CN105087565A - 一种营养不良型大疱性表皮松解症核苷酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种营养不良型大疱性表皮松解症新核苷酸，该核苷酸COL7A1基因定位于3号染色体3p21.1区域,由118个外显子组成，具有SEQ？ID？NO:1所示的核苷酸序列。本发明运用提取基因组DNA，PCR扩增和直接测序等分子生物学技术对中国汉族1例胫前显性遗传型营养不良型大疱性表皮松解症（DDEB-Pt）散发患者进行详细临床资料调查并对基因突变进行检测，检测到1个COL7A1基因突变，即COL7A1基因甘氨酸替换突变c.G6109？A？(p.Gly2037Arg)。本发明扩充了中国汉族人营养不良型大疱性表皮松解症的遗传及临床数据库，为患者的遗传咨询、产前诊断及基因治疗等奠定了基础。

Description

一种营养不良型大疱性表皮松解症核苷酸及其应用

技术领域

本发明涉及少见的单基因遗传性皮肤病-大疱性表皮松解症的检测。特别是一种营养不良型大疱性表皮松解症新核苷酸及其应用。

背景技术

遗传性大疱性表皮松解症(Epidermolysisbullosa，EB)是一种少见的单基因遗传性皮肤病，呈常染色体显性（AD）或隐性（AR）遗传。特征性表现为皮肤脆性增加，皮肤受到轻微摩擦即可导致皮肤分层，通常在数分钟内发生紧张水疱、糜烂和结痂。其致病原因主要是由于编码皮肤蛋白的基因出现了突变，导致蛋白质结构异常或皮肤结构蛋白先天性缺陷，使表皮发生松解，关节伸侧等易受外力摩擦部位出现大疱。大多数患者在婴儿期开始发病，少数病例成年出现症状。

大疱性表皮松解症由vonHebra于1870年首先描述，1886年德国Koebner首次报告并命名了大疱性表皮松解症。有关EB的诊断和分类意见，多次在国际会议上提出并不断得到补充。2007年在最新的分子遗传学研究基础上第三次研讨会对既往的认识进行完善和修正，这一新的分类标准己于2008年6月正式发布。根据透射电镜超微结构以水疱在皮肤中的位置为标准，最新的分类方法将EB分为单纯型（epidermolysisbullosasimplex,EBS）、交界型（junctionalepidermolysisbullosa,JEB）、营养不良型（dystrophicepidermolysisbullosa,DEB）和Kindler综合征四个临床类型，各型又包括不同的亚型（表1）。

表1EB的主要临床类型及亚型

营养不良型大疱性表皮松解症（DEB）是一种会形成瘢痕的EB，水疱位于皮肤的深层组织，真皮上层的致密板下。将DEB分为显性遗传（DDEB）和隐性遗传（RDEB）两大亚型。DEB组织病理表现为表皮下水疱，疱内及真皮炎症细胞浸润不明显，常见囊肿样结构。透射电镜观察显性DEB可见致密板下裂隙，锚纤维数量减少，而隐性DEB锚纤维明显减少或消失。

分型：与原来的分类相比，隐性遗传的Hallopeau-Siemens（RDEB-HS）改称重症泛发型RDEB（RDEB-Sevgen），非Hallopeau-Siemens型RDEB（RDEB-nHs）改称为其他泛发型RDEB（RDEB-O），（表2）

表2DEB的主要临床类型

（一）显性遗传型DEB（DDEB）： 泛发型DDEB（DDEB-Gen）肢端型DDEB（DDEB-Ac）胫前型DDEB（DDEB-Pt）痒疹型DDEB（DDEB-Pr）甲局限型DDEB（DDEB-Na）新生儿大疱性表皮松解DDEB（DDEB-BDN）。

（二）隐性遗传型DEB（RDEB）：（1）重症泛发型RDEB（RDEB-Sevgen）（2）其他泛发型RDEB（RDEB-O）（3）反相型RDEB（RDEB-I）（4）胫前型RDEB（RDEB-Pt）（5）痒疹型RDEB（RDEB-Pr）（6）向心型RDEB（RDEB-Pt）（7）新生儿大疱性表皮松解RDEB（RDEB-BDN）。

胫前显性遗传型营养不良型大疱性表皮松解症（DDEB-Pt）

胫前显性遗传型营养不良型大疱性表皮松解症（DDEB-Pt）是DEB中一罕见临床亚型，1946年Kuske报道1例发生于胫前区的瘙痒性水疱、萎缩及瘢痕的DEB，称为胫前DEB。出生时即可发生，亦可在婴儿期或儿童期发病。主要发生于胫前、前臂，少数亦可发生于躯干。瘙痒明显，可见瘢痕、粟丘疹及甲营养不良。成人期损害可呈苔藓样斑块。病情呈慢性进行性发展，尤其进入青春期后加重。血中IgE水平可增高。需与肥厚性扁平苔藓、皮肤淀粉样变及人为皮炎鉴别。

