-DNA载体VTvaf17-PDGFA转染后人软骨细胞培养物(HC)中B2M基因的cDNA。
以GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因为参考基因。
图6
示出了在人软骨细胞培养物(HC)(Cell Applications,Inc Cat.402K-05a)中，用基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB转染前和转染这些细胞48小时后，治疗性基因，即PDGFB基因的cDNA扩增子积累图，以便评估渗入真核细胞的能力和功能活性，即治疗性基因在mRNA水平的表达。
反应过程中扩增子的积累曲线如图6所示，对应于：
1-DNA载体VTvaf17-PDGFB转染前人软骨细胞培养物(HC)中PDGFB基因的cDNA，
2-DNA载体VTvaf17-PDGFB转染后人软骨细胞培养物(HC)中PDGFB基因的cDNA，
3-DNA载体VTvaf17-PDGFB转染前人软骨细胞培养物(HC)中B2M基因的cDNA，
4-DNA载体VTvaf17-PDGFB转染后人软骨细胞培养物(HC)中B2M基因的cDNA。
以GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因为参考基因。
图7
示出了用DNA载体VTvaf17-BMP-2转染HOb人成骨细胞后，HOb人成骨细胞培养物的细胞裂解物中BMP-2蛋白浓度图，根据细胞裂解物中BMP-2蛋白浓度的变化评估功能活性，即在蛋白水平上的表达。
图7示出了以下元素：
培养物A-用无质粒DNA的树枝状聚合物水溶液转染的HOb人成骨细胞培养物(参照)，
培养物B-用DNA载体VTvaf17转染的HOb人成骨细胞培养物，
培养物C-用DNA载体VTvaf17-BMP-2转染的HOb人成骨细胞培养物。
图8
示出了在用DNA载体VTvaf17-BMP-7转染MG-63人骨肉瘤细胞(
CRL-1427TM)后，这些细胞培养物裂解物中BMP-7蛋白浓度图，以便评估功能活性，即在蛋白水平的治疗性基因表达，和通过携带BMP-7治疗性基因的基于基因疗法载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白表达水平的可能性。
图8示出了以下元素：
培养物A-用无质粒DNA的树枝状聚合物水溶液转染的MG-63人骨肉瘤培养物(参照)，
培养物B-用DNA载体VTvaf17转染的MG-63人骨肉瘤培养物，
培养物C-用DNA载体VTvaf17-BMP-7转染的MG-63人骨肉瘤培养物。
图9
示出了在用DNA载体VTvaf17-OPG转染HGF-1人牙龈成纤维细胞(
CRL-2014TM)后，这些细胞培养物裂解物中OPG蛋白浓度图，以评估功能活性，即在蛋白水平的治疗性基因表达，和通过携带OPG治疗性基因的基于基因疗法载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白表达水平的可能性。
图9示出了以下元素：
培养物A-用无质粒DNA的树枝状聚合物水溶液转染的HGF-1人牙龈成纤维细胞系的细胞培养物(参照)，
培养物B-用DNA载体VTvaf17转染的HGF-1人牙龈成纤维细胞系的细胞培养物，
培养物C-用DNA载体VTvaf17-OPG转染的HGF-1人牙龈成纤维细胞系的细胞培养物。
图10
示出了在用基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA转染人软骨细胞(HC)(CellApplications,Inc Cat.402K-05a)后，这些细胞培养物裂解物中PDGFA蛋白浓度图，以评估功能活性，即在蛋白水平的治疗性基因表达，和通过携带PDGFA治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白表达水平的可能性。
图10示出了以下元素：
培养物A-用无质粒DNA的树枝状聚合物水溶液转染的人软骨细胞(HC)细胞培养物(参照)，
培养物B-用基因疗法DNA载体VTvaf17转染的人软骨细胞(HC)细胞培养物，
培养物C-用基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA转染的人软骨细胞(HC)细胞培养物。
图11
示出了在用基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB转染人软骨细胞(HC)(CellApplications,Inc Cat.402K-05a)后，这些细胞培养物裂解物中PDGFB蛋白浓度图，以评估功能活性，即在蛋白水平的治疗性基因表达，和通过携带PDGFB治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白表达水平的可能性。
图10示出了以下元素：
培养物A-用无质粒DNA的树枝状聚合物水溶液转染的人软骨细胞(HC)细胞培养物(参照)，
培养物B-用基因疗法DNA载体VTvaf17转染的人软骨细胞(HC)细胞培养物，
培养物C-用基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB转染的人软骨细胞(HC)细胞培养物。
图12
示出了在将基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA注射到3例患者的皮肤中后，这些患者的皮肤生检样本中PDGFA蛋白浓度图，以评估功能活性，即治疗性基因在蛋白水平上的表达，以及使用携带PDGFA治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白表达水平的可能性。
图12示出了以下元素：
P1I-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA的区域中的患者P1皮肤生检，
P1II-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的区域中的患者P1皮肤生检，
P1III-来自完整部位的患者P1皮肤生检，
P2I-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA的区域中的患者P2皮肤生检，
P2II-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的区域中的患者P2皮肤生检，
P2III-来自完整部位生检的患者P2皮肤，
P3I-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA的区域中的患者P3皮肤生检，
P3II-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)区域中的患者P3皮肤生检，
P3III-来自完整部位生检的患者P3皮肤。
图13
示出了在将基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG注射到3例患者的腓肠肌中后，这些患者的腓肠肌生检样本中OPG蛋白浓度图，以评估功能活性，即治疗性基因在蛋白水平上的表达，以及使用携带OPG治疗性基因的基于基因疗法载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白表达水平的可能性。
图13示出了以下元素：
P1I-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG的区域中的患者P1腓肠肌生检，
P1II-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的区域中的患者P1腓肠肌生检，
P1III-来自完整部位生检的患者P1腓肠肌，
P2I-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG的区域中的患者P2腓肠肌生检，
P2II-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的区域中的患者P2腓肠肌生检，
P2III-来自完整部位生检的患者P2腓肠肌，
P3I-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG的区域中的患者P3腓肠肌生检，
P3II-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)区域中的患者P3腓肠肌生检，
P3III-来自完整部位生检的患者P3腓肠肌。
图14
示出了在将基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7注射到3例患者的皮肤中后，这些患者的皮肤生检样本中BMP-7蛋白浓度图，以评估功能活性，即治疗性基因在蛋白水平上的表达，以及使用携带BMP-7治疗性基因的基于基因疗法载体VTvaf17的基因疗法DNA载体提高蛋白表达水平的可能性。
图14示出了以下元素：
P1I-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7的区域中的患者P1皮肤生检，
P1II-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的区域中的患者P1皮肤生检，
P1III-来自完整部位生检的患者P1皮肤，
P2I-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7的区域中的患者P2皮肤生检，
P2II-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的区域中的患者P2皮肤生检，
P2III-来自完整部位生检的患者P2皮肤，
P3I-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7的区域中的患者P3皮肤生检，
P3II-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)区域中的患者P3皮肤生检，
P3III-来自完整部位生检的患者P3皮肤。
图15
示出了皮下注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7转染的自体成纤维细胞培养物后，人皮肤生检样本中BMP-7蛋白浓度图，以说明通过注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7转染的自体细胞的使用方法。
图15示出了以下元素：
P1C-在注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7转染的患者的自体成纤维细胞培养物的区域中的患者P1皮肤生检，
P1B-在注射用基因疗法DNA载体VTvaf17转染的患者的自体成纤维细胞的区域中的患者P1皮肤生检，
P1A-来自完整部位生检的患者P1皮肤。
图16
示出了三只Wistar大鼠在注射基因疗法载体混合物后，牙龈软组织机械损伤区域中人BMP-2蛋白、人BMP-7蛋白、人OPG蛋白、人PDGFA蛋白和人PDGFB蛋白的浓度图：基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7、基因疗法DNA载体VTvaf17-IFNA2、基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG、基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA、基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB，以说明使用基因疗法DNA载体混合物的方法。
图16显示了以下元素：
K1I-在注射基因疗法DNA载体混合物：VTvaf17-BMP-2、VTvaf17-BMP-7、VTvaf17-OPG、VTvaf17-PDGFA和VTvaf17-PDGFB的区域中的K1大鼠损伤牙龈组织碎片，
K1II-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的区域中的K1大鼠损伤牙龈组织碎片，
K1III-来自参考完整部位的K1大鼠牙龈组织碎片，
K2I-在注射基因疗法DNA载体混合物：VTvaf17-BMP-2、VTvaf17-BMP-7、VTvaf17-OPG、VTvaf17-PDGFA和VTvaf17-PDGFB的区域中的K2大鼠损伤牙龈组织碎片，
K2II-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的区域中的K2大鼠损伤牙龈组织碎片，
K2III-来自参考完整部位的K2大鼠牙龈组织碎片，
K3I-在注射基因疗法DNA载体混合物：VTvaf17-BMP-2、VTvaf17-BMP-7、VTvaf17-OPG、VTvaf17-PDGFA和VTvaf17-PDGFB的区域中的K3大鼠损伤牙龈组织碎片，
K3II-在注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的区域中的K3大鼠损伤牙龈组织碎片，
K3III-来自参考完整部位的K3大鼠牙龈组织碎片。
图17
示出了用DNA载体VTvaf17-OPG转染BT牛鼻甲细胞(bovine turbinate cell)(
CRL-1390TM)前和48小时后OPG治疗性基因cDNA扩增子积累图，以说明通过将基因疗法DNA载体注射到动物中的使用方法。
反应过程中扩增子的积累曲线如图17所示，对应于：
1-基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG转染前牛鼻甲细胞中OPG基因的cDNA，
2-基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG转染后牛鼻甲细胞中OPG基因的cDNA，
3-基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG转染前牛鼻甲细胞ACT基因的cDNA，
4-基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG转染后牛鼻甲细胞ACT基因的cDNA。
以GenBank数据库中以编号AH001130.2列出的公牛/牛肌动蛋白基因(ACT)为参考基因。
具体实施方式