DDEB-Pt致病基因VII型胶原（COL7A1）。VII型胶原是三个相同的α1链构成的同源三聚体，每一α1多肽链含有中央胶原性三螺旋区，两侧为非胶原性氨基端和梭基端。胶原性结构区由特征性Gly-X-Y重复序列构成三螺旋结构域。VII型胶原基因（COL7A1）定位于3p21.1,由118个外显子组成（GenbankNo：L23982），是迄今报道的外显子最多的基因。绝大多数DDEB的基因突变均为甘氨酸替换突变（某一碱基的点突变导致甘氨酸被其它氨基酸替换）。

发明内容

本发明公开了一种营养不良型大疱性表皮松解症新核苷酸，该核苷酸COL7A1基因定位于3号染色体3p21.1区域,由118个外显子组成，具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。

本发明进一步公开了营养不良型大疱性表皮松解症新核苷酸在制备检测成人、婴儿营养不良型大疱性表皮松解症中的应用。其中遗传性大疱性表皮松解症指的是单基因遗传性皮肤病。表现为皮肤脆性增加，皮肤受到轻微摩擦即可导致皮肤分层，通常在数分钟内发生紧张水疱、糜烂和结痂。

本发明公开的营养不良型大疱性表皮松解症新发基因，COL7A1基因定位于3号染色体3p21.1区域,由118个外显子组成，具有（GenbankNo：L23982）,是迄今报道的外显子最多基因。1993年BurgesonRE首次报道了COL7A1基因是DEB致病基因，1994年国外对COL7A1进行研究测序，发现了完整的COL7A1基因结构组成，为DEB突变的研究奠定了基础。据统计到目前为止报道的COL7A1基因突变点总共有730多个（http://www.col7.info）。大部分COL7A1基因突变具有极大的种族及家系特异性，而复发性突变也可见于数个种族，如意大利人常见突变为497insA、8441-14de121、4783G-A、G1664A、7344G-A和425A-C；墨西哥人常见突变为24700insG；英国人常见突变为R578X、778de1G和R2814X；日本人常见突变为5818de1C、6573-1G-to-C和E2857X。到目前为止，在DDEB-pt中有6个致病突变被鉴定。分别为1995年ChristianoAM等报道了1个DDEB-pt家系中COL7A1基因105号外显子p.Gly2623Cys甘氨酸替换突变；1998年KonA等报道了1个DDEB-pt家系中COL7A1基因108号外显子c.8045A＞G外显子跳跃突变；1999年BettsCM等报道了1个RDEB-pt家系中COL7A1基因115号外显子g.33563-33576del/ND缺失突变；2002年GardellaR等报道了1个RDEB-pt家系中COL7A1基因55号外显子c.267-1G＞C/p.Pro1699Leu错义突变；2009年HamadaT等报道了1个DDEB-pt家系中COL7A1基因73号外显子p.Gly2059Glu甘氨酸替换突变和2013年LiuYH等报道了1个中国DDEB-pt家系中COL7A1突变基因73号外显子c.6101G＞T错义突变。

本研究中，我们在1例DDEB-pt散发患者中检测到c.G6109A(p.Gly2037Arg)甘氨酸替换突变，是一个新发突变（第7个），即患者COL7A1基因73号外显子的6109位点鸟嘌呤（G）转化为腺嘌呤（A），使得三螺旋区第2037位密码子由GCT变成ACT，编码氨基酸由甘氨酸（Gly）变为精氨酸（Arg），在家族正常人及正常对照中均未检测到。

本发明对中国汉族1例胫前显性遗传型营养不良型大疱性表皮松解症（DDEB-Pt）散发患者进行详细临床资料调查并对基因突变进行检测，检测到1个COL7A1基因甘氨酸替换突变c.G6109A(p.Gly2037Arg)。并证实这个突变为致病性突变，系国内外首次报道。DDEB-Pt散发患者是否存在denovo突变，有待进一步深入研究和探讨。本研究扩充了中国汉族人营养不良型大疱性表皮松解症的遗传及临床数据库，为患者的遗传咨询、产前诊断及基因治疗等奠定了基础。

附图说明：

图1为COL7A1-ZZS(1-10thprimers)；

图2为COL7A1-ZZS(11-17thprimers)；

图3为COL7A1-ZZS(18-25thprimers)；

图4为COL7A1-ZZS(26-41thprimers)；

图5为COL7A1-ZZS(42-56thprimers)；

图6为COL7A1-ZZS(57-73thprimers)；

图7为COL7A1-ZZS(74-87thprimers)；

图8为COL7A1-ZZS(88-104thprimers)；

图9为L7A1-ZZS(105-118thprimers)；

其中图1-9均为胫前显性遗传型营养不良型大疱性表皮松解症（DDEB-Pt）PCR扩增结果，其中COL7A1基因PCR电泳结果，各条带所处位置与DNAMarker比较，为目的扩增序列；

图10相同的突变在患儿父母和家系外100名正常对照图；其中患儿COL7A1基因第73号外显子6109位点鸟嘌呤（G）被腺嘌呤(A)替换（c.G6109A）(b)COL7A1基因第73号外显子正常DNA序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989）中所述的条件。

实施例1

材料与方法

研究对象

本研究收集了1个中国汉族EB散发病例，确诊为胫前显性遗传型营养不良型大疱性表皮松解症（DDEB-Pt）。由本院皮肤科医师根据其典型的临床表现结合病史、实验室检查确诊。经南方医科大学伦理委员会的许可，在征得患者知情同意后，留取详细的临床资料，收集的资料包括患者性别、年龄、发病年龄、皮损类型、皮损分布、诱发因素、家系内患病情况以及组织病理等。同时抽取患者及其父母静脉血5ml置于EDTAK₃(或EDTANa₄)抗凝管中。同时留取100例家系外正常对照的静脉血以排除单核昔酸多态性(SNFP)。血标本放置在–85℃超低温冰箱冷冻保存用于基因突变检测。

方法

1.1实验材料

1.1.1主要实验仪器

(1)ABI9700DNA扩增仪（上海英潍捷基公司）

(2)ABI3730XL测序仪（上海英潍捷基公司）

(3)磁力振荡器/MSIMinishaker振荡器（MadeinMalaysia）

(4)台式低温高速离心机/Microtec1542R低温高速离心机（美国BeckmanTJ-6型）

(5)DK-8D型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）

(6)全波长紫外/可见光扫描分光光度计ND-1000（美国NanoDrop公司）

(7)DNA扩增仪（美国PE2400）

(8)DYY-III型电泳槽（北京六一仪器厂）

(9)水平电泳槽（北京六一仪器厂）

(10)ZJ型紫外观测灯（上海顾村电光仪器厂）

(11)Tgradientthermocycler（BiometraMadeinGermany）

(12)FD201稳压稳流电泳仪（北京通用分析仪器厂）

(13)台式小量离心机（EppendorfMadeinGermany）

1.1.2主要试剂

(1)蛋白酶K（美国MerCk公司）

(2)丙烯酞胺（美国Sigma公司）

(3)甲叉双丙烯酞胺（美国Sigma公司）

(4)dNTP混合物（美国Sigma公司）

(5)DNA聚合酶(Taq酶)（美国Promega公司）

(6)DNA分子量标准(PBR322/Haelll)（美国Promega公司）

(7)外切酶I（ExonI）（BIOLAB公司）

(8)虾碱性磷酸酶（SAP）（USB公司）

(9)四种标有不同荧光标记的ddNTP

(10)特异扩增K14及COL7A1基因外显子引物（上海英潍捷基公司）

1.1.3耗材

(1)10ml塑料吸管（江苏晟康医疗用品有限公司）

(2)AXYGENPIPETTIPS0.5-10ul(AxygenScientificInc.,USA)

(3)AXYGENPIPETTIPS1-200ul(AxygenScientificInc.,USA)

(4)AXYGENPIPETTIPS1-1000ul(AxygenScientificInc.,USA)

(5)AXYGEN1.5ml离心管(AxygenScientificInc.,USA)

(6)单道Eppendorf可调移液器（0.1-2.5ul）(Eppendorf,Germany)

(7)单道Eppendorf可调移液器（2.0-20ul）(Eppendorf,Germany)

(8)单道Eppendorf可调移液器（20-200ul）(Eppendorf,Germany)

(9)单道Eppendorf可调移液器（100-1000ul）(Eppendorf,Germany)

(10)粘附载玻片188105（江苏世泰实验器材有限公司）

(11)无水乙醇

1.1.4分析软件和电子数据库咨询

(1)引物设计软件：Prime(version5.0)

(2)序列读取软件：Chromas(version2.31)

(3)DNA分析软件：DNAStart（version10.0）

(4)美国国立生物技术信息中心：http://www.ncbi.nlm.nih.gov

(5)网上在线孟德尔遗传：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/

(6)人类基因突变数据库(TheHumanGeneMutationDatabase)：http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php

(7)基因库（Genebank）：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank

(8)HumanIntermediateFilamentDatabase：http://www.interfil.org/

(9)HumanGenomeBrowserandBlat：http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat

UCSCGenomeBrowser由UniversityofCaliforniaSantaCruz(UCSC)创立和维护。该站点包含人类、小鼠和大鼠等多个物种的基因组草图，并可以提供一系列网页分析工具。站点用户可通过它可靠、迅速浏览基因组的任何一部分，同时可得到与该部分有关的基因组注释信息。