基于3165bp DNA载体VTvaf17，构建携带治疗性基因的基因疗法DNA载体，设计为提高人和动物组织中这些治疗性基因的表达水平。产生携带人治疗性基因的每种基因疗法DNA载体的方法将治疗性基因的蛋白质编码序列克隆到基因疗法DNA载体VTvaf17的多接头，所述治疗性基因选自以下基因的组：BMP-2基因(编码BMP-2蛋白)、BMP-7基因(编码BMP-7蛋白)、OPG基因(编码OPG蛋白)、PDGFA基因(编码PDGFA蛋白)和PDGFB基因(编码PDGFB蛋白)。众所周知，DNA载体渗入真核细胞的能力主要取决于载体的大小。尺寸最小的DNA载体具有更高的渗透能力。因此，优选载体中不存在不承担功能负载，但同时增加载体DNA大小的元件。在携带选自BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因的组的治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的生产过程中，考虑了DNA载体的这些特征，其中载体中没有大的非功能性序列和抗生素抗性基因，除了技术优势和安全使用外，允许携带治疗性基因(选自BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因的组)的所产生的的基因疗法DNA载体VTvaf17的尺寸显著减小。因此，所获得的基因疗法DNA载体渗入真核细胞的能力是由于其长度小所致。
如下产生以下每一种基因疗法DNA载体：DNA载体VTvaf17-BMP-2、或VTvaf17-BMP-7、或VTvaf17-OPG、或VTvaf17-PDGFA、或VTvaf17-PDGFB：将选自BMP-2或BMP-7或OPG或PDGFA或PDGFB基因的组的治疗性基因编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17，分别获得基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、SEQ ID No.1；或VTvaf17-BMP-7、SEQ ID No.2；或VTvaf17-OPG、SEQ ID No.3；或VTvaf17-PDGFA、SEQ ID No.4；或VTvaf17-PDGFB、SEQ ID No.5。从生物正常组织标本中提取总RNA，产生BMP-2基因(1219bp)、BMP-7基因(1322bp)、OPG基因(1207bp)、PDGFA基因(592bp)、PDGFB基因(729bp)的编码区。利用反转录反应合成了人BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因的第一链cDNA。用化学合成法为此目的产生的寡核苷酸进行扩增。通过考虑到用于进一步克隆的最佳程序的特异性限制性内切核酸酶切割扩增产物，并用位于VTvaf17载体多接头上的BamHI、EcoRI、HindIII、KpnI、SalI、NheI限制性位点克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17。限制位点的选择是这样进行的，即克隆的片段进入载体VTvaf17表达盒的阅读框，而蛋白编码序列不包含所选核酸内切酶的限制位点。本领域的技术人员认识到，基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或VTvaf17-BMP-7、或VTvaf17-OPG、或VTvaf17-PDGFA或VTvaf17-PDGFB生产的方法学实施可以在选择已知的分子基因克隆方法的框架内变化，并且这些方法包括在本发明的范围内。例如，不同的寡核苷酸序列可用于扩增BMP-2、或BMP-7、或OPG、或PDGFA、或PDGFB基因，不同的限制性内切酶，或实验室技术，如不依赖于连接的基因克隆。
基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或VTvaf17-BMP-7、或VTvaf17-OPG、或VTvaf17-PDGFA、或VTvaf17-PDGB分别具有SEQ ID No.1、或SEQ ID No.2、或SEQ ID No.3、或SEQ IDNo.4、或SEQ ID No.5的核苷酸序列。同时，遗传密码的简并性是本领域专家已知的，并且这意味着本发明的范围还包括核苷酸序列的变体，不同之处在于核苷酸的插入、缺失或替换，它们不导致由治疗性基因编码的多肽序列的变化，和/或不导致VTvaf17载体调控元件的功能性活性的丧失。同时，遗传多态性是本领域专家已知的，并且意味着本发明的范围还包括来自BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因的组的核苷酸序列的变体，所述变体也编码BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB蛋白的氨基酸序列的不同的变体，它们在生理条件下的其功能性活性上与列出的那些没有区别。
渗入真核细胞并表达功能性活性的能力，即表达所获得的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或VTvaf17-BMP-7、或VTvaf17-OPG、或VTvaf17-PDGFA或VTvaf17-PDGFB的治疗性基因的能力通过将所获得的载体注射入真核细胞，并随后分析特异性mRNA的表达和/或治疗性基因的蛋白质产物得到证实。引入了基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或VTvaf17-BMP-7、或VTvaf17-OPG、或VTvaf17-PDGFA、或VTvaf17-PDGFB的细胞中特异性mRNA的存在显示所获得的载体渗入真核细胞并表达治疗性基因的mRNA的能力。此外，该领域的专家知道mRNA基因的存在是强制性条件，但不是治疗性基因编码的蛋白质翻译的证据。因此，为证实基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或VTvaf17-BMP-7、或VTvaf17-OPG、或VTvaf17-PDGFA、或VTvaf17-PDGFB在引入了基因疗法DNA载体的真核细胞中在蛋白质水平上表达治疗性基因的特性，使用免疫学方法进行由治疗性基因编码的蛋白质浓度的分析。BMP-2、或BMP-7、或OPG、或PDGFA或PDGFB蛋白的存在证实真核细胞中治疗性基因表达的功效，以及使用基于携带治疗性基因(选自BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因的组)的基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，增加蛋白质浓度的可能性。为证实所产生的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2(即BMP-2基因)、携带治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7(即BMP-7基因)、携带治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG(即OPG基因)、携带治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA(即PDGFA基因)、携带治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB(即PDGFB基因)的功效，使用以下方法：
A)实时PCR，即在用基因疗法DNA载体转染不同的人和动物细胞系后，人和动物细胞裂解液中治疗性基因的mRNA累积的变化；
B)酶联免疫吸附测定，即在用基因疗法DNA载体转染不同的人细胞系后，人细胞裂解液中治疗性蛋白质的定量水平的变化。
C)酶联免疫吸附测定，即在将基因疗法DNA载体注射入这些组织后，人和动物组织生检标本的上清液中治疗性蛋白质的定量水平的变化；
D)酶联免疫吸附测定，即在用基因疗法DNA载体转染的该人的自体细胞注射这些组织后，在人组织生检的上清液中治疗性蛋白质的定量水平的变化。
为了证实使用构建的携带治疗性基因(即BMP-2基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、携带治疗性基因(即BMP-7基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7、携带治疗性基因(即OPG基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG、携带治疗性基因(即PDGFA基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA的可行性，进行了以下操作：
A)用基因疗法DNA载体转染不同的人和动物细胞系，
B)将基因疗法DNA载体注射到不同的人和动物组织中，
C)将基因疗法DNA载体混合物注射到动物组织中，
D)将转染了基因疗法DNA载体的自体细胞注射到人体组织中。
如由基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7、或基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB(分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5)的核苷酸序列中缺乏与病毒基因组同源的区域和抗生素抗性基因所证实，由于基因疗法DNA载体中缺少构成病毒基因组核苷酸序列的调控元件并且基因疗法DNA载体中缺少抗生素抗性基因，这些使用方法缺少针对人和动物的基因疗法的潜在风险。
该领域的专家已知，使用基因疗法DNA载体中的抗生素抗性基因，通过在含有选择性抗生素的营养培养基中增加细菌生物质来获得制备量的这些载体。在本发明的框架内，为了确保携带BMP-2、或BMP-7、或OPG、或PDGFA、或PDGFB治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17的安全使用，使用含有抗生素的选择性营养培养基是不可能的。提出了基于大肠杆菌菌株SCS110-AF获得用于生产这些基因疗法载体的菌株的方法，作为用于获得携带治疗性基因(选自BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因的组)的基因疗法DNA载体VTvaf17的技术解决方案，以便于在工业规模上扩大基因疗法载体的生产。大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB生产的方法涉及大肠杆菌菌株SCS110-AF的感受态细胞的生产，其中使用对于本领域的专家熟知的转化(电穿孔)方法，将基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或DNA载体VTvaf17-BMP-7、或DNA载体VTvaf17-OPG、或DNA载体VTvaf17-PDGFA、或DNA载体VTvaf17-PDGFB分别注射入这些细胞。将所获得的大肠杆菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2、或大肠杆菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、或大肠杆菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA、或SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB用于分别生产基因疗法DNA载体VTvaf17-NOS2、或VTvaf17-NOS3、或VTvaf17-VIP、或VTvaf17-KCNMA1、或VTvaf17-CGRP，允许使用无抗生素培养基。
为了确认大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB的生产，进行了转化、选择并且随后以提取质粒DNA结尾。
为了证实基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、携带治疗性基因(即BMP-7基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7、携带治疗性基因(即OPG基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG、携带治疗性基因(即PDGFA基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA、携带治疗性基因(即PDGFB基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB在工业规模上的可生产性、可构建性和至生产规模的扩大，在工业规模上对各自含有携带治疗性基因(即BMP-2或BMP-7或OPG或PDGFA或PDGFB基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB进行发酵。
将细菌团的生产扩大至工业规模用于分离携带治疗性基因(选自BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因的组)的基因疗法DNA载体VTvaf17的方法，所述方法涉及在提供合适的生物质累积动态的无抗生素营养培养基中孵育大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB的种子培养物。在对数生长期达到足够量的生物质后，将细菌培养物转移至工业发酵罐，并然后培养至稳定期，然后提取含有治疗性DNA产物(即基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7、或基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA或基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB)的级份，多级过滤，并且通过色谱方法进行纯化。该领域的专家已知，菌株的培养条件、营养培养基的组成(除了无抗生素)、所使用的设备、和DNA纯化方法可以随特定生产线在标准操作程序的框架内变化，但是使用大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2、大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB的扩大、工业生产、和DNA载体的纯化的已知方法落入本发明的范围。
通过本发明实施例的示例来说明本发明的所述公开内容。
本发明的本质将在下面的实施例中解释。
实施例1。
制备携带治疗性基因(即BMP-2基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2。
将BMP-2基因编码区(1219bp)通过NheI和HindIII限制性位点克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17上，构建了基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2。从生物人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen,俄罗斯)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒
高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得BMP-2基因的编码区(1219bp)：
BMP2_F ACAGCTAGCCTCCTAAAGGTCCACCATGGT，
BMP2_R TATAAGCTTCTAGCGACACCCACAACCCT。
通过整合6个源自不同来源的DNA片段构建基因疗法DNA载体VTvaf17：
(a)复制起点由具有点突变的可商购质粒pBR322区域的PCR扩增产生；
(b)EF1a启动子区由人基因组DNA的位点的PCR扩增产生；
(c)hGH-TA转录终止子由人基因组DNA位点的PCR扩增产生；
(d)转座子Tn10的RNA-OUT调控位点由寡核苷酸合成；
(e)卡那霉素抗性基因由可商购的质粒pET-28的位点的PCR扩增产生；
(f)多接头通过使两个合成寡核苷酸退火而产生。
根据制造商的说明，使用可商购的试剂盒
高保真DNA聚合酶(NewEngland Biolabs,USA)进行PCR扩增。片段具有重叠区域，允许它们与随后的PCR扩增合并。使用寡核苷酸Ori-F和EF1-R整合片段(a)和(b)，并且使用寡核苷酸hGH-F和Kan-R整合片段(c)、(d)、和(e)。之后，所产生的片段通过以位点BamHI和NcoI限制性，随后连接来整合。这形成仍然缺少多接头的质粒。为了添加它，通过BamHI和EcoRI位点切割质粒，然后与片段(f)连接。因此，构建携带侧翼有SpeI限制位点的卡那霉素抗性基因的4182bp载体。然后由SpeI限制位点切割该基因，并且将剩余片段与自身连接。这形成重组的3165bp基因疗法DNA载体VTvaf17，并允许无抗生素选择。
将BMP-2基因编码区的扩增产物和DNA载体VTvaf17用NheI和HindIII限制性内切酶(New England Biolabs,USA)切割。
这得到4360bp的DNA载体VTvaf17-BMP-2，其具有核苷酸序列SEQ ID No.1，并且总体结构如图1A所示。
实施例2。
制备携带治疗性基因(即BMP-7基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7。
将BMP-7基因编码区(1322bp)通过NheI和HindIII限制性位点克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17上，构建了基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7。从生物人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen,俄罗斯)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒
高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得BMP-7基因的编码区(1322bp)：
BMP7_F TCAGCTAGCGTAGAGCCGGCGCGATGCA，
BMP7_R TATAAGCTTCTAGTGGCAGCCACAGGC；扩增产物和DNA载体VTvaf17用限制性内切酶NheI和HindIII(New England Biolabs,USA)切割。
这得到4463bp的DNA载体VTvaf17-BMP-7，其具有核苷酸序列SEQ ID No.2，并且总体结构如图1B所示。
基因疗法DNA载体VTvaf17的构建如实施例1所述。
实施例3。
制备携带治疗性基因(即人OPG基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG。
将OPG基因编码区(1207bp)通过BamHI和EcoRI限制性位点克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17上，构建了基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG。从生物人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen,俄罗斯)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒
高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得OPG基因编码区(1207bp)：
OPG_F AGGATCCACCATGAACAACTTGCTGTGCTGC，
OPG_R ATAGAATTCATAAGCAGCTTATTTTTACTGATTG；扩增产物和DNA载体VTvaf17用限制性内切酶BamHI和EcoRI(New England Biolabs,USA)切割。
这得到4348bp的DNA载体VTvaf17-OPG，其具有核苷酸序列SEQ ID No.3，并且总体结构如图1C所示。
基因疗法DNA载体VTvaf17的构建如实施例1所述。
实施例4。
制备携带治疗性基因(即PDGFA基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA。
将PDGFA基因编码区(592bp)通过BamHII和EcoRI限制性位点克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17上，构建了基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA。从生物人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen,俄罗斯)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒
高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得PDGFA基因的编码区(592bp)：
PDGFA_F AGGATCCACCATGAGGACCTTGGCTTGCCT，
PDGFA_R TATGAATTCACCTCACATCCGTGTCCTCT；扩增产物和DNA载体VTvaf17用限制性内切酶BamHII和EcoRI(New England Biolabs,USA)切割。
这得到3733bp的DNA载体VTvaf17-PDGFA，其具有核苷酸序列SEQ ID No.4，并且总体结构如图1D所示。
基因疗法DNA载体VTvaf17的构建如实施例1所述。
实施例5。
制备携带治疗性基因(即PDGFB基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB。
将PDGFB基因编码区(729bp)通过SalI和KpnI限制性位点克隆至3165bp的DNA载体VTvaf17上，构建了基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB。从生物人体组织样本中分离总RNA，然后使用商业试剂盒Mint-2(Evrogen)进行反转录反应，并使用以下寡核苷酸和市售试剂盒
高保真DNA聚合酶(New England Biolabs,USA)进行PCR扩增，获得PDGFB基因编码区(729bp)：
PDGFB_F TATGTCGACCACCATGAATCGCTGCTGGGCGCT，
PDGFB_R TATGGTACCTAGGCTCCAAGGGTCTCCTTC；扩增产物和DNA载体VTvaf17用限制性内切酶SalI和KpnI(New England Biolabs,USA)切割。
这得到3888bp的DNA载体VTvaf17-PDGFB，其具有核苷酸序列SEQ ID No.5，并且总体结构如图1D所示。
基因疗法DNA载体VTvaf17的构建如实施例1所述。
实施例6。
证明携带治疗性基因(即BMP-2基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性。本实施例还证明了使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
用携带人BMP-2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2转染HOb人成骨细胞培养物(Cell Applications,Inc Cat.406-05a)后48小时，评估BMP-2治疗性基因mRNA积累的变化。在实时PCR中，通过cDNA扩增子的积累动态来确定mRNA的数量。
使用原代HOb人成骨细胞培养物，评估BMP-2治疗性基因mRNA积累的变化。使用人成骨细胞生长培养基：All-in-one ready-to-use(Cell Applications,Inc Cat.417-500)在标准条件(37℃，5％CO2)下培养HOb细胞培养物。培养过程中每48小时更换培养基。
为达到90％的汇合，在转染程序前24小时将细胞以每孔5x104个细胞的量接种到24孔板中。根据制造商的建议，使用Lipofectamine3000(ThermoFisher Scientific,USA)进行表达人BMP-2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2的转染。在试管1中，将1μL DNA载体VTvaf17-BMP-2溶液(浓度500ng/μL)和1μL试剂P3000加到25μL培养基Opti-MEM(Gibco,USA)。通过轻轻的摇晃混合制备物。在试管2中，将1μL Lipofectamine 3000溶液加到25μL培养基Opti-MEM(Gibco,USA)中。通过轻轻的摇晃混合制备物。将来自试管1的内容物加入到试管2的内容物中，在室温下温育混合物5分钟。将所得溶液以40μL的体积逐滴加入到细胞中。
用不含插入的治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染的HOb细胞(图中未示出不含插入治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染之前和之后BMP-2基因的cDNA)用作参照。按上述方法制备转染用参照载体VTvaf17。
根据制造商的建议，使用Trizol试剂(Invitrogen,USA)提取HOb细胞的总RNA。将1mlTrizol试剂加入有细胞的孔中，匀浆并在65℃加热5分钟。然后将样本以14000g离心10分钟，并在65℃再次加热10分钟。然后加入200μL氯仿，轻轻搅拌混合物，以14000g离心10分钟。然后分离水相，与1/10体积的3M醋酸钠、pH5.2和等体积的异丙醇混合。将样本在-20℃温育10分钟，然后在14000g离心10分钟。将沉淀的RNA在1ml 70％乙醇中漂洗、风干，并溶于10μL的无RNase的水中。通过实时PCR评估cDNA扩增子的积累动力学，测定转染后BMP-2mRNA的表达水平。为了生产和扩增人BMP-2基因特异性cDNA，使用以下BMP-2_SF和BMP-2_SR寡核苷酸
BMP-2_SF ATGCAAGCAGGTGGGAAAGT,
BMP-2_FR GGGAGCCACAATCCAGTCAT
扩增产物长度为353bp。
使用SYBR GreenQuantitect RT-PCR试剂盒(Qiagen,USA)进行反转录反应和PCR扩增，以进行实时PCR。反应在20μl的体积中进行，包含：25μl QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master Mix、2.5mM氯化镁、每个引物0.5μM和5μl RNA。对于反应，在下列条件下使用CFX96扩增仪(Bio-Rad,USA)：42℃逆转录30分钟，98℃变性15分钟的1个循环，接着40个循环，其包含94℃变性15s，60℃退火30s和72℃伸长30s。使用GenBank数据库中以编号NM004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因为参考基因。阳性对照包括在含有BMP-2和B2M基因cDNA序列的已知浓度质粒所代表的基质上的PCR扩增子。阴性对照包括去离子水。使用Bio-Rad CFX Manager 2.1软件(Bio-Rad,USA)实时定量BMP-2和B2M基因cDNA扩增子的积累动态。分析结果如图2所示。
图2显示，由于用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2转染HOb人成骨细胞，人BMP-2基因的特异性mRNA水平大幅提高，证实了该载体能够渗入真核细胞并在mRNA水平上表达BMP-2基因的能力。本研究结果也证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2来提高BMP-2基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例7。
证明携带治疗性基因(即BMP-7基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性。本实施例还证明了使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
用携带人BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7转染MG-63人骨肉瘤培养物(
CRL-1427TM)后48小时，评估BMP-7治疗性基因mRNA积累的变化。在实时PCR中，通过cDNA扩增子的积累动态来确定mRNA的量。
在添加了10％的牛血清(Paneko,Russia)的EMEM(
30-2003TM)中，在标准条件(37℃,5％CO2)下培养原代MG-63人骨肉瘤细胞(
CRL-1427TM)。为达到90％的汇合，在转染程序前24小时将细胞以每孔5x104个细胞的量接种到24孔板中。Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific,USA)用作转染试剂。用表达人BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7按照实施例6中描述的程序进行转染。使用GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因为参考基因。用不含治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染的MG-63人骨肉瘤细胞培养物(图中未示出不含插入治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染之前和之后BMP-7基因的cDNA)用作参考。除具有与实施例6不同的序列的寡核苷酸外，如实施例6所述进行RNA分离、反转录反应和实时PCR。为了扩增人BMP-7基因特异性cDNA，使用以下BMP-7_SF和BMP-7_SR寡核苷酸：
BMP-7_SF GCTGGCTGGTGTTTGACATC，
BMP-7_SR TGGTGGCGTTCATGTAGGAG
扩增产物长度为459bp。
阳性对照包括在含有BMP-7和B2M基因cDNA序列的已知浓度质粒所代表的基质上的PCR扩增子。阴性对照包括去离子水。使用Bio-Rad CFX Manager 2.1软件(Bio-Rad,USA)实时定量PCR产物(即BMP-7和B2M基因cDNA)。分析结果如图3所示。