1.2实验方法

1.2.1主要试剂和溶液的配制

(1)0.5MEDTA(pH8.0)：称EDTA·Na₂·2H₂O18.6g，加水70ml，电磁搅拌，用Na0H调节pH值为8.0，加水至100ml，高压灭菌后室温存放。

(2)10%SDS(十二烷基磺酸钠)：称SDS10g，溶于80ml水中，加热助溶后，加数滴1NHCI调pH至7.2，定容到100ml，室温存放。

(3)3M乙酸钠(pH4.6)：称NaAc·3H₂O40.8g，溶于20ml水中，以冰乙酸调pH至4.6，加水至100ml。

(4)TE(pH8.0)(含Tris-HCL10mM，EDTA1mM)：取1MTris一HCL(pH8.0)10ml，加0.5MEDTA2ml，加水至1000ml。

(5)PBS缓冲液(10x)：Na₂HPO₄11.5g，KH₂PO₄2g，NaCl80g，KCl2.0g，加水至I000ml，此液稀释10倍后pH为7.4。

(6)琼脂糖凝胶加样缓冲液(6x)：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖溶于水中。

(7)TAE(50x)：每升含Tris242g，冰醋酸57.lml，0.5MEDTA(pH8.0)100ml。

(8)蛋白酶K：(-20℃保存)10%SDS50ul，0.5MEDTA2ul，H₂O0.5ml蛋白酶K10mg，分装成30ul/管。

(9)红细胞溶解液：(室温保存备用)10mMKHCO31.0012g，155mMNH4CI8.29g，1mMEDTA(取0.5mol/L2mL)加水至1000mL。(用HCI或NaOH调PH至7.5)

(10)核裂解液：(室温保存备用)10mMTris-HCL，400mMNaCI4.68g，2mMEDTA(取0.5mol/L0.8ml)加水至200mL。PH至8.0(取1M2ml)。

皮肤标本组织病理

由本院皮肤科医师在局麻下用梭形皮肤切除术切取患者皮损部位皮肤，并尽快将标本放置于10%福尔马林溶液中，再由科室病理专业技师按以下流程对切取的皮肤标本进行进一步处理：固定、水洗、硬化、脱水、透明、包埋、切片、染色。

基因组DNA的制备

1.2.3.1全血标本采集

获得知情同意后，抽取EB患者及正常成员和100位家系外正常人静脉血5ml置EDTAK₃(或EDTANa₄)抗凝管中。血标本放置在–85℃超低温冰箱冷冻保存。

基因组DNA的提取

采用改良盐析法提取外周静脉血中的基因组DNA，步骤如下：

(1)细胞解冻：标本从–85℃超低温冰箱取出，放置在–20℃低温冰箱24小时，再从–20℃低温冰箱取出放置4℃冰箱解冻24小时。

(2)红细胞裂解：

①吸取500ul全血置于1.5ml离心管中，加入800ul红细胞裂解液，翻转、混匀。

②混合液室温下放置10分钟使红细胞裂解(其间颠倒多次，使液体混匀)。

③室温下以3000rpm转速离心10分钟，尽可能去除上清液(为裂解的红细胞)，保留下面的沉淀(沉淀主要为白细胞)。

④重复步骤③，剧烈振荡离心管15秒至沉淀重悬。

⑤重复步骤②③④，再次裂解。

(3)核裂解和蛋白质沉淀：

①向振荡后的离心管中加入170ul核裂解液和80ul蛋白沉淀剂，吹打多次使白细胞裂解，此时液体变得粘稠。

②将离心管置于70℃水浴箱中2小时，前15分钟持续摇晃，使反应体系充分混匀。

③室温下以12000rpm转速离心10分钟，离心管底部可见棕色蛋白沉淀。

④将上清液转移至洁净的离心管。

(4)DNA沉淀：

①室温下向上清液中加入2倍于上清体积异丙醇，轻柔翻转混合液体，可见白色DNA形成的线状沉淀。

②室温下以12000rpm转速离心l分钟，离心管底部即为DNA沉淀。

(5)DNA洗涤和溶解：

①弃去上清液，加入lml70%乙醇至离心管，轻柔颠倒离心管清洗DNA沉淀，低速离心，甩干管壁残留液体。

②小心吸出乙醇，重复步骤①，重复洗涤DNA1次。

小心吸出乙醇，将离心管倒置于洁净吸水纸上晾干15分钟。

加入100ulDNA溶解液，65℃水浴l小时使DNA充分溶解。

将DNA溶液置于4℃保存备用。

(6)DNA原液纯度、浓度的测定及模板DNA的配制：

用Nanodrop分光光度计测DNA原液的D230、D260及D280值，并计算模板的纯度和浓度。根据DNA原液浓度配成浓度为100ng/ul的模板DNA。

1.2.4COL7A1基因引物合成、稀释和保存

1.2.4.1基因的序列获取

在NCBI的网页（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）输入COL7A1基因的名称，可得到该基因的基因组DNA序列及mRNA序列。