图3显示，由于基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7转染MG-63人骨肉瘤细胞，人BMP-7基因的特异性mRNA水平大幅提高，证实了该载体能够渗入真核细胞并在mRNA水平上表达BMP-7基因的能力。本研究结果也证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7来提高BMP-7基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例8。
证明携带治疗性基因(即OPG基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性。本实施例还证明了使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
用携带人OPG基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG转染HGF-1人牙龈成纤维细胞(
CRL-2014TM)后48小时，评估OPG治疗性基因mRNA积累的变化。在实时PCR中，通过cDNA扩增子的积累动态来确定mRNA的量。
在添加了10％牛血清(
30-2020TM)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(
30-2002TM)中，在标准条件(37℃,5％CO2)下培养HGF-1人牙龈成纤维细胞系(
CRL-2014TM)。为达到90％的汇合，在转染程序前24小时将细胞以每孔5x104个细胞的量接种到24孔板中。Lipofectamine 3000(ThermoFisher Scientific,USA)用作转染试剂。用表达人OPG基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG按照实施例6中描述的方法进行转染。使用GenBank数据库中以编号NM004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因为参考基因。用不含治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染HGF-1人牙龈成纤维细胞系(图中未示出未插入治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染前后OPG基因的cDNA)用作参考。除具有与实施例6不同的序列的寡核苷酸外，如实施例6所述进行RNA分离、反转录反应和实时PCR。为了扩增人OPG基因特异性cDNA，使用以下OPG_SF和OPG_SR寡核苷酸：
OPG_SF CTACACAGACAGCTGGCACA，
OPG_SR CTCCAAATCCAGGAGGGCAG
扩增产物长度为182bp。
阳性对照包括含有OPG和B2M基因的cDNA序列的已知浓度质粒所代表的基质上的PCR扩增子。阴性对照包括去离子水。使用Bio-Rad CFX Manager 2.1软件(Bio-Rad,USA)实时定量OPG和B2M基因cDNA扩增子的积累动态。分析结果如图4所示。
图4显示，由于用基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG转染HGF-1人牙龈成纤维细胞，人OPG基因的特异性mRNA水平大幅提高，证实了该载体能够渗入真核细胞并在mRNA水平上表达OPG基因的能力。本研究结果也证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG来提高OPG基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例9。
证明携带治疗性基因(即PDGFA基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性。本实施例还证明了使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
用携带人PDGFA基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA转染人软骨细胞培养物(HC)(Cell Applications,Inc Cat.402K-05a)后48小时，评估PDGFA治疗性基因mRNA积累的变化。在实时PCR中，通过cDNA扩增子的积累动态来确定mRNA的数量。
在标准条件(37℃，5％CO2)下在人软骨细胞生长培养基：All-in-one ready-to-use(Cell Applications,Inc Cat.402K-05a)中培养人软骨细胞系(HC)。为达到90％的汇合，在转染程序前24小时将细胞以每孔5x104个细胞的量接种到24孔板中。Lipofectamine3000(ThermoFisher Scientific,USA)用作转染试剂。用表达人PDGFA基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA按照实施例6中描述的方法进行转染。以未携带治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染人软骨细胞系(HC)(图中未示出未插入治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染前后PDGFA基因的cDNA)用作参照。除具有与实施例6不同的序列的寡核苷酸外，如实施例6所述进行RNA分离、反转录反应和实时PCR。为了扩增人PDGFA基因特异性cDNA，使用以下PDGFA_SF和PDGFA_SR寡核苷酸：
PDGFA_SF CTGCCCATTCGGAGGAAGAG，
PDGFA_SR CTTGACACTGCTCGTGTTGC
扩增产物长度为180bp。
阳性对照包括含有PDGFA和B2M基因的cDNA序列的已知浓度质粒所代表的基质上的PCR扩增子。使用GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因为参考基因。阴性对照包括去离子水。使用Bio-Rad CFX Manager 2.1软件(Bio-Rad,USA)实时定量通过扩增得到的PCR产物(即PDGFA和B2M基因cDNAs)。分析结果如图5所示。
图5显示，由于基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA转染人软骨细胞系HC，人PDGFA基因的特异性mRNA水平大幅提高，证实了该载体能够渗入真核细胞并在mRNA水平上表达PDGFA基因。本研究结果也证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA来提高PDGFA基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例10。
证明携带治疗性基因(即PDGFB基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB渗入真核细胞的能力及其在治疗性基因mRNA表达水平上的功能活性。本实施例还证明了使用携带治疗性基因的基因疗法DNA载体的可行性。
用携带人PDGFB基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB转染人软骨细胞培养物(HC)(Cell Applications,Inc Cat.402K-05a)后48小时，评估PDGFB治疗性基因mRNA积累的变化。在实时PCR中，通过cDNA扩增子的积累动态来确定mRNA的数量。
在标准条件(37℃，5％CO2)下在人软骨细胞生长培养基：All-in-one ready-to-use(Cell Applications,Inc Cat.402K-05a)中培养人软骨细胞系(HC)。为达到90％的汇合，在转染程序前24小时将细胞以每孔5x104个细胞的量接种到24孔板中。Lipofectamine3000(ThermoFisher Scientific,USA)用作转染试剂。用表达人PDGFB基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB按照实施例6中描述的方法进行转染。未携带治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染人软骨细胞系(HC)(图中未示出未插入治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染前后PDGFB基因的cDNA)用作参照。除具有与实施例6不同的序列的寡核苷酸外，如实施例6所述进行RNA分离、反转录反应和实时PCR。为了扩增人PDGFB基因特异性cDNA，使用以下PDGFB_SF和PDGFB_SR寡核苷酸：
PDGFB_SF CGCTCTTCCTGTCTCTCTGC，
PDGFB_SR CGGGTCATGTTCAGGTCCAA
扩增产物长度为181bp。
阳性对照包括含有PDGFB和B2M基因的cDNA序列的已知浓度的质粒所代表的基质上的PCR扩增子。使用GenBank数据库中以编号NM 004048.2列出的B2M(β-2-微球蛋白)基因为参考基因。阴性对照包括去离子水。使用Bio-Rad CFX Manager 2.1软件(Bio-Rad,USA)实时定量通过扩增得到的PCR产物(即PDGFB和B2M基因cDNAs)。分析结果如图6所示。
图6显示，由于基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB转染人软骨细胞系HC，人PDGFB基因的特异性mRNA水平大幅提高，证实了该载体能够渗入真核细胞并在mRNA水平上表达PDGFB基因。本研究结果也证实了利用基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB来提高PDGFB基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例11。
证明了携带BMP-2基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2在哺乳动物细胞中提高BMP-2蛋白表达的效率和可行性。
用携带人BMP-2基因的DNA载体VTvaf17-BMP-2转染HOb人成骨细胞(CellApplications,Inc Cat.406-05a)后，评估这些细胞的裂解物中BMP-2蛋白浓度的变化。
HOb人成骨细胞培养物的生长如实施例6所述。
为达到90％的汇合，在转染程序前24小时将细胞以每孔5x104个细胞的量接种到24孔板中。使用第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)进行转染。使用不含DNA载体的树枝状聚合物水溶液(A)和不含BMP-2基因cDNA的DNA载体VTvaf17(B)为参照，并使用携带人BMP-2基因的DNA载体VTvaf17-BMP-2(C)为转染剂。DNA-树枝状聚合物复合物是根据制造商的程序(QIAGEN,SuperFect Transfection Reagent Handbook,2002)在做出一些修改的情况下制备的。对于在24孔板的1个孔中进行的细胞转染，将培养基加到溶解在TE缓冲液中的1μg DNA载体中至最终体积60μL，然后加入5μL SuperFect转染试剂，并通过移液五次轻轻混合。该复合物在室温下温育10-15分钟。然后从孔中取出培养基，用1ml PBS缓冲液冲洗孔。将350μL含10μg/ml庆大霉素的培养基加入到所得到的复合物中，轻轻混合，并加入细胞中。将细胞与复合物在37℃在5％CO2的存在下培养2-3小时。
然后仔细除去培养基，用1ml PBS缓冲液冲洗活细胞阵列。然后，加入含有10μg/ml庆大霉素的培养基，并在37℃在5％CO2的存在下培养24-48小时。
转染后，将0.1ml 1N HCl加入0.5ml培养液中，充分混合，并在室温下培养10分钟。然后，加入0.1ml 1.2M NaOH/0.5M HEPES(pH7-7.6)中和该混合物并充分搅拌。收集上清液并用于测定治疗蛋白。根据制造商的方法，使用人BMP-2DuoSet ELISA(R&D Systems CatDY355-05,USA)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测BMP-2蛋白，使用ChemWell AutomatedEIA和化学分析仪(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。
为了测量浓度的数值，使用已知BMP-2蛋白浓度的试剂盒参照样本构建的校准曲线。灵敏度为50pg/ml，测量范围为50pg/ml-4000pg/ml。用R-3.0.2进行结果的统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的图如图7所示。
图7显示，与参照样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2转染HOb人成骨细胞导致BMP-2蛋白浓度提高，这证实了载体渗入真核细胞并在蛋白水平表达BMP-2基因的能力。本研究结果也证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2来提高BMP-2基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例12。
证明了携带BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7在哺乳动物细胞中提高BMP-7蛋白表达的效率和可行性。
用携带人BMP-7基因的DNA载体VTvaf17-BMP-7转染MG-63人骨肉瘤细胞(
CRL-1427TM)后，评估这些细胞的裂解物中BMP-7蛋白浓度的变化。细胞的生长如实施例7所述。
使用第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)进行转染。使用不含DNA载体的树枝状聚合物水溶液(A)和不含BMP-7基因cDNA的DNA载体VTvaf17为参照(B)，并使用携带人BMP-7基因的DNA载体VTvaf17-BMP-7(C)为转染剂。按照实施例11中描述的方法进行DNA树枝状聚合物复合物的制备和MG-63细胞的转染。
转染后，将0.1ml 1N HCl加入0.5ml培养液中，充分混合，并在室温下培养10分钟。然后，加入0.1ml 1.2M NaOH/0.5M HEPES(pH7-7.6)中和该混合物并充分搅拌。收集上清液并用于测定治疗蛋白。根据制造商的方法，使用人BMP-7ELISA(Raybiotech,Inc Cat.ELH-BMP7-1,USA)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测BMP-7蛋白，使用ChemWell AutomatedEIA和化学分析仪(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。