基因的HumanBLATSearch

在UCSC的数据库（www.genome.ucsc.edu）中，将基因的mRNA的编码序列进行humanBLAT搜寻，从而得到COL7A1基因的基因组序列SEQIDNO:1。

采用Primer5.0进行引物设计

根据基因mRNA序列与基因组序列的HumanBLATSearch的结果，采用引物设计软件Primer5.0。将含有外显子及外显子/内含子交界处的基因组序列输入Primer5.0软件，根据序列长短、合适的起始及中止位置限定设计条件，从输出结果中挑选合适的引物。考虑到测序结果的准确性和测序仪机器的误差，以及外显子/内含子交界50个碱基以内序列可能影响mRNA剪切，一般要超出目标序列边界50-100bp左右。

引物设计主要是针对基因的编码区进行的，引物设计参照以下原则：

(1)引物长度控制在18-23bp。

(2)GC含量控制在40%-60%之间。

(3)引物自身不能有连续4个碱基的互补，引物间不能有连续4个碱基的互补。

(4)引物二聚体及发夹结构的能值不能过高（通常不超过4.5kcal/mol），二聚体及发夹结构的能值过高易导致产生引物二聚体带，并且将降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

(5)对于某些相邻的片段较短的外显子且两外显子间的内含子亦较短的片段，可合并设计成一对引物（如外显子3、4设计成一对引物等）。

CAGGCAAGACCAGGACTCGGGTCGTGGAGTTGGCTGGGTTACCATCCCAAGTCCCAGTGATGTTTCTGCAAAGACCTGGCGGCCAGAAGAGATCCTGAGTCTGACCTGTCACTCCTGCTCAGCAGGAGTGACAGGTCAGCGGGTCAGGAGCACATAGGATGTGTACCCTGACCTAGACCGAGGTCACTTTATCTTGCCCTCAGGAGTGATAGGTGGTGGCCAGGGATTCATGGAGTCAGACAATTCTGCCAGCCTCTGACGGCCTTGCAGACTCAGGACTCGTGAGAGATGTGGGCTGAGGGGCACATGGGATGTCAGTGGCAGGCTGGGCACTTTCTTCAGGTCAGACCAGCAGAGGCCATGAAGGGATGGACAGGCAAGGAGCACAGCATAGAGGCAGCCCAGTGAGTGGGGGAGGTGTCGAAGGAGAGGGCTGGAGGTACCTTCTCACTCTGCGTCCCTAACCAGGACCAGAGTGAGGCTGAGTACTGCAGGAGGCTTGTGAGGTCAGAGGGAAATGCTAATGAGGGTATGGGTGCCAGGGAGGAGGGAGTGGGATTCTAGACTCCCATCATCTTCCCCCACCTGGACCCCCAATAAACACAGAGTTTGCTAGCCCTGGCTGGGCAATCAGGAACACACGCTGCCTAAAGTGACCTGTCGCATACAGCAATGGTTAGGGCCCTAACCATTGCTGTATGCCCAAAGGCTCACTACCAATCCAGGGTCTGAGAGGAGGGAGCCATCAGTGTCTCGCCTACCAACCCAGTTAACAGAGCCAGGGAGGAGTCACTCAGAGTCGACCCAGGATCTCAGATCTCTTGCAGGAGACAGAACTTGATAGTTGGGGCTCTGTGGAGACCAAGTTACTGAAGCGGGCAGATAGTGGGCGTAGTGGGAAGTGTGAGAGAGCTGGGAGAATCACCCTGATGTGTTTCTCCAGGAAGGACATGTCAGAACCCGCATGGACTCCTGGGGCTATTAAGGTGGGGTCCAGTGGCTGTAAGGAGTAGGCTGATGGGAGGGTCTCTTTGAGGTTGAAGGGACTGGGTGGTAGAATATGAGACAGCTTTGAGGAGTGCTCTGCCTCACTGTTCCACCCGCTCAGGCGAATGTCAACGTTGCTCTCTAAGTGTCTTCCCCCCACTACACATCACTTGCCGGTATGTGGAGGCAAGTGATCAAGGATTTTGGGAGAACTGCAAGGATTTTGGGAGAACTGAGAACTATGAAGCCCAGCACAGTGGTTGGGTGCTGGGCTTGCCAATAGCTCCAGGAGGTCTTTCTCCTTCAGGGTGACTCCACGTTCGCCCTGATGGAAATCTAGCCCTGTCTGTCCATATATAGGAGGGTCACTGCTCAGACTTCCAATTCCATGTGACCTGTGGATGGAAGGATAAGAGGGCAGTTGGTGAAGGTTGTAAGAGGGAGGTGATGCAGGACCTTGAGAACTGCTTGCTTCTTTCCTATCACCTTCATGCCTGATGGGAACCTCTGATGTGGAAGATTGGGAGGGTTTAGCACACACGCATCTGAAGGCTAAGGTTTCAGAGGGACAGTGGAGGTTTCAGAGGGACAGTGGGGATCTGATAACCCAGGCTCATGAGCCTGGGTTATCAGATTCTCTCGGATGCTGTGACTAGCCCAAGGGATATCTCAGAGTCTTGGCTGTGTAGGTGTGCCCATGCTCCAAGACACACACCATCAGCACCCTGAGACCTCGGGAGAGAAGTGAGTATTGGCCAGTCTCCCCACGGTCACCTGAGTGCGGATGTTGGGTAGGCCCAAGTTCCCTTGAGTGTGCAGGAGCTTCTCTGTCATGACAGCAAGAGGTCAGAGGAGTCAAGGTGGGTTGTTTAGGGGGAAGAGAGAATGCTGGTGGGGGTGTAGCTGTACAGCCACCCCTCTTCCCTCACTCTCCCCAGGAGAGTGAGGGAAGAGTTAGGGTCAGAAATTCCAGGGTGACTAGTGACCAGGAAGCCTCAAGTCAGTCCCTAGTGCCGCTAAGGTCAGTGTGTGGAACCCTAGACAGAGTCAGGACCCGTAAGTCCTTGCCCAACACCAGAGAGGCACACAGACACAGCAAGTGAGGCCCAGATTGAGGGCATGGACACAGCTTGAAGTAGTGTGCGCCAACCTCCTGCTGCCTGTCGACCCTTGACCGTCAAGGGTTGGGCTCCAGGTGGAAACAGGCTTGTGGGTGCACAAGCCTGTTTCCAAATGGGGTGGGTAAACTATGGGTCCGCATATTTAAGCTCTGGCCCTTATGCCCGCCATCACACTAGCCCGTGTCTGAACTCTGTACTCCCTCTTCCTCCTGTGGTGATGAGAGTCCTGGGAGGGCCCATCCTAAGTCCTCACGATCGTGAGGACTTAGGATGGGGAGGTTGGAAATCAGAGGCACTCTTGCCTCTGATTTCCAACCCGCACCTGAATTCTAATAGAAGGTCCTGGCATGAGTGGTGCCCTCACAGATGCTGTGGCGGGCTCGTTGTATTCTAAGCAAAAGCTACCACACTGGTGCCACTATCCAGGGCGATTCTGCAGTGGGGTGAGCCTTAGGGTACAGAGGGGATGGGGGCTCTACACCCCCATGACCCGACGAGTTCAGGGAGGTTCCAGATGGTTATGAGGTTGGAAGGGAGCTCTGACTCCTGATCCCTGGGACTATGGTGAGACTGCATCCATGCAGTCTCACCATAGCTTGACTGCTTGCCCTGTAACCCTCTGCCTGTGTGTCTCTCTGCATTCATGGACACCCATACAGTGGAAATCAGTGCTGCAGGGTTTGTGGGAATCAGAGCCCTGACCTTTCAACCCTCTAAGGACTCCTCCCCCAGAACTCTCCGGGGAAGGTCAGATGCATCACAGGCTTGGGTCAAG

1.2.4.4引物稀释和保存

所有引物均由上海英潍捷基公司广州合成部合成，并按照如下步骤稀释：

(1)按照DNA合成产品使用说明计算该条引物分子量、质量数和摩尔数，进而根据所需的浓度计算需加入双蒸水（ddH₂O）的量；

(2)将引物管离心数秒使引物结晶体聚集至管底；

(3)轻轻打开装引物的管子，以免在开启时飞扬丢失，小心加入计算后所要加的ddH₂O。

(4)充分振荡、混匀；

(5)3000rpm离心3分钟；

(6)放入-20℃长期保存。

反应

1.2.2.5.1PCR反应原理

聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区域。每一个PCR循环，反应混合体系都在模板变性、引物退火和引物延伸三种不同温度下依序进行。

(1)变性阶段：在94℃热变性，两条模板链发生分离。

(2)退火阶段：两条引物在50℃左右分别与模板链杂交。

(3)延伸阶段：在最适温度72℃时，使引物序列延伸、靶片段的拷贝数加倍。

重复该PCR循环过程25-38次，使PCR产物呈指数累积增加。

降落PCR（touchdownPCR）即选定一个温度范围，如57-68℃，随着循环的增多，退火温度每个循环依次降低，然后再以某一特定的退火温度循环30次左右。其原理是，随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，这种方法的退火温度范围较大，在最佳退火温度不确定时比较适用。

反应体系

COL7A1PCR反应体系:

表3COL7A1PCR反应体系（50UL）

1.2.2.5.3PCR反应程序

PCR反应程序采用touchdownPCR程序，具体反应程序如下：

表4COL7A1PCR反应程序

1.2.2.5.4PCR反应产物保存

反应产物可放置4℃保存。

反应注意事项

由于PCR反应能够使单个DNA分子得以扩增，所以应当注意防止反应体系被污染。

(1)凡不用工作台时应打开紫外灯，工作台内应置有PCR专用的微量离心机，一次性手套、整套移液器和其他必需品。所有缓冲液、吸头和离心管使用前必须经过高压处理。

(2)一旦进入吸加PCR试剂的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套，并勤于更换。

(3)准备专供PCR使用的成套试剂，分装成小份。配制这些试剂时，要用从未接触过实验室内任何DNA的新用具。

(4)必须设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中所有其他成分的对照反应。

产物琼脂糖凝胶电泳

(1)用高压灭菌指示纸带将洗净、干燥的电泳装置配备的塑料盘的开口封住，形成一个胶模。将胶模放在水平工作台上。

(2)配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液，用电子天平准确称量琼脂糖1.5克并转移至玻璃瓶中，用量筒量取100ml电泳缓冲液，倒至玻璃瓶中并摇匀。LR—PCR产物采用0.6%琼脂糖凝胶电泳。

(3)在微波炉中加热悬浮液至琼脂糖溶解。

(4)使溶液冷却至60℃，加入溴化乙锭至终浓度为0.5ug/ml，充分混匀。

(5)用吸管取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，任其凝固。在距离底板0.5-1.0mm的位里上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。

(6)将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中，凝胶的厚度在3-5mm之间，检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。

(7)在室温放置30分钟凝胶完全凝固后，小心移去梳子和高压灭菌纸带，将凝胶放入电泳槽中。.

(8)加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。

(9)DNA样品与加样缓冲液混合后，用微量移液器慢慢将2ul混合物加入样品槽中，此时凝胶已浸没在缓冲液中。在其中一孔中加入DNAmarker。

(10)盖上电泳槽并通电，采用1-5V/cm的电压降（按两极间距离计算）。电泳示溴酚兰在凝胶中迁移出适当的距离。

(11)切断电流，从电泳槽上拔下电线，打开槽盖。在紫外灯下检查凝胶并扫描。

产物纯化和DNA测序

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，用SAP酶和ExonI处理。

反应体系如下：

1)反应物质：SAP酶(1U/μl）0.4μl，ExonI(20U/μl)0.25μl，ddH₂O1.35μl，PCR产物5μl。

2)酶切反应条件：37℃60min，80℃15min，4℃forever。

3)测序反应操作如下：

(1)试剂准备：测序引物1.0μl

PCR纯化产物2.5μl荧光测序MIX2.0μlddH₂O2.5μl。

(2)PCR扩增流程：96℃20S，50℃20S，60℃4min，总共30个循环后保持在4℃，需要2小时45分左右。

(3)测序前样品准备：反应液的配制（即用即配，低温放置）：NaAC3M，PH5.2，1μl；EDTA100mM，PH8.0，1μl；Glycogen20mg/ml，0.5μl，共2.5μl。

(4)乙醇沉淀：

1.5ml离心管中加入2.5μl反应液，30μl95%冰乙醇（-20℃），8μl测序PCR反应产物，混匀立即在4℃下以14000rpm转速离心15分钟。

可以看到离心管底部有白色DNA沉淀，小心在吸水纸上倒掉上清。

加100-200μl70%冰乙醇洗涤脱DNA沉淀，4℃以下以12000rpm转速离心5分钟。

在吸水纸上小心地倒掉上清。

重复步骤 ，重复洗涤一次。

低速离心甩干管壁残留液体，用Tip吸干残留的液体，避光放入37℃培养箱干燥约3分钟。

在每个离心管中加入30μl甲酰胺（SampleLoadingSolution,SLS)，反复吹打直至管底沉淀完全溶解，低速离心甩干管壁残留液体。

(5)上样：

小心转移样品至测序仪样品板孔内（不要出现气泡），最后加一滴石蜡油至每个孔内。

在缓冲液板孔内加入3/4体积的测序缓冲液。

测序结果分析

测序结果对比分析：测序图上显示双峰为杂合子，利用人工判读的方法识别杂合突变。应用NCBIBLAST数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）进行在线碱基序列比对，利用NCBISNP数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp）排除数据库中已有的SNP位点。

参照下列标准来确定某一杂合双峰是否是突变，突变测序图至少应满足下列一些条件：

(1)显示杂合的碱基两侧序列是可辨别的单峰，背景比较低；

(2)将杂合个体与纯合个体测序图进行比较，在杂合图中，碱基峰有下降趋势，杂合子的两个峰比两种纯合子的峰均低；

(3)有插入或缺失的片断，测序图应具有明显的特征性：杂合子的测序体峰会从插入或缺失位置开始变为两条杂合链。通过对比两种不同纯合子的序列可确定插入或缺失的是什么碱基。必要时进行反向测序以验证。