为了测量浓度的数值，使用已知BMP-7蛋白浓度的试剂盒参照样本构建的校准曲线。灵敏度为10pg/ml，测量范围为10pg/ml-6000pg/ml。用R-3.0.2进行结果的统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的图如图8所示。
图8显示，与参照样本相比，用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7转染MG-63人骨肉瘤细胞培养物导致BMP-7蛋白浓度提高，证实了载体渗入真核细胞并在蛋白水平表达BMP-7基因的能力。本研究结果也证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7来提高BMP-7基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例13。
证明了携带OPG基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG在哺乳动物细胞中提高OPG蛋白表达的效率和可行性。
用携带人OPG基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG转染HGF-1人牙龈成纤维细胞系(
CRL-2014TM)后，评估这些细胞的裂解物中OPG蛋白浓度的变化。细胞的培养如实施例8所述。
使用第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)进行转染。使用不含DNA载体的树枝状聚合物水溶液(A)和不含OPG基因cDNA的DNA载体VTvaf17为参照(B)，并使用携带人OPG基因的DNA载体VTvaf17-OPG(C)为转染剂。按照实施例11中描述的方法进行DNA树枝状聚合物复合物的制备和HGF-1人牙龈成纤维细胞系的转染。
转染后，将0.1ml 1N HCl加入0.5ml培养液中，充分混合，并在室温下培养10分钟。然后，加入0.1ml 1.2M NaOH/0.5M HEPES(pH7-7.6)中和该混合物并充分搅拌。收集上清液并用于测定治疗蛋白。根据制造商的方法，使用人骨保护素(OPG)ELISA(RayBiotech,Cat.ELH-OPG-1,USA)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测OPG蛋白，使用ChemWellAutomated EIA和化学分析仪(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。
为了测量浓度的数值，使用已知OPG蛋白浓度的试剂盒参照样本构建的校准曲线。灵敏度至少为1pg/ml，测量范围为1pg/ml-900pg/ml。用R-3.0.2进行结果的统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的结果如图9所示。
图9显示，与参照样本相比，基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG转染HGF-1人牙龈成纤维细胞系导致OPG蛋白浓度提高，证实了该载体能够渗入真核细胞并在蛋白水平上表达OPG基因的能力。呈现的结果也证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG来提高OPG基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例14。
证明了携带PDGFA基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA在哺乳动物细胞中提高PDGFA蛋白表达的效率和可行性。
用携带人PDGFA基因的DNA载体VTvaf17-PDGFA转染人软骨细胞(HC)(CellApplications,Inc Cat.402K-05a)后，评估这些细胞的培养物裂解物中PDGFA蛋白浓度的变化。细胞的培养如实施例9所述。
使用第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)进行转染。使用不含DNA载体的树枝状聚合物水溶液(A)和不含PDGFA基因cDNA的DNA载体VTvaf17(B)为参照，并使用携带人PDGFA基因的DNA载体VTvaf17-PDGFA(C)为转染剂。按照实施例11中描述的方法进行DNA树枝状聚合物复合物的制备和HC细胞的转染。
转染后，将0.1ml 1N HCl加入0.5ml培养液中，充分混合，并在室温下培养10分钟。然后，加入0.1ml 1.2M NaOH/0.5M HEPES(pH7-7.6)中和该混合物并充分搅拌。收集上清液并用于测定治疗蛋白。
根据制造商的方法，使用人PDGF-AA ELISA试剂盒(Sandwich ELISA)(LifeSpanBioScience Cat.LS-F6082-1,USA)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测PDGFA蛋白，使用ChemWell Automated EIA和化学分析仪(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。
为了测量浓度的数值，使用已知PDGFA蛋白浓度的试剂盒参照样本构建的校准曲线。灵敏度为57pg/ml，测量范围为156pg/ml-10000pg/ml。用R-3.0.2进行结果的统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的图如图10所示。
图10显示，与参照样本相比，基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA转染人软骨细胞培养物(HC)导致PDGFA蛋白浓度提高，证实了该载体能够渗入真核细胞并在蛋白水平上表达PDGFA基因的能力。呈现的结果也证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA来提高PDGFA基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例15。
证明了携带PDGFB基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB在哺乳动物细胞中提高PDGFB蛋白表达的效率和可行性。
用携带人PDGFB基因的DNA载体VTvaf17-PDGFB转染人软骨细胞(HC)(CellApplications,Inc Cat.402K-05a)后，评估这些细胞的培养物裂解物中PDGFB蛋白浓度的变化。细胞的培养如实施例10所述。
使用第6代SuperFect转染试剂(Qiagen,Germany)进行转染。使用不含DNA载体的树枝状聚合物水溶液(A)和不含PDGFB基因cDNA的DNA载体VTvaf17为参照(B)，并使用携带人PDGFB基因的DNA载体VTvaf17-PDGFB(C)为转染剂。按照实施例11中描述的方法进行DNA树枝状聚合物复合物的制备和HC细胞的转染。
转染后，将0.1ml 1N HCl加入0.5ml培养液中，充分混合，并在室温下培养10分钟。然后，加入0.1ml 1.2M NaOH/0.5M HEPES(pH7-7.6)中和该混合物并充分搅拌。收集上清液并用于测定治疗蛋白。
根据制造商的方法，使用人PDGF-BB ELISA试剂盒(Sandwich ELISA)(LifeSpanBioScience Cat.LS-F12289,USA)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测PDGFB蛋白，使用ChemWell Automated EIA和化学分析仪(Awareness Technology Inc.,USA)进行光密度检测。
为了测量浓度的数值，使用已知PDGFB蛋白浓度的试剂盒参照样本构建的校准曲线。灵敏度至少为31.2pg/ml，测量范围为31.2pg/ml-2000pg/ml。用R-3.0.2进行结果的统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的图如图11所示。
图11显示，与参照样本相比，基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB转染人软骨细胞培养物(HC)导致PDGFB蛋白浓度提高，证实了该载体能够渗入真核细胞并在蛋白水平上表达PDGFB基因的能力。呈现的结果也证实了利用基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB来提高PDGFB基因在真核细胞中的表达水平的可行性。
实施例16。
证明了使用携带PDGFA基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA在人体组织中提高PDGFA蛋白表达的效率和可行性。
为了证明携带治疗性基因(即PDGFA基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA的效率及其使用的可行性，评估了在注射携带人PDGFA基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA后人皮肤中PDGFA蛋白浓度的变化。
为了分析PDGFA蛋白浓度的变化，将携带PDGFA基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA注射到三名患者的前臂皮肤中，同时注射安慰剂，该安慰剂是不含PDGFA基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17。
患者1，男性，33岁(P1)；患者2，女性，47岁(P2)；患者3，女性，43岁(P3)。使用聚乙烯亚胺转染试剂cGMP级in-vivo-jetPEI(Polyplus Transfection,France)作为转运系统。将含有PDGFA基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA和不含PDGFA基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17作为安慰剂溶于无菌无核酸酶的水。为了获得遗传构建体，根据制造商的建议制备了DNA-cGMP级in-vivo-jetPEI复合物。
使用以30G针至3mm深度的隧道法，以用于每种遗传构建体1mg的量注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带PDGFA基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA。对于每种遗传构建体，基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带PDGFA基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA的注射体积为0.3ml。每种遗传构建体的注射点位于前臂部位的8至10cm间隔处。
在注射基因疗法DNA载体的遗传构建体后第2天取生检标本。使用皮肤生检设备Epitheasy 3.5(Medax SRL,Italy)，生检样本取自注射携带PDGFA基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA(I)、基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)(II)的部位中的患者皮肤和取自完整皮肤(III)。生检部位的患者皮肤用无菌盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小为约10mm3，并且体重约11mg。将样本置于含有50mM Tris-HCl、pH7.6、100mM NaCl、1mM EDTA和1mM苯甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并匀浆以获得匀浆悬浮液。然后将悬浮液在14000g下离心10分钟。收集上清液，并用于通过用酶联免疫吸附测定(ELISA)测定治疗蛋白。如实施例14所述，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定PDGFA蛋白。
为了测量浓度的数值，使用已知PDGFA蛋白浓度的试剂盒参照样本构建的校准曲线。根据制造商的方法，使用ChemWell Automated EIA化学分析仪(Awareness TechnologyInc.,USA)进行光密度检测，用R-3.0.2进行结果的统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的图如图12所示。
图12显示了与不含人PDGFA基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)注射部位中的PDGFA蛋白浓度相比，携带人PDGFA治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA的注射部位中所有三名患者的皮肤中PDGFA蛋白浓度提高，这表明了基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA的效率，并证实了其使用的可行性，特别是在将基因疗法DNA载体注射到人体组织时。
实施例17。
证明了使用携带OPG基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG来提高OPG蛋白在人体组织中的表达的效率和可行性。
为证明携带OPG治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG的效率及其使用的可行性，评估了注射携带治疗性基因(即人OPG基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG后人肌肉组织中OPG蛋白浓度的变化。
为分析OPG蛋白浓度的变化，将与转运分子一起的携带OPG基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG注射到三名患者的皮肤中，同时注射安慰剂，其是与转运分子一起的不含OPG基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17。
患者1，女性，40岁(P1)；患者2，男性，43岁(P2)；患者3，男性，54岁(P3)。使用聚乙烯亚胺转染试剂cGMP级in-vivo-jetPEI(Polyplus Transfection,France)作为转运系统；样本制备是根据制造商的建议进行的。
使用以30G针至10mm左右的深度的隧道法，以用于每种遗传构建体的1mg的量注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带OPG基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG。对于每种遗传构建体，基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带OPG基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG的注射体积为0.3ml。每种遗传构建体的注射点位于前臂部位的8至10cm间隔处。