查阅中国自1995年以来报道的DEB资料

查阅中国生物医学光盘（CBM）及美国国立生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)输入相关检索词，检索自1995年以来国内DEB相关突变报道，然后查阅全文，对这些病例的临床特点和突变筛查结果进行分析总结。

结论：

l)运用提取基因组DNA，PCR扩增和直接测序等分子生物学技术对中国汉族1例胫前显性遗传型营养不良型大疱性表皮松解症（DDEB-Pt）散发患者进行详细临床资料调查并对基因突变进行检测，检测到1个COL7A1基因突变，即COL7A1基因甘氨酸替换突变c.G6109A(p.Gly2037Arg)。

2)证实这个突变为致病性突变，COL7A1基因甘氨酸替换突变c.G6109A(p.Gly2037Arg)系国内外首次报道。

3)本研究扩充了中国汉族人营养不良型大疱性表皮松解症的遗传及临床数据库，为患者的遗传咨询、产前诊断及基因治疗等奠定了基础。

实施例2

试剂盒的制备及应用

1、PCR试剂盒的组成：

dNTP(10mM)30μl；

10×Buffer(10×酶特异性反应缓冲液)50μl；

Taq聚合酶（5U/μl耐热DNA聚合酶）5μl；

PCR引物（5μM）SEQIDNO:110μl；

阳性对照品(KP)10μl；

阴性对照品（KN）10μl；

ddH₂O5ml；

每个试剂盒可用于检测10个样品。

其中10×Buffer、dNTP、Taq聚合酶由宝生物工程有限公司提供；引物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品、阴性对照品和ddH₂O由我们自行制备。

2、仪器设备

其中10×Buffer、dNTP、Taq聚合酶由上海生工提供；引物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品、阴性对照品和ddH2O由我们自行制备。实验的设备PCR仪（又名DNA热循环扩增仪）、电泳设备（包括电泳仪及电泳槽）、凝胶成像仪、-20℃冰箱、高速离心机、微量移液器和0.2mlPCR薄壁管。

3、PCR试剂盒的使用具体实例

使用上述的PCR试剂盒检测营养不良型大疱性表皮松解症（DDEB-Pt）的PCR检测方法包括如下步骤：

（1）提取待测患者临床提取液作为模板（抽取患者静脉血）；

（2）在PCR薄壁管中加入、dNTP、10×Buffer、Taq聚合酶、引物、待测样品模板和ddH₂O混匀；

（3）将薄壁PCR管中混匀的混合物在PCR仪上扩增；

（4）在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；

（5）分析并进行结果判断。

上述步骤(1)中的模板为取样汉族1例胫前显性遗传型营养不良型大疱性表皮松解症（DDEB-Pt）散发患者静脉血的粗提液（静脉血）。

上述步骤（1）中的环境样品模板的提取方法为：

取1.5ml培养物，在12000rpm条件下离心1分钟，去掉上清液；

取500μl的ddH₂O重悬沉淀，在8000rpm条件下离心5分钟，去掉上清液，烘干；

取100μlddH₂O重悬沉淀，在100℃沸水中水浴10分钟；

再置于冰上10分钟后，在12000rpm条件下离心2分钟；

⑤取3μl中层上清作为PCR模板

上述步骤（3）中的PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为：

前期为使变性能够达到所需的温度而必需的前期处理过程的一个循环为95℃，5分钟；

变性温度和时间为95℃，45秒；

复性温度和时间为53℃/58℃，1分钟；

延伸温度和时间为72℃，1分钟；

变性、复性、延伸的循环次数为35个循环；

为稳定扩增产物而进行一个循环的温度和时间为72℃，5分钟。

上述步骤（4）在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为：

取2～5μl扩增产物与6×溴酚蓝上样缓冲液以5：1的体积比混合；

将混合液上样于1.0％的琼脂糖凝胶上；

将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约30分钟，用DL2000Marker进行对照；

观察并记录结果。

SEQUENCELISTING

<110>内蒙古自治区人民医院

<120>一种营养不良型大疱性表皮松解症核苷酸及其应用

<160>1

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>2883

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

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Claims (3)

1.一种营养不良型大疱性表皮松解症新核苷酸，该核苷酸COL7A1基因定位于3号染色体3p21.1区域,由118个外显子组成，具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述营养不良型大疱性表皮松解症新核苷酸在制备检测成人、婴儿营养不良型大疱性表皮松解症中的应用。

3.权利要求1所述的遗传性大疱性表皮松解症指的是单基因遗传性皮肤病。