在注射基因疗法DNA载体的遗传构建体后第2天取生检标本。使用皮肤生检设备MAGNUM(BARD,USA)，生检标本取自注射携带OPG基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG(I)、基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)(II)的部位中的患者肌肉组织和取自腓肠肌的完整部位(III)。生检部位中的患者皮肤用无菌盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。所述生检样本大小为约20mm3，并且体重可达22mg。将样本置于含有50mM Tris-HCl、pH7.6、100mMNaCl、1mM EDTA和1mM苯甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并匀浆以获得匀浆悬浮液。然后将悬浮液在14000g下离心10分钟。收集上清液，并用于测定治疗蛋白。
如实施例13所述，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定OPG蛋白。
为了测量浓度的数值，使用已知OPG蛋白浓度的试剂盒参照样本构建的校准曲线。用R-3.0.2进行结果的统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的图如图13所示。
图13显示了与不含人OPG基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)的注射部位中的OPG蛋白浓度相比，携带治疗性基因(即OPG基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG的注射部位中所有三名患者的腓肠肌中OPG蛋白浓度增加，这表明了基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG的效率，并证实了其使用的可行性，特别是在将基因疗法DNA载体注射到人体组织肌肉时。
实施例18。
证明了使用携带BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7来提高BMP-7蛋白在人体细胞中的表达的效率和可行性。
为了证明携带治疗性基因(即BMP-7基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7的效率及其使用的可行性，评估了注射携带人BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7后人皮肤中BMP-7蛋白浓度的变化。
为了分析BMP-7蛋白浓度的变化，将携带BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7注射到三名患者的前臂皮肤，同时注射安慰剂，该安慰剂为不含BMP-7基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17。
患者1，男性，62岁(P1)；患者2，男性，55岁(P2)；患者3，女性，58岁(P3)。使用聚乙烯亚胺转染试剂cGMP级in-vivo-jetPEI(Polyplus Transfection,France)作为转运系统。将含有BMP-7基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7和不含BMP-7基因cDNA的基因疗法DNA载体VTvaf17作为安慰剂溶于无菌无核酸酶的水。为了获得遗传构建体，根据制造商的建议制备了DNA-cGMP级in-vivo-jetPEI复合物。
使用以30G针至3mm的深度的隧道法，以用于每个遗传构建体的1mg的量注射基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7。对于每种遗传构建体，基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)和携带BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7的注射体积为0.3ml。每种遗传构建体的注射点位于前臂部位的8至10cm间隔处。
在注射基因疗法DNA载体的遗传构建体后第2天取生检标本。使用皮肤生检设备Epitheasy 3.5(Medax SRL,Italy)，生检样本取自注射携带BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7(I)、基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)(II)的部位中的患者皮肤和取自完整皮肤(III)。生检部位中的患者皮肤用无菌盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小为约10mm3，并且体重约11mg。将样本置于含有50mM Tris-HCl、pH7.6、100mMNaCl、1mM EDTA和1mM苯甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并匀浆以获得匀浆悬浮液。然后将悬浮液在14000g下离心10分钟。收集上清液，并通过用酶联免疫吸附测定(ELISA)测定治疗蛋白，如实施例12所述。
为了测量浓度的数值，使用已知BMP-7蛋白浓度的试剂盒参照样本构建的校准曲线。用R-3.0.2进行结果的统计处理和数据可视化(https://www.r-project.org/)。源自测定的图如图14所示。
图14显示了与不含人BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)注射部位中的BMP-7蛋白浓度相比，携带人BMP-7治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7的注射部位中所有三名患者皮肤中BMP-7蛋白浓度增加，这表明了基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7的效率，并证实了其使用的可行性，特别是在将基因疗法DNA载体皮内注射到人体组织中时。
实施例19。
证明了携带BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7的效率及其使用以通过注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7转染的自体成纤维细胞来提高BMP-7蛋白在人组织中的表达水平的可行性。
为确认携带BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7的效率其使用的可行性，评估了注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7转染的同一患者的自体成纤维细胞培养物后患者皮肤中BMP-7蛋白浓度的变化。
将转染了携带BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7的合适的自体成纤维细胞培养物注射到患者的前臂皮肤中，同时注射用未携带BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17转染的自体成纤维细胞培养物形式的安慰剂。
从患者皮肤生检标本中分离人原代成纤维细胞培养物。使用皮肤生检设备Epitheasy 3.5(Medax SRL,Italy)从由紫外线保护的区域，即耳后或肘部内侧取皮肤的生检标本。生检标本为约10mm和约11mg。患者的皮肤用无菌盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。在37℃在5％CO2存在下，在含10％胎牛血清和100U/ml氨苄青霉素的DMEM培养基中培养原代细胞培养物。每2天进行培养基传代和更换。培养物生长的总持续时间不超过25-30天。然后从细胞培养液中取出5x104个细胞的等分试样。用携带BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7或安慰剂(即不携带BMP-7治疗性基因的VTvaf17载体)转染患者的成纤维细胞培养物。
根据制造商的说明，使用阳离子聚合物如聚乙烯亚胺JETPEI(Polyplustransfection,France)进行转染。将细胞培养72小时，然后注射到患者体内。使用隧道法，以13mm长的30G针至约3mm深度，在前臂中注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7转染的患者的自体成纤维细胞培养物和用基因疗法DNA载体VTvaf17转染的患者的自体成纤维细胞培养物作为安慰剂。经修饰的自体成纤维细胞在注射悬浮液中的浓度约为每1ml悬浮液中约5mln细胞，注射细胞的剂量不超过15mln。自体成纤维细胞培养物的注射点以8至10cm的间隔定位。
在注射用携带治疗性基因(即BMP-7基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7和安慰剂转染的自体成纤维细胞培养物后，在第4天取生检样本。使用皮肤生检装置Epitheasy3.5(Medax SRL,Italy)，从注射用携带治疗性基因(即BMP-7基因)的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7转染的自体成纤维细胞培养物(C)、用不携带BMP-7治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17的非转染的自体成纤维细胞培养物(安慰剂)(B)的部位的患者皮肤中，以及从完整皮肤部位(A)取生检。将生检位点中患者皮肤用无菌生理盐水初步冲洗，并用利多卡因溶液麻醉。生检样本大小为大约10mm3，并且重量为大约11mg。将样本放置于含有50mMTris-HCl(pH 7.6)、100mM NaCl、1mM EDTA、和1mM苯甲基磺酰化氟的缓冲溶液中，并且匀化以获得匀化的悬浮液。然后将悬浮液以14,000g离心10分钟。收集上清液，并用于测定如实施例12所述的治疗性蛋白质。
源自测定的图显示在图15中。
图15显示与用不携带BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17(安慰剂)转染的自体成纤维细胞培养物的注射部位的BMP-7蛋白浓度相比，用携带BMP-7基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7转染的自体成纤维细胞培养物的注射部位中患者皮肤的区域中NOS2蛋白的浓度增加，表明基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7的功效及其使用以便于提高人器官中BMP-7的表达水平(特别是在向皮肤中注射用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7转染的自体成纤维细胞后)的可行性。
实施例20。
证明了携带BMP-2治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、携带BMP-7治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7、携带OPG治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG、携带PDGFA治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA、携带PDGFB治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB联合应用以用于提高哺乳动物组织中BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB蛋白表达水平的可行性。
在将基因疗法载体混合物注射到大鼠大腿后，对该位点的BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB蛋白浓度的变化进行评估。该研究在3只实验动物-8个月大，重240-290g龄雄性Wistar大鼠上进行。在麻醉(Zoletil剂量为40mg/kg体重，IP)下，将12mm长的固体金属针紧密沿牙齿从下切牙在内侧边的前庭面插入边缘牙龈，几乎无需努力撕裂组织。
使用聚乙烯亚胺转染试剂cGMP级in-vivo-jetPEI(Polyplus Transfection,France)作为转运系统。将等摩尔的基因疗法DNA载体混合物溶于无菌无核酸酶的水中。为了获得遗传构建体，根据制造商的建议制备了DNA-cGMP级in-vivo-jetPEI复合物。注射体积为0.1ml，DNA总量为100μg。用胰岛素注射器将溶液注射到牙龈软组织中。大鼠在程序后2天实施断头。
在注射基因疗法DNA载体后第2天取样。生检材料取自携带BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因的五种基因疗法DNA载体的混合物的注射部位中的右侧牙龈部分(位点I)，取自基因治疗DNA VTvaf17(安慰剂)注射部位中的左侧牙龈部分(位点II)，以及取自未进行任何操作的上牙龈部位(位点III)。将每个样本置于含有50mM Tris-HCl、pH7.6、100mMNaCl、1mM EDTA和1mM苯甲基磺酰氟的缓冲溶液中，并匀浆以获得匀浆悬浮液。然后将悬浮液在14000g下离心10分钟。收集上清液，并用于测定治疗蛋白，如实施例11(BMP-2蛋白的定量)、实施例12(BMP-7蛋白的定量)、实施例13(OPG蛋白的定量)、实施例14(PDGFA蛋白的定量)和实施例15(PDGFB蛋白的定量)中所述的。源自测定的图如图16所示。
图16显示与位点II(安慰剂位点)和位点III(完整部位)相比，注射携带BMP-2治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、携带BMP-7治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7、携带OPG治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG、携带PDGFA治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA、携带PDGFB治疗性基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB的混合物的损伤牙龈组织(位点I)中的BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB蛋白浓度增加。所获得的结果显示，联合使用基因疗法DNA载体的效率和上调治疗蛋白在哺乳动物组织中表达水平的使用可行性。
实施例21。
证明了携带OPG基因的DNA载体VTvaf17-OPG基因治疗的效率及其使用以提高哺乳动物细胞中OPG蛋白表达水平的可行性。
为证明携带人OPG基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG的效率，评估了携带人OPG基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG转染BT牛鼻甲细胞(
CRL-1390TM)后48小时该BT牛鼻甲细胞中OPG治疗性基因mRNA积累的变化。
在标准条件下在添加了10％马血清(
30-2040TM)的DMEM培养基(
30-2002TM)中培养BT牛鼻甲细胞(
CRL-1390TM)。如实施例8所述实施用携带人OPG基因的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG和未携带人OPG基因的DNA载体VTvaf17(参考)的转染、RNA提取、反转录反应、PCR扩增和数据分析。使用GenBank数据库中以编号AH001130.2号列出的公牛/牛肌动蛋白基因(ACT)为参考基因。阳性对照包括含有OPG和ACT基因序列的已知浓度的质粒所代表的基质上的PCR扩增子。阴性对照包括去离子水。使用Bio-Rad CFXManager 2.1软件(Bio-Rad,USA)实时定量PCR产物(即OPG和ACT基因cDNAs)。
源自测定的图如图17所示。
图17显示，由于用基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG转染BT牛鼻甲细胞，人OPG基因的特异性mRNA水平大幅提高，证实了该载体能够渗入真核细胞并在mRNA水平上表达OPG基因的能力。呈现的结果证实了使用基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG来提高OPG基因在哺乳动物细胞中的表达水平的可行性。
实施例22。
携带基因疗法DNA载体的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA，其生产方法。
构建用于在工业规模上生产携带选自以下基因的组：BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB的治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体的菌株，即分别携带基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或VTvaf17-BMP-7、或VTvaf17-OPG、或VTvaf17-PDGFA、或VTvaf17-PDGFB的大肠杆菌SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA、或SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB，供其生产，允许无抗生素选择，所述构建方法涉及制备大肠杆菌菌株SCS110-AF的电感受态细胞，并且用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或DNA载体VTvaf17-BMP-7、或DNA载体VTvaf17-OPG、或DNA载体VTvaf17-PDGFA、或DNA载体VTvaf17-PDGFB对这些细胞进行电穿孔。之后，将所述细胞倒入具有选择性培养基的琼脂板(培养皿)，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖、和10μg/ml氯霉素。其中，产生大肠杆菌菌株SCS110-AF以生产基因疗法DNA载体VTvaf17或基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，允许无抗生素阳性选择，这涉及构建含有允许无抗生素阳性选择的转座子Tn10调控元件RNA-IN的64bp线性DNA片段；1422bp果聚糖蔗糖酶基因sacB(其产物确保在含有蔗糖的培养基内进行选择)、选择发生同源重组的菌株克隆需要的763bp氯霉素抗性基因catR和两个同源序列329bp和233bp(确保与基因失活同时的基因recA的区域中的同源重组)，然后通过电穿孔转化大肠杆菌细胞，并且选择在含有10μg/ml氯霉素的培养基中存活的克隆。
获得的用于生产的菌株登记于国家生物资源中心(NationalBiologicalResource Centre)-俄罗斯国家工业微生物保藏中心(RussianNational Collection ofIndustrial Microorganisms)(NBRC RNCIM)、RF和NCIMB专利保藏服务中心(PatentDeposit Service)，UK的收集中，登录号如下：
大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2-在俄罗斯国家工业微生物保藏中心登记，编号B-13167，保藏日期2018年5月11日；国际保藏机构(INTERNATIONAL DEPOSITARYAUTHORITY)号NCIMB43034，保藏日期2018年4月20日，
大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7-在俄罗斯国家工业微生物保藏中心登记，编号B-13166，保藏日期2018年5月11日；国际保藏机构国际保藏机构号NCIMB 43036，保藏日期2018年4月20日，
大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG-在俄罗斯国家工业微生物保藏中心登记，编号B-13272，保藏日期2018年10月16日；国际保藏机构国际保藏机构国际保藏机构号NCIMB 43036，保藏日期2018年12月31日，
大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA-在俄罗斯国家工业微生物保藏中心登记，编号B-13344，保藏日期2018年11月22日；国际保藏机构国际保藏机构国际保藏机构号NCIMB 43252，保藏日期2018年11月8日，
大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB-在俄罗斯国家工业微生物保藏中心，编号B-13271，保藏日期2018年10月16日；国际保藏机构国际保藏机构国际保藏机构号NCIMB43302，保藏日期2018年12月13日。
实施例23。
用于扩大携带治疗性基因(选自BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB的组)的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体到工业规模的方法。
为证实基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2(SEQ ID No.1)、或VTvaf17-BMP-7(SEQID No.2)、或VTvaf17-OPG(SEQ ID No.3)、或VTvaf17-PDGFA(SEQ ID No.4)、或VTvaf17-PDGFB(SEQ ID No.5)在工业规模上的可生产性和可构建性，对各自包含携带治疗性基因(即BMP-2或BMP-7或OPG或PDGFA或PDGFB)的基因疗法DNA载体VTvaf17的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB进行大规模的发酵。如实施例22所述的，每种大肠杆菌SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB基于大肠杆菌菌株SCS110-AF(Cell andGene Therapy LLC,UnitedKingdom)通过如下方法产生：用携带治疗性基因(即BMP-2、或BMP-7、或OPG、或PDGFA、或PDGFB)的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或VTvaf17-BMP-7、或VTvaf17-OPG、或VTvaf17-PDGFA、或VTvaf17-PDGFB对该菌株的感受态细胞进行电穿孔，其中将转化的细胞在具有选择性培养基的琼脂板(培养皿)中进一步接种，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、和6％蔗糖，并且进行个别克隆的选择。
在10l发酵罐中进行携带基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2的大肠杆菌SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2的发酵，随后提取基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2。
对于大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2的发酵，制备含有(每10l的体积)：100g胰蛋白胨和50g酵母浸膏(Becton Dickinson,USA)的培养基；然后将培养基用水稀释至8800ml，并且在121℃下高压蒸汽处理20分钟，并然后添加1200ml 50％(w/v)蔗糖。之后，以100ml的体积，将大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2的种子培养物接种于培养物烧瓶中。将培养物在30℃下在摇床恒温箱中孵育16小时。将种子培养物转移至Techfors S生物反应器(Infors HT,Switzerland)中，并培养至稳定期。通过在600nm下测量培养物的光密度来控制该过程。将细胞在5,000-10,000g下沉淀30分钟。去除上清液，并将细胞沉淀重悬浮于10％(按体积计)的磷酸盐缓冲盐水中。将细胞以5,000-10,000g再次离心30分钟。去除上清液，将20mM TrisCl、1mM EDTA、200g/l蔗糖(pH 8.0)的溶液以1000ml的体积添加至细胞沉淀中，并且将混合物充分搅拌至匀化的悬浮液。然后添加卵溶菌酶溶液，至终浓度为100μg/ml。将混合物在冰上孵育20分钟，同时轻轻搅拌。然后添加2500ml0.2M NaOH，10g/l十二烷基磺酸钠(SDS)，将混合物在冰上孵育10分钟，同时轻轻搅拌，然后添加3500ml 3M乙酸钠、2M乙酸(pH 5-5.5)，并将混合物在冰上孵育10分钟，同时轻轻搅拌。将所得样品以15,000g或更高值离心20-30分钟。将溶液小心倾析，通过粗滤器(滤纸)除去残余的沉淀物。然后，添加RNase A(Sigma,USA)至终浓度为20μg/ml，并且将溶液在室温下孵育过夜持续16小时。然后将溶液以15,000g离心20-30分钟，并通过0.45μm膜过滤器(Millipore,USA)。然后，用100kDa膜(Millipore,USA)进行超滤，并用25mM TrisCl(pH 7.0)的缓冲溶液将混合物稀释至初始体积。这种操作进行了三至四次。将溶液施加到用25mM TrisCl(pH 7.0)平衡的含有250ml DEAE SepharoseHP(GE,USA)的柱上。上样后，将柱用三倍体积的相同溶液洗涤，并然后使用25mM Tris-HCl(pH 7.0)的线性梯度洗脱基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2，以获得25mM Tris-HCl(pH 7.0)，1M NaCl的溶液，柱体积的五倍。通过测量在260nm处的流出溶液的光密度来控制洗脱过程。将含有基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2的色谱级分结合在一起，并使用Superdex 200(GE,USA)进行凝胶过滤。将柱用磷酸盐缓冲盐水平衡。通过测量在260nm处的流出溶液的光密度来控制洗脱过程，并通过琼脂糖凝胶电泳分析级分。将含有基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2的级分结合在一起，并储存在-20℃下。为评价过程的再生产性，将指定的处理操作重复五次。以类似的方式进行大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB的所有处理操作。
终产物产量的处理再生产性和定量特性证实了基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或VTvaf17-BMP-7、或VTvaf17-OPG、或VTvaf17-PDGFA、或VTvaf17-PDGFB在工业规模上的生产性和构建性。
因此，所产生的含有治疗性基因的基因疗法DNA载体可用于将其递送至由该基因编码的蛋白质表达减少或不足的人和动物细胞中，从而确保所希望的治疗性效果。
本发明设定的目的，即构建基因疗法DNA载体，以提高BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因的表达水平，结合以下特性：
I)由于具有最小长度的获得的基因疗法载体所致的上调真核细胞中治疗性基因表达的有效性；
II)由于基因疗法DNA载体中不存在代表病毒基因组核苷酸序列的调控元件和抗生素抗性基因，因此在人类和动物的基因疗法中安全使用的可能性；
III)在工业规模上菌株的可生产性和可构建性；
IV)以及已经实现用于产生这些基因疗法DNA载体的携带这些基因疗法DNA载体的菌株的构建目的，其通过以下实施例支持：
项I-实施例1、2、3、4、5；6；7；8；9；10；11；12；13；14；15；16；17；18、19、20、21；
项II-实施例1、2、3、4、5；
项III和项IV-实施例22、23。
工业适用性
以上列出的所有实施例证实了所提议的携带治疗性基因(选自BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB基因的组)以便于提高这些治疗性基因的表达水平的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，携带基因疗法DNA载体的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB，以及其在工业规模上的生产方法的工业实用性。
缩略词词表：
VTvaf17：无病毒基因组序列和抗生素抗性标记的基因疗法载体(无病毒-抗生素的治疗载体)
DNA：脱氧核糖核酸
cDNA：互补脱氧核糖核酸
RNA：核糖核酸
mRNA：信使核糖核酸
bp：碱基对
PCR：聚合酶链反应
ml：毫升，μl：微升
mm3：立方毫米
l：升
μg：微克
mg：毫克
g：克
μM：微摩尔
mM：毫摩尔
min：分钟
s：秒
rpm：每分钟转数
nm：纳米
cm：厘米
mW：毫瓦特
RFU：相对荧光单位
PBS：磷酸缓冲盐水
Claims (16)
1.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的BMP-2治疗性基因的编码区，形成具有核苷酸序列SEQ ID No.1的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2。
2.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的BMP-7治疗性基因的编码区，形成具有核苷酸序列SEQ ID No.2的基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7。
3.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的OPG治疗性基因的编码区，形成具有核苷酸序列SEQID No.3的基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG。
4.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的PDGFA治疗性基因的编码区，形成具有核苷酸序列SEQ ID No.4的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA。
5.基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生，其中所述基因疗法DNA载体具有克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17的PDGFB治疗性基因的编码区，形成具有核苷酸序列SEQ ID No.5的基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，其携带BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA或PDGFB治疗性基因，所述基因疗法DNA载体由于如下的实情是独特的，即每种构建的基因疗法DNA载体：根据权利要求1、2、3、4或5所述的VTvaf17-BMP-2、或VTvaf17-BMP-7、或VTvaf17-OPG、或VTvaf17-PDGFA、或VTvaf17-PDGFB由于VTvaf17载体部分不超过3200bp的有限大小而具有有效渗入人和动物细胞并表达克隆至其中的BMP-2、或BMP-7、或OPG、或PDGFA或PDGFB治疗性基因的能力。
7.根据权利要求1、2、3、4或5所述的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体，其携带BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA或PDGFB治疗性基因，所述基因疗法DNA载体由于如下的实情是独特的，即每种构建的基因疗法DNA载体：根据权利要求1、2、3、4或5所述的VTvaf17-BMP-2、或VTvaf17-BMP-7、或VTvaf17-OPG、或VTvaf17-PDGFA、或VTvaf17-PDGFB使用核苷酸序列作为结构元件，所述核苷酸序列不是抗生素抗性基因、病毒基因或病毒基因组调控元件，从而确保其安全用于人和动物的基因疗法。
8.根据权利要求1、2、3、4或5所述的携带BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA或PDGFB治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体生产的方法，所述方法涉及如下获得基因疗法DNA载体中的每一种：VTvaf17-BMP-2、或VTvaf17-BMP-7、或VTvaf17-OPG、或VTvaf17-PDGFA、或VTvaf17-PDGFB：将BMP-2、或BMP-7、或OPG、或PDGFA、或PDGFB治疗性基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，分别获得基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2，SEQ ID No.1、或VTvaf17-BMP-7，SEQ ID No.2、或VTvaf17-OPG，SEQ ID No.3、或VTvaf17-PDGFA，SEQ ID No.4、或VTvaf17-PDGFB，SEQ ID No.5，其中所述BMP-2、或BMP-7、或OPG、或PDGFA、或PDGFB治疗性基因的编码区通过如下获得：通过从人生物组织样本中分离总RNA，然后使用获得的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增，并用相应的限制性内切酶切割扩增产物，其中通过NheI和HindIII、或SalI和KpnI、或BamHI和EcoRI限制性位点进行对所述基因疗法DNA载体VTvaf 17的克隆，其中在无抗生素的情况下进行选择，
其中，在基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2，SEQ ID No.1产生过程中使用以下为此目的产生的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增：
BMP2_F ACAGCTAGCCTCCTAAAGGTCCACCATGGT，
BMP2_R TATAAGCTTCTAGCGACACCCACAACCCT，
并用NheI和HindIII限制性内切酶进行扩增产物的切割和将BMP-2基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，
其中，在基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7，SEQ ID No.2产生过程中使用以下为此目的产生的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增：
BMP7_F TCAGCTAGCGTAGAGCCGGCGCGATGCA，
BMP7_R TATAAGCTTCTAGTGGCAGCCACAGGC，
并用NheI和HindIII限制性内切酶进行扩增产物的切割和将BMP-7基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，
其中，在基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG，SEQ ID No.3产生过程中使用以下为此目的产生的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增：
OPG_F AGGATCCACCATGAACAACTTGCTGTGCTGC，
OPG_R ATAGAATTCATAAGCAGCTTATTTTTACTGATTG，
并用BamHI和EcoRI限制性内切酶进行扩增产物的切割和将OPG基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，
其中，在基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA，SEQ ID No.4产生过程中使用以下为此目的产生的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增：
PDGFA_F AGGATCCACCATGAGGACCTTGGCTTGCCT，
PDGFA_R TATGAATTCACCTCACATCCGTGTCCTCT，
并用BamHII和EcoRI限制性内切酶进行扩增产物的切割和将PDGFA基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中，
其中，在基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB，SEQ ID No.5产生过程中使用以下为此目的产生的寡核苷酸进行反转录反应和PCR扩增：
PDGFB_F TATGTCGACCACCATGAATCGCTGCTGGGCGCT，
PDGFB_R TATGGTACCTAGGCTCCAAGGGTCTCCTTC，
并用SalI和KpnI限制性内切酶进行扩增产物的切割和将PDGFB基因的编码区克隆至基因疗法DNA载体VTvaf17中。
9.使用根据权利要求1、2、3、4或5所述的携带BMP-2、BMP-7、OPG、PDGFA和PDGFB治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生的方法，所述方法涉及用从基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的构建的基因疗法DNA载体的组选择的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体或选择的几个基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体转染患者或动物器官和组织的细胞；和/或将通过从基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的构建的基因疗法DNA载体选择的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体或选择的几个基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体转染的所述患者或动物的自体细胞注射入相同患者或动物的器官和组织；和/或将从基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的构建的基因疗法DNA载体的组选择的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体或选择的几个基于基因疗法DNA载体VTvaf17的携带治疗性基因的基因疗法DNA载体注射入相同患者或动物的器官和组织，或所指示的方法的组合。
10.用于构建根据权利要求1、2、3、4或5所述的基因疗法DNA载体的菌株的生产方法，所述基因疗法DNA载体用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生，所述方法涉及制备大肠杆菌菌株SCS110-AF的电感受态细胞，并用基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7、或基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB对这些细胞进行电穿孔，然后将所述细胞倒入具有选择性培养基的琼脂平板(培养皿)，所述选择性培养基含有酵母浸膏、蛋白胨、6％蔗糖和10μg/ml氯霉素，因此得到大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB。
11.根据权利要求10获得的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2以供其生产，在所述基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法DNA载体用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生。
12.根据权利要求10获得的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7以供其生产，在所述基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法DNA载体用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生。
13.根据权利要求10获得的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG以供其生产，在所述基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法DNA载体用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生。
14.根据权利要求10获得的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA以供其生产，在所述基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法DNA载体用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生。
15.根据权利要求10获得的大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB，其携带基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB以供其生产，在所述基因疗法DNA载体的生产过程中允许无抗生素选择，所述基因疗法DNA载体用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生。
16.根据权利要求1、2、3、4或5所述的携带BMP-2、或BMP-7、或OPG、或PDGFA、或PDGFB治疗性基因的基于基因疗法DNA载体VTvaf17的基因疗法DNA载体在工业规模上生产的方法，所述基因疗法DNA载体用于治疗与骨组织和软骨再生障碍相关的疾病，包括在手术或放疗后，用于优化或激活同种异体或异种骨移植物的骨诱导性，正牙学中的钛植入物，用于改善牙科学中骨缺损的再生，所述方法涉及如下生产基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-2、或基因疗法DNA载体VTvaf17-BMP-7、或基因疗法DNA载体VTvaf17-OPG、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFA、或基因疗法DNA载体VTvaf17-PDGFB：通过用选自大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-2、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-BMP-7、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-OPG、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFA、或大肠杆菌菌株SCS110-AF/VTvaf17-PDGFB的种子培养物对含有制备的培养基的培养烧瓶接种，然后将细胞培养物在培养箱摇床中孵育并转移到工业发酵罐中，然后培养到稳定期，然后提取含有靶DNA产物的级份，多级过滤，并通过色谱法纯化。
